05_[ ]_KJM hwp

Transcription

1 Korean Journal of Microbiology (2018) Vol. 54, No. 2, pp pissn DOI eissn Copyright c 2018, The Microbiological Society of Korea Cellulosimicrobium sp. YB-43 으로부터 mannanase C 유전자의클로닝과효소특성 윤기홍 * 우송대학교바이오식품과학전공 Gene cloning of β-mannanase C from Cellulosimicrobium sp. YB-43 and characterization of the enzyme Ki-Hong Yoon* Food Science and Biotechnology Major, Woosong University, Daejeon 34606, Republic of Korea (Received April 26, 2018; Revised June 2, 2018; Accepted June 4, 2018) The characteristics of enzyme and gene for mannanase B had been reported from Cellulosimicrobium sp. YB-43 producing some kind of mannanase. A gene coding for the enzyme, named mannanase C (ManC), was expected to be located downstream of the manb gene. The manc gene was cloned by polymerase chain reaction and sequenced completely. From this nucleotide sequence, ManC was identified to consist of 448 amino residues and contain a carbohydrate binding domain CBM2 besides a catalytic domain, which was homologous to mannanase belonging to the glycosyl hydrolase family 5. The catalytic domain of ManC showed the highest amino acid sequence similarity of 55% with the mannanases from Streptomyces sp. SirexAA-E (55.8%; 4FK9_A) and S. thermoluteus (57.6%; BAM62868). The His-tagged ManC (HtManC) lacking N-terminal signal peptide with hexahistidine at C-terminus was produced and purified from cell extract of recombinant Escherichia coli. The purified HtManC showed maximal activity at 65 C and ph 7.5, with no significant change in its activity at ph range from 7.5 to 10. HtManC showed more active on konjac and locust bean gum (LBG) than guar gum and ivory nut mannan (ivory nut). Vmax and Km values of the HtManC for LBG were 68 U/mg and 0.45 mg/ml on the optimal condition, respectively. Mannobiose and mannotriose were observed on TLC as major products resulting from the HtManC hydrolysis of mannooligosacharides. *For correspondence. ykh@wsu.ac.kr; Tel.: ; Fax: In addition, mannobiose and mannose were commonly detected as the hydrolyzed products of LBG, konjac and ivory nut. Keywords: Cellulosimicrobium sp. YB-43, cloning, mannanase C, purification Mannanase는 β-mannan, glucomannan, galactomannan과 galactoglucomannan으로분류된 mannan 다당류를구성하는 mannose 잔기간 β-1,4-mannosyl 결합을무작위적으로분해하는효소로 β-mannosidase, α-galactosidase, β-glucosidase 및 acetyl mannan esterase와함께 mannan의분해에관여하며이들효소중가장주된역할을한다. 미생물뿐아니라동물과식물에서도생산되는것으로알려진 mannanase는섬유물질의가수분해에관여하는효소중 cellulase와 xylanase에비해뒤늦게관심을받았으며 1990년대이후부터그특성이다양한미생물유래의효소를중심으로본격적인연구가이루어졌다. 펄프와제지표백공정, 바이오매스자원의당화공정, 커피와과일음료가공공정및석유채취공정을비롯하여세제와사료첨가용효소로 mannanase의산업적용도가주목을받고있다 (Srivastava and Kapoor, 2017). Mannanase의활용성을높이기위해효소의활성과안정성을개량하고자분자진화와구조기반의합리적설계를통해내열성, 내산성, 비활성이나

2 Cellulosimicrobium sp. 의 mannanase C 특성 127 분해효율이개선된변이효소가개발되고있다 (Walia et al., 2015). Mannanase는 cellulase나 xylanase와유사하게활성영역으로만구성되거나또는추가적으로탄수화물결합영역 (cellulose binding domain; CBM), S-layer-homologous (SLH) 이나 fibronectin (FN) 영역을포함하고있다 (Kumagai et al., 2011; Takasuka et al., 2014; Zhang et al., 2017). Mannanase의활성영역은아미노산배열의상동성에따라 glycosyl hydrolase family (GH) 5, 26, 113과 134에속하는것으로알려져있으며대부분은 GH5와 GH26의효소에해당한다. GH26의 mannanase는활성영역만으로구성된세균성효소가대부분인반면에 GH5의 mannanase 는세균과균류에서두루생산되며활성영역과함께다른기능성영역을포함한효소가많다 (Stoll et al., 1999; Dhawan and Kaur, 2007). 한편미생물의유전체염기서열의정보가많아지면서이로부터추론되는단백질의아미노산배열에근거하여매우많은 mannanase의존재가알려지고있으나효소특성이조사된것은일부에불과하다. Cellulosimicrobium 속은 2001년에 16S rdna 서열및세포벽과세포막의조성분에따라 Cellulomonas cellulans가 Cellulosimicrobium cellulans로재분류되어제안되었다 (Schumann et al., 2001). 기존에다르게분류된균종들이 Cellulosimicrobium 속균주로재분류됨과동시에신균주들이분리동정되어현재까지 Cellulosimicrobium 속으로동정된균종은 C. aquatile, C. cellulans, C. funkei, C. terreum, C. arenosum, C. marinum 과 C. variabile 등이알려져있다. C. cellulans은 curdlan을 1,3- β-glucan 올리고당으로가수분해하는 β-1,3-glucanases를비롯하여 xylanase, β-xylosidase, protease 등의효소를생산하는균으로보고되었으며 (Oda et al., 2018), 토양이나동물의장관에서분리된 Cellulosimicrobium 속균주들이 chitinase, β -glucosidase, cellulase, xylanase의효소를생산하는것으로알려졌다. Mannanase를생산하는 Cellulosimicrobium 속의균으로는 C. cellulans, C. funkei HY-13와 Cellulosimicrobium sp. YB-43가분리되었고이들은한종류이상의 mannanase를생산하는것으로알려졌다 (Stoll et al., 1999; Kim et al., 2011a; Yoon, 2015). Cellulosimicrobium sp. YB-43의 mannanase 중에서 mannanase B (ManB) 의유전자는클로닝되고효소특성이밝혀진바있으며 (Yoon, 2016), 본연구에서는이와는다른 mannanase C (ManC) 의유전자를클로닝하여재조합대장균으로부터효소를정제하고그특성을조사하였다. 재료및방법 Mannanase 유전자클로닝 Cellulosimicrobium sp. YB-43의 manb 유전자주변염기서열 (GenBank accession no. KX620013) 과 Cellulosimicrobium sp. MM의유전체염기서열 (NZ_JPQW ) 을참고하여 mannanase 유전자로예상되는 DNA 단편을증폭하기위한 primer PCM2-3F (CATGAAGCGGTTCATTTGGGAGT) 와 PCM2-3R (CTCACGCTCGACAAGGCGCTCTA) 을설계하였다. Cellulosimicrobium sp. YB-43의유전체 DNA를주형, PCM2-3F 와 PCM2-3R 을 primer 로하고 Pfu-X DNA polymerase 을사용하여 95 C에서 3분간처리후 95 C (25초), 60 C (40초), 72 C (2분) 의반응을 30회반복하고최종적으로 72 C에서 20 분간반응함으로써얻은유전자단편을 puc19에도입하고이를 Escherichia coli DH5α에형질전환하였다. Mannanase 활성을갖는형질전환주는 0.5% locust bean gum (LBG), trypan blue (80 μg/ml) 와 ampicillin (100 μg/ml) 이첨가된 LB 배지에서콜로니주변에형성된 LBG 분해환을관찰하여선발하였다. Mannanase 유전자의과잉발현및정제 Mannanase 유전자를과잉발현시키기위해 pet23a의 T7 promoter 하단에도입하여재조합플라스미드를제조하였다. Mannanase의 signal peptide를제거하고카르복시말단에 His-tag이연결되도록 pet23a(+) 의 NdeI과 XhoI 사이에유전자를도입하기위해 2종류의 primer PCM2-3EF (GTCCATATG GACGAAGCGACCACGGACGG; 밑줄은 NdeI 위치 ) 와 PCM2-3ER (AAACTCGAGGCTCGCCGAGCAGTCGACGA; 밑줄은 XhoI 위치 ) 을제조하였다. 이들 primer로증폭된유전자단편을 NdeI과 XhoI으로절단하여동일한효소로처리한 pet23a(+) 에도입하여재조합플라스미드 pcme3을제조하였다. 재조합플라스미드를 E. coli BL21(DE3) Codon Plus에도입한형질전환주를이용하여 His-tagged ManC (HtManC) 의유전자를과잉발현시키기위해서는평판배지에서자란콜로니를항생제를첨가한 LB에접종하여 37 C에서하룻밤진탕배양한후, 동일배지 300 ml을함유한 baffled flask에 1% 가되도록접종하고 37 C에서진탕배양하면서흡광도 (OD 600 ) 가 0.6에도달했을때 IPTG를 1.0 mm이되도록첨가하였다. 25 C에서 6시간추가로진탕배양하고배양액을원심분리하여얻은균체를 8 ml의 cell lysis buffer (50 mm NaH 2 PO 4, 300 mm NaCl, 10 mm imidazole, ph 8.0) 에현탁하여초음파파쇄한후원심 Korean Journal of Microbiology, Vol. 54, No. 2

3 128 Ki-Hong Yoon 분리하여균체파쇄상등액을회수하였다. 이를동일한완충액으로평형화시킨 Ni-NTA 컬럼에주입한후 washing buffer (50 mm NaH 2 PO 4, 300 mm NaCl, 20 mm imidazole, ph 8.0) 로세척하였다. HtManC를 300 mm imidazole을함유한완충액으로추출하고각분획의 mannanase 활성분석과 SDS-PAGE 분석을통해활성이높고단일단백질이포함된분획을골라 10 mm sodium phosphate 완충액 (ph 6.0) 에서투석하여정제효소로사용하였다. Mannanase 반응특성분석 Mannanase 활성을측정하기위해서는 0.5% LBG와 50 mm ph 완충액을포함한반응액에효소를혼합하여총부피를 1 ml 로하여 50 C에서 15분동안반응시켰다. DNS 용액 3 ml를첨가하여반응을정지시키고끓는물에서 5분동안방치하여발색시킨후 540 nm에서흡광도를측정하였다. 효소활성도 1.0 unit는위의조건에서 1분동안 LBG로부터 1 μmol의 mannose 에상응하는환원당을생성하는효소량으로정의하였다. 기질특이성을조사하기위해서 LBG, guar gum, oat spelt xylan과 carboxymethyl cellulose (CMC) 는 Sigma-Aldrich Co., konjac glucomannan (konjac) 와 ivory nut mannan (ivory nut) 은 Megazyme으로부터각각구매하였다. 반응온도와 ph가효소활성에미치는영향을조사하기위해서 C와 ph 의범위에서 mannanase 활성을각각측정하였다. ph 안정성은 ph 범위에서 mannanase 효소액을 1 시간동안방치한후잔존활성을조사하여결정하였다. 금속이온과화합물이효소활성에미치는영향을조사하기위해서는이들의최종농도가 5 mm이되도록반응액에첨가하고효소활성을측정하였다. 반응산물의분석 Mannan (0.5%) 또는 Megazyme으로부터구입한만노올리고당 (MOS; 0.5%) 과 20 mm sodium phosphate 완충액 (ph 7.5) 이포함된반응액에효소를과량첨가하여 40 C에서 5 시간동안반응을수행한후 95 C에서 3분동안열처리하고이를원심분리하였다. 반응상등액을적정량취해 n-propanol, nitromethane과증류수 [7:1:2, (v/v)] 혼합용액을전개용액으로하여 silica gel-precoated thin layer plate (Merck Kiesegel, No. 5748) 에서박층크로마토그래피 (TLC) 를수행한후가수분해산물을관찰하였다 (Yoon, 2016). 결과및고찰 Mannanase 유전자클로닝 Cellulosimicrobium sp. YB-43의 manb 유전자를포함하여주변위치의염기서열이결정된바있으며 manb 유전자의하부에동일한전사방향으로위치한 orf가아미노말단지역을포함하는유전자의일부로추정되었다 (KX620013). 완전한 orf는아니지만이로부터예상되는아미노산배열이다른 mannanase 와상동성을보였을뿐아니라 YB-43의배양상등액으로부터부분정제된 ManC의아미노말단배열을포함하고있었다. ManC를암호하는유전자로추측되는 orf를클로닝하기위해중합효소연쇄반응 (PCR) 용도의 primer를설계하였다. Upper primer PCM2-3F는 manc 유전자의상부지역으로추정되는 manb 유전자의하부염기서열을기반으로제조하였으며, 카르복실말단지역의해당하는염기서열은확인되지않았으므로 manb 유전자를포함하는지역과염기서열의상동성이높은 Cellulomicrobium sp. MM의유전체서열 (NZ_JPQW ) 을기반으로하여 lower primer PCM2-3R을설계하였다. PCM2-3F와 PCM2-3R을사용하여 PCR로증폭된유전자단편을정제하여직접염기서열을결정하고 HincII로절단된 puc19에도입하였다. 이를대장균에형질전환하여 LBG 분해활성을갖는형질전환주를얻었다. 형질전환주로부터추출한재조합플라스미드에삽입된단편의염기서열을결정한결과 PCR로증폭단편을사용하여결정된염기서열과동일하여클로닝된 manc 유전자는 PCR 증폭과정중변이가없었음이확인되었다. 클로닝된유전자의염기서열로부터 448 아미노잔기로구성된 ManC를암호하는 1,347 bp 크기의 manc 유전자가확인되었으며 (Fig. 1), manc는 manb와 104개 nucleotide가떨어져존재하였다. manc 유전자개시코돈으로부터 5 염기와각각떨어진상부지역에리보좀결합부위로추정되는 GAAGGA의서열이존재하였다. SignalP 4.1 프로그램으로 ManC의 signal peptide를조사한결과그람양성균을기준으로는아미노말단의 39개잔기가 signal peptide로예측되었고그람음성균을기준으로하였을때는 34개잔기의 signal peptide로예측되어서로달랐다. YB-43의배양상등액으로부터부분정제된 ManC 의아미노말단배열 (DEATTDGLH) 이 manc 유전자에서예측된 ManC의 40~48 번째아미노산잔기에해당하여그람양성균을기준으로 39개잔기의아미노말단이 signal peptide로예측된결과와일치하였다 (Yoon, 2015). 일반적으로 signal peptide의절단위치앞이 A-X-A로배열되어있는것으로알려졌으며 (Tjalsma and van Dijl, 2005), 그 미생물학회지제 54 권제 2 호

4 Cellulosimicrobium sp. 의 mannanase C 특성 129 Fig. 1. Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of manc gene. The amino acid deduced from the open reading frame is shown with the one-letter code below the nucleotide sequence. Putative ribosome binding site (SD) is depicted below the underlines and amino acids corresponding to the signal sequence are italicized. The catalytic domain and CBM2 are represented by single underline and double underline, respectively. The upper and lower primers are indicated by arrows in the start and end positions of complete nucleotide sequence. The numbers at the end of each line correspond to the nucleotide positions. 람양성균과그람음성균을기준으로각기다르게예측된 ManC 의 signal peptide 절단위치앞지점인 37~39번째와 32~34번째배열이 A-A-A로 A-L-A로각각나타나모두 A-X-A의배열과같았다. ManB의경우도 SignalP 4.1 프로그램으로그람양성균과그람음성균을기준으로예측된 signal peptide의길이가달랐지만, 절단위치앞은 A-X-A로배열되었으며재조합대장균에서정제된 ManB의아미노말단배열은그람음성균을기준으로예측된일치한것으로보고되었다 (Yoon, 2016). C. fimi의 mannanase는모균과재조합대장균에서생산되었을때아미노말단배열의길이가차이가있었으며재조합대장균에서생산된효소의아미노말단배열이 14 잔기를더포함한것으로알려졌다 (Stoll et al., 1999). 이와는달리모균과재조합대장균으로부터생산된 Bacillus subtilis WL-7의 mannanase 는아미노말단배열이동일하였다 (Kweun et al., 2004). Mannanase 유전자와단백질유전자염기서열로부터예측된아미노산배열에의해 ManC 는 GH5에속하는 mannanase의활성영역 (52~304) 과 CBM2 (352~445) 과높은상동성으로배열되어 ManB와유사하게다영역효소로확인되었으며, ManB는 CBM2 대신 2개의 CBM10 을포함하는것이차이가있었다. ManC의아미노산배열을미국 NCBI database에등록된다른효소와비교한결과 Cellulosimicrobium sp. MM (96%; WP_ ) 과 C. cellulans (94%; ARU50407) 의단백질과가장높은상동성을보였으며, 이외에는 Oerskovia sp. Root918 (KRD35857), C. funkei (KLN36010), Isoptericola dokdonensis DS-3 (ANC31527) 과 Nocardiopsis dassonvillei (WP_ ) 의단백질과는 60% 이하의상동성을나타냈다. 그러나이들은모두유전체염기서열에서유추된단백질에해당한것으로효소활성에대한연구는보고된바가없다. 기능이보고된효소중 ManC의활성영역과상동성이높은단백질의아미노산배열을비교한결과 Streptomyces sp. SirexAA-E (55.8%; 4FK9_A), S. thermoluteus (57.6%; BAM62868), S. lividans 1326 (48.8%; AAA26710), S. thermolilacinus (55.4%; BAK26781), C. funkei HY-13 (47.8%; AEE43708), Thermobifida fusca (56.3%; 1BQC_A) 와 Cellulosimicrobium sp. YB-43 (47%; KX620013) 의 mannanase 와 47~58% 의상동성을보였다 (Fig. 2). 이들중 S. thermoluteus (StManII) 와 S. thermolilacinus (StMan) 의 mannanase는 ManC 와같이 CBM2를포함하였으며, 이외에도 FN3 영역을추가적으로함유하였다 (Kumagai et al., 2011, 2013a). 그러나 ManC Korean Journal of Microbiology, Vol. 54, No. 2

5 130 Ki-Hong Yoon Fig. 2. Comparison of amino acid sequences in catalytic domains between ManC and other mannanases. The amino acid sequences of catalytic domains from eight mannanases including ManB (KX620013) and ManC (ManC) of Cellulosimicrobium sp. YB-43, Thermomonospora fusca mannanase (1BQC_A), S. lividans 1326 ManA (AAA26710), C. funkei HY-13 ManH (AEE43708), S. thermolilacinus StMan (BAK26781), and S. thermoluteus StManII (BAM62868) are aligned to maximize similarities with gaps (hyphens) by Clustal W method. Eight strictly conserved residues of GH5 mannanase for catalytic reaction are bold, and the boxed sequence indicates the putative calcium binding residues. Numbers at the beginning of each line correspond to the amino acid position in each mannanase. 의 CBM2의아미노산배열은이들효소와 25% 수준의낮은상동성을보였다. GH5 mannanase의아미노산배열중보존적으로보고된 8 개잔기가 ManC에서 Arg93, His129, Asn172, Glu173, His240, Tyr242, Glu269와 Trp298로확인되었으며이들중 Glu173와 Glu269는각각산염기작용활성잔기와친핵성활성잔기에해당한다 (Hilge et al., 1998). ManC의 280~282 번째아미노산잔기배열 (DED) 은 Streptomyces sp. SirexAA-E (Takasuka et al., 2014), S. thermoluteus (Kumagai et al., 2013a), S. lividans 1326 (Arcand et al., 1993) 및 Thermomonospora fusca (Hilge et al., 1998) 의 mannanase와같이 StMan의 Ca 2+ 과결합하는아미노산잔기로보고된 Asp285, Glu286, Asp287 잔기배열과동일하였다 (Kumagai et al., 2012, 2013b). 그러나 ManB 및 C. funkei HY-13 mannanase H (ManH) 의배열은차이가있었다. 재조합대장균이생산하는 mannanase 의정제 manc 유전자를재조합대장균에서과잉발현하기위해 signal peptide 영역에해당하는부분을제거한유전자를 pet23a의 T7 promoter 하단에도입하였으며, 이와동시에효소의정제과정을간편화하기위해종결코돈을제거하고카르복시말단에 His tag이융합되도록하였다. 이렇게제조된재조합플라스미드 pcme3을 E. coli BL21 (DE3) 과희소 trna 유전자가도입된 E. coli BL21 (DE3) Codon Plus에각각형질전환하여 IPTG로 HtManC의유전자를과잉발현한결과 E. coli BL21 (DE3) Codon Plus의형질전환주에서 mannanase 생산성이높았으나, 다른단백질의과잉발현정도에비해낮았다. 이는 manc 유전자의 GC 함량이 70% 이상이므로대장균에서 ManC 의생합성효율이낮기때문으로추정된다. 또한 IPTG 첨가후 37 C에서배양하였을때는발현된단백질이대부분불용성단백질로존재하였으며, IPTG를첨가한후 25 C로배양하였을때는수용성단백질로발현된 mannanase의양이증가한것으로나타났다. 재조합대장균에서생산된 HtManC를 Ni-NTA 컬럼크로마토그래피로정제한결과분자량이약 49 kda로확인되었다 미생물학회지제 54 권제 2 호

6 Cellulosimicrobium sp. 의 mannanase C 특성 131 (Fig. 3). manc 유전자의염기서열로부터예상되는 HtManC 의분자량은융합된 6개의 His을합쳐서 45.2 kda로추정되었으나정제된 HtManC는 SDS-PAGE에서는이보다큰분자량을보였다. 재조합대장균균체에서정제된 ManB도예상되는분자량은 41.5 kda였지만 SDS-PAGE에서약 45 kda로관찰된바있다 (Yoon, 2016). 한편 C. funkei HY-13 의배양상등액으로부터정제된 mannanase K (ManK) 의아미노말단배열 (DEATTDGLHVVDD) 이보고되었으며이는 manc 유전자로부터예측된 ManC 아미노말단의아미노산잔기배열 DEATTDGLHVVDG에해당하며한개잔기만을제외하고 Fig. 3. SDS-PAGE of the purified HtManC from recombinant E. coli. Lanes: P, the purified enzyme; M, the molecular weight markers. 일치하는것으로나타났다 (Kim et al., 2011b). ManK의유전자에대한보고는없으나 ManK의아미노말단의잔기배열이 ManC와거의동일한것으로보아이들효소간에유사도가매우높을것으로예상되는데 ManK의분자량은 35 kda로밝혀져차이가매우컸다. 이러한분자량의차이는유전자의차이일수도있지만생산된단백질이분해되어카르복실말단부위가절단된상태로정제되었을수도있다고추측된다 (Takasuka et al., 2014). 정제된 HtManC를사용하여반응온도와 ph가효소활성에미치는영향을조사한결과 ph 7.5에서활성이가장높았으며사용된완충용액의종류에따라활성에차이를보였지만 ph 7.5~10 범위에서거의활성에차이가없이최대활성을보였다 (Fig. 4A). ph 11에서도최대활성의 50% 이상의활성을보여알칼리조건에서활성이높은것이확인되었으며 ph 6.0에서는최대활성의 50% 수준의활성을보이고 ph 5.0에서는활성이 15% 이하로급격히감소하였다. HtManC의최적반응온도는 65 C로나타났으며 (Fig. 4B), 이는 YB-43으로부터생산된 ManC의최적반응조건인 65 C와 ph 7.5의결과와일치하였고 (Yoon, 2015) 55 C와 ph 6.5~7.0에서최대활성을보이는 ManB와는차이가있었다. ManH는 50 C와 ph 6.0, ManK는 50 C와 ph 7.0에서최대활성을나타내어 HtManC와는차이가있었다 (Kim et al., 2011a, 2011b). ph 3.0~12 범위에서 HtManC를 1시간방치한후에잔존활성을조사한결과 ph 5.0~11의범위에서는전혀감소되지않고활성을유지하였으며 ph 4에서는매우미약하게실활되었다 (Fig. 4A). 또한 ph 11.5에서는 94.6% 잔존활성을보여 ph 4.0~11.5 범위에서안정하게유지하였으며이는 YB-43의배 (A) (B) Fig. 4. ph and temperature profiles for activity and stability of the purified HtManC. (A) The ph profiles were obtained by measuring the mannanase activities at various ph s with a constant temperature of 55 C. ph stability (- -) was determined by measuring the residual activities after pre-incubation for 1 h at 4 C. Buffers (50 mm) used were as follows: sodium citrate (- -, ph 5 6), sodium phosphate (- -, ph 6 8), Tris (- -, ph 8 9), KCl-borate (- -, ph 9 11), and NaOH-sodium phosphate. (B) Temperature profiles (- -) were obtained by measuring the mannanase activities at different temperatures with a fixed ph 7.5. Thermostability (- -) was determined by measuring the residual activities after pre-incubation for 30 min at different temperatures. Each curve represents the average of three independent experiments within standard errors of 2% among them. Korean Journal of Microbiology, Vol. 54, No. 2

7 132 Ki-Hong Yoon 양상등액에서부분정제된 ManC와유사하였다. HtManC보다알칼리조건에서활성이나안정성이우수한효소로알려진 B. halodurans PPKS-2의 mannanase는 ph 11과 70 C에서최대활성을보였으며 (Vijayalaxmi et al., 2013), Streptomyces sp. CS428의 mannanase는 ph 12.5와 60 C에서최대활성을보이고 ph 5~12.5 범위에서 24시간방치하였을때 89% 이상의잔존활성을유지하였다 (Pradeep et al., 2016). 열안정성을조사하기위해 30~55 C 범위에서 30분간방치한후에잔존활성을조사하였다. 30 C에서도 5% 이상실활되었으며, 50 C 이상에서는급격히실활되었다 (Fig. 4B). 45 C 와 50 C에서시간을달리하여방치한후잔존활성을조사한결과 45 C에서는 60분방치하였을때 57% 잔존활성을보였으며, 50 C에서 20분방치하였을때 44% 의잔존활성을보였다 ( 결과미제시 ). ManB의경우 50 C에서 30분간방치후에도 60% 이상의활성을유지하는것으로보고되었는데이로보아 ManC는 ManB에비해열안정성이낮은것을알수있었다. S. lividans 66의 mannanase는 38 C 이하에서는안정하고 42 C 에서반감기가약 4시간이며 58 C에서 15분내에실활되어 HtManC와유사한수준으로판단되었다 (Arcand et al., 1993). 금속이온을비롯한여러화합물을 5 mm로첨가한상태에서 HtManC의활성을분석한결과 EDTA, Fe 3+ 와 Cu 2+ 에의해활성이 10~20% 정도감소하였으며 Ca 2+, Mg 2+, Co 2+ 와 Na + 에의해서도약간감소하였다. Fe 2+, Zn 2+, K + 를포함하여 SDS와 dithiothreitol (DTT) 에의해서활성이증가하였으며특히 DTT 에의해 HtManC의활성이 1.7배수준으로크게증가하였다 (Table 1). SDS와 DTT의농도를 0~20 mm (2.5, 5.0, 10, 15, 20 mm) 범위로하여활성을조사한결과 2.5 mm의농도에서 SDS는약 1.2 배, DTT는약 1.8배로각각 HtManC의활성을가장높게증가시켰으며, 첨가량이증가할수록활성의증가정도는감소하는경향을보였다. SDS의경우 20 mm을첨가하였을때 HtManC의활성이 SDS를첨가하지않았을때보다 미약하게증가하였고 DTT는 20 mm 첨가한상태에서도약 1.7배증가하였다. HtManC는 4개의 cysteine 잔기를포함하고있는데 DTT가 cysteine 잔기간에 disulfide 결합의형성을방지하거나또는 HtManC가다량체로응집되지않도록하여활성이증진되었을가능성이있다. Trichoderma harzianum의 mannanase는 DTT (20 mm) 에의해약 3.2배활성이증가하여 HtManC 보다높은증가율을보였다 (Ferreira and Filho, 2004). 한편 SDS는단백질형태를변화시켜대부분의효소에서활성을감소시키는효과를보이지만, 일부의효소는일정한농도의 SDS가존재해도단백질의 2차구조가변화하지않고외부표면에결합된 SDS에의해단백질형태에제한적으로미세한변화가일어남으로써효소활성이증가하는것으로밝혀졌다 (Moore and Flurkey, 1990). HtManC의활성이 SDS에의해증가된것도이러한현상과관련이있을것으로추정된다. 금속이온이효소활성에미치는영향은효소에다양한양상을보이는데, ManB의활성은 Cu 2+, Zn 2+, Mn 2+ 이온과 EDTA 및 SDS에의해활성이크게감소하였으며 SDS에의해활성이감소한정도는 35% 이상으로 HtManC와는크게달랐다. ManH도 Cu 2+, Zn 2+ 와 EDTA에의해크게저해되었으며, ManK 는 SDS에의한결과는없었으나 Tween 80 (0.5%) 과 Triton X-100 (0.5%) 에의해약간증가하는것으로보고되었다 (Kim et al., 2011b). 재조합대장균으로부터정제된 StMan 은 HtManC 와는다르게 EDTA에의해활성이대부분저해되며 Ca 2+ 과 Mg 2+ 이효소활성에필요하였으며 (Kumagai et al., 2011), Streptomyces sp. CS147의 mannanase는 Ca 2+ 에의해크게활성이증진되지만 Mg 2+ 에의해서는저해되는것으로보고되었다 (Yoo et al., 2015). 최적반응조건에서 LBG를기질로하여 1.7~6.7 mg/ml의농도범위에서 HtManC의초기반응속도를구해 Lineweaver- Burk plot에서 Vmax와 Km 값을결정한결과 68.0 U/mg과 0.45 mg/ml로측정되었다. 다른효소들과비교하였을때최대 Table 1. Effects of metal ions and other reagents on the HtManC activity Effector (5 mm) Relative activity (%) Effector (5 mm) Relative activity (%) None 100 ± 0.2 HgCl ± 0.0 KCl ± 0.2 MnCl ± 1.0 NaCl 92.5 ± 0.9 MgCl ± 1.4 CaCl ± 0.2 NiCl ± 0.3 CoCl ± 0.9 ZnCl ± 0.7 CuCl ± 0.1 Dithiothreitol ± 0.7 FeCl ± 0.4 EDTA 81.8 ± 0.3 FeCl ± 1.0 SDS ± 2.0 미생물학회지제 54 권제 2 호

8 Cellulosimicrobium sp. 의 mannanase C 특성 133 반응속도는 StMan 보다약간높았으나그외의효소에비해서낮았으며기질친화도는비교적높은것으로나타났다 (Table 2). 기질특이성과최종가수분해산물기질특이성을비교하기위해여러다당류를기질로하여반응을실시한결과 HtManC는 mannan을분해하였으며 CMC 와 para-nitrophenyl-β-mannopyranoside를분해하지못하였고 oat spelt xylan은매우미약하게분해하였다. Table 3에보인바와같이 HtManC는 ManB 및 StManII와유사하게 konjac glucomannan에대한활성이가장높았으며, guar gum에대한활성은 LBG에비해 54.2% 수준으로 YB-43의배양상등액에서부분정제된 ManC (57%) 및 StManII 와유사하였고 ManK와 Paenibacillus sp. CH-3의 mannanase B 보다는낮았다 (Zhang et al., 2017). Ivory nut에대한활성은 StManII와유사한수준으로나타났다 (Kumagai et al., 2013a). 한편 LBG를기질로하였을때 HtManC (48.9 U/mg) 의비활성은 ManH (8,498 U/mg), ManK (7,109 U/mg) 와 Streptomyces sp. S27의 Man5S27 (2,107 U/mg) 에비해매우낮았으며 (Shi et al., 2011), StMan (61 U/mg) 과 Thermobifida fusca의 mannanase (TfMan; 114 U/mg) 에비해서도낮았다 (Kumagai et al., 2011). 특히 HtManC의아 미노말단이 ManK와유사한것으로확인되었는데도불구하고비활성에는매우큰차이를보였다. 최종반응산물을조사하기위해과량의 HtManC를사용하여 mannan과 MOS를가수분해한후반응액을 TLC로분석하였다. Figure 5A에보인바와같이 HtManC 는 mannobiose (M2) 를분해하지못하였으며 mannotriose (M3) 를소량만분해하였다. Mannotetraose (M4) 이상의중합도를갖는 MOS의주된분해산물은 M2와 M3로확인되었으며적은양의 mannose가생성되었다. 한편 ManB는 HtManC와동일하게 M2를분해하지못하며 M3의이상의중합도를갖는 MOS의분해능이높았으나주된반응산물로 M2가생성되었으며미량의 mannose와 M3가생성되어 HtManC와차이가있었다. ManH는 MOS의주요분해산물로 M2와 M3를생성하며 mannose도미량생성하여 HtManC와유사하였으며이와더불어당전이활성을갖는것으로보고되었다 (Kim et al., 2011a). 그러나 ManK는 M3 을분해하지못하였고 M4와 mannopentaose (M5) 의분해산물로 M2와 M3 및 M4가관찰되었고 mannose는생성되지않아 HtManC와는달랐다 (Kim et al., 2011b). HtManC에의한 LBG, konjac과 ivory nut의분해산물로 M2와소량의 mannose가공통적으로관찰되었으며, LBG에 Table 2. Kinetic parameters of mannanase for LBG Mannanases Vmax (U/mg) Km (mg/ml) References Cellulosimicrobium sp. YB-43 (HtManC) This study S. lividans Arcand et al. (1993) S. thermolilacinus (StMan) Kumagai et al. (2011) Streptomyces sp. S27 (Man5S27) 3, Shi et al. (2011) Streptomyces sp. CS Yoo et al. (2015) Streptomyces sp. CS428 5, Pradeep et al. (2016) T. fusca RC14071 (TfMan) Kumagai et al. (2011) Table 3. Comparison of hydrolyzing activity for mannans between HtManC and others Substrates Relative activity (%) of HtManC a ManB b ManH c ManK d PaManB e StManII f LBG Konjac ND ND Guar gum Ivory nut 43.4 ND ND ND 40.3 ND, not determined. a HtManC of Cellulosimicrobium sp. YB-43 in this study b ManB of Cellulosimicrobium sp. YB-43 (Yoon, 2016) c ManH of Cellulosimicrobium sp. HY-13 (Kim et al., 2011a) d ManK of Cellulosimicrobium sp. HY-13 (Kim et al., 2011b) e ManB of Paenibacillus sp. CH-3 (Zhang et al., 2017) f StManII of S. thermoluteus (Kumagai et al., 2013a) Korean Journal of Microbiology, Vol. 54, No. 2

9 134 Ki-Hong Yoon (A) (B) 의배양상등액으로부터정제된 ManC와유사한것으로확인되었고 YB-43의또다른 mannanase인 ManB와는차이가있었으며, 아미노말단의서열이유사한 C. funkei HY-13의 ManK 와는반응특성의유사성이높지않은것으로밝혀졌다. 적요 Fig. 5. Thin-layer chromatogram of hydrolysis products of β-1,4-linked mannooligosaccharides and mannans with the purified HtManC. The reaction mixtures containing the purified HtManC and MOSs or mannanas, in 20 mm sodium phosphate buffer (ph 7.5) were incubated for 5 h at 40 C, respectively. MO of (A) and (B) stands for a standard mixture of mannose (M1) and MOSs consisting of mannobiose (M2), mannotriose (M3), mannotetraose (M4), mannopentaose (M5), and mannohexaose (M6). (A) Lanes M2 to M6 represent each hydrolyzate of mannobiose to mannohexaose. (B) LG, IN, GG and Kn stand for hydrolyzates of locust bean gum, ivory nut, guar gum and konjac, respectively. 서는 M4, ivory nut에서는 M3가추가적으로관찰되었다 (Fig. 5B). Konjac의가수분해산물중에는 mannose, M2 뿐아니라여러종류의올리고당이관찰되었는데이는 konjac이 glucose 와 mannose가 β-1,4 결합을하고있으며 HtManC가 mannose 간의결합만을가수분해하기때문에 glucose와 mannose로구성된다양한올리고당이생성된때문으로보인다. 한편 guar gum에대한활성도가 LBG에비해 54% 수준에이르는데도불구하고 guar gum의분해산물이 TLC에서거의관찰되지않았는데이는 guar gum 분해산물의중합도가높아 TLC에서해리될수준으로이동하지못한때문으로판단되며이러한현상은 ManB의가수분해산물에서도동일하게나타난바있다. 한편 ManH에의한 LBG 분해산물로는 M5가가장많았으며 mannohexaose (M6) 와 mannoheptaose도상당량존재하였으며, ivory nut의분해산물로는 M3~M6가다량생성되었으며 M4가가장많은것으로보고되었다. ManK는 LBG로부터 M2 와 M5를주로생성하였으며, ManB는 LBG의분해산물로다량의 M2와소량의 mannose 및 M6와이동도가유사한 MOS 도생성하였다. StMan과 TfMan에의한 LBG의가수분해산물에서도 M2가다량존재하였으며이외에 StMan에의해다량의 M3와함께 M4와 M5도생성되었으나 mannose는생성되지않았고, TfMan에의해서는 M3, M5와함께매우적은양의 mannose가생성되었다 (Kumagai et al., 2013a). 본연구를통해밝혀진 ManC의아미노산배열은기능이보고된기존의 mannanase와상동성이 50% 미만의수준으로낮았다. 또한재조합대장균에서생산된 HtManC의반응특성과안정성및가수분해산물을비교하였을때 HtManC는 YB-43 여러종류의 mannanase를생산하는 Cellulosimicrobium sp. YB-43으로부터 mannanase B를암호하는 manb 유전자와효소의특성이보고된바있다. Mannanase C (ManC) 로명명한효소의유전자가 manb 유전자의하류에위치한것으로예상되어이를중합효소연쇄반응으로클로닝하여 manc 유전자의염기서열을결정하였다. ManC는 448 아미노산잔기로구성된것으로확인되었으며 glycosyl hydrolase family 5에속하는 mannanase와상동성이높은활성영역과탄수화물결합영역 (CBM2) 이존재하였다. ManC의활성영역은 Streptomyces sp. SirexAA-E (55.8%; 4FK9_A) 및 S. thermoluteus (57.6%; BAM62868) 의 mannanase와아미노산배열의상동성이 55% 이상으로가장높았다. Signal peptide 영역이제거되고카르복실말단에 hexahistidine이연결되도록제조한 His-tagged ManC (HtManC) 의유전자를재조합대장균에서발현하여균체파쇄액으로부터 HtManC를정제하였다. HtManC은65 C 와 ph 7.5에서최대활성을보였으며 ph 7.5~10범위에서활성에큰변화가없었다. HtManC는 locust bean gum (LBG) 과 konjac에대한분해활성이 guar gum과 ivory nut mannan (ivory nut) 에비해높았다. 최적반응조건에서 LBG를기질로하여반응동력학적계수를측정한결과 Vmax와 Km이 68 U/mg과 0.45 mg/ml로나타났다. HtManC 에의한만노올리고당 (MOS) 과 mannan의분해산물을 TLC로관찰한결과 mannobiose 보다중합도가큰 MOS로부터 mannobiose와 mannotriose가주된분해산물로생성되었다. 또한 LBG, konjac과 ivory nut의분해산물로 mannobiose와소량이 mannose가공통적으로관찰되었다. 감사의말 이연구는 2018년도우송대학교교내학술연구조성비지원에이해이루어진것임. 미생물학회지제 54 권제 2 호

10 Cellulosimicrobium sp. 의 mannanase C 특성 135 References Arcand, N., Kluepfel, D., Paradis, F.W., Morosoli, R., and Shareck, F β-mannanase of Streptomyces lividans 66: cloning and DNA sequence of the mana gene and characterization of the enzyme. Biochem. J. 290, Dhawan, S. and Kaur, J Microbial mannanases: an overview of production and applications. Crit. Res. Biotechnol. 27, Ferreira, H.M. and Filho, E.X.F Purification and characterization of a β-mannanase from Trichoderma harzianum strain T4. Carbohydr. Polym. 57, Hilge, M., Gloor, S.M., Rypniewski, W., Sauer, O., Heightman, T.D., Zimmermann, W., Winterhalter, K., and Piontek, K Highresolution native and complex structures of thermostable β- mannanase from Thermomonospora fusca - substrate specificity in glycosyl hydrolase family 5. Structure 6, Kim, D.Y., Ham, S.J., Lee, H.J., Cho, H.Y., Kim, J.H., Kim, Y.J., Shin, D.H., Rhee, Y.H., Son, K.H., and Park, H.Y. 2011a. Cloning and characterization of a modular GH5 β-1,4-mannanase with high specific activity from the fibrolytic bacterium Cellulosimicrobium sp. strain HY-13. Bioresour. Technol. 102, Kim, D.Y., Ham, S.J., Lee, H.J., Kim, Y.J., Shin, D.H., Rhee, Y.H., Son, K.H., and Park, H.Y. 2011b. A highly active endo-β -1,4-mannanase produced by Cellulosimicrobium sp. strain HY-13, a hemicellulolytic bacterium in the gut of Eisenia fetida. Enzyme Microb. Technol. 48, Kumagai, Y., Kawakami, K., Mukaihara, T., Kimura, M., and Hatanaka, T The structural analysis and the role of calcium binding site for thermal stability in mannanase. Biochimie 94, Kumagai, Y., Kawakami, K., Uraji, M., and Hatanaka, T. 2013a. Binding of bivalent ions to actinomycete mannanase is accompanied by conformational change and is a key factor in its thermal stability. Biochim. Biophys. Acta 1834, Kumagai, Y., Kawakami, K., Uraji, M., and Hatanaka, T. 2013b. Effect of the binding of bivalent ion to the calcium-binding site responsible for the thermal stability of actinomycete mannanase: Potential use in production of functional mannooligosaccharides. J. Mol. Cataly. B: Enzym. 94, Kumagai, Y., Usuki, H., Yamamoto, Y., Yamasato, A., Arima, J., Mukaihara, T., and Hatanaka, T Characterization of calcium ion sensitive region for β-mannanase from Streptomyces thermolilacinus. Biochim. Biophys. Acta 1814, Kweun, M.A., Lee, M.S., Choi, J.H., Cho, K.H., and Yoon, K.H Cloning of a Bacillus subtilis WL-7 mannanase gene and characterization of the gene product. J. Microbiol. Biotechnol. 14, Moore, B.M. and Flurkey, W.H Sodium dodecyl sulfate activation of a plant polyphenoloxidase. Effect of sodium dodecyl sulfate on enzymatic and physical characteristics of purified broad bean polyphenoloxidase. J. Biol. Chem. 265, Oda, M., Inaba, S., Kamiya, N., Bekker, G.J., and Mikami, B Structural and thermodynamic characterization of endo-1,3-β -glucanase: Insights into the substrate recognition mechanism. Biochim. Biophys. Acta 1866, Pradeep, G.C., Cho, S.S., Choi, Y.H., Choi, Y.S., Jee, J.P., Seong, C.N., and Yoo, J.C An extremely alkaline mannanase from Streptomyces sp. CS428 hydrolyzes galactomannan producing series of mannooligosaccharides. World J. Microbiol. Biotechnol. 32, 84. Schumann, P., Weiss, N., and Stackebrandt, E Reclassification of Cellulomonas cellulans (Stackebrandt and Keddie 1986) as Cellulosimicrobium cellulans gen. nov., comb. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, Shi, P., Yuan, T., Zhao, J., Huang, H., Luo, H., Meng, K., Wang, Y., and Yao, B Genetic and biochemical characterization of a protease-resistant mesophilic β-mannanase from Streptomyces sp. S27. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, Srivastava, P.K. and Kapoor, M Production, properties, and applications of endo-β-mannanases. Biotechnol. Adv. 35, Stoll, D., Stalbrand, H., and Warren, R.A Mannan-degrading enzymes from Cellulomonas fimi. Appl. Environ. Microbiol. 65, Takasuka, T.E., Acheson, J.F., Bianchetti, C.M., Prom, B.M., Bergeman, L.F., Book, A.J., Currie, C.R., and Fox, B.G Biochemical properties and atomic resolution structure of a proteolytically processed beta-mannanase from cellulolytic Streptomyces sp. SirexAA-E. PLoS One 9, e Tjalsma, H. and van Dijl, J.M Proteomics-based consensus prediction of protein retention in a bacterial membrane. Proteomics 5, Vijayalaxmi, S., Prakash, P., Jayalakshmi, S.K., Mulimani, V.H., and Sreeramulu, K Production of extremely alkaliphilic, halotolerent, detergent, and thermostable mannanase by the free and immobilized cells of Bacillus halodurans PPKS-2. Purification and characterization. Appl. Biochem. Biotechnol. 171, Walia, A., Mehta, P., Guleria, S., and Shirkot, C.K Modification in the properties of paper by using cellulase-free xylanase produced from alkalophilic Cellulosimicrobium cellulans CKMX1 in biobleaching of wheat straw pulp. Can. J. Microbiol. 61, Yoo, H.Y., Pradeep, G.C., Lee, S.K., Park, D.H., Cho, S.S., Choi, Y.H., Yoo, J.C., and Kim, S.W Understanding β-mannanase from Streptomyces sp. CS147 and its potential application in lignocellulose based biorefining. Biotechnol. J. 10, Yoon, K.H Characterization of two β-mannanases from Cellulosimicrobium sp. YB-43. Korean J. Microbiol. 51, Yoon, K.H Molecular cloning and characterization of β-mannanase B from Cellulosimicrobium sp. YB-43. Korean J. Microbiol. 52, Zhang, J.X., Chen, Z.T., Meng, X.L., Mu, G.Y., Hu, W.B., Zhao, J., and Nie, G.X Gene cloning, expression, and characterization of a novel β-mannanase from the endophyte Paenibacillus sp. CH-3. Biotechnol. Appl. Biochem. 64, Korean Journal of Microbiology, Vol. 54, No. 2