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영학 양
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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(2): (2016) ISSN / eissn 연구논문 Alteromonas sp. SH-1 균유래의 α-agarase 의특성조사 이솔지 1, 신다영 2, 김재덕 3, 이동근 1,2, 이상현 1,2,3 * Characterization of α-agarase from Alteromonas sp. SH-1 Sol-Ji Lee 1, Da-Young Shin 2, Jae-Deog Kim 3, Dong-Geun Lee 1,2, and Sang-Hyeon Lee 1,2,3 * Received: 11 November 2015 / Revised: 7 April 2016 / Accepted: 13 June The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering 1 신라대학교일반대학원바이오과학과 1 Department of Bioscience, Graduate School, Silla University, Busan , Korea Tel: , Fax: slee@silla.ac.kr 2 신라대학교제약공학과 2 Department of Pharmaceutical Engineering, Silla University, Busan , Korea 3 신라대학교일반대학원그린화학융합공학과 3 Department of Green-Chemistry Convergence Engineering, Silla University, Busan , Korea Abstract: A novel agar-degrading marine bacterium, SH-1 strain, was isolated from seashore of Namhae at Gyeongnam province, Korea. The SH-1 strain exhibited 98% similarity with Alteromonas species based on 16S rdna sequencing and named as Alteromonas sp. SH-1. Alteromonas sp. SH-1 showed agarase activity of U/L (1.67 U/mg protein). The molecular masses of the enzymes were predicted as about 85 kda and 110 kda by SDS-PAGE and zymogram. The enzymatic activity was optimal at 30 o C and the relative agarase activity was decreased as temperature increase from 30 o C and thus about 90% and 70% activities were shown at 40 o C and 50 o C, respectively. The optimum ph was 6.0 for agarase activity in 20 mm Tris-HCl buffer and activities were less than 70% and 85% activity at ph 5.0 and ph 7.0, respectively, compared with that at ph 6. Agarase activity has remained over 90% at 20 o C after 1.5 hour exposure at this temperature. However, its activity was less than 60% at 30 o C after 0.5 h exposure at this temperature. The enzymes produced agarooligosaccharides such as agaropentaose and agarotriose from agarose, indicating that the agarases are α-agarases. Thus, Alteromonas sp. SH-1 and its agarases would be useful for the industrial production of agarooligosaccharides which are known as having anticancer and antioxidation activities. Keywords: α-agarase, agaropentaose, agarooligosaccharide, Alteromonas sp. SH-1, marine derived bacterium 1. INTRODUCTION 한천 (agar) 은 galactose 와 galactopyranose 의중합체로, 홍조류의세포벽구성성분인점질성의난소화성복합다당류이다 [1,2]. 한천은 3,6-anhydro-α-L-galactopyranosyl-(1,3)-D-galactopyranose 가 β-1,4 결합으로연결된 heteropolymer 형태의 D, L-galactan 인 agarose (70%) 와 sulfate esters, pyruvate acetal 과 methyl ethers 등에의해수식된 3,6-anhydro-α-L-galactose 가존재하는 agaropectin (30%) 으로구성되어있다 [3-5]. 한천은가공시켜미생물배양배지의고형제로사용되거나순수한 agarose 만을분리정제하여분자생물학적연구에서전기영동의 gel 을제조할때에도사용된다 [6,7]. 국내에서는한천의생산량이수천톤에달하고있어풍부한수산자원중하나이다. 하지만대부분의한천은방치되고있으며, 전체생산량의 6.5% 정도만단순가공처리되어값싼원료로사용된다. 현재까지보고된대부분의한천분해효소는 30~45 o C 의온도와수소이온농도가중성인영역에서높은활성을나타내며, α-agarase 와 β-agarase 의 2 종류를포함하고있다 [7]. 한천올리고당 (agarooligosaccharides) 은한천의효소적분해에의해생성되는것으로 α-agarase 는 agarooligosaccharides 를생산하고, β-agarase 는 neoagarooligosaccharides 를생산한다고알려져있다. 한천올리고당은미백, 보습, 항산화및항암효

2 114 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(2): (2016) 과등여러가지유용한기능을가지고있다. 또한난소화성으로비만, 변비, 당뇨병치료등에도사용된다 [8,9]. 따라서한천분해효소를생산하는미생물과한천분해효소에대한연구가많이진행되어왔는데 Saccharophagus degradans 2-40 [10], Acinetobacter sp. AG LSL-1 [11], Flammeovirga yayeyamensis YT [12], Streptomyces coelicolor A3(2) [13], Glaciecola sp. SL-12 [14] 및 Thalassomonas sp. SL-5 [2] 등이보고되어있으며, 기존한천분해효소의인공적진화 (artificial evolution) 를통한효소활성의개선 [15] 등이보고되는등한천분해균주와한천분해효소에대한많은연구가있다. 본연구에서는국내연안의해수로부터한천분해능이뛰어난해양미생물을분리및동정하였고, 분리한해양미생물이생산하는한천분해효소의생화학적특성을조사하고산업적이용가능성을제시하고자하였다. 2. MATERIALS AND METHODS 2.1. 한천분해균주의분리및동정경상남도남해군미조면연안에서채취한해수의해양미생물을분리하기위하여증균용배지로사용되는 Marine agar 2216 (Difco, Detroit, USA) 배지에도말하고, 30 o C 에서배양하였다. 한천분해활성에의해 Marine agar 2216 배지를함몰시키는 SH-1 균주를선별하였고 3 차례이상순수분리하여한천분해능을확인하였다. 순수분리한균주를 Marine broth 2216 배지 4 ml 에접종한후 30 o C, 250 rpm 의조건에서하루동안배양한뒤원심분리 (3000 g, 4 o C, 15 min) 하여균체를회수하였다. 회수한균체는 Wizard Genomic DNA isolation Kit (Promega, Madison, WI, USA) 를이용하여 genomic DNA 를획득하였고, 이를 PCR 반응의주형으로사용하여 16S rdna 유전자단편을증폭하였다. PCR primer 로는 27F (5 - AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3 ) 와 1492R (5 -TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T-3 ) 을사용하였으며, 증폭된 DNA 단편은 PCR/Gel Combo Kit (NucleoGen, Siheung, Korea) 로정제하였다. DNA 염기서열분석은 Cosmogenetech (Seoul, Korea) 에서수행하였다. 분석된염기서열은 BLAST 를사용하여보고된균주들과의유사도를검토하였으며, Clustal 프로그램 (ClustalW2) 을이용하여다중염기배열 (multiple alignment) 을수행한후 Neighbor-joining method 와 Bootstrap method (n=1,000) 로분석하여계통분류학적위치를파악하였다 분리균주의생장과한천분해효소활성측정 0.2% agar 가첨가된 Marine broth 2216 배지 (ph 7.6) 50 ml 에균주를접종하고 30 o C, 250 rpm 에서 6 일간배양하였다. 분리된균주의생장과한천분해효소활성을확인하기위하여 12 시간마다일부배양액을채취하여측정에사용하였다. 생장양상은 600 nm 의파장에서흡광도로측정하였고효소 활성은아래의 2.4. 효소활성측정 을따랐다 조효소액의제조 Marine broth 2216 배지 4 ml 에순수분리한 SH-1 균주를접종한후진탕배양기를이용하여 30 o C, 250 rpm 에서 1 일간배양하였다. 배양액은 0.2% agar 가첨가된 Marine broth 2216 배지 50 ml 에계대한후진탕배양기를이용하여 30 o C, 250 rpm 에서 3.5 일간배양하였다. 배양후원심분리 (3000 g, 4 o C, 15 min) 하여얻어진상층액을 SnakeSkin Dialysis Tubing (Thermo Scientific, USA) 에넣은후 900 ml 의 20 mm Tris- HCl (ph 7.0) 완충용액을이용하여 4 o C 에서 3 회투석을수행하였다. 투석은 2 시간마다 20 mm Tris-HCl (ph 7.0) 완충용액을한번씩교체하는것을 2 번반복한후 3 회째에는 12 시간이상시행하였다. 투석후제조된조효소액은 membrane filter (0.45 µm, Millipore, USA) 를통과시킨후사용할때까지 4 o C 에서냉장보관하였다 효소활성측정한천분해효소의활성은 DNS법을이용하여측정하였으며, DNS법은 3,5-dinitrosalicylic acid method의변법으로실시하였다 [16]. DNS 용액은 NaOH 13.2 g, 3,6-dinitrosalicylic acid 7.07 g, sodium sulfate 5.53 g, potassium tartrate (Rochelle salt) g, phenol 5.07 g을증류수 1 L에녹여서제조하였다. 1 ml의조효소반응액에 3 ml의 DNS 용액을첨가하여 100 o C 에서 10분간가열한후 550 nm의파장에서흡광도를측정하였다. 표준적정곡선으로는 D-galactose를사용하였고, 한천분해효소의활성은 1분당 1 µmol의 galactose를생산하는효소의양을 1 unit (U) 으로정의하였다. 조효소액에함유되어있는총단백질의양은 Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, USA) 를이용하여실시하였다 한천분해효소의최적온도측정조효소액을이용하여온도에따른한천분해활성을비교하였다. 표준기질용액으로는 0.2% (w/v) 의 agarose 가포함된 20 mm Tris-HCl (ph 6.0) 완충용액을이용하였다. 기질용액을중탕가열한후온도별 (20~70 o C) 로냉각하였다. 처리된기질용액 1.0 ml 에조효소액 0.5 ml 를첨가하여 20~70 o C 의각온도에서 30 분간반응시킨후한천분해효소의활성을측정하였다 한천분해효소의최적 ph 측정 ph에따른한천분해효소의활성을측정하기위하여 20 mm sodium acetate 완충용액 (ph 4.0~5.0), 20 mm Tris-HCl 완충용액 (ph 5.0~8.0), 20 mm GTA (3,3-dimethyl-glutamic acid, Tris (hydroxymethyl)-aminomethane, 2-amino-2-methyl-1,3-propanediol) 완충용액 (ph 8.0~9.0) 을이용하였다. 최종농도 0.2% (w/v) 의 agarose가포함된세가지완충용액을중탕가열한후 30 o C까지냉각하고반응수조의온도를유지하면서완충용액 1.0 ml에조효소액 0.5 ml를첨가하여 30분간반응시킨

3 Alteromonas sp. SH-1 균유래의 α-agarase 의특성조사 115 후한천분해효소의활성을측정하였다 한천분해효소의열안정성측정한천분해효소의열안정성을측정하기위하여표준기질용액으로는 0.2% (w/v) 의 agarose 가포함된 20 mm Tris-HCl (ph 6.0) 완충용액을이용하였다. 조효소액 0.5 ml 를첨가하여각온도 (20~70 o C) 에서각각 0.5, 1, 1.5, 2 시간동안열처리한후, 기질용액 1 ml 를첨가하여 30 분간 30 o C 에서반응시켰다. 측정된한천분해효소의열안정성은열처리하지않은한천분해효소의활성과비교하였다 한천분해효소의 Zymogram 한천분해효소를확인하기위하여 SDS 를첨가하지않은 10% 의 polyacrylamide 겔에 0.1% (w/v) 의 agarose (LMP, Promega, USA) 를첨가하여전기영동을수행하였다 [17]. 전기영동은조효소액 10 µl 에 SDS 가첨가되지않은 sample 완충용액 5 µl 를첨가하여 0.1% (w/v) SDS 를함유한 running 완충용액에서실시하였다. 전기영동이완료된후겔을반으로나누어단백질밴드부분을 GelCode Blue Stain Reagent (Pierce, Rockford, IL, USA) 를이용하여가시화하였으며, zymogram 분석을위한겔은 0.1% (v/v) Triton X-100 (USB, USA) 및증류수로 1 시간씩세척하여 SDS 를제거한후 4 o C 에서 24 시간반응시켰고루골용액 (Lugol's solution) 을이용하여한천이분해된위치를확인하였다 한천가수분해산물의 thin-layer chromatography (TLC) 분석조효소액을이용하여 agarose 의분해산물을 TLC 로분석하였다. 조효소액과 20 mm Tris-HCl (ph 6.0) 완충용액을 30 o C 에서 0, 0.25, 0.5, 1, 6, 24 시간반응시킨후, Silica Gel 60 TLC Plate (Merck, Darmstadt, Germany) 로분석을행하였다. 전개용매로 n-butanol/acetic acid/h 2 O (2/1/1 (v/v/v)) 를사용하였 고, 10% (v/v) H 2 SO 4 로가시화시켰다. 표준물질로는 neoagarooligosaccharides [9] 를사용하였다. 한천분해효소에의해생산되는가수분해산물의농도는 Image J 1.44o (Wayne Rasband, Bethesda, USA) 프로그램을사용하여분석하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 한천분해균주의분리및동정 Marine agar 2216 배지에서높은활성을보이는것으로분리된한천분해균 SH-1 균주의 16S rdna 염기서열분석결과 1,465 bp 의염기서열을얻었고, NCBI 의 BLAST 탐색으로 Alteromonas sp. Ant82 및 Alteromonas sp. YD72 의 16S rdna 와 98% 의높은상동성을나타냈으므로, 분리균주를 Alteromonas sp. SH-1 으로명명하였다. 본연구와 GenBank 에서획득한 16S rdna 염기서열을 Neighbor-joining method 와 Bootstrap method (n=1,000) 로분석하여나타난본연구균주의계통분류학적위치를 Fig. 1 에나타냈다. 한천분해활성을보이는 Alteromonas 속균주에대한보고는칠레 [18], 중국 [19] 등에서보고되고있다 균주의생장과한천분해효소의활성측정균주의생장에따른한천분해효소전체의활성을 Fig. 2(a) 에나타냈다. 접종후흡광도가증가하여 3.5 일까지대수기로확인되었으며, 이후점점감소되는생장곡선을나타냈다. 또한, 배양액 1 L 당한천분해효소의활성은 30 o C 에서 3.5 일동안배양했을때 U/L 로최고치를나타내었다. 조효소액을 BCA Kit (Thermo Scientific, USA) 를이용하여단백질을정량한결과 208 mg/l 로단백질 1 mg 당한천분해효소의활성은 1.67 U/mg 로나타났다. 따라서이후연구에서는최고활성 (348.3 U/L, 1.67 U/mg) 을보이는 3.5 일까지배양한배양액을이용하여효소활성을측정하였다. Fig. 1. Phylogenetic tree based on almost complete 16S rdna sequence comparing isolated Alteromonas sp. SH-1 strain with other bacteria. The numbers at the branch node are percentages of bootstrap values (n=1,000) and numbers in parenthesis are numbers in GenBank.

4 116 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(2): (2016) Fig. 3. Effect of reaction temperature on agarase activity. The reactions were carried out at 20, 30, 40, 50, 60 and 70 o C in 1.0 ml of 20 mm Tris-HCl (ph 6.0) buffer containing 0.2% agar and 0.5 ml of enzyme solution for 30 min. Fig. 2. (A) Cell growth and total agarase activity of Alteromonas sp. SH-1 (total agarase activity [units/l], cell growth [OD 600 ]). (B) Agarase activity per cell density [units/l/od 600 ]. 그리고세포당효소활성을확인하기위하여한천분해효소전체의활성을생장곡선의흡광도로나누어 Fig. 2(b) 에나타냈다. 그결과 1 일에서가장크게나타났으며시간이지남에따라점차감소하였다 한천분해효소의최적온도측정각온도에서의한천분해효소의상대활성을 Fig. 3에나타냈다. 가장높은활성을나타낸 30 o C의반응온도에서나타난효소활성을 100% 로하였을때, 상대활성이 40 o C에서는약 90%, 20과 50 o C에서는약 70% 를나타내었고, 나머지온도에서도 60% 이상의상대활성을갖는것으로나타났다 (Fig. 3). 본연구와동일한 Alteromonas 속세균의한천분해효소의최적활성에필요한온도는 35 o C [19] 와 40 o C [16] 등이보고되어있는데본연구는 30 o C에서최적활성을보여차이를보였다. Alteromonas 속세균이아닌균주에따른온도별최적활성은 Saccharophagus degradans 2-40 [10] 이 30 o C로본연구에서분리한 Alteromonas sp. SH-1 균주와동일하였고, Acinetobacter sp. AG LSL-1 [11], Flammeovirga yayeyamensis YT [12] 와 Streptomyces coelicolor A3(2) [13] 는 40 o C로본연구에서분리한 Alteromonas sp. SH-1 균주유래의한천분해효소보다높은온도에서최적활성을나타내는것을알수있었다. 또한, 배양액 1 L당한천분해효소의활성을보면본연구의 Fig. 4. Effect of ph on agarase activity. The reactions were carried out at 30 o C in 1.0 ml of corresponding buffer (, 20 mm sodium acetate, ph ;, 20 mm Tris-HCl, ph ;, 20 mm GTA, ph ) containing 0.2% agar and 0.5 ml of enzyme solution for 30 min. Alteromonas sp. SH-1 는 U/L 로최고치를나타내어 Glaciecola sp. SL-12 [14] 의 233 U/L 보다는 1.5 배정도높았으며 Thalassomonas sp. SL-5 [2] 의 363 U/L 와유사한활성을나타내는것을확인할수있었다 한천분해효소의최적 ph 측정한천분해효소가각 ph 에서보이는상대활성을 Fig. 4 에나타냈다. 사용한완충용액과 ph 중에서최고의한천분해활성을나타내는것은 20 mm Tris-HCl 완충용액에서 ph 6.0 으로나타났다. 가장높은활성을나타낸 ph 6.0 에서나타난효소활성을 100% 로하였을때한천분해상대활성이 ph 7.0 에서 80% 이상이고 ph 5.0 와 8.0 에서 60% 이상유지되었으므로,

Alteromonas sp. SH-1 균유래의 α-agarase 의특성조사 117 Fig. 5. Heat stability of agarase activity. The enzyme solutions were pre-incubated at 20, 30, 40, 50, 60 and 70 o C for 0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 h.

The molecular masses of the enzymes were 85 kda and 110 kda. (protein mass marker; lane M, cell free extract of agarase; lane C, zymogram analysis of agarase; lane Z). 약산성과약염기성사이의비교적넓은범위에서높은활성을보였다.

5 Alteromonas sp. SH-1 균유래의 α-agarase 의특성조사 117 Fig. 5. Heat stability of agarase activity. The enzyme solutions were pre-incubated at 20, 30, 40, 50, 60 and 70 o C for 0, 0.5, 1.0, 1.5 and 2.0 h. The reactions were then carried out at 30 o C in 1.0 ml of 20 mm Tris-HCl (ph 6.0) buffer containing 0.2% agar and 0.5 ml of heat-treated enzyme solution for 30 min. Fig. 6. SDS-PAGE and zymogram analysis of agarase. The molecular masses of the enzymes were 85 kda and 110 kda. (protein mass marker; lane M, cell free extract of agarase; lane C, zymogram analysis of agarase; lane Z). 약산성과약염기성사이의비교적넓은범위에서높은활성을보였다. 본연구와동일한 Alteromonas 속세균의한천분해효소의최적활성에필요한 ph 는 7.0 [16,19] 그리고 6.5 [18] 가보고되었다. 최적온도와최적 ph 에서차이를보여 Alteromonas 속세균이다양한한천분해효소를생산할가능성을내포하는것으로판단되었다. Alteromonas 속이외의균주가생산하는한천분해효소의활성에있어서의최적 ph 가 6.0 인경우는 Acinetobacter sp. AG LSL-1 [11], ph 7.0 인경우는 Saccharophagus degradans 2-40 [10] 와 Streptomyces coelicolor A3(2) [13] 이고, Flammeovirga yayeyamensis YT [12] 는 ph 8.0 에서최적활성이보고되었다 한천분해효소의열안정성측정 Alteromonas sp. SH-1 이생산하는한천분해효소의열안정성을 Fig. 5 에나타냈다. 40 및 50 o C 에서는 1 시간의열처리를행하였을때약 40% 의상대활성을유지하는것으로보였지만, 60 o C 이상의온도에서는 0.5 시간의열처리를하였을때활성을거의잃어버리는것으로나타났다. 따라서 Alteromonas sp. SH-1 이생산하는한천분해효소는약한내열성을가지고있는것으로판단할수있었다 한천분해효소의 Zymogram Alteromonas sp. SH-1 유래의단백질밴드와한천분해효소를생산하는단백질을 Fig. 6 에나타냈다. Alteromonas sp. SH-1 은약 85 kda 및 110 kda 의분자량을나타내는 2 개의한천분해효소를생산하는것으로확인되었다. 본연구와유사한크기의 agarase 를보고한사례들이있으며 [20,21], 85 kda 이상의크기를가지는 agarase 는 α-agarase 가있다 [22] 한천가수분해산물의 TLC 분석 Alteromonas sp. SH-1 균주를 3.5 일간배양하여제조된조효 Fig. 7. TLC analysis of the hydrolyzed products of agarose by agarase. The reactions were carried out at 30 o C in 20 mm Tris-HCl (ph 6.0) buffer containing 0.2% agar and 0.5 ml of enzyme solution for 0, 0.25, 0.5, 1, 6 and 24 h. The reaction mixtures were developed by TLC. (NA, neoagarooligosaccharides; NA2, neoagarobiose; NA4, neoagarotetraose; NA6, neoagarohexaose). 소액에 agarose 를기질로첨가하여시간별로반응시킨후 TLC 로분석한결과를 Fig. 7 에나타냈다. 현재한천분해효소는 α-agarase 와 β-agarase 두가지만존재한다고알려져있어 β-agarase 의산물인 neoagarooligosaccharides 를통해한천분해효소의산물을추정하고한천분해효소가 α- 와 β-agarase 중어디에속하는지파악하였다 [20]. Alteromonas sp. SH-1 균주가생산하는한천분해효소의분해산물을 TLC 로분석한결과

6 118 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(2): (2016) 를보면, agaropentaose 및 agarotriose 그리고 agaroheptaose 로추정되는 agarooligosaccharides 를생산하는것으로보아이균주가생산하는효소들은 α-agarase 로확인되었다 [20]. 각각의반응시간에서나타난반응산물의합을 100% 로하여 TLC 로분석한결과, 0.25 시간부터 24 시간까지분해산물인 agaroheptaose : agaropentaose : agarotriose 의농도는비슷하게유지되었으며, 평균적으로각각 21.2%, 50% 및 28.8% 로생산되는것을확인하였다. Agarose 를기질로사용할경우 β-agarase 는 neoagarohexaose, neoagarotetraose 및 neoagarobiose 를생성하고, α-agarase 는 agaropentose 및 agarotriose 를생성한다 [1]. 현재까지의보고에따르면 Alteromonas 속의한천분해균주는종에따라 α-agarase [6] 또는 β-agarase [4,17,23] 를생산한다고알려져있으나 α-agarase 를생산하는 Alteromonas 속균주는 Alteromonas agarlyticus strain GJ1B [6] 와 Alteromonas sp. GNUM-1 [17] 등만보고되어있다. Alteromonas 속세균이생산하는 α-agarase 의분자량은 GJ1B 균주가 180 kda [6], GNUM-1 균주가 30 kda [17] 으로보고되고있고다른보고는없는실정이다. 따라서본연구에서보고하는약 85 kda 및 110 kda 의분자량을나타내는 (Fig. 6) 2 개의 α-agarase 는신규성이높다고할것이다. 본연구에서획득한 Alteromonas sp. SH-1 균주와 α-agarase 들은다른한천분해효소처럼배양조건의최적화및해당유전자의 cloning 을통한과다발현으로기능성한천올리고당의산업적생산에이용이가능할것으로기대된다. 4. CONCLUSION 경상남도남해군미조면연안으로부터채취한해수를이용하여한천분해활성을보이는해양성세균을분리하였다. 선택된한천분해균주는 16S rdna 염기서열분석을통해 Alteromonas 의 16S rdna 와약 98% 유사한것으로확인되었으며, Alteromonas sp. SH-1 으로명명하였다. Alteromonas sp. SH-1 균주가생성하는한천분해효소는 30 o C 와 ph 6.0 에서최대활성을나타내었으며, 한천분해강도는 U/L (1.67 U/mg protein) 로나타났다. 한천분해효소는 SDS-PAGE 및 zymogram 을통해분자량이 85 kda 및 110 kda 임을확인하였다. 또한 30 o C 에서 1.5 시간동안열처리하였을때약 50% 이상의상대활성을보였으며, 40 o C 와 50 o C 에서도 1 시간동안열처리하였을때약 40% 이상의상대활성을보였으므로약한내열성을가지는것으로사료된다. TLC 분석결과, Alteromonas sp. SH-1 균주가생성하는한천분해효소는 agarose 를분해하여항산화및항암효과를가지는기능성한천올리고당인 agaropentaose 와 agarotriose 를생성하는것으로보아 α-agarase 로확인되었다. 따라서 Alteromonas sp. SH-1 균주와이균주가생산하는 α-agarase 는산업적으로유용하게활용할수있을것으로기대된다. REFERENCES 1. Jang, H. J., D. G. Lee, S. W. Lee, M. J. Jeon, W. J. Chun, K. K. Kwon, H. S. Lee, and S. H. Lee (2011) Isolation of a marinederived Flammeovirga sp. mbrc-1 strain and characterization of its agarase. KSBB J. 26: Lee, D. G., N. Y. Kim, M. K. Jang, O. H. Lee, and S. H. Lee (2007) Isolation and characterization of a marine bacterium Thalassomonas sp. SL-5 producing β-agarase. J. Life Sci. 17: Hong, J. H., J. J. Lee, S. H. Hur, H. S. Choi, and J. Y. Kong (2001) Effect of agarooligosaccharides on the growth of intestinal bacteria. J. Fd. Hyg. Safety 16: Seo, Y. B., Y. Lu, W. J. Chi, H. R. Pack, K. J. Jeong, S. K. Hong, and Y. K. Chang (2014) Heterologous expression of a newly screened β-agarase from Alteromonas sp. GNUM1 in Escherichia coli and its application for agarose degradation. Process Biochem. 49: Yang, M., X. Mao, N. Liu, Y. Qiu, and C. Xue (2014) Purification and characterization of two agarases from Agarivorans albus OAY 02. Process Biochem. 49: Hassairi, I., R. Ben Amar, M. Nonus, and B. B. Gupta (2001) Production and separation of α-agarase form Alteromonas agarlyticus strain GJ1B. Biores. Technol. 79: Kim, Y. J. (2010) Properties of the agarase and its gene isolated from a marine bacterium, Tamlana agarivorans. M.S. dissertation, University of Chungnam, Taejon, Korea. 8. Kim, Y. N. (2011) Isolation and purification of new agarase from marine bacterium. M.S. dissertation, University of Kyungsang, Jinju, Korea. 9. Lee, D. G., M. K. Jang, O. H. Lee, N. Y. Kim, S. A. Ju, and S. H. Lee (2008) Over-production of a glycoside hydrolase family 50 β- agarase from Agarivorans sp. JA-1 in Bacillus subtilis and the whitening effect of its product. Biotechnol. Lett. 30: Kim, H. T., S. Lee, D. Lee, H. S. Kim, W. G. Bang, K. H. Kim, and I. G. Choi (2010) Overexpression and molecular characterization of Aga50D from Saccharophagus degradans 2-40: An exo-type β- agarase producing neoagarobiose. Appl. Microbiol. Biotechnol. 86: Lakshmikanth, M., S. Manohar, Y. Souche, and J. Lalitha (2009) Extracellular β-agarase LSL-1 producing neoagarobiose from a newly isolated agar-liquefying soil bacterium, Acinetobacter sp., AG LSL-1. Process Biochem. 44: Yang, J. I., L. C. Chen, Y. Y. Shih, C. Hsieh, C. Y. Chen, W. M. Chen, and C. C. Chen (2011) Cloning and characterization of β- agarase AgaYT from Flammeovirga yaeyamensis strain YT. J. Biosci. Bioeng. 112: Temuujin, U., W. J. Chi, Y. K. Chang, and S. K. Hong (2012) Identification and biochemical characterization of Sco3487 from Streptomyces coelicolor A3(2), an exo- and endo-type β-agaraseproducing neoagarobiose. J. Bacteriol. 194: Lee, D. G., O. H. Lee, H. J. Jang, M. K. Jang, K. H. Yoo, and S. H. Lee (2008) Isolation and characterization of a marine derived bacterium Glaciecola sp. SL-12 producing β-agarase. J. Life Sci. 18:

7 Alteromonas sp. SH-1 균유래의 α-agarase 의특성조사 Jang, M. K., S. W. Lee, D. G. Lee, N. Y. Kim, K. H. Yu, H. J. Jang, S. Kim, A. Kim, and S. H. Lee (2010) Enhancement of the thermostability of a recombinant β-agarase, AgaB, from Zobellia galactanivorans by random mutagenesis. Biotechnol. Lett. 32: Chi, W. J., J. H. Lim, D. Y. Park, M. C. Kim, C. J. Kim, Y. K. Chang, and S. K. Hong (2013) Isolation and characterization of a novel agar degrading bacterium Alteromonas macleodii subsp. Gnum08120, from red macroalgae. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 41: Kim. J. H., and S. K. Hong (2012) Isolation and characterization of an agarase-producing bacterial strain, Alteromonas sp. GNUM-1, from the west Sea, Korea. J. Microbiol. Biotech. 22: Leon, O., L. Quintana, G. Peruzzo and J. C. Slebe (1992) Purification and properties of an extracellular agarase from Alteromonas sp. strain C-1. Microbiol. 58: Wang, J., H. Mou, X. Jiang, and H. Guan (2006) Characterization of a novel β-agarase from marine Alteromonas sp. SY37-12 and its degrading products. Appl. Microbiol. Biotechnol. 71: Ohta, Y., Y. Hatada, M. Miyazaki, Y. Nogi, S. Ito, and K. Horikoshi (2005) Purification and characterization of a novel from a Thalassomonas sp. Curr. Microbiol. 50: Fu, X. T. and S. M. Kim (2010) Agarase: Review of major sources, categories, purification method, enzyme characteristics and applications. Mar. Drugs 8: Kim, J. H., Y. H. Kim., S. K. Kim, B. W. Kim, and S. W. Nam (2011) Properties and Industrial applications of seaweed polysaccharides-degrading enzymes from the marine microorganisms. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 39: Kohtaro, K., M. Masuda, Y. Iwasaki, H. Nakagawa, R. Kobayashi, and S. Usami (1999) Purification and characterization of a novel β-agarase from an alkalophilic bacterium, Alteromonas sp. E-l. J. Biosci. Bioengi. 87:

미생물분류는형태적특징, 생리 생화학적성질과상태, 화학분류학적성질과상태등을이용하여구분하는것이일반적이지만, 이와같은방법을이용하면많은시간을필요로한다. 또한분류가힘든경우나, 정확하지못한결과를얻는경우도있다. 최근미생물분류에도분자생물학적인방법을이용하여, 미생물이가지고있는 DNA를

Code RR180A - 연구용 - Bacterial 16S rdna PCR Kit 사용설명서 v201011da 미생물분류는형태적특징, 생리 생화학적성질과상태, 화학분류학적성질과상태등을이용하여구분하는것이일반적이지만, 이와같은방법을이용하면많은시간을필요로한다. 또한분류가힘든경우나, 정확하지못한결과를얻는경우도있다. 최근미생물분류에도분자생물학적인방법을이용하여, 미생물이가지고있는