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해영 승
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1 Journal of the Korea Academia-Industrial cooperation Society Vol. 18, No. 12 pp , ISSN / eissn 류진협 1, 안주희 1, 우용규 1, 조현정 2* 1 ( 주 ) 네이처포, 2 건양대학교임상병리학과 The anti-inflammation effects of A.C.C. extracts on the LPS-induced Raw cell Jin-Hyeob Ryu 1, Ju-Hee An 1, Yong-Kyu Woo 1, Hyun-Jeong Cho 2* 1 Nature4 Co. Ltd, 2 Department of Biomedical Laboratory Science, College of Medical Science, Konyang University 요약본연구의목적은황백을포함한총 14가지의한약재를증류추출하여얻은시료 (A.C.C. 추출물 ) 의항염증활성을확인하고임상적인효과를평가하는것이다. 이를위해, Lipopolysaccharide(LPS) 로자극한 RAW 264.7세포에서세포가방출하는 nitric oxide(no) 생성량과염증성사이토카인인 tumor necrosis factor(tnf)-α, interleukin(il)-1β 및 IL-6 생성량의변화를확인하였다. 그결과, A.C.C. 추출물은세포독성없이 LPS가증가시킨 NO와염증성사이토카인들의생성을강력하게억제하였다. 또한, A.C.C. 추출물은 Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), Candida albicans and Streptococcus mutans 등의세균들에서 99.9% 의강력한세균감소율을보여주었다. 이는 A.C.C. 추출물이항염증효과와함께강력한항균효과를가진유효한성분인것을의미한다. 또한, 기저귀발진, 가려움증, 땀띠증상을겪고있는영 유아에게 A.C.C. 추출물을도포하였을때, 발진, 아토피, 짓무름, 가려움증, 땀띠등의증상개선효과를나타내었으며, 영 유아피부의땀띠가 2주일경과후상당히완화된것을육안으로확인할수있었다. 이는 A.C.C. 추출물이임상적으로도항염증및항균작용을통하여기저귀발진및땀띠등의증상을완화시키는물질임을확실히한것이다. 그러므로, A.C.C. 추출물이염증성질환에대한효과적인대안이될수있을것으로사료된다. Abstract This study was conducted to evaluate the anti-inflammatory activity and clinical efficacy of a sample (A.C.C. extracts) obtained by distillation extraction of 14 herbal medicines including Phellodendron bark. To confirm this, the amount of nitric oxide (NO) produced by the cells in RAW cells stimulated by lipopolysaccharide (LPS) and the changes in the production of inflammatory cytokines such as tumor necrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-1β and IL-6 were determined. The results showed that A.C.C. extracts strongly inhibited the production of NO and inflammatory cytokines increased by LPS without cytotoxicity. In addition, A.C.C. extracts showed strong bacterial reduction rates of 99.9% in Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), Candida albicans and Streptococcus mutans. These findings indicate that A.C.C. extracts are effective ingredients with a strong antimicrobial effect together with an anti-inflammatory effect. In addition, when A.C.C. extracts were applied to infants and toddlers who were suffering from diaper rash, itching, and perspiration symptoms, symptoms of rash, atopy, rash, itching, and heat rash were improved. After the lapse of time, it was visually confirmed that it was considerably relaxed. These findings confirm that A.C.C. extracts comprise a clinically effective anti-inflammatory and anti-bacterial agent that alleviates symptoms such as diaper rash and fever and may therefore be an effective alternative to inflammatory diseases. Keywords : A.C.C. extracts, Anti-bacterial, Anti-inflammation, Cytokine, Lipopolysaccharide-induced Raw cell, Nitric oxide 본연구는중소기업청창업성장기술개발사업 창조경제혁신센터연계과제 (No. S ) 로지원받아연구되었다. * Corresponding Author : Hyun-Jeong Cho (Konynag Univ.) Tel: hjcho@konyang.ac.kr Received November 1, 2017 Revised(1st November 20, 2017, 2nd November 29, 2017) Accepted December 8, 2017 Published December 31,

2 한국산학기술학회논문지제 18 권제 12 호, 서론체내에서일어나는염증반응은상처나세균감염과같은물리적, 화학적자극이있을때손상부위를회복시키는중요한신체의방어기전가운데하나이며, 자극이가해질때국소적으로혈관활성물질들이유리됨으로써혈관투과성이증대되어염증이유발된다 [1]. 이는생체에서일어나는방어기전이지만, 지속적으로염증반응이일어날때점막손상을촉진하여결과적으로부종, 통증, 발적, 발열등을유발하며, 심혈관질환, 류마티스관절염, 기관지염및암과같은만성적인염증과연관된질병을야기할수있다 [2]. 대식세포 (machrophage) 는염증반응을일으키는주요세포로알려져있으며, 이들은자극이있을경우나면역세포들에서분비되는 cytokine에의해활성화되어 nitric oxide(no) 와 cytokine을생성하여생체방어에중요한역할을담당한다 [3]. Lipopolysaccharide(LPS) 는그람음성균의세포외막에있는내독소로잘알려져있는데, 이는대식세포또는단핵구를자극함으로써 tumor necrosis factor-α(tnf-α), interleukin-1β(il-1β) 및 IL-6등의염증매개성 cytokine 들의분비를자극하여염증반응을촉매한다 [4-7]. TNFα는체내에서대식세포, 림프구및백혈구등에서생성되는 cytokine으로정상상태에서는생성되지않다가대식세포가자극을받게되면합성되어분비된다. IL-6는대표적인 pro-inflammatory cytokine의한종류이며, 단핵구를포함한여러종류의세포에서분비되어초기면역반응에서중요한역할을한다 [8]. IL-1β는 IL-6 및 TNF-α와함께대표적인염증성 cytokine의하나로 NO 를생성하게하는매개물질로서, 국소염증을일으키고 T 세포활성화와 B 세포의성숙및 NK cell을활성화시키는 cytokine으로알려져있다 [9]. 이러한염증매개성물질들의합성은 cyclooxygenase(cox) 에의해 arachidonic acid가 leukotriene, prostaglandin, thromboxane 등으로전환되는과정및 nitric oxide (NO) 이생성되는데관여하며, 결과적으로숙주에치명적결과를초래한다고보고되어있다 [10,11]. 특히, NO는반응성이높은물질로서박테리아, 바이러스, 균, 및기생충과같은병원균에대하여선천면역반응에필수적인역할을수행하는것으로알려져있는물질로서 [12], NO synthase(nos) 에의해 L-arginine으로부터만들어지며, NOS는 constitutive NOS(cNOS) 와 inducible NOS(iNOS) 로나뉜다. 이중 inos는외부자극또는 pro-inflammatory cytokine 등의자극이있을경우, 다량의 NO를생산하여혈관투과성및부종등을일으켜염증반응을유발시키고 [13], 과도한경우류마티스관절염및자가면역장애와같은면역성질환까지도이어진다고알려져있다 [14]. 본연구에서는주요성분으로서황백을포함한총 14 가지의한약재를증류추출하여얻은시료 (A.C.C. 추출물 ) 를이용하였다. 황백은황백나무의껍질을말린것으로, 혈당저하, 폐렴쌍구균, 인형결핵균, 포도상구균등에대하여발육저하작용을함과동시에종양세포의번식을감소시키며, 살균작용을한다고보고된바가있고, 항염증에관련된효과가알려져있으나그기전이나임상적인의의에대한연구는미흡한실정이다 [15]. 따라서, 본연구는대식세포인 Raw 세포가 LPS에의해염증반응이유도되었을때, A.C.C. 추출물이 NO 생성및 pro-inflammatory cytokine(tnf-α, IL-1 β 및 IL-6) 합성에있어서어떤영향을미치는확인함으로써 A.C.C 추출물의항염증효과를알아보고자하였다. 또한, seudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), Candida albicans 및 Streptococcus mutans 균주를이용하여항균활성을보고자하였으며, 이를임상적으로적용하여기저귀발진, 가려움증, 땀띠증상을겪고있는영 유아에게 A.C.C. 도포하였을때증상이개선되는효과가나타나는지보고자하였다. 2. 실험재료및방법 2.1 실험재료본초학을바탕으로문헌조사를진행하여총 14가지의한약재를선발하였다. 한약재의구입은서울약령시에씨케이 ( 주 ) 에서생약제제로포장되어판매하는제품을사용하였다. Dulbecco s modified eagle s medium (DMEM), fetal bovine serum(fbs) 은 Hyclone(Logan, UT, USA) 에서구입하였다. Penicillin(100 U/mL), streptomycin(100 ug/ml) 은 Gibco(Life technology lnc., Gaithersburg, MD, USA) 에서구입하였다. LPS, 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide(mtt), Sodium Nitrite, Dimethyl sulfoxide (DMSO) 는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 504

3 에서구입하였다. Nitrite oxide(no) detection kit은 intron에서구입하여이용하였으며, ELISA assay kit는 Thermo Fisher Scientific에서구입하였다. 2.2 실험방법 A.C.C. 추출물의준비황백외 13가지한약재를각각의비율에따라배합하여 3차증류수 40L를용매로하여 80 에서 11시간을증류추출하였다 (Fig. 1, Table 1) MTT assay 에의한세포독성측정 Raw 세포생존율측정은 96 well plate에 cells/well의농도가되도록조절한후 24시간동안배양하여안정화를시행하였다. 24시간후 well에배지를모두제거하였다. A.C.C. 추출물의최종농도로 1, 5, 10 µg/ml이되도록배양액에희석하여세포주에처리한후 3시간동안배양하였다. 3시간후대조군을제외한 well에 LPS 1 µg/ml을처리하였다. 24시간후배지를모두제거한후, 각 well에 MTT용액 (0.2 µg/ml in phenol red free DMEM) 100 µl씩첨가하여 37, 5% CO 2 incubator에서 2시간동안반응하여 MTT가환원되도록하였다. 그후, 각 well에 DMSO 용액을첨가하여생성된 formazan을용해시켰다. Microplate reader를이용하여 545 nm에서흡광도를측정하였다 Nitric Oxide 생성량측정 Raw 세포를 6 well plate에 cells/well의농도로세포를첨가하였다. 24시간동안 37, 5% CO 2 Fig. 1. Distilled extraction of 14 natural products including phellodendron bark (A.C.C extracts). Table 1. The materials and proportion of in A.C.C. extracts Materials Proportion (%) Phellodendron bark 24 Scutellaria baicalensis 5 Paeonia lactiflora Pall. 12 Dictamnus dasycarpus Turcz. 12 Anemarrhena asphodeloides 6 Alumen 12 Dryobalanops aromatica Gaertner 2 Mentha arvensis var. piperascens 4 Inula helenium 3 Syringa velutina var. kamibayashii 1 Corydalis incisa 6 Eclipta prostrata 6 Lonicera japonica 1 Glycyrrhiza uralensis Raw 세포의배양 Raw 세포는한국세포주은행에서구입하였다. Penicillin/streptomycin 100 unit/ml과 10% FBS가함유된 DMEM 배지를사용하여 37, 5% CO 2 incubator에서배양하였으며, 3일에한번씩계대배양하였다. incubator에보관한후, Raw 세포에 1, 5, 10 µg/ml A.C.C. 추출물을처리하고 3시간후 LPS 1 µg/ml를처리하여 24시간배양하였다. nitric oxide을 Griess reaction에기초한 nitrite oxide(no) detection kit (intron) 로분석하였다. 세포배양상등액에 Griess Reagent를넣고혼합하여 10분간상온에서반응시킨후, microplate reader로 520 nm 흡광도에서측정하였다. Sodium nitrite의농도별표준곡선을바탕으로하여식에적용시켜배양액내의 NO 농도를결정하였다 염증관련 cytokines 분비량측정염증유발사이토카인인 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 생성량을측정하기위하여 6 well plate에 Raw 세포를 cells/well의농도로첨가하였다. 24시간후 1, 5, 10 µg/ml A. C. C. 추출물을처리하고 3시간후 1 µg/ml의 LPS를대조군을제외한모든 well에처리하였다. 24시간동안배양후배지에분비된 TNF-α, IL-6 및 IL-1β 를 ELISA kit(thermo Fisher Scientific) 를이용하여분석을하였다. Microplate reader로 450 nm에서측정하였다 항균활성 A.C.C. 추출물의항균활성을보기위하여항균력측 505

한국산학기술학회논문지제 18 권제 12 호, 2017 정은 paper disc 방법을사용하였다. 시험전배양한시험균주를각배지에맞게 1.0 10 4 이상접종하였다. 멸균된 paper disk에 A.C.C. 100 µl 로딩후 30분동안말려서준비하였다. 시험균주가접종된배지위에 A.C.C. 가로딩된 paper disk를간격에맞추어올린후 24-48 시간 incubator에배양하였다.

4 한국산학기술학회논문지제 18 권제 12 호, 2017 정은 paper disc 방법을사용하였다. 시험전배양한시험균주를각배지에맞게 이상접종하였다. 멸균된 paper disk에 A.C.C. 100 µl 로딩후 30분동안말려서준비하였다. 시험균주가접종된배지위에 A.C.C. 가로딩된 paper disk를간격에맞추어올린후 시간 incubator에배양하였다. Paper disk 주변의억제대를측정하여결과판정및분석하였다 임상연구절차공고를통하여모집된피험자는대상자의특성에따라대리인 ( 보호자 ) 이 사전설문지 작성을실시한다. 사전설문조사를통하여증상, 피부상태등을파악한뒤조성물을제공하고연구원은피험자에게 14일동안매일같은시간에하루 1cc 양으로 5-10회를도포할수있도록교육하였다. 또한객관적인연구결과를위하여환부를사진촬영하여도포전과후를비교분석하며, 이때사진은얼굴과같이개인을식별할수있는부위는제외하였다. 도포 14일종료후대리인은 시험설문지 를작성하였다. 자료의보관기간은생명윤리법에따라연구가종료된시점으로부터 3년동안보관하며, 정보보호기간이후개인정보및사진은복원이불가능한방법으로영구삭제할것이다 통계분석모든측정값은평균 ± 표준편차값으로표시하였고, 통계적분석은적절하게양측독립표본 t-test 또는 ANOVA test를통하여수행하였다. 이분석이각집단간의그룹평균값이상당한차이를나타내는경우, 각집단을사후검정방법인 Scheffe s 방법을통하여적용하였다. 3. 결과 3.1 A.C.C. 추출물이 Raw 세포에미치는세포독성 A.C.C. 추출물이 Raw 세포에미치는영향을확인하기위하여 A.C.C. 추출물을농도별 (1, 5, 10 µg/ml) 로전처리한후 1 µg/ml의 LPS를처리하였다. 24 시간동안배양한후, MTT assay 방법을이용하여세포독성을확인하였다. 그결과, 세포생존율이각각 98.47, 90.91, 93.23% 로세포생존에있어서유의적인의미를보이지않는높을생존율이확인되었다 (Fig. 2). Fig. 2. Effects of A.C.C extracts on cell viability in Raw cells treated with LPS. Cell viability was measured by MTT assay. *, p < 0.05, **, p < 0.01 compared to control. Con; control, LPS 1 µg/ml ; 1 µg/ml lipopolysaccharide, A0; LPS 1 µg/ml, A1; A.C.C. 1 µg/ml, A5; A.C.C. 5 µg/ml, A10; A.C.C. 10 µg/ml, Q.C 10 µm; quercetin 10 µm. 3.2 A.C.C. 추출물이 Raw 세포의 NO 생성억제에미치는효과 Fig. 3. Effects of A.C.C extracts on nitric oxide production in Raw cells treated with LPS. NO concentration was determined by Griess reaction. ###, p<0.001 compared to control, and ***, p < compared to 1 µg/ml LPS. Con; control, LPS 1 µg/ml ; 1 µg/ml lipopolysaccharide, A0; LPS 1 µg/ml, A1; A.C.C. 1 µg/ml, A5; A.C.C. 5 µg/ml, A10; A.C.C. 10 µg/ml, Q.C 10 µm; quercetin 10 µm. 대식세포를 LPS로자극하였을때, inducible nitric oxide synthase(inos) 가발현되어과량의 NO를생성한다. 생성된 NO는염증반응을촉진하여조직손상을유발한다고알려져있다 [16]. 따라서 A.C.C. 추출물이 NO 와같은염증성매개물질을억제하는지보고자하였다. 506

그결과, Raw 264.7 세포에 LPS 처리하였을때, 대조군에비하여 NO 생성이 0.45에서 3.15로 7배로증가되는것을확인하였다. A.C.C. 추출물을 1, 5, 10 µg/ml로처리하여 NO의생성억제효과를측정하였을때, 그결과 Raw 264.7세포에서 LPS 유도로증가된 NO생성이 A.C.C. 추출물로인해농도의존적으로억제되는것을확인하였다 (Fig.

7 세포에 LPS 처리시대조군과비교하였을때, TNF-α, IL-1β 및 IL-6는상당히증가하였다 (Fig. 4). 하지만 A.C.C. 추출물처리에의하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-6는감소하였다. 특히, A.C.C. 추출물을 10 µg/ml 농도로처리하였을때, 상당히감소하였다. 이러한결과를통하여 A.C.C. 추출물이 Raw 264.

(b) Effects of A.C.C. extracts on IL-1β in dose-dependent manner. (c) Effects of A.C.C. extracts on IL-6 in dose-dependent manner. Pro-inflammatory cytokines was measured in the media with Raw264.

5 그결과, Raw 세포에 LPS 처리하였을때, 대조군에비하여 NO 생성이 0.45에서 3.15로 7배로증가되는것을확인하였다. A.C.C. 추출물을 1, 5, 10 µg/ml로처리하여 NO의생성억제효과를측정하였을때, 그결과 Raw 264.7세포에서 LPS 유도로증가된 NO생성이 A.C.C. 추출물로인해농도의존적으로억제되는것을확인하였다 (Fig. 3). 3.3 A.C.C. 추출물이 Raw 세포의 cytokine 생성억제에미치는효과 위하여 ELISA assay 방법으로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의변화량을측정하였다. Raw 세포에 A.C.C. 추출물을농도별로처리후 LPS 처리를하였다. 그결과, Raw 세포에 LPS 처리시대조군과비교하였을때, TNF-α, IL-1β 및 IL-6는상당히증가하였다 (Fig. 4). 하지만 A.C.C. 추출물처리에의하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-6는감소하였다. 특히, A.C.C. 추출물을 10 µg/ml 농도로처리하였을때, 상당히감소하였다. 이러한결과를통하여 A.C.C. 추출물이 Raw 세포에서염증을유도하는 cytokine을억제함으로써항염증효과가있다는것을확인하였다. (a) (c) Fig. 4. Inhibitory effects on cytokine production of A.C.C. extracts in Raw264.7 cells with LPS. (a) Effects of A.C.C. extracts on TNF-α in dose-dependent manner. (b) Effects of A.C.C. extracts on IL-1β in dose-dependent manner. (c) Effects of A.C.C. extracts on IL-6 in dose-dependent manner. Pro-inflammatory cytokines was measured in the media with Raw264.7 cells that were stimulated with LPS.. ###, p < compared to control, and **, p < 0.01, and ***, p < compared to 1 µg/ml LPS. Con; control, LPS 1 µg/ml ; 1 µg/ml lipopolysaccharide, A0; LPS 1 µg/ml, A1; A.C.C. 1 µg/ml, A5; A.C.C. 5 µg/ml, A10; A.C.C. 10 µg/ml. 염증반응이유도되는과정에서 NO 및 PGE2와같은염증매개물의생성과면역반응을통한염증성 cytokine 의생성이동반되어일어난다. 대표적인 cytokine 으로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6가있다 [17]. A.C.C. 추출물이염증매개성 cytokine 생성에어떤영향을미치는지보기 (b) 3.4 A.C.C. 추출물의항균활성효과 가려움증, 소아발진을유발하는주요원인균으로 A군사슬알균 (Streptococcus pyogenes) 및황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 이알려져있다. 또한, 여성질염 (Vaginal Candidiasis), 발진, 소양감의주요원인진균으로 Candida albicans이있으며, 이로인해남성의경우사타구니등피부가접히고습기가잘차는부위에곰팡이가감염되는경우샅백선또는칸디다성간찰진과같은피부감염증이발생할수있다 [18]. 본실험에서는, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, MRSA(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), Candida albicans 및 Streptococcus mutans 균들에대하여아래의표와같은방법으로실험을진행하였으며, A.C.C. 추출물이총 5가지균주에서 99.9% 라는강력한세균감소율 (%) 을보여주었다 (Table 2). 따라서 A.C.C. 추출물은위 5가지균에대하여강력한항균효과를가진유효한성분인것을알수있다. Table 2. Anti-bacterial activities of A.C.C. extracts. Contents Initial conc. (CFU/ml) Results Con. after 24 h (CFU/ml) Condition Inhibition rate(%) Pseudomonas aeruginosa control A.C.C < Staphylococcus control aureus A.C.C < MRSA (Methicillin control resistant Staphylococcus A.C.C aureus) < Candida albicans control A.C.C < Streptococcus mutans control A.C.C < ±

한국산학기술학회논문지제 18 권제 12 호, 2017 3.5 A.C.C. 추출물이영 유아의기저귀발진, 땀띠에미치는영향기저귀발진, 가려움증, 땀띠증상을겪고있는영 유아를대상으로하여 A.C.C. 추출물을도포하였을때, 발진, 아토피, 짓무름, 가려움증, 땀띠등의증상이개선되는지임상적으로확인하고자하였다.

6 한국산학기술학회논문지제 18 권제 12 호, A.C.C. 추출물이영 유아의기저귀발진, 땀띠에미치는영향기저귀발진, 가려움증, 땀띠증상을겪고있는영 유아를대상으로하여 A.C.C. 추출물을도포하였을때, 발진, 아토피, 짓무름, 가려움증, 땀띠등의증상이개선되는지임상적으로확인하고자하였다. 임상시험전발진, 아토피, 짓무름, 가려움증및땀띠의총 5가지항목으로사전설문지를진행하였다. 총 4점만점으로진행하였으며, 발진항목이 2.61 ± 1.1 점으로가장높았으며, 다음으로는땀띠항목이 2.41 ± 1.1 점으로높았다. 사전설문지작성후, 14 일동안매일같은시간에 1cc 양을하루에 5~10회도포하도록하고 14일후에시험설문지작성을진행하였다. 그결과, 사용후점수는모두 1.5 점이하로전반적으로개선된양상을보였다. 사용전가장높았던발진과땀띠모두각각 1.39 ± 0.70, 1.35 ± 0.70 점으로상당히감소된결과를확인하였다 (Fig. 5, Table 3). 또한, 영 유아의임상시험전과 A.C.C. 추출물을 1주일간도포후, 그리고 A.C.C. 추출물을 2주일간도포후의경과를비교하여관찰하였다. 그결과, 피부의땀띠가 2주일경과되었을때상당히사라진것을확인할수있었다. 따라서 A.C.C. 추출물이기저귀발진및땀띠등의증상에효과가있는것으로보여진다 (Fig. 6). Fig. 5. Change of symptoms after using A.C.C. extracts (n=18). *, p < 0.05, and ***, p < compared to 0 week. Table 3. Change of rash, atopy, erosion, puritus, heat rash symptoms according to the using A.C.C. extracts O week (average ± SD) 2 week (average ± SD) Rash ± ± Atopy ± ± Erosion ± ± Pruritus ± ± Heat rash ± ± Fig. 6. Change of heat rash symptoms before and after using A.C.C. extracts. 4. 고찰및결론 염증반응은외부자극에의해생체내에서일어나는복구체계로서임상적으로발적, 발열, 종창, 동통등을동반하여나타난다. 염증반응에관여하는세포로는대식세포, 단구, 림프구, 비만세포, 섬유아세포, 혈소판등이있으며, 염증반응시히스타민, 세로토닌, arachidonic acid 대사체, 활성산소, 사이토카인등과같은염증매개인자가생성및방출된다 [19]. 반복적인염증반응은염증세포에서활성산소종과활성질소종의과다생성을유발함으로써영구적인유전자의변형을일으켜비가역적인병변을초래하기도한다 [20]. 대체로 nitric oxide synthase (NOS) 중의 inos가염증반응에관여한다고알려져있으며, interferon-γ, 염증성사이토카인및 LPS 의자극으로인해발현된다. 체내에서의 NO는항균과종양제거에있어서중요한기능을담당하지만 [21], inos에의해만들어진 NO는혈관투과성증가, 부종등의반응을유발하고염증매개물질의합성을촉진하여염증을심화시키는것으로알려져있다 [22,23]. 본연구의결과를볼때, A.C.C. 추출물은마우스대식세포인 RAW 세포에서세포독성을가지지않는것을확인할수있는데 (Fig. 2), 이는 A.C.C. 추출물이세포에서나타내는효과들이세포의생존율의변화와는무관한고유의효과라는것을의미한다. A.C.C. 추출물의항염증효과를확인하기위해 RAW 세포에 A.C.C. 추출물을여러농도로 3시간동안전처리하고, 1 µg/ml LPS를 24시간동안처리한후, 세포에서염증성인자인 NO의생성변화를측정하였다. 그결과 LPS에의해증가한 NO 생성량이 A.C.C. 추출물에의해농도의존적으로감소되었다 (Fig. 3). 이러한결과는 A.C.C. 추출물이 LPS에의해진행되는염증과정에서중요한매개인자인 NO의형성을저해하는것으로항염증작용을가진다는것을말해준다. 또한, 염증반응이시작될때염 508

7 증반응의전사인자로알려진 NF-κB가활성화됨으로 TNF-α, IL-1β 및 IL-6와같은중요한염증촉진단백질의유전자발현을조절하는데, 이들이 inos의활성화를조절하여염증반응에중요한역할을담당하는것으로알려져있다 [24-26]. 따라서, 염증의중요한지표로서염증매개성사이토카인 (TNF-α, IL-1β 및 IL-6) 에미치는 A.C.C. 추출물의효과를확인하고자하였다. RAW 세포에 LPS를처리하여염증을유발하고, 이때 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의생성량을 A.C.C. 추출물이어떻게변화시키는지확인한결과, A.C.C. 추출물이 LPS 에의하여유도된염증인자들을농도의존적으로강력하게감소하는것을알수있었다 (Fig. 4). 이결과들로통해 A.C.C. 추출물이 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의생성을감소시킴으로써 inos의발현을조절하여 NO 생성을억제하는항염증효과를나타낸다는것을분명히하였다. 또한, A.C.C. 추출물은 Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus), Candida albicans 및 Streptococcus murans 균들에대하여 99.9 % 라는강력한세균감소율 (%) 을나타내었다 (Table 1). 이는 A.C.C. 추출물이항염증효과와항균작용의시너지를나타내는효과적인염증치료제로서이용가능성이있음을보여준것이다. 이를확실하게확인하기위하여기저귀발진, 가려움증, 땀띠증상을겪고있는영 유아를대상으로하여 A.C.C. 도포시발진, 아토피, 짓무름, 가려움증, 땀띠등의증상개선효과가있는지평가해보았다. 사전설문지를평가한결과 4점만점에서발진항목이 2.61 ± 1.1 점으로가장높았으며, 14일사용후 1.39 ± 0.70 점으로사용전에비하여상당히감소되었다 (Fig. 5). 또한, 영 유아의임상시험전, 후의경과를관찰한결과, A.C.C. 추출물을 2주일동안사용하였을때피부의땀띠가상당히완화된것을확인할수있었다. 이는 A.C.C. 추출물이임상적으로도항염증및항균작용을통하여기저귀발진및땀띠등의증상을완화시키는물질이라는것을확실히한것이다 (Fig. 6). 그러므로, 항염증및항균효과를가지는 A.C.C. 추출물및이를주원료로한제품이염증성질환에대한효과적인대안이될수있을것으로사료된다. References [1] S. T. Lee, Y. R. Jeong, M. H. Ha, S. H. Kim, M. W. Byun, S. K. Jo," Induction of nitric oxide and TNF-α by herbal plant extract in mouse macrophage", J. Korean Soc. Food Sci. Nutr, vol. 29, pp , [2] T. Ljung, S. Lundberg, M. Varsanyi, C. Ohansson, P. T. Schmidt, M. Herulf, "Rectal nitric oxide as biomaker in the treatment of inflammatory bowel disease: responders versus non-responders", World Gastroenterol, vol. 12, no. 21, pp , June, DOI: [3] J. B. Jeong, S. C. Hong, H. J. Jeong, J. S. Koo, "Anti-inflammatory effects of ethyl acetate fraction from Cnidium officinale Makino on LPS-stimulated RAW and THP-1 cells", Korean Journal of Plant Resources, vol. 25, no. 3, pp , DOI: [4] J. Frostegård, A. K. Ulfgren, P. Nyberg, U. Hedin, J. Swedenborg, U. Andersson, G. K. Hansson, "Cytokine expression in advanced human atherosclerotic plaques: dominance of pro-inflammatory (Th1) and macrophage-stimulating cytokines", Atherosclerosis, vol. 145, no. 1, pp , July, DOI: [5] J. Shi, S. Shan, H. Li, G. Song, Z. Li, Anti-inflammatory effects of millet bran derived-bound polyphenols in LPS-induced HT-29 cell via ROS/miR-149/Akt/NF-κB signaling pathway, Oncotarget, vol. 8, no. 43, pp , September, DOI: [6] H. Zhang, B. Zhang, X. Zhang, X. Wang, K. Wu, Q. Guan, Effects of cathelicidin-derived peptide from reptiles on lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in weaned piglets, Vet Immunol Immunopathol, vol. 192, pp , October, DOI: [7] J. W. Lee, H. W. Ryu, S. Y. Park, H. A. Park, O. K. Kwon, H. J. Yuk, K. K. Shrestha, M. Park, J. H. Kim, S. Lee, S. R. Oh, K. S. Ahn, Protective effects of neem (Azadirachta indica A. Juss.) leaf extract against cigarette smoke- and lipopolysaccharide-induced pulmonary inflammation, Int J Mol Med. vol. 40, no. 6, pp , December, DOI: [8] J. H. Moon, H. Go, S. M. Shin, K. T. Kim, "Anti-inflammatory effect of extracts from Ligustrum obtusifolium S. fruits in RAW macrophages", J. Soc. Korean Med. Diagn, vol. 17, pp , [9] S. L. Masters, A. Simon, I. Aksentijevich, D. L. Kastner, "Horror Auto inflammaticus: The Molecular Pathophysiology of Autoinflammatory Disease", Annual Review of Immunology, vol. 27, no. 1, pp , DOI: [10] D. H. Kim, S. J. Park, J. Y. Jung, S. C. Kim, S. H. Byun, "Anti-inflammatory Effects of the Aqueous Extract of Hwangnyeonhaedok-tang in LPS-activated Macrophage Cells", Korean J. Herbol, vol. 24, no. 4, pp , [11] M. L. McDaniel, G. Kwon, J. R. Hill, C. A. Marshall, 509

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(Hyun-Jeong Cho) [ 정회원 ] 2002 년 2 월 : 인제대학교임상병리학과석사 2005 년 2 월 :

9 우용규 (Yong-Kyu Woo) [ 정회원 ] 1998 년 7 월 : 경북대학교전자공학학사 2003 년 2 월 : 서울대학교의용생체공학석사수료 2014 년 7 월 현재 : 네이처포, 개발 / 경영, 대표이사 < 관심분야 > 의용공학 조현정 (Hyun-Jeong Cho) [ 정회원 ] 2002 년 2 월 : 인제대학교임상병리학과석사 2005 년 2 월 : 인제대학교임상병리학과박사 2005 년 3 월 ~ 2006 년 2 월 : 일본 파마푸드박사후연수 2008 년 2 월 ~ 현재 : 건양대학교의과학대학임상병리학과부교수 < 관심분야 > 혈액학, 뇌과학 511

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,