DOI: /jkaoms 백서에서금식으로인한스트레스대응축활성화의회복조절기전에서구강인두로부터입수되는다양한맛자극의효과 유상배 1 이종호 1 류비탈리 2 장정원 1 1 서울대학교치의학대학원구강악안면외과학교실및치학연구소 2 Program in

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1 DOI: /jkaoms 백서에서금식으로인한스트레스대응축활성화의회복조절기전에서구강인두로부터입수되는다양한맛자극의효과 유상배 1 이종호 1 류비탈리 2 장정원 1 1 서울대학교치의학대학원구강악안면외과학교실및치학연구소 2 Program in Neuroscience, Department of Veterinary and Comparative Anatomy, Pharmacology and Physiology, Washington State University Abstract (J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2011;37: ) Effects of oropharyngeal taste stimuli in the restoration of the fasting-induced activation of the HPA axis in rats Sang-Bae Yoo 1, Jong-Ho Lee 1, Vitaly Ryu 2, Jeong-Won Jahng 1 1 Dental Research Institute, Department of Oral and Maxillofacial Surgery, Seoul National University School of Dentistry, Seoul, Korea 2 Program in Neuroscience, Department of Veterinary and Comparative Anatomy, Pharmacology and Physiology, Washington State University, Pullman, WA, United States Introduction: This study examined the regulatory mechanism underlying the meal-induced changes in the hypothalamic-pituitary-adrenal gland (HPA) axis activity. Materials and Methods: Male Sprague-Dawley rats ( g) were hired for two different experiments as follows; 1) rats received either 8% sucrose or 0.2% saccharin ad libitum after 48 h of food deprivation with the gastric fistula closed (real feeding) or opened (sham feeding). 2). rats received 5 ml of intra-oral infusion with 0.2% saccharin or distilled water after 48 h of food deprivation. One hour after food access, all rats were sacrificed by a transcardiac perfusion with 4% paraformaldehyde. The brains were processed for c-fos immunohistochemistry and the cardiac blood was collected for the plasma corticosterone assay. Results: Real feedings with sucrose or saccharin and sham feeding saccharin but not sucrose, following food deprivation decreased the plasma corticosterone level. c-fos expression in the nucleus tractus of solitarius (NTS) of the fasted rats was increased by the consumption of sucrose but not saccharin, regardless of the feeding method. On the other hand, the consumption of sucrose or saccharin with real feeding but not the sham, induced c- Fos expression in the paraventricular nucleus (PVN) of the fasted rats. The intra-oral infusion with saccharin or water decreased the plasma corticosterone level of the fasted rats. Intra-oral water infusion increased c-fos expression in both the PVN and NTS, but saccharin only in the NTS in the fasted rats. Conclusion: Neither restoration of the fasting-induced elevation of plasma corticosterone nor the activation of neurons in the PVN and NTS after refeeding requires the palatability of food or the post-ingestive satiety and caloric load. In addition, neuronal activation in the hypothalamic PVN may not be an implication in the restoration of the fasting-induced elevation of the plasma corticosterone by oropharyngeal stimuli of palatable food. Key words: Hypothalamic-pituitary-adrenal gland axis, Oropharyngeal food stimuli, Paraventricular nucleus, Nucleus tractus Solitarii [paper submitted / revised / accepted ] Ⅰ. 서론 장정원 서울특별시종로구연건동 28 서울대학교치의학대학원치의학과구강악안면외과학교실 Jeong Won Jahng Dental Research Institute, Seoul National University School of Dentistry 28, Yeongeon-dong, Jongno-gu, Seoul, , Korea TEL: FAX: jwjahng@snu.ac.kr 뇌시상하부 (hypothalamus) 는섭식행동및스트레스반응과관련된신경내분비계의통합조절작용이이루어지는부위이다 1,2. 뇌시상하부의측뇌실핵 (paraventricular nucleus) 은궁상핵 (arcuate nucleus) 의신경세포들로부터신경말단이풍부하게사출되어있어, 궁상핵을통해전달되는내장계의감각정보를통합조절하여섭식행동을제어하게하는뇌부위이다 3. 한편, 스트레스대응축 (hypothalamuspituitary-adrenal gland axis; HPA axis) 의중심에위치한측뇌실핵은, 개체가스트레스에노출될경우부신피질자극호르몬분비촉진호르몬 (corticotropin-releasing hormone) 을합성하여, 뇌하수체에서부신피질자극호르몬 (adrenocorticotrophic hormone) 의합성과분비를촉진시킨다. 부신피질자극호르몬은부신피질로부터스트레스대응축활성화의최종산물인당질코르티코이드 ( 설치류의경우, 코르티코스테론 ) 합성과분비를촉진시킨다 4,5. 생리적스트레스 This research was supported by a grant ( ) from Basic Science Research Program through the National Research Foundation of Korea (NRF) and a grant (2010K000812) from Brain Research Center of the 21st Century Frontier Research Program funded by the Ministry of Education, Science and Technology, the Republic of Korea. 195

2 J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2011;37: 상황인금식은백서의혈장코르티코스테론수준을현저히증가시키고 6-9, 재급식에의해혈장코르티코스테론수준은빠른시간내에정상수준으로회복된다 10,11. 구강을통한음식물의섭취는뇌간 (brain stem) 의신경세포들을활성화시킨다. 백서의구강에설치된도관을통해열량이있는액상의먹이를주입할경우, 미주신경등쪽핵 (dorsal motor nucleus of vagus), 고립로핵 (nucleus tractus of solitarius; NTS) 및최하구역 (area postrema) 에서 c-fos 발현이유도된다고보고되었다 12. 구강을통한일반사료의섭취도백서의고립로핵에서 c-fos 발현을유도하는데, 절식또는금식시킨백서의고립로핵에서 c-fos 발현양상은자유급식대조군에비해차이를보이지않는것으로보고되었다 13. 위장도관설치시술후액상의먹이를섭취한백서의고립로핵에서 c-fos 발현은일반사료섭취대조군의경우와비슷한정도로유도되며, 위장도관이열린상태에서구강을통한액상먹이의섭취 (sham feeding) 는특히고립로핵의전두부 (rostral-nts) 에서 c-fos 발현을위장도관이닫힌액상먹이섭취대조군 (real feeding) 의경우와유사한정도로유도한다고보고되었다 14. 음식물섭취로인한위팽창 (gastric distension) 은식사시포만감을증진시키는데 15, 위장의기계적팽창은미주신경등쪽핵, 고립로핵및최하구역으로구성된등쪽미주신경집합체 (dorsal vagal complex) 에서흥분성시냅스정보를지닌기계적자극수용체 (vagal mechanoceptor) 를활성화시킨다 16,17. 사후위장내용물 (gastric content) 의무게와고립로핵의카테콜아민 (catecholamine) 뉴런에서 c-fos 발현정도사이에는양성적인상관관계 (positive correlation) 가있다고보고되었다 13. 구강을통한음식물섭취시고립로핵에입수된미각및위내장계의정보는뇌시상하부의측뇌실핵으로전달되어스트레스대응축의활성화정도를변화시키는것으로생각되고있다. 신경세포활성화의인덱스로사용되는 c-fos 면역조직염색법을통한연구로부터, 미각정보는고립로핵, 그물형성체 (reticular formation), 부완핵및편도체 (amygdala) 등의뇌영역에서신경세포활성을유도한다는사실이알려졌다 18. 혀와입으로부터의미각경로는안면신경 (VII), 설인신경 (IX) 및미주신경 (X) 을통해후두와인두로부터고립로핵의전두부 (rostral-nts) 및중간부 (intermediate-nts) 에도달한다 고립로핵으로부터의미각정보는초기미각과내장신호의통합이일어나는교뇌의부완핵 (parabrachial nucleus) 에투사되고 19,20, 그신경원으로부터의축삭은시상의배쪽후내측핵 (ventral posteromedial nucleus) 으로사출된다 19,21. 시상핵으로부터미각정보는뇌섬엽피질 (insular cortex) 이라불리는미각신피질 (neocortex) 에도달한다 위내장계자극경로는미주신경을거쳐최하구역 (area postrema) 에도달후고립로핵의후두부 (caudal-nts) 에도달한다 20,25. 고립로핵에전달된위내장계정보는교뇌의부완핵, 중앙편도체 (central amygdala) 및뇌시상하부측뇌실핵에투사되고 20,26, 시상의배쪽후핵 (ventral posterior lateral thalamus) 의소세포부로전달되는것으로알려져있다 27. 본연구진은이전연구에서, 백서의금식동안증가되었던혈장코르티코스테론수준은열량이함유되지않은먹이섭취에의해서도빠르게회복되는것을보고하였다 28. 본연구에서는, 백서의금식동안증가된혈장코르티코스테론수준의회복조절기전에서구강내의다양한맛자극의효과를검색하였다. 1. 실험동물 Ⅱ. 연구대상및방법 Sprague-Dawley 종 g 의수컷백서를구입 (Koatech, Pyeongtaek, Korea) 하여서울대학교치학연구소실험동물실에서사육유지시켰고 ( 서울대학교실험동물자원관리원실험동물위원회승인번호, SNU ), 실험기간동안온도 (22±1 ) 와습도 (55%) 가 12 시간명암주기 ( 명주기 : 7:00-19:00) 로일정하게유지되는 specific pathogen free (SPF) 환경에서동물을유지시켰다. 백서는단독 cage 에유지시키며물과먹이를자유롭게섭취할수있도록공급하였다. 실험시작전 1 주일간은매일체중을측정하면서실험실환경과실험자에게익숙해지도록적응시켰다. 실험군간의체중차이를최소화하기위해, 백서의체중을정렬 (latin-square design) 하여실험군을분류하였다. 실험 1. 위장계의팽만감이배제된상태에서구강을통한음식물의자발적섭취가혈장코르티코스테론수준및뇌조직뉴런활성화에미치는효과검색 위도관이설치시술된백서에게위도관이닫힌상태 (real feeding) 또는열린상태 (sham feeding) 에서액상의먹이를자발적으로섭취하도록하였다. Real feeding 을통해서는음식물의섭취와소화과정에서형성되는구강및위내장계의자극이뇌로전달될수있다 Sham feeding 은구강을통해섭취된액상의음식물이위도관을통해누출되므로위내장계의자극이배제된다 33. 실험군은금식 (food deprivation, FD) 군, 설탕용액 real feeding (R/Suc) 또는 sham feeding (S/Suc) 군, 사카린용액 real feeding (R/Sac) 또는 sham feeding (S/Sac) 군으로나누어설정하였다. FD 군은 48 시간동안사료공급을중단하였고물은자유롭게섭취하도록하였다. R/Suc 군또는 S/Suc 군은 48 시간동안의사료공급중단후 8% 설탕용액을 1 시간동안자유로이섭취하도록하였다. R/Sac 군또는 S/Sac 군은 48 시간동안의사료공급중단후 0.2% 사카린용액을 1 시간동안자유로이섭취하도록하였다. 각실험군의뇌조직시료는심장관류법으로고정한후채취하여 c-fos 면역염색법으로분석하였으며, 혈액시료 196

3 백서에서금식으로인한스트레스대응축활성화의회복조절기전에서구강인두로부터입수되는다양한맛자극의효과 는심장으로부터채취하여혈장코르티코스테론분석에사용되었다. 실험 2. 음식물의자발적섭취행동, 위내장계의포만감및흡수된열량의효과가배제된상황에서구강내의음식물자극이혈장코르티코스테론수준및뇌조직뉴런활성화에미치는효과검색 백서의구강에설치된도관을통해액상의먹이를주입하였다. 실험군은 FD 군, 증류수주입 (DW) 군, 사카린용액주입 (Sac) 군으로나누었다. FD 군은뇌조직및혈액시료채취전 48 시간동안사료공급을중단하였고물은자유롭게섭취하도록하였다. DW 군및 Sac 군은 48 시간동안의사료공급중단후구강도관을통해증류수또는 0.2% 의사카린용액을 5 ml 씩 syringe infusion pump 를사용하여 1 분당 0.5 ml 의속도로서서히주입하였다. 증류수또는사카린용액을주입하고 1 시간후에뇌조직및혈액시료를채취하였다. 뇌조직시료는심장관류법으로고정한후채취하여 c-fos 면역염색법으로분석하였으며, 혈액시료는심장으로부터채취하여혈장코르티코스테론분석에사용되었다. 2. c-fos 면역조직화학염색법 백서의복강에 pentobarbital (120 mg/kg) 과 chloral hydrate 혼합액을과용량복강내주사하여신속히마취시킨후, 심장관류법 (transcardiac perfusion) 을이용하여헤파린 (JWpharma.co., Seoul, Korea) 이첨가된 0.9% 생리염수를혈관에흘려보내어혈액을제거하고, 이어서냉각시킨고정액 (4% paraformaldehyde, 0.1 M sodium phosphate buffer, ph 7.2) 을주입하여조직을고정시켰다. 생리염수와고정액은매개체당각기 100 g 당 50 ml 및 100 ml 를소모하였으며, peristatic pump 를사용하여매분당 4.5 ml 의속도로서서히주입하였다. 뇌를신속히적출하여동일한고정액으로 2 시간동안 4 에서후고정시킨후, 냉동절편제작시조직의손상을방지할목적으로 30% sucrose 용액에 24 시간동안보관하였다. Sliding microtome (Microm, Zeiss, Germany) 을이용하여측뇌실핵 (bregma -1.3 mm 와 -2.1 mm 사이 ) 과고립로핵 (bregma mm 와 mm 사이 ) 34 조직을 40 μm두께로냉동박절하였다. 조직을 0.1 M PBS (phosphate buffered saline, ph 7.2) 에모았다. Triton 용액 (1% bovine serum albumin, 0.2% Triton X-100, 0.1 M PBS) 에 30 분간처리후, polyclonal anti-rabbit c-fos antibody (Calbiochem, CA, USA) 로상온에서 16 시간반응시켰다. PBS-BSA (0.5% BSA, 0.1 M PBS) 로조직을세척하고, biotinylated anti-rabbit IgG (1:200, Vector Laboratories, CA, USA) 로 1 시간동안반응시켰다. 다시 PBS-BSA 로조직을세척한다음, avidinbiotin complex (ABC Elite kit, Vector Laboratories, CA, USA) 에 1 시간반응시켰다. 0.1 M phosphate buffer 로조직을세 척한후, DAB (0.05% 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride, 0.003% hydrogen peroxide, 0.1 M phosphate buffer, ph 7.2) 를이용하여 5 분동안발색시켰다. 슬라이드에부착된염색된뇌조직은일반적인탈수 (dehydration) 와청명 (cleaning) 과정을거친후, Permount (Fisher, CA, USA) 를이용하여덮개유리를씌웠다. 3. 혈장코르티코스테론농도측정 백서를 2 항에서와동일한방법으로마취한후흉강을열고심이를통해혈액을채취하였다. 헤파린 - 나트륨함유진공혈청분리관 (BD Vacutainer, NJ, USA) 에넣어 20 분간실온방치하였다. 2,000 rpm 에서 20 분동안원심분리한후, 혈장만을수집하여분석할때까지 -70 극저온냉동고에보관하였다. 혈장내코르티코스테론농도는방사능 125 I 으로표지된 Rat Corticosterone Kit (DPC, CA, USA) 를이용하여측정하였다. 4. 위장도관설치시술 (Gastric cannulation) 수술전위장을완전히비우기위해백서를 24 시간동안금식시켰고, pentobarbital (70 mg/kg) 과 chloral hydrate 혼합액 (3 ml/kg) 으로마취시켰다. 수술을위해배쪽의털을면도하고베타딘 (Sung Kwang Pharm. co., Cheonan, Korea) 으로소독하였다. 복부중심선에서 4-5 mm 측면에서시작하여 cm 의복부절개를실시하였다. 절개를통해위장이노출되면복강밖으로 forcep 으로부드럽게잡아당겨멸균거즈위에놓았다. 위앞쪽벽을 2-3 mm 절개해스테인레스스틸재질의도관 (cannula) 을삽입후이음새를 6 번실크를사용하여쌈지봉합 (purse-string suture) 하였다. 상처난조직을아물게하고위주변에서액이새어나오지못하도록망상직물 (mesh) 을도관에끼워넣어위바깥표면에놓았다. 위를원래위치에놓고복부근육과피부를 3 번실크를사용하여단속적봉합 (interrupted suture) 으로절개부위를봉합하였다. 스테인레스스틸재질의 washer 를도관에돌려서끼워넣고나사를도관안에끼워놓았다. 감염을최소화하기위하여수술후 4-5 일동안항생제 trimethoprim sulfate (0.5 ml/kg) 를근육주사하였다. 도관설치시술후 7-10 일간의회복기동안영양이배려된유동식을공급한후실험에사용하였다. 5. 구강내도관설치시술 (Intraoral cannulation) 백서를 pentobarbital (45 mg/kg) 과 chloral hydrate 혼합액 (2 ml/kg) 으로마취시킨후턱밑의피부를 2 mm 정도절개하였다. 중간부위를 30 도정도로구부린 20 게이지스테인레스스틸바늘 ( 길이 : 1.5 inch) 을턱밑의절개된부위로부터구강안쪽으로찔러넣고, 한쪽끝에지지대를가진 20 cm 197

4 J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2011;37: 길이의주입관 (polyethylene tubing, PE 90, Clay Adams, MD, USA) 의반대쪽을바늘끝에끼워서턱밑으로빼내었다. 두귀와앞다리의중간쯤에위치하는등쪽피부를 2 cm 정도절개하고철사를넣어피부밑을통과하여턱밑피부절개부위로나오게하였다. 턱밑으로나와있는주입관을철사에끼우고, 철사를잡아당겨서주입관이등쪽절개부위로끌려나오게하였다. 주입관에서철사를분리하고턱밑의피부절개부위를 3 번실크를사용하여봉합하였다. 등쪽피부절개부에노출된주입관에보조관 (supporting tube) 을끼우고절개부위의안쪽피부에봉합고정시킨후, 절개부위의피부를수술클립 (surgical clip) 으로봉합하였다. 보조관을한손으로잡고주입관을다른손으로당겨서지지대가달린주입관의끝이혀밑에제대로위치되었는지확인한다음, 보조관의위쪽끝부분과주입관사이의공간을순간접착제 (3M, MN, USA) 로봉합하였다. 등쪽으로노출되어있는주입관의길이를 5-6 cm 정도되게자르고주입관속으로생리염수를주입하여입에서생리염수가나오는지확인한후수술부위를베타딘으로소독하였다. 수술후 3 일동안항생제를주사하였다. 7 일간의회복기를거쳐서실험에사용하였다. 6. 정량화및통계처리 c-fos 항체로면역염색된세포의수는 Olympus BX-50 광학현미경 (Olympus Co., Tokyo, Japan) 과 MCID image analyze system (Imaging Research Inc., Ontario, Canada) 을이용하여측정하였다. 각개체당해부학적으로근접한측뇌실핵 (bregma-1.88 mm 근접 ) 의 2 개의조직절편들을측정하여각절편당평균값을계산하였다. 고립로핵은후미부 (c- NTS) 와중간부 (i-nts) 의지역으로구분하여, 각개체당 4 개씩의조직절편들을측정하였다. 실험결과는평균 ± 표준오차로나타내었으며, 통계분석을위하여 statview (version 5.01, The SAS Institute, CA, USA) 프로그램을사용하였다. 모든실험수치는각군간분류하여일원분산분석 (one-way ANOVA) 방법을사용하였다. 실험군간분산분석결과에서유의한차이는최소유의차검정법 (Fisher s protected least significance difference, PLSD) 으로사후검정법 (post-hoc test) 을수행하여차이를규명하였고, 각각의그래프들은 GraphPad PRISM (version 3.02, GraphPad Software Inc., CA, USA) 을사용하여나타냈다. Ⅲ. 결과 1. 구강을통한음식물의자발적섭취가혈장코르티코스테론수준및뇌조직뉴런활성화에미치는효과 위도관이설치시술된백서에게, 48 시간동안의금식후 real feeding 또는 sham feeding 방식으로액상의먹이를 1 시간동안자발적으로섭취하도록하였다. 설탕용액을공급받은실험군에서는 real feeding 군 (R/Suc) 에비해 sham feeding 군 (S/Suc) 의음용량이감소된것으로보였지만, 통계적으로유의한차이는아니었다.(Table 1) 사카린용액을공급받은경우에는 real feeding 군 (R/Sac) 에비해 sham feeding 군 (S/Sac) 의음용량이현저히감소되었다.(P<0.05) 각실험군에서채취된혈액의혈장코르티코스테론농도를방사성동위원소를이용한면역분석법으로측정하였다. R/Suc 군의혈장코르티코스테론수준은금식군 (FD) 에비해통계적으로유의하게감소되었지만 (P<0.05), S/Suc 군의혈장코르티코스테론수준은 FD 군에비해차이를보이지않았다.(Fig. 1) 한편, 금식후사카린용액을음용한실험군은 R/Sac 군뿐아니라 S/Sac 군에서도혈장코르티코스테론수준이 FD 군에비해통계적으로유의하게감소되었다. (P<0.05) 각실험군의측뇌실핵과고립로핵조직절편으로 c-fos 면역조직화학분석을실행하였다.(Figs. 2, 3) 측뇌실핵의 c-fos 면역조직화학염색강도는 R/Suc 군또는 R/Sac 군에서나머지실험군들에비해증가된것으로관찰되었다.(Figs. 2. A-E) c-fos 면역양성핵의수를정량분석한결과, 설탕용액또는사카린용액의 real feeding 군측뇌실핵에서 c-fos 면역양성핵의수가금식군에비해통계적으로유의하게증가되었으며 (P<0.05), S/Suc 군또는 S/Sac 군에서는이와같은증가가관찰되지않았다.(Fig. 3. A) 고립로핵의 c-fos 면역조직화학상을검색한결과 (Figs. 2. F-O, 3. B), 설탕용액을음용한실험군에서는섭식방법에상관없이고립로핵후미부 (R/Suc, P<0.05; S/Suc, P<0.001) 와중간부 (R/Suc, P<0.01; S/Suc, P<0.001) 에서 c-fos 면역양성핵의수가금식군에비해뚜렷하게증가되었다.(Fig. 3. B) 사카린용액을 real feeding 또는 sham feeding 방식으로음용한실험군의고립로핵에서 c-fos 면역양성핵의수는금식군의것과차이를보이지않았다. Table 1. Liquid intake during 1 h of refeeding period following 48 h of food deprivation Groups R/Suc S/Suc R/Sac S/Sac Liquid Intake (g) ± ± ±2.191* 6.393±1.271 (R/Suc: 1 h real refeeding with sucrose, S/Suc: 1 h sham refeeding with sucrose, R/Sac: 1 h real refeeding with saccharin, S/Sac: 1 h sham refeeding with saccharin) *P<0.05 vs. S/Sac, Data is presented by means±s.e. 198

5 백서에서금식으로인한스트레스대응축활성화의회복조절기전에서구강인두로부터입수되는다양한맛자극의효과 A B C D E F G H I J K L M N O FD R/Suc S/Suc R/Sac S/Sac Fig. 1. Plasma corticosterone levels. Rats received ad libitum access to either 8% sucrose or 0.2% sodium saccharin for 1 h with gastric fistula closed (real feeding) or opened (sham feeding) following 48 h of food deprivation. Cardiac blood was collected immediately after exposing the heart for perfusion, and the plasma level of corticosterone was analyzed by radioimmunoassay.(fd: 48 h food deprivation) *P<0.05 vs. FD, Data is presented by means±s.e. Fig. 2. c-fos immunohistochemistry in the PVN and the NTS. Rats were trans-cardiac perfused with 4 % PFA immediately after 1 h of ad libitum access to either 8% sucrose or 0.2% sodium saccharin for 1 h with gastric fistula closed (real feeding) or opened (sham feeding) following 48 h of food deprivation. Distinctive black dots represent c-fos immunoreactivity (-ir) nuclei. A-E. PVN, f-j. caudal NTS (c-nts), K-O. intermediate NTS (i-nts). (FD: 48 h food deprivation, R/Suc: 1 h real refeeding with sucrose, S/Suc: 1 h sham refeeding with sucrose, R/Sac: 1 h real refeeding with saccharin, S/Sac: 1 h sham refeeding with saccharin, AP: area postrema, 3v: 3rd ventricle, 4v: 4th ventricle) Scale bars: 200μm. Fig. 3. The number of c-fos-immunoreactive (-ir) nuclei in the PVN (A) and NTS (B).(FD: 48 h food deprivation) *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 vs. FD, Data is presented by means±s.e. 199

6 J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2011;37: 구강내의음식물자극이혈장코르티코스테론수준및뇌조직뉴런활성화에미치는효과 음식물의자발적섭취행동, 위내장계의포만감및흡수된열량의효과가배제된상황에서구강내의음식물자극의효과를검색하기위해, 백서의구강에도관을설치시술하였다. 48 시간동안사료공급이중단된백서의구강에도관을통해 0.2% 의사카린용액을주입하고 1 시간후혈장코르티코스테론수준을검색한결과, 금식군 (FD) 에비해현저하게감소 (P<0.05) 된것을알수있었다.(Fig. 4) 또한, 금식후구강도관을통해증류수가주입된 DW 군의혈장코르티코스테론수준도 FD 군에비해통계적으로유의한감소를보였다.(P<0.05) 각실험군의측뇌실핵에서 c-fos 면역양성핵의수를정량분석한결과 (Fig. 5. A), DW 군의측뇌실핵에서 c-fos 유전자발현이 FD 군에비해증가된것으로분석되었다. (P<0.05) 사카린용액주입군 (Sac) 의측뇌실핵에서 c-fos 유전자발현은 FD 군과통계적으로유의한차이를보이지않았다.(Fig. 5. A) 한편, 금식후구강도관을통한사카린용액의주입은고립로핵에서 c-fos 유전자발현을효과적으로유도하여, 고립로핵의중간부 (P<0.05) 에서 c-fos 면역양성핵의수가 FD 군에비해뚜렷하게증가되었다.(Fig. 5. B) 흥미롭게도, DW 군의고립로핵중간부에서 c-fos 면역양성핵의수가 FD 군에비해증가된것으로분석되었다. (P<0.05) Fig. 4. Plasma corticosterone levels. Rats received intra-oral infusion with saccharin or distilled water for 10 min following 48 h of food deprivation, and then were sacrificed for analyzing plasma level of corticosterone.(fd: 48 h food deprivation, Sac: intra-oral infusion with 0.2% saccharin, DW: intra-oral infusion with distilled water) *P<0.05, **P<0.01 vs. FD, Data is presented by means±s.e. Fig. 5. The number of c-fos-immunoreactive (-ir) nuclei in the PVN (A) and NTS (B).(FD: 48 h food deprivation, Sac: intraoral infusion with 0.2% saccharin, DW: intra-oral infusion with distilled water) *P<0.05, **P<0.01 vs. FD, Data is presented by means±s.e. 200

7 백서에서금식으로인한스트레스대응축활성화의회복조절기전에서구강인두로부터입수되는다양한맛자극의효과 Ⅳ. 고찰 1. 구강을통한음식물섭취에따른혈장코르티코스테론변화 백서의혈장코르티코스테론수준은금식동안증가되고 6-9, 재급식후빠른시간내에정상수준으로회복된다고 10,11 보고되었다. 본연구진은이전의연구에서, 재급식시열량이배제된사료역시비록정상사료보다속도는느리지만금식동안증가된혈장코르티코스테론수준을회복시키는것으로보고하였다 28. 본연구에서, 위도관이설치된백서에게금식후 real feeding 방식으로설탕용액또는사카린용액을음용하도록한결과, 혈장코르티코스테론수준이금식대조군에비해유의하게감소된것으로나타났다. 이러한결과는열량의유무에관계없이단맛이있는음식물의섭취는금식동안증가되었던혈장코르티코스테론수준을회복시킬수있음을시사한다. 맛있는음식의섭취는스트레스에대한심리적이고생리적인반응을감소시킬수있다고보고되었다 35. 역설적수면부족 (paradoxical sleep deprivation, PSD) 이유도된백서에서사카린및설탕용액의섭취는혈중의부신피질자극호르몬및코르티코스테론수준을감소시킨다고보고되었다 36. 위도관이설치시술된백서에서 real feeding 방식은위도관을닫은상태에서음식물을자발적으로섭취하도록하는방법으로, 음식물의섭취과정동안음식의질감이나맛등의구강내의물리, 화학적자극뿐아니라위내장계에서포만감및소화흡수로인한자극정보들을형성하게된다 따라서단맛이나는음식물섭취에따른구강및위내장계의정보는, 영양성분의소화흡수로형성되는정보가배제된상태에서도, 금식으로인한스트레스대응축의활성화를회복시키는신호가될수있는것으로사료된다. 한편, 금식후사카린용액또는설탕용액을 sham feeding 방식으로음용시킨결과, 사카린용액 sham feeding 군의혈장코르티코스테론수준은금식대조군에비해감소되었으나, 설탕용액 sham feeding 군은금식대조군과차이를보이지않았다. Sham feeding 방식은위도관이열린상태에서음식물을섭취하도록하는방법으로, 구강에서섭취된액상의음식물이위도관을통해위장밖으로유출되므로음식의질감이나맛등의구강내의물리, 화학적자극은형성하지만 33 위내장계의포만감및소화흡수로인한자극정보의형성을최소화시킬수있기때문에, 백서에서음식맛의선호도를측정하기위한유용한방법으로알려져있다 29. 따라서이전의보고 37 에서와같이금식후 sham feeding 군의사카린용액음용량이 real feeding 군의사카린음용량보다현저히감소했음에도불구하고, 사카린용액 sham feeding 군의혈장코르티코스테론수준이금식군에비해감소되었다는사실은, 구강및인두에서의단맛정보가금식으로인한스트레스대응축활성화를회복시키는데강 력하고유효한자극이됨을시사한다. 그런데, 금식후 sham feeding 군의설탕용액음용량이 real feeding 군의설탕용액음용량과유사했음에도불구하고, 설탕용액 sham feeding 군의혈장코르티코스테론수준은금식군의것과차이를보이지않았다는점은주목할만하다. 이전의연구에서, 금식상태의백서에게 sham feeding 을하였을때, 포도당용액의음용량이사카린용액음용량에비해현저히많은것으로보고된바있다 38. 본연구의 sham feeding 결과에서도, 열량이없는사카린용액음용량에비해열량이있는설탕용액음용량이많은것을알수있다. 앞서, sham feeding 은백서에서음식맛의선호도를측정하기위한유용한방법으로사용된다는사실을언급한바 29, 백서의구강및인두에서포도당, 설탕등의열량이있는단맛을열량이없는사카린의단맛보다선호하는맛으로인지한다는것을알수있다. 따라서구강인두에서사카린의단맛인지는금식에의한스트레스대응축활성화를회복시키는데효과적신호를형성하였으나, 백서가사카린보다선호하는설탕의단맛은오히려효과적이지못하였다는결론에이르게된다. 현재로서는그기전을설명할만한근거는없으나, 구강인두를통해인지된설탕맛의정보로부터백서가예상하였던위내장계를통한열량의유입이 sham feeding 방식에서는이루어지지않은것이또다른스트레스상황이되었을가능성을짐작할수있다. 백서의위장에설치된도관을열고진행하는 sham feeding 방식의실험결과에서, 금식스트레스, 즉금식으로인한스트레스대응축의활성화를완화시키는데있어서구강및인두를통한사카린맛의수용은유효한효과를내었으나, 설탕맛의수용은그렇지못하였다. 금식스트레스의완화효과가구강인두에서특정맛의수용을필요로하는지알아보기위해, 금식상태의백서에게구강도관을통하여소량의사카린용액또는증류수를공급하였다. 구강에설치된도관을통해음식물을공급하는방법은, 자유롭게움직이는백서에게동일한양의액상음식물을일정한속도로공급하여미각자극에대한반응을평가하는방법으로사용된다 39. 금식후소량의증류수만을공급받은백서의혈장코르티코스테론수준이, 사카린공급군의경우와마찬가지로, 금식군에비해통계적으로유의하게감소된결과는, 금식스트레스의완화를위해구강인두내의특정맛수용이필수적이지않음을시사한다. 이전의연구에서, 백서에서 48 시간동안의금식은물에대한양성적쾌감 (hedonic) 반응을증진시킨다고보고되었다 40. 쾌감반응의조절기전에는전뇌의중격의지핵이중심역할을하는것으로알려져있으며 41-43, 스트레스반응시중격의지핵뉴런의활성화가수반된다고보고되었다 본연구결과에서, 백서의금식후구강인두에주어진소량의증류수자극은고립로핵및측뇌실핵의뉴런활성화를유도하는사실을알았다. 따라서금식후구강인두에주어지는소량의증류수에의한금식스트레스완화효과에는고립로핵및측뇌 201

8 J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2011;37: 실핵뉴런활성화와연계하여중격의지핵뉴런의기능이관련되었을가능성을짐작할수있다. 2. 구강을통한음식물섭취에따른측뇌실핵뉴런의활성화기전 백서의경우, 음식물섭취시측뇌실핵및고립로핵에서 c-fos 유전자발현이유도되는데 10,12-14,48, 특히열량을함유한단맛음료의 real feeding 은측뇌실핵뉴런에서 c-fos 발현을유도한다고보고되었다 48. 본연구에서는열량을함유한단맛음료인설탕용액뿐아니라열량을함유하지않은단맛음료인사카린용액의 real feeding 에의해서도측뇌실핵의 c-fos 발현이뚜렷하게유도되었으나, sham feeding 으로섭취된설탕용액및사카린용액은측뇌실핵뉴런에서 c-fos 발현을유도하지못함을보여주었다. 이결과는음식물섭취시, 음식물에함유된열량이나음식의맛정보보다는위내장계의팽만감이측뇌실핵뉴런의활성화를유도하는유효한자극정보가됨을시사한다. 백서의위장에설치된풍선을이용한이전의연구에서위장의인위적팽창은측뇌실핵뉴런의활성화를유도한다고보고된바있다 16. 음식물의섭취시구강인두에서의맛자극과위내장계의팽만감등의자극정보는후뇌의고립로핵을통해시상하부의측뇌실핵으로전달되는것으로알려졌다 18-20,49. 본연구에서, 설탕용액의 real feeding 또는 sham feeding 은모두고립로핵후미부및중간부뉴런의활성화를효과적으로유도하였으나, 측뇌실핵뉴런의활성화는설탕용액 real feeding 에의해서만유도되었다. 이결과는, 구강을통한음식물섭취시구강인두에서형성되는자극에의한고립로핵뉴런의활성화는측뇌실핵뉴런의활성화를유도하기에충분한정보가아님을시사한다. 한편, 음식물섭취시위내장계의정보는간뇌의고립로핵후미부와교뇌의부완핵을거쳐시상하부의측뇌실핵으로전달된다고알려져있다 20,26. 본연구에서위장도관이설치된백서의사카린용액 real feeding 은고립로핵뉴런의활성화를효과적으로유도하지못하였음에도불구하고측뇌실핵뉴런의활성화를뚜렷하게유도한것을보았다. 이는, 음식물섭취시위내장계의자극정보는고립로핵후미부뉴런의활성화를매개로하지않고서도측뇌실핵뉴런의활성화를유도할수있음을뜻한다. 구강을통한음식물섭취시위내장계의자극정보는고립로핵후미부에서뇌로입수되고 20,25, 구강인두의맛정보는고립로핵의전두부및중간부에서입수되는것으로알려져있다 본연구에서, 위도관이설치시술된백서에서사카린용액의 sham feeding 은고립로핵중간부뉴런의활성화를효과적으로유도하지못하였으나, 구강도관이설치된백서에서사카린용액의소량공급은고립로핵중간부뉴런의활성화를뚜렷하게유도하였다. 이전의연구에서도, 구강도관을통한사카린용액주입은고립로핵에 서 c-fos 발현을증가시킨다고보고되었다 50. 사카린용액의 sham feeding 에의한고립로핵뉴런의 c-fos 유전자발현유도에관한다른연구자들의보고는찾아보기힘들고, 본연구진은이전연구에서백서의금식후사카린이함유된무열량사료의섭취는고립로핵에서 c-fos 발현을유도하지못함을보고한바있다 28. 백서에서구강도관을통한음식물의공급은음식물섭취에대한자발적인의지가없는상황에서인위적으로구강내자극을유도하는방식으로, 음식물섭취과정에서수반되는뇌부위활성화의조절기전에있어서음식물의자의적섭취행동이요구되는 sham feeding 방식과는근본적으로차이가있다. 이전의연구에서, 구강도관을통한증류수의공급은백서의고립로핵중간부에서 c-fos 유전자발현을유도한다고보고되었다 18. 본연구결과에서, 금식후구강도관을통한증류수공급은간뇌의고립로핵중간부뿐아니라전뇌의측뇌실핵에서도 c-fos 발현을유도하였다. 반면, 구강도관을통한사카린용액의공급은고립로핵중간부에서 c-fos 발현은통계적으로유의하게증가시켰으나측뇌실핵뉴런에서 c-fos 발현은효과적으로유도하지못하였다. 이러한결과는, 금식후구강에주어진증류수자극에의한측뇌실핵뉴런의활성화는고립로핵뉴런의활성화를매개로한것이아닐가능성을시사한다. 3. 혈장코르티코스테론수준변화와측뇌실핵뉴런활성화 백서의혈장코르티코스테론수준은금식동안증가되고 6-9, 재급식후빠른시간내에정상수준으로회복된다 10,11 는보고들로부터, 재급식시고립로핵을통해스트레스대응축의중심에위치된측뇌실핵에전달되는구강인두및위내장계의정보가금식동안증가되었던스트레스대응축의활성화의완화에기여할가능성이시사된다. 본연구에서, 설탕용액또는사카린용액의 real feeding 이측뇌실핵뉴런의 c-fos 유전자발현을유도한동시에금식동안증가되었던혈장코르티코스테론수준을감소시켰다. 뇌조직에서 c-fos 유전자발현은뉴런활성화의일반적지표로사용된다. 따라서이결과는, 구강인두및위내장계에서전달된정보에의한측뇌실핵뉴런활성화와혈장코르티코스테론수준감소사이의관련성을시사한다. 또한구강도관을통해공급된소량의증류수가측뇌실핵뉴런활성화와아울러혈장코르티코스테론감소를유도한결과는, 재급식시측뇌실핵뉴런활성화와혈장코르티코스테론수준감소사이의연관성을더욱뒷받침한다. 한편, sham feeding 또는구강도관을통해공급된사카린용액은측뇌실핵뉴런의활성화를효과적으로유도하지못하였으나금식동안증가되었던혈장코르티코스테론수준을감소시켰다. 이결과는, 구강인두에서입수된선호맛자극은측뇌실핵뉴런활성화를통하지않는다른신경전달회로를통해스트 202

9 백서에서금식으로인한스트레스대응축활성화의회복조절기전에서구강인두로부터입수되는다양한맛자극의효과 레스대응축활성화의회복기전에관여할것임을시사한다. 금식동안증가되었던스트레스대응축의회복조절기전을밝히기위해서는구강내의다양한맛자극에의해활성화되는측뇌실핵뉴런의정체를규명하는연구가선행되어야할것으로사료된다. Ⅴ. 결론 1. 재급식시구강및인두에서수용되는음식의맛이나위내장계의포만감및열량흡수등의정보는, 금식동안증가된혈장코르티코스테론수준의회복을위한필수적인조건이아님을알수있었다. 2. 구강인두에서입수되는음식의맛이나열량정보는측뇌실핵및고립로핵뉴런활성화를유도하기위한효과적인신호이기는하나필수조건은아님을알수있었다. 3. 구강인두에서입수된선호맛자극은금식으로인한스트레스대응축의증가된활성도를회복시킬수있는데, 이기전에측뇌실핵뉴런활성화는중심적역할을하지않을것임이시사되었다. References 1. Isse T, Ueta Y, Serino R, Noguchi J, Yamamoto Y, Nomura M, et al. Effects of leptin on fasting-induced inhibition of neuronal nitric oxide synthase mrna in the paraventricular and supraoptic nuclei of rats. Brain Res 1999;846: Nelson RJ, Kriegsfeld LJ, Dawson VL, Dawson TM. Effect of nitric oxide on neuroendocrine function and behavior. Front Neuroendocrinol 1997;18: Watts AG. Understanding the neural control of ingestive behaviors: helping to separate cause from effect with dehydration-associated anorexia. Horm Behav 2000;37: Antoni FA. Hypothalamic control of adrenocorticotropin secretion: advances since the discovery of 41-residue corticotropin-releasing factor. Endocr Rev 1986;7: Whitnall MH. Regulation of the hypothalamic corticotropin-releasing hormone neurosecretory system. Prog Neurobiol 1993;40: Kiss A, Jezova D, Aguilera G. Activity of the hypothalamic pituitary adrenal axis and sympathoadrenal system during food and water deprivation in the rat. Brain Res 1994;663: van Haasteren GA, Linkels E, van Toor H, Klootwijk W, Kaptein E, de Jong FH, et al. Effects of long-term food reduction on the hypothalamus-pituitary-thyroid axis in male and female rats. J Endocrinol 1996;150: Yoshihara T, Honma S, Katsuno Y, Honma K. Dissociation of paraventricular NPY release and plasma corticosterone levels in rats under food deprivation. Am J Physiol 1996;271:E Kim YM, Lee JY, Choi SH, Kim DG, Jahng JW. RU486 blocks fasting-induced decrease of neuronal nitric oxide synthase in the rat paraventricular nucleus. Brain Res 2004;1018: Timofeeva E, Picard F, Duclos M, Deshaies Y, Richard D. Neuronal activation and corticotropin-releasing hormone expression in the brain of obese (fa/fa) and lean (fa/?) Zucker rats in response to refeeding. Eur J Neurosci 2002;15: Jahng JW, Lee JY, Yoo SB, Kim YM, Ryu V, Kang DW, et al. Refeeding-induced expression of neuronal nitric oxide synthase in the rat paraventricular nucleus. Brain Res 2005;1048: Fraser KA, Davison JS. Meal-induced c-fos expression in brain stem is not dependent on cholecystokinin release. Am J Physiol 1993;265:R Rinaman L, Baker EA, Hoffman GE, Stricker EM, Verbalis JG. Medullary c-fos activation in rats after ingestion of a satiating meal. Am J Physiol 1998;275:R Fraser KA, Raizada E, Davison JS. Oral-pharyngeal-esophageal and gastric cues contribute to meal-induced c-fos expression. Am J Physiol 1995;268:R Phillips RJ, Powley TL. Gastric volume rather than nutrient content inhibits food intake. Am J Physiol 1996;271:R McCann MJ, Rogers RC. Impact of antral mechanoreceptor activation on the vago-vagal reflex in the rat: functional zonation of responses. J Physiol 1992;453: Raybould HE, Gayton RJ, Dockray GJ. CNS effects of circulating CCK8: involvement of brainstem neurones responding to gastric distension. Brain Res 1985;342: Harrer MI, Travers SP. Topographic organization of Fos-like immunoreactivity in the rostral nucleus of the solitary tract evoked by gustatory stimulation with sucrose and quinine. Brain Res 1996;711: Norgren R. Gustatory system. In: Paxinos G, ed. The Rat Nervous System. 2nd ed. San Diego: Academic Press; 1995: Yamamoto T. Electrophysiology of CTA. In: Bures J, Bermu dez- Rattoni F, Yamamoto T, eds. Conditioned taste aversion: memory of a special kind. 1st ed. New York: Oxford Univ. Press; 1998: Pritchard TC, Hamilton RB, Norgren R. Projections of the parabrachial nucleus in the old world monkey. Exp Neurol 2000; 165: Yamamoto T, Matsuo R, Kiyomitsu Y, Kitamura R. Taste responses of cortical neurons in freely ingesting rats. J Neurophysiol 1989;61: Kobayakawa T, Ogawa H, Kaneda H, Ayabe-Kanamura S, Endo H, Saito S. Spatio-temporal analysis of cortical activity evoked by gustatory stimulation in humans. Chem Senses 1999;24: Bermu dez-rattoni F. Molecular mechanisms of taste-recognition memory. Nat Rev Neurosci 2004;5: Tsukamoto G, Adachi A. Neural responses of rat area postrema to stimuli producing nausea. J Auton Nerv Syst 1994;49: Hermann GE, Kohlerman NJ, Rogers RC. Hepatic-vagal and gustatory afferent interactions in the brainstem of the rat. J Auton Nerv Syst 1983;9: Cechetto DF, Saper CB. Evidence for a viscerotopic sensory representation in the cortex and thalamus in the rat. J Comp Neurol 1987;262: Yoo SB, Lee JH, Ryu V, Jahng JW. Ingestion of non-caloric liquid diet is sufficient to restore plasma corticosterone level, but not to induce the hypothalamic c-fos expression in food-deprived rats. Nutr Neurosci 2007;10: Weingarten HP, Watson SD. Sham feeding as a procedure for assessing the influence of diet palatability on food intake. Physiol Behav 1982;28: Conover KL, Shizgal P. Competition and summation between rewarding effects of sucrose and lateral hypothalamic stimulation in the rat. Behav Neurosci 1994;108: Davis JD, Smith JP, Kung TM. Abdominal vagotomy alters the structure of the ingestive behavior of rats ingesting liquid diets. Behav Neurosci 1994;108: Nissenbaum JW, Sclafani A. Sham feeding response of rats to polycose and sucrose. Neurosci Biobehav Rev 1987;11: Emond MH, Weingarten HP. Fos-like immunoreactivity in vagal and hypoglossal nuclei in different feeding states: a quantitative study. Physiol Behav 1995;58: Paxinos G, Watson C. The rat brain in Stereotaxic Coordinates. 203

10 J Korean Assoc Oral Maxillofac Surg 2011;37: nd ed. San Diego: Academic Press; Ulrich-Lai YM, Ostrander MM, Thomas IM, Packard BA, Furay AR, Dolgas CM, et al. Daily limited access to sweetened drink attenuates hypothalamic-pituitary-adrenocortical axis stress responses. Endocrinology 2007;148: Suchecki D, Antunes J, Tufik S. Palatable solutions during paradoxical sleep deprivation: reduction of hypothalamic-pituitaryadrenal axis activity and lack of effect on energy imbalance. J Neuroendocrinol 2003;15: Sclafani A, Nissenbaum JW. On the role of the mouth and gut in the control of saccharin and sugar intake: a reexamination of the sham-feeding preparation. Brain Res Bull 1985;14: Sclafani A, Nissenbaum JW. Is gastric sham feeding really sham feeding? Am J Physiol 1985;248:R Grill HJ, Norgren R. The taste reactivity test. I. Mimetic responses to gustatory stimuli in neurologically normal rats. Brain Res 1978;143: Berridge KC. Modulation of taste affect by hunger, caloric satiety, and sensory-specific satiety in the rat. Appetite 1991;16: Wacker J, Dillon DG, Pizzagalli DA. The role of the nucleus accumbens and rostral anterior cingulate cortex in anhedonia: integration of resting EEG, fmri, and volumetric techniques. Neuroimage 2009;46: Pizzagalli DA, Holmes AJ, Dillon DG, Goetz EL, Birk JL, Bogdan R, et al. Reduced caudate and nucleus accumbens response to rewards in unmedicated individuals with major depressive disorder. Am J Psychiatry 2009;166: Shirayama Y, Chaki S. Neurochemistry of the nucleus accumbens and its relevance to depression and antidepressant action in rodents. Curr Neuropharmacol 2006;4: Bruchas MR, Xu M, Chavkin C. Repeated swim stress induces kappa opioid-mediated activation of extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neuroreport 2008;19: Kalivas PW, Duffy P. Selective activation of dopamine transmission in the shell of the nucleus accumbens by stress. Brain Res 1995;675: Campioni MR, Xu M, McGehee DS. Stress-induced changes in nucleus accumbens glutamate synaptic plasticity. J Neurophysiol 2009;101: Lucas LR, Wang CJ, McCall TJ, McEwen BS. Effects of immobilization stress on neurochemical markers in the motivational system of the male rat. Brain Res 2007;1155: Naimi N, Rivest S, Racotta I, Richard D. Neuronal activation of the hypothalamic magnocellular system in response to oropharyngeal stimuli in the rat. J Neuroendocrinol 1997;9: Berthoud HR. Multiple neural systems controlling food intake and body weight. Neurosci Biobehav Rev 2002;26: Yamamoto T, Sawa K. Comparison of c-fos-like immunoreactivity in the brainstem following intraoral and intragastric infusions of chemical solutions in the rats. Brain Res 2000;866: