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1 1) 사상체질의학회지 2009;21(1): J of Sasang Constitutional Medicine Vol. 21, No. 1, 2009: 사상체질별 Short Tandem Repeat 대립유전자빈도 박화용 유현주 * 구임회 * 김종열 * 한국한의학연구원신한방제제연구센터, * 한국한의학연구원체질생물학의공학연구센터 Abstract Short Tandem Repeat Allele Frequencies in Sasang Constitution Hwayong Park, Hyun Joo Yu*, Imhoi Ku*, Jong Yeol Kim* Herbal Medicine Improvement Research Center Constitutional Biology & Medical Engineering Research Center *Korea Institute of Oriental Medicine 1. Objectives As a basic trial for identification of Sasang constitutional gene marker, we genotyped and analysed statistical relationships of STR(short tandem repeat) alleles and its distribution in each constitution. 2. Methods After obtaining basic constitutional data with questionnaire (QSCC II), decision of constitution was made by 3 different constitution specialists' diagnosis, and only the samples of specialists' agreement of each constitution by discussion were taken into this research. Using multiplex PCR kit, total 146 constitutional samples were amplified in 16 autosomal STR marker, genotyped, and analysed statistically. Among 16 markers, 15 were analysed in this study excluding the amelogenin marker is used for in gender identification. 3. Results and Conclusions It is difficult to determine the relationship between constitution and STR marker as the sample size is small, however, Penta D and vwa were shown to be related statistically with constitution. It has been know that STRs has no genetic informations, however there are some recent research results showing STRs as a regulatory element, relationship between microsatellite instability and repeat number and size, and post-transcriptional sigualing. STRs which is not known about its function currently, are proposed to have function and/or regulatory activities anyhow with Sasang constitution. It is believed that the results of this study can halp determine and deatify the markers related to Sasang Constitutional Medicien. Key words :: Sasang constitution, STR, Genotyping. 접수일 2009 년 3 월 8 일 ; 승인일 2009 년 3 월 23 일 연구비지원기관 : 한국한의학연구원 교신저자 : 김종열 ( 우 ) 대전광역시유성구전민동엑스포로 483. Tel : (042) Fax : (042) ssmed@kiom.re.kr

2 228 사상체질의학회지 2009;21(1): 사상체질별 Short Tandem Repeat 대립유전자빈도 I. 序論 세계각국에는각각고유의전통의학이있으며이를현대화하고과학화하려는노력이최근들어더욱활발히진행되고있으며특히중국에서는이미오래전부터꾸준히관련연구를진행하여오고있다. 한편유럽에서는천연물, 또는유효성분추출물을이용하여현대의화학적합성약물을대체하려는연구가활발하다. 한국의전통한의학역시오랜역사를지니고있지만이에대한과학적연구는다른이화학적연구분야에비하여그리많지않은것이사실이고그나마본격적인연구가시작된것은최근의일이다. 한의학에서도특히사상체질의학은 100 년이넘는역사를가지고있으며현재에도이제마의사상체질의학에근거한진단과치료는일반적인진단과치료에비해월등한효과를보이고있는것이사실이다. 특히체질별로처방을달리하는사상처방에있어서더욱그러하다. 체질별로약재를달리하고체질특성에따라약재의가감을달리하는체질처방은같은질병이라하더라도체질별로다르게약을처방함으로써치료효과를극대화할수있는것이며임상에서도실제효과의우수성은잘알려진사실이다. 사상체질이란것은사람의성격, 체형, 용모사기, 성질재간등수많은체질관련요소들을望, 問, 聞, 切의四診에의하여판단하는것으로서생명과학적으로는표현형 (phenotype) 이라할수있는것들이다. 하지만이표현형들에관련된생물학적마커나유전자로서알려진것은현재거의없다. 왜냐하면그동안관련생물학적연구가많지않았던것이사실이고, 또한시도된연구에서도체질과의연관성을보여줄수있는큰유의성이있는성과를거두지못하였기때문이기도하다. 또한사상체질표현형들은생물학적요소들에의해서만결정되는것이아니고환경과교육및섭생등도체질형성에상당부분기여하기때문인것으로생각된다. 생물학적으로체질이라는것은인간이라고하는생명체에서볼수있는표현형 (phenotype) 의범주에속하는것으로서생명과학적방법을이용한체질관련마커와유전자의발굴및이의밑바탕에있는유전자형 (genotype) 을밝히기위한연구를시도할수있다. 체질은한두개, 또는몇개의유전자에의해결정되는것은아니고수많은유전자와이들의발현정도및그조합에따라결정되는소위 복합형질 (complex trait) 이라할수있는만큼다양한수많은유전자와마커에대하여무수한연구와시도가이루어져야만한다. 최근에는 DNA chip 과 RNA microarray 와같은대용량실험방법과도구들이개발되어있는상태이어서수많은유전자와그발현정도를 whole genome 의수준에서관찰할수있게된것은매우다행스러운일이다. 본연구에서는체질관련유전자, 또는유전자형을발굴하기위한시도중의하나로서친자확인, 신원확인, 범죄자확인등에사용되는유전자감식방법에사용되는미세위성체 (microsatellite, 또는 STR; short tandem repeat) 라고하는마커를이용하여체질별 genotyping을수행하였다 1). 특히 SINE (short interspersed transposable element), 또는 LINE (long interspersed transposable element) 과마찬가지로, 이들유전자마커에어떤유전정보가있는것은아니지만최근이와같은유전정보가없는부위들의존재이유에대하여다양한가설과의견들이대두되고있고, 현재는우리가알지못하지만어떤중요한역할을할것이라는의견이점점설득력을얻고있는상황에서체질을대상으로 STR 마커의빈도와분포를관찰하여어떠한유의성이있는가를관찰하고자하였다. Ⅱ. 材料및方法 체질별 DNA 시료는체질이확진된사람 146명의말초혈액으로부터 DNA 추출 kit(qiaamp DNA Blood Midi Kit, Qiagen, Hilden, Germany) 를사용하여추출하였으며 working DNA 의최종농도는 10ng/ μl로조절하여실험에사용하였다. 피험자는모두혈연관계가없는사람들로서소양인 49명, 소음인 48명, 태음인 49명등이며희귀체질인태양인은시료를구할수없어본연구에포함하지않았다. 체질의진단은우선체질설문지 QSCC II를사용하여기초적인체질관련정보를획득한후 3인의사상체질전문의에의한진단을실시한다음논의를거쳐체질진단결과가일치하는대상을연구에포함하였다.

3 박화용외사상체질의학회지 2009;21(1): Multiplex PCR 은 PowerPlex R 16 System manual을참고하여 genomic DNA 10 20ng에 PowerPlex R 16 primer pair mix (Promega, USA) 와 Gold STR buffer를 final 1 가되도록가하고 1 unit 의 AmpliTaq Gold DNA polymerase 를더하여최종 reaction volume 20μl를 GeneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 에서시행하였다 2). PCR amplification 의조건은다음과같다. Initial denaturation은 95 11분, 96 2분진행한후 94 1분, 60 1분, 70 90초의반응을 10 cycle, 그리고 90 1분, 60 1분, 70 90초의반응을 20 cycle 반복하고 final extension 은 60 에서 30분간반응시켰다. 반응이끝난 PCR product는 ABI 3100 automatic sequencer(applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를이용하여분획한다음 GeneScan 과 Genotyper software (ver 3.7) 를이용하여 genotyping하고분석하였다. ABI 3100 sequencer 에 loading하기전에증폭된 PCR product에서 1.0μl를취하여 formamide/internal lane standard mix(hi-di formamide 9.5μl + ILS μl ) 와섞어 9 5 에서 3분간 denaturation시킨다음얼음에급냉시킨후 loading하였다. PowerPlex R 16 System은 microsatellite 마커 Penta E, D18S51, D21S11, TH01, D3S1358, FGA, TPOX, D8S1179, vwa, Amelogenin, Penta D, CSF1PO, D16S539, D7S820, D13S317, D5S818의 16가지로구성되어있으며이들 16가지의마커가하나의 tube 내에서한번의 PCR 반응으로증폭될수있는시약이다. 16가지의마커중성별감별을위한 Amelogenin 을제외한나머지 15가지의마커를본연구의분석대상으로삼았다. Ⅲ. 結果 본연구에희귀체질인태양인의시료는포함하지못하였으며나머지소양, 소음, 태음의세가지체질 146명의 DNA 시료를연구대상으로시행한 genotyping 결과및 allele 의빈도와분포및 repeat structure는 Appendix의 table 1부터 table 6에정리하였다. 결과적으로 15가지의 STR repeat 마커들중에서 Penta D의경우 p value 가 로서통계적유의성이가장높은 STR marker 로나타났으며, 그다음으로는 vwa 에서 의 p value를얻었다. 나머지 13개의 marker 들은모두 p value 가 0.05이상으로서유의성이없는것으로판단하였다. Penta D는 chromosome 21번의 21q22.3에위치하고있으며 GenBank ( ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 에 13개의 repeat를갖는 sequence (AP001752) 가등록되어있는데본연구결과세가지모든체질에서 9개의 repeat를갖는 allele 9가가장높은빈도 ( 소양 , 소음 , 태음 ) 로관찰되었고체질사이에서가장큰차이를보이는것은 allele 8인데소양 , 소음 , 태음 의빈도로태음에비해나머지체질에서 4배이상의빈도를보였으며 allele 12와 13에서도체질별빈도의차이를볼수있었다 (Table 1). 두번째로큰체질유의성을보이는 (p value ) vwa 는염색체상의위치가 12p13.31이며 von Willebrand Factor A의 40번째 intron 에존재한다. GenBank 에는 18개의 repeat를갖는 sequence(m25858) 가등록되어있으며본연구에서는 17개의 repeat를갖는 allele 17이가장높은빈도로관찰되었다. 체질별로는소양에서 allele 18이 , 소음에서 allele 17이 , 태음에서는 allele 17이 로서각각가장높은빈도를보였으며, 체질별로는 minor allele을제외한나머지 allele 14, 15, 16, 17, 18에서유의한차이를보였다 (Table 2). Penta D와 vwa 에대한 Pearson chi-square test를통한통계량을보면, 우선 Penta D의경우 allele 12는태음체질에대하여상당히낮은연관성을가지고있지만소음과소양체질에서는매우큰연관성을가짐을알수있다. 따라서 Pearson chi-square test를통한검정통계량은 , 자유도는 14, 점근유의확률 ( 양측검정 ) 은 0.02 이므로유의수준을 0.05로선택하였을때전체적으로 Penta D의체질연관성이높음을알수있다 (Table 3). vwa 의경우는 allele 14이소음체질에서는연관성이작지만태음과소양의체질연관성이큼을알수있고, 특히태음은 allele 16 과의연관성이강함을알수있다. Chi-square test 값이가장크게나타난소양의 allele 20은기대빈도가 5보다작아서그신뢰도가높지는않지만전체적으로 Pearson chi-square test의통계량은 , 자유도는 12, 점근유의확률 ( 양측검정 ) 은 0.028을얻음으로써유의수준 0.05를기

4 230 사상체질의학회지 2009;21(1): 사상체질별 Short Tandem Repeat 대립유전자빈도 Table 2. Observed Allele Frequencies of D13S317, D7S820, D16S539, CSF1PO, and Penta D (χ2 Tests are , , , , , and p values are , , , , , respectively). STR Locus Allele 소양 (n=49) 소음 (n=48) 태음 (n=49) Total(n=146) Repeat Structure Penta D [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] 15 D13S [TATC] [TATC] [TATC] [TATC] [TATC] [TATC] [TATC] 14 D7S [GATA] [GATA] [GATA] [GATA] [GATA] [GATA] [GATA] [GATA] 14 D16S [GATA] [GATA] [GATA] [GATA] [GATA] [GATA] [GATA] 14 CSF1PO [AGAT] [AGAT] [AGAT] [AGAT] [AGAT] [AGAT] 13

5 박화용외사상체질의학회지 2009;21(1): Table 3. Observed Allele Frequencies of vwa, D8S1179, and TPOX (χ2 tests are , , and p values are , , , respectively). STR Locus Allele 소양 (n=49) 소음 (n=48) 태음 (n=49) Total(n=146) Repeat Structure vwa TCTA[TCTG]4[TCTA] TCTA[TCTG]4[TCTA] 10, or TCTA[TCTG] 3[TCTA] TCTA[TCTG] 4[TCTA] 11, or TCTA[TCTG] 3[TCTA] TCTA[TCTG] 4[TCTA] TCTA[TCTG] 4[TCTA] TCTA[TCTG] 4[TCTA] TCTA[TCTG] 4[TCTA] 15 D8S [TCTA] [TCTA] [TCTA] [TCTA] 1[TCTG] 1[TCTA] [TCTA] 1[TCTG] 1[TCTA] [TCTA] 1[TCTG] 1[TCTA] [TCTA] 2[TCTG] 1[TCTA] [TCTA] 2[TCTG] 2[TCTA] [TCTA] 2[TCTG] 1[TCTA] 15 TPOX [AATG] [AATG] [AATG] [AATG] [AATG] 12 Table 3. Pearson χ2 Test Stastic of Penta D and vwa. Allele Penta D vwa Allele 소양 (n=49) 소음 (n=48) 태음 (n=49) 소양 (n=49) 소음 (n=48) 태음 (n=49)

6 232 사상체질의학회지 2009;21(1): 사상체질별 Short Tandem Repeat 대립유전자빈도 Table 4. Observed Allele Frequencies of D18S51, Penta E, and D5S818 (χ2 Tests are , , , and p values are , , , respectively). STR Locus Allele 소양 (n=49) 소음 (n=48) 태음 (n=49) Total(n=146) Repeat Structure D18S [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] [AGAA] 24 Penta E [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] [AAAGA] 23 D5S [AGAT] [AGAT] [AGAT] [AGAT] [AGAT] [AGAT] [AGAT] 14

7 박화용외사상체질의학회지 2009;21(1): Table 6. Observed Allele Frequencies of D3S1358, TH01, and D21S11 (χ2 Tests are , , , and p values are , , , respectively). STR Locus Allele 소양 (n=49) 소음 (n=48) 태음 (n=49) Total(n=146) Repeat Structure D3S TCTA[TCTG] 2[TCTA] TCTA[TCTG] 3[TCTA] TCTA[TCTG] 3[TCTA] TCTA[TCTG] 3[TCTA] TCTA[TCTG] 3[TCTA] 14 TH [AATG] [AATG] [AATG] [AATG] [AATG] 6ATG[AATG] [AATG] 10 D21S [TCTA] 4[TCTG] 6[TCTA] 3TA [TCTA] [TCTA] 4[TCTG] 6[TCTA] 3TA [TCTA] [TCTA] 4[TCTG] 6[TCTA] 3TA [TCTA] [TCTA] 5[TCTG] 5[TCTA] 3TA [TCTA] 10TATCTA [TCTA] 6[TCTG] 5[TCTA] 3TA [TCTA] 3TCA[TCTA ]2TCCATA [TCTA] [TCTA]5[TCTG]6[TCTA]3TA [TCTA]3TCA[TCTA]2TCCATA [TCTA]10TATCTA variant allele [TCTA] 5[TCTG] 6[TCTA] 3TA [TCTA] [TCTA] 5[TCTG] 6[TCTA] 3TA [TCTA] 11TATCTA [TCTA] 6[TCTG] 5[TCTA] 3TA [TCTA] [TCTA] 5[TCTG] 6[TCTA] 3TA [TCTA] 12TATCTA [TCTA] 5[TCTG] 6[TCTA] 3TA [TCTA] 13TATCTA

8 234 사상체질의학회지 2009;21(1): 사상체질별 Short Tandem Repeat 대립유전자빈도 Table 7. Observed Allele Frequencies of FGA (χ2 Test , p Value ). Allele 소양 (n=49) 소음 (n=48) 태음 (n=49) Total(n=146) Repeat Structure [TTTC] 3TTTTTTCT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTTCT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTTCT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTTCT[CTTT] [TTTC]3TTTTTTCT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTTCT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTTCT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTTCT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTTCT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTTCT[CTTT] [TTTC] 3TTTTTTCT[CTTT] 19 준으로관찰한결과체질과 vwa 의연관성이높다고할수있다. Ⅳ. 考察 인간유전체의약 80 90% 는소위 junk DNA 라불리는유전정보로서의의미가없는부분으로구성되어있다. STR 역시 intron 이나 intergenic DNA 에속하는것들로서수백만년동안의인류진화과정동안유지되어오면서그 repeat의수와형태가점점다양하게변화해왔다. 그런데이러한 repeat 들이과연정말로아무런의미가없는반복되어배열된단순염기들에불과한것일까? 유전적의미는없다하더라도구조적 으로어떤역할을하거나, 또는아직알지못하는어떤기작을통해 transcription을 regulation 하는것은아닐까? 이와같은 repeat 들에대해서그존재이유와의미를재해석해보고자하는노력들이최근에진행되어왔다. 일반적으로 DNA 복제시의 slipage나 unequal crossing-over 가 microsatellite 에서의새로운 mutation을유발하는 mechanism 인것으로알려져있는데이러한 event 들이일어나는 microsatellite들중에서도특히 expression gene 에근접해있는 repetitive sequence 들은진화과정에있어 regulatory element 로서중요한역할을한다는보고가있다 3). 한편 mutation rate나 microsatellite instability는 homo-

9 박화용외사상체질의학회지 2009;21(1): geneous repeat 의크기및수와매우밀접한상관관계가있다는연구결과가있는데, Wierdl 등이 yeast 에서의 tandem repeat 를대상으로연구한바에의하면 microsatellite instability rate 와 single repeat addition rate 는 repeat unit의길이가길수록증가하며, 2개이상의 repeat 가 deletion 되는 large deletion 은 33bp 이하의 repeat 보다는주로 repeat unit 가 51bp 이상되는경우에발생함을관찰하기도하였다 4). Short tandem repeat(str) 들은 highly polymorphic 하고그 sequence는 common 하며 genome 전체에고루 random하게산재해있는특성으로인하여종종질병관련유전자의 genotyping에도사용되고있는데 2001 년 Riley의 prostate carcinoma에관한연구를보면, phosphoglycerate kinase(pgk1) gene의 STR allelic distribution이환자와정상인사이에서유의하게차이가있음을알수있다 5). 또한역시같은연구자인 Riley의 2002년보고에의하면수많은 repeat들중에서가장흔한것중의하나가 GATA repeat인데, GenBank database 를조사하여분석한결과 GATA가있거나또는없는 spliced variants 들에게서 STR을갖는 transcript들이더욱많이관찰되었다. 이는 GATA repeat가어떤기능을하고있음을의미하는것이며그대부분의기능은 membrane-associated protein과관련된 mrna에대한 post-transcriptional signal 을 encoding 하는것으로여겨진다 6). 사상체질이라는표현형을결정하는, 또는그에관여하는유전자나생물학적표현형마커는아직까지구체적으로알려진것이없다. 체질이라는것자체가생물학적으로는복합형질 (complex trait) 의하나로볼수있는데여기에는수많은유전자를포함하는생물학적요인과개체발생및발달과정, 그리고교육과학습등의사회환경적요인까지영향을미치는것으로여겨진다. 한의학에서의사상체질의학개념에는생물학적인측면과물리학적측면뿐아니라정신과적측면, 그리고사회인류학적측면까지도고려하고있기때문이다. 이렇게많은요인중에서생물학적요인과마커를발굴하기위하여많은시도가있어왔고지금도진행되고있지만아직뚜렷한성과는없다. 그러나이같은노력들과실험적시도들에의한무수 한결과들이축적되면결국에는사상체질과연관된마커를발굴할수있을것이며궁극적으로는사상체질을결정하는유전자를밝힐수있을것으로여겨진다. 특히본연구결과는 STR에대한연구들에서표현형, 질병, 유전자의기능등과관련된유의한결과들이보고되고있는최근의상황에서사상체질이라는복합형질을결정하는, 또는그형질의형성에기여하는체질유전자의발굴에중요한기초적연구결과가될수있을것으로사료된다. 또한체질과관련된유전자는그수가매우많을것으로생각되며따라서향후생물학뿐아니라타연구분야에서의관련연구결과에서발생되는유의한결과와융합된과학적체질진단과해석에유용한지표로활용될수있을것으로기대된다. Ⅴ. 結論 희귀체질태양인을제외한소양, 소음, 태음의세가지체질 146명의시료를대상으로 15가지의 autosomal STR marker 를이용하여그빈도를관찰하고체질별유의성이있는지를분석하였다. 이중에서 p value 가 0.05이하로서통계적유의성을보이는것은 Penta D와 vwa 의두가지이다. 이와같은결과는통계적방법에의한수치상의결과이며이연구의결과에서곧바로체질과연관된유전자나마커를얻을수있는것은아니다. 다만체질과의연관가능성을의미하는것으로더욱많은샘플을대상으로연구하여보다더통계적의미가더욱큰결과를도출한다음이들마커와그인접부위의유전자와 sequence를분석해보는것은체질유전자연구에있어매우큰연구가치가있을것으로사료된다. 본연구의목적도역시이와같은시도에서이루어진것이며, 위에언급한 repeat 들의잠재적기능이나역할에관련된연구결과들과같은차원에서체질유전자발굴을위한연구의기초가될수있을것으로사료된다. STR repeat 와같이현재에는기능이알려져있지않거나, 또는우리가알지못하는유전자부위의경우체질유의성이없어보이는무의미한것일수있지만향후관련연구가많이진행되고또융합 복합연구에의한새로운차원에서의연구결과들을

10 236 사상체질의학회지 2009;21(1): 사상체질별 Short Tandem Repeat 대립유전자빈도 기대해볼때본연구에서와같은기초연구또한매우중요한시도이며, 체질유전자발굴과생물학적체질규명의밑바탕이될수있을것이다. Ⅵ. 感謝의글 본논문은한국한의학연구원기관고유과제 체질건강수준표준개발 연구비 ( 과제번호 K08020) 지원에의하여수행되었음. Ⅶ. 參考文獻 Levinson G, Gutman GA. Slipped strand mispriming: a major mechanism for DNA sequence evolution. Molecular Biology and Evolution. 1987;4: Wierdl M, Dominska M, Petes TD. Microsatellite instability in yeast: dependence on the length of the microsatellite. Genetics ; 146 : Riley DE, Krieger JN. Short tandem repeat polymorphism linkage to the androgen receptor gene in prostate carcinoma. Cancer ; 92 : Riley DE, Krieger JN. Diverse eukaryotic transcripts suggest short tandem repeats have cellular functions. Biochemical and Biophysical Research Communi cations ; 298 :

Can032.hwp

Can032.hwp Chromosomal Alterations in Hepatocellular Carcinoma Cell Lines Detected by Comparative Genomic Hybridization Sang Jin Park 1, Mahn Joon Ha, Ph.D. 1, Hugh Chul Kim, M.D. 2 and Hyon Ju Kim, M.D. 1 1 Laboratory