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서라 호
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1 FDC 법제연구제 11 권제 2 호, , 2016 국제유전독성시험가이드라인최신동향 김주환 안일영 노종윤 박소은 이정선 고경육 손수정 이종권 식품의약품안전평가원독성평가연구부 초록유전독성시험은시험물질이유전자또는염색체에미치는상해작용을평가하는시험을말하며, 신약개발과정에서독성에따른후보물질선별작업에필수적으로수행하는시험항목으로잠재적인발암성또는돌연변이유발물질을검출하기위해수행하는시험이다. 의약품등의유전독성시험은의약품규제조화위원회 (International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use, 이하 ICH) 및경제협력개발기구 (Organisation for Economic Cooperation and Development, 이하 OECD) 의가이드라인에따라수행되고있다. 하지만, in vitro 유전독성시험결과에서위양성이높게나타나는문제점등이대두되고최신과학기술이발달함에따라새로운시험법들이만들어지고있다. 이에 ICH와 OECD에서는이러한점들을고려하여최근유전독성시험가이드라인을제 개정하고있다. ICH는기존가이드라인을통합하여의약품의안전성평가를위한유전독성시험및자료해석가이드라인 (S2(R1)) 으로통합하여유전독성시험표준조합, in vitro 시험에서최고농도설정기준, in vivo 시험에서반복투여독성시험과의통합, 새로운유전독성시험법의적용, 시험결과평가및후속시험전략등에대한내용을포함하여개정하였다. OECD 유전독성시험가이드라인은 ICH에서언급하고있지않은자세한시험방법을명시하고있다. 최근 OECD에서도사용빈도가낮은 6가지시험법가이드라인을폐지하였고, 기존의가이드라인에서결과판정기준, historical data 관리, 시험기관의숙련도등의내용을포함하여개정되었고, in vitro 시험에서의최고농도설정기준등이변경되었으며, 새로운시험법에대한신규가이드라인을제정하였다. 따라서유전독성분야에있어이러한국제가이드라인의변화에맞춰국내규정도변화하여의약품개발에있어국제조화를이룰수있도록하여국내제약산업의국제경쟁력강화에힘써야할것으로사료된다. 주요어 유전독성, 의약품규제조화위원회, 경제협력개발기구, 가이드라인 I. 서론 유전독성이란기존에는세포또는개체수준에서돌연변이를유발하는성질을의미하였으나현재는유전물질에상해성을나타내는성질을포함하는광범위한의미로이용되고있다. 1) 또한유전독성시험은시험물질이유전자또는유전자의담체인염색체에미치는상해작용을평가하는시험을말하며, 2) 신약개발과정에서독성에따른후보물질선별작업에필수적으로수행하는시험항목으로잠재적인발암성또는돌연변이유발물질을검출하기위해수행하는시험의한종류이다. 유전독성시험은유전자돌연변이, 염색체이상, DNA의상해성또는그수복성등을지표로하는여러가지 in vitro 및 in vivo 시험방법들이있으며, 통상적으로한종류의유전독성시험으로모든유전독성기전을확인하는것이불가능하기때문에표준화된시험법들을조합하여유전독성평가가이루어지고있다. 이러한시험들은국제적으로표준화된 ICH 및 OECD의가이드라인에따라수행되고있다. ICH는의약품의허가, 심사, 사후안전관리등의약품규 제전반의국제조화가이드라인을제정하는의약품분야국제협력체이며, OECD는화학물질의안전성등을평가하기위한독성시험가이드라인을제정하는국제기구이다. ICH 는의약품의유전독성시험및표준시험법에대한가이드라인을제공하고있으며, OECD는각각의유전독성시험의자세한방법에대한가이드라인을제정하여제공하고있다. 하지만, Kirkland 등은발암물질로분류된 372종의물질이복귀돌연변이시험과 in vitro 소핵시험을조합한결과에서민감도는 94% 로높고, 특이도는 12% 로낮게나타나며복귀돌연변이시험과 in vitro 마우스림포마시험의조합시험에서는발암물질 436종을이용하여분석한결과에서 89% 의민감도와 32% 의특이도를확인하였다. 또한복귀돌연변이시험, in vitro 소핵시험, in vitro 마우스림포마시험결과를조합한결과, 민감도가 91% 로높고특이도는 5% 로낮게나타나는것을보고하였다. 3-4) 이와같이포유류배양세포를이용한유전독성시험에서높은위양성이관찰되는점이문제가되어이를해결할방안에대하여전세계적으로논의가지속되어왔다. 2006년에는유럽동물대체시험법검증센터 (European Centre for the Validation of Alternative 교신저자, 이종권 (28159) 충북청주시흥덕구오송생명 2 로 187 오송보건의료행정타운식품의약품안전평가원특수독성과 (Tel: , Fax: , jkleest@korea.kr)

2 202 김주환 안일영 노종윤 박소은 이정선 고경육 손수정 이종권 Methods, 이하 ECVAM) 가주최한회의에서는 in vitro 시험수행에있어서세포배양조건, 세포주의안정성, 세포독성과세포독성의기전등에대한논의가진행되었다. 5) 또한국제생명과학회 (International Life Sciences Institute, ILSI)- 보건환경과학위원회 (Health and Environmental Sciences Institute, HESI) 에서도유전독성시험의양성결과에대한후속시험법에대한논의가진행되었으며, 세포독성의최고용량에대한재시험과최고용량을낮추어재시험할것을요구하는한편, 후속시험으로수행할 in vivo 시험선택기준과가이드라인등을제안하였다. 6) 또한과학기술의발달에따라새로운유전독성시험법등이마련되면서다양한종말점 (endpoint) 에대한유전독성평가가가능하게되었다. 그리고국제유전독성전문가회의 (International Workshop on Genotoxicity testing, 이하 IWGT) 등을통해서유전독성평가에있어증거중심접근 (Weight of evidence) 과작용기전중심 (Mode of Action) 에기반한유전독성시험결과해석을위한후속시험의중요성이강조되었다. 7) 이에따라 ICH에서는 in vitro 유전독성시험에서유전자의수적이상유발물질검출의한계점, 동물복지차원에서의동물수감소, 양성결과에대한후속시험의명확화, 의약품개발초기단계에서의장벽감소를위한관련없는결과의감소및결과해석의명확화등을해결하기위하여 2011년기존유전독성가이드라인인 S2A 8) 와 S2B 9) 를통합하여의약품의안전성평가를위한유전독성시험및자료해석가이드라인 (S2(R1)) 10) 을개정하여유전독성조합시험법, 결과평가등에대한명확한평가기준을제시하였다. 11) 또한 OECD는 2010년에실무작업반회의를통해새로운유전독성시험가이드라인개발및기존가이드라인의개정필요성에대한논의를하였으며, 이중에는시험방법개선, 세포독성의한계점, 최고농도변경등에관련된내용이포함되어있다. 12) 이러한결과로 2014년에 DNA 손상을평가할수있는 in vivo comet assay(tg 489) 13) 가제정되었으며, 기존 in vivo 소핵시험및 in vitro 염색체이상시험등이개정되었으며, 전세계적으로활용빈도가매우낮은일부유전독성시험가이드라인 (6종류) 을폐기하였다. 14) 또한돌연변이원성을검색할수있는기존의포유류세포를이용한 in vitro 유전자돌연변이시험을 Hprt 및 xprt 유전자를이용한방법 (TG 476) 15) 과 thymidine kinase 유전자를이용한방법 (TG 490) 16) 으로 2015년에분리하였다. 의약품개발에있어유전독성평가는우선적으로 ICH 가이드라인에따라서시험을수행해야하지만, ICH에서제시하고있는조건을준수하며 ICH에서제시하지않는자세한시험방법등에대해서는 OECD 독성시험가이드라인을준용하여시험을수행하고있다. 이렇듯유전독성평가는 ICH 와 OECD 가이드라인이국제표준으로인식되어있다. 유전독성시험은의약품개발초기단계에서물질스크리 닝및발암성예측을위한시험으로많이이용되고있으며, 최신과학기술발달에따라많은변화가진행되어왔다. 따라서, 본연구에서는의약품개발시많이적용되고있는 ICH 유전독성가이드라인과 OECD 유전독성시험가이드라인에대한최신동향에대해소개하고자한다. II. 본론 1. ICH 유전독성가이드라인개정동향 ICH에서는기존 S2B와 S2A 가이드라인을통합하여 S2 (R1) 을 2011년새롭게개정하였다. 과거 S2B(1997) 에서는박테리아를이용한복귀돌연변이시험 (Bacterial mutation assay, AMES Test), 포유류배양세포를이용한체외염색체이상시험 (in vitro mammalian chromosomal aberration test) 또는체외마우스림포마돌연변이시험 (in vitro mouse lymphoma assay) 과같이 in vitro 조건에서두가지조합시험을수행하고설치류조혈세포를이용한체내염색체이상시험 (in vivo chromosome aberration test) 또는체내소핵시험 (in vivo micronucleus test) 과같이 2가지동물시험에서하나의시험을선택하여수행하였다. ICH S2(R1) 으로개편되면서는표준조합 1에서기존복귀돌연변이시험과함께 in vitro 시험으로 in vitro 염색체이상시험, in vitro 마우스림포마시험및 in vitro 소핵시험중하나를선택하여시험을수행하고동물을이용한 in vivo 시험으로 in vivo 염색체이상시험또는 in vivo 소핵시험중하나를선택하여수행하도록권고하고있다. 또한표준조합 2에서는복귀돌연변이시험과 in vivo 소핵시험그리고 DNA 손상평가시험인 in vivo 코멧시험을수행하도록권고하였다. In vitro 시험에서주요변경사항은기존 S2A/S2B에서는복귀돌연변이시험을처음수행했을때음성판정이나애매모호한판정 (equivocal) 의결과가나왔을경우시험물질의농도에변화를주어 2회반복시험을요구하였다. 그러나, 개정후 S2(R1) 에서는명확한양성이나음성결과가나왔다면추가시험을실시하지않고 1회만실시하도록권장하고있다. 또한, 기존에는포유류세포를이용한시험 ( 소핵시험 or 염색체이상시험 ) 에서최고농도의경우 10 mm 또는 5mg/ ml을권장하였지만, 개정후에는세포독성이나시험물질의침전이없다면 1/10이줄어든 1mM 또는 0.5 mg/ml로수행하도록권고하고있다. 또한, 최대독성한계부분을보강하여 in vitro 염색체이상시험과 in vitro 소핵시험에서물질의농도는세포독성이세포성장의 50% 를초과할수없도록명시하였고, in vitro 마우스림포마돌연변이시험에서는 80~ 90% 의세포독성이되도록명시하였다. 이러한변화는높은위양성율을줄이기위한방안으로개정된부분이다. In vivo 시험에서주요변경사항은기존에는매시험을수

3 국제유전독성시험가이드라인최신동향 203 행할때양성대조군이반드시필요하다고언급되었지만, 개정후에는양성대조군에서동일한결과와명확한양성판정이있을시매시험마다양성대조군을추가할필요없음을제시하였다. 또한, 동물복지차원에서 3R (Reduction, Refinement, Replacement) 을반영하여 in vivo 유전독성시험을반복투여독성시험과통합하여시험을수행할수있음을제시하고있다. 그리고과거포유류세포를이용한조합시험에서높은위양성율의결과에대한후속조치시험으로 in vivo 시험 ( 소핵시험, 부정기 DNA 합성시험 ) 을수행하도록권고하였다. 이 2가지시험중 DNA 손상평가시험인부정기 DNA 합성시험의경우단지간조직에서만평가를할수있는제한점을가지고있어개정된가이드라인에서는간조직이외에도다른장기에서다방면으로 DNA 손상평가를확인할수있는시험법인 in vivo 코멧시험도권장하고있다. 시험결과평가및후속시험전략에서는생물학적타당성평가에있어서음성결과판정에고려할수있는조건을명시하였으며, 박테리아를이용한돌연변이시험의양성결과및포유류세포를이용한시험의양성결과에대한평가시고려사항에대하여명시하였다. In vivo 시험결과평가에있어흡수, 분포, 배설및대사를고려하고 in vitro 및 in vivo 결과가일치하지않는다면대사의차이, 화합물의배설등을고려함을명시하였으며, 박테리아를이용한돌연변이시험이음성이고다른시험에서양성결과가나왔을경우의후속전략으로증거중심접근 (weight of evidence) 으로충분하지않을때, 추가적인 in vitro 시험 ( 돌연변이염색체이상을유발하는시험물질은 DNA 손상인자가아니라는증거또는생체와관련되지않은간접적인기전에관한증거를확인하는시험 ) 에의하거나 2개의적절한 in vivo 시험 ( 서로다른조직과노출을증명하는 2가지시험 ) 수행과 S9 활성에따른 in vitro 양성결과에대한후속조치와 in vivo 소핵시험의양성결과에대한후속조치등이명시되었으며, 발암성시험에서종양발견시, 후속유전독성시험에대하여도언급하였다. 2. OECD 유전독성가이드라인제 개정동향 OECD 유전독성시험가이드라인은과학기술의발달과 IWGT 등의전문가회의를통해도출된의견을받아들여제 개정되고있다. 비록 OECD 유전독성시험가이드라인은화학물질을대상으로유전독성평가시활용하지만, ICH 유전독성시험가이드라인에서언급되지않은사항등에대해서는시험항목별 OECD 유전독성시험가이드라인을참고하고있다. OECD 유전독성시험가이드라인은최근에많은변화가있었다. 우선국제적으로사용빈도가낮은초파리를이용한 반성열성치사시험 (OECD TG 477), 포유류세포를이용한 in vitro 자매염색분체교환시험 (OECD TG 479), Saccharomyces cerevisiae를이용한유전자돌연변이시험 (OECD TG 480), Saccharomyces cerevisiae를이용한유사분열재조합시험 (OECD TG 481), 포유류세포를이용한부정기 DNA 합성시험 (OECD TG 482), 마우스스포트시험 (OECD TG 484) 의 6가지시험법에대한가이드라인들이폐지되었다. 14) 전반적으로 in vitro 유전독성시험의경우, 위양성결과빈도를줄이기위하여최고농도설정에있어독성이없는물질은기준을낮추었으며 (2 mg/ml 또는 10 mm 중낮은농도 ), 시험결과의통계학적인부분을강화하기위하여계수하는세포의수를늘렸다. 또한 in vivo 유전독성시험에서는시험물질의투여경로를임상적용경로로설정하였으며, 확실한결과판정을위한및음성판정기준을명확하게하였다. 이러한내용을바탕으로포유류배양세포를이용한 in vitro 염색체이상시험 (OECD TG 473), 17) 설치류조혈세포를이용한 in vivo 소핵시험 (OECD TG 474), 18) 포유류골수세포를이용한 in vivo 염색체이상시험 (OECD TG 475), 19) 포유류배양세포를이용한 in vitro 소핵시험 (OECD TG 487) 20) 의 4가지가이드라인이결과판정기준및 historical data 관리, 최고용량설정등의내용을중심으로개정되었다. 또한 DNA 손상을평가할수있는 in vivo 코멧시험 (OECD TG 489) 21) 의가이드라인을새롭게제정하였다. 또한포유류세포를이용한유전자돌연변이시험 (OECD TG 476) 이 hprt 및 xprt locus를이용하는방법 15) 과 thymidine kinase 유전자를이용하는방법으로분리하여 thymidine kinase 유전자를이용한유전자돌연변이시험 (OECD TG 490) 16) 으로새롭게제정하였다. 주요시험법에대한가이드라인의주요개정사항은다음과같다. 2.1 박테리아를이용한복귀돌연변이시험 (OECD TG 471) 22) 박테리아를이용한복귀돌연변이시험은 1997년이후개정된사항이없었다. 이시험은높은특이도를가진시험으로음성물질을정확하게음성으로구분할수있다. 가이드라인에서제시하고있는박테리아균주는살모넬라균과대장균을사용한다. 시험에서는시험물질의최고농도설정시세포독성과용해도를고려하여결정한다. 시험의경우는음성, 양성대조군을포함한플레이트당복귀된집락수계수후, 평균집락수및표준편차값을제시하고, 시험물질의은대사활성계유 무에상관없이최소 1개균주에서의 1개이상농도에서농도의존적인증가와재현성있는결과가나왔을때양성판정을결정할수있다고제시되어있다.

4 204 김주환 안일영 노종윤 박소은 이정선 고경육 손수정 이종권 표 1. 포유류배양세포를이용한 in vitro 염색체이상시험주요변경사항항목 OECD TG 473 (1997) OECD TG 473 (2016) 부형제 액상부형제우선고려난용성물질은유기용매사용 증류수 : 10%(v/v) 이내유기용매 (DMSO): 최종처리배지의 1%(v/v) 이내 S9 농도 최종처리배지의 1-10% (v/v) 최종처리배지의 1-2% (v/v), 최대 10% (v/v) 까지가능 최고농도결정시고려사항 용해도, 세포독성, ph, 삼투압 용해도, 세포독성, ph, 삼투압 무독성 / 가용성물질의최고농도 5mg(µl)/ml 또는 10 mm 중낮은쪽 2mg(µl)/ml 또는 10 mm 중낮은쪽 세포독성지표 세포성장의약 50% 감소를초과하지않는범위 농도군당 200 중기상 ( 음성대조군은각 culture 당균등배분 200 중기상 ) 55 ± 5% 세포독성 Cell line - Relative Population Doubling (RPD) - Relative Increase in Cell Count (RICC) Primary culture of lymphocytes - Mitotic index (MI) 농도및음성대조군당 300 중기상계수 용량의존적인증가혹은재현성있는증가 음성일때조치 대사활성계적용시음성 : case-by-case 로확인필요 ( 시험조건변경포함 ), 확인시험하지않을때는이유제시 언급없음 Historical control data 요구요구 2.2 포유류배양세포를이용한 in vitro 염색체이상시험 (OECD TG 473) 17) 포유류배양세포를이용한체외염색체이상시험가이드라인을개정전과개정후를비교하여정리하였다 ( 표 1). 주요변경사항은대사활성계인 S9의기존처리농도는최종처리배지의 1~10% 넓은범위대의농도였지만현재개정된사항에서는최적화된농도는 1~2% 로범위가좁혀졌고최대 10% 가능하다고명시하였다. 무독성 / 가용성물질의최고농도에있어개정후, 2 mg(µl)/ml과 10 mm 중낮은쪽을선택하도록제시하였으며, 에서는농도군당 200개의중기상을계수하였지만개정후통계학적검증방법의효과를늘이기위하여 300개로높였다. 또한, 에있어서적어도한농도에서음성대조군과비교하여통계학적으로유의성있게증가하고농도의존적으로증가하며모든결과가 historical negative control data에포함되지않을경우확실한양성으로판정하고있다. 2.3 포유류배양세포를이용한 in vitro 소핵시험 (OECD TG 487) 20) 포유류배양세포를이용한 in vitro 소핵시험을개정전인 2010년버전과개정후내용과비교하였다 ( 표 2). 주요개정사항으로는시험물질의농도를설정하는데있어서공비를개정후, 2~3배사이로정하도록명시하고있다. 대사활성 계 (S9) 의농도의경우최종배지처리의 1~10% 였지만, 개정후에는 1~2% 로염색체이상시험과동일하다. 무독성 / 가용성물질의최고농도는 2mg(µl)/ml과 10 mm 중낮은쪽을선택하도록명시되어있다. 양성대조군의경우개정후에는대사활성계비처리군에추천물질 2종 (Methyl methansulphonate, Mitomycin C) 이추가되었다. 또한, 에있어서적어도한농도에서음성대조군과비교하여통계학적으로유의성있게증가하고농도의존적으로증가하며모든결과가 historical negative control data에포함되지않을경우확실한양성으로판정하고있다. 2.4 설치류조혈세포를이용한 in vivo 소핵시험 (OECD TG 474) 18) 설치류조혈세포를이용한 in vivo 소핵시험을아래와같이개정전과후를비교하여정리하였다 ( 표 3). 주요개정사항으로는개정전에는경구혹은복강투여를원칙으로명시했으나, 개정후에는복강투여는권장하지않고임상적용경로로투여하는방법을제시하였다. 투여및샘플채취시간은개정전과내용은비슷하지만크게추가된사항으로 3일이상투여할경우, 투여시간과샘플채취시간이자세히명시되었으며, in vivo 코멧시험과동시수행가능함을제시하였다. 또한, 은동물 1 마리당 1 검체로미성숙적혈구와성숙적혈구를포함하여기존 200개를계수하여미

5 국제유전독성시험가이드라인최신동향 205 표 2. 포유류배양세포를이용한 in vitro 소핵시험주요변경사항항목 OECD TG 487 (2010) OECD TG 487 (2016) 공비 10 이하대략 2~3배 S9 농도 최종처리배지의 1-10% (v/v) 최종처리배지의 1-2% (v/v), 최대 10% (v/v) 까지가능 최고농도결정시고려사항용해도, 세포독성, ph, 삼투압용해도, 세포독성, ph, 삼투압무독성 / 가용성물질의최고농도 5mg(µl)/ml or 10 mm 중낮은쪽 2mg(µl)/ml or 10 mm 중낮은쪽 양성대조군 -S9: 4-Nitroquinoline-N-Oxide Cytosine arabinoside +S9: Benzo(a)pyrene Cyclophosphamide Aneugens: Colchicine, Vinblastine -S9: Methyl methanesulphonate Mitomycin C 4- Nitroquinoline-N-Oxide Cytosine arabinoside +S9: Benzo(a)pyrene Cyclophosphamide Aneugens: Colchicine, Vinblastine 세포독성지표 Relative Population Doubling (RPD) Relative Increase in Cell Count (RICC) 55 ± 5% Cytotoxicity Cytochalasin B - - Relative Population Doubling (RPD) - Relative Increase in Cell Count (RICC) Cytochalasin B + - Cyto kinesis-block Proliferation Index (CBPI) - Replicative Index (RI) Cytokinesis blocker (Cyto B) 사용 Cyto B -: 세포에서농도및대조군당최소 2,000 개의소핵계수 Cyto B +: 2 핵세포에서농도및대조군당최소 2,000 개의소핵계수 Human lymphocyte 사용시에는 cyto B 를사용해야함. Cytochalasin B - - 세포에서농도및대조군당최소 2,000 개의소핵계수 Cytochalasin B 핵세포에서농도및대조군당최소 2,000 개의소핵계수 Human lymphocyte 사용시에는 cyto B 를사용해야함. 다른 cell type 사용시에는의무사항아님 성숙적혈구의비율을구했지만최소 500개로증가하였고, 2,000개의미성숙적혈구에서소핵을계수하였지만 4,000개의미성숙적혈구에서소핵을계수하도록권장하였다. 또한, 에있어서적어도한농도에서음성대조군과비교하여통계학적으로유의성있게증가하고용량의존적으로증가하며모든결과가 historical negative control data 에포함되지않을경우확실한양성으로판정하고있다. 2.5 설치류를이용한 in vivo 염색체이상시험 (OECD TG 475) 19) 설치류를이용한 in vivo 염색체이상시험을개정전과후를비교하여표 4에정리하였다. In vivo 염색체이상시험에서시험적인방법보다는결과과그후결과해석에대한내용이주로개정되었다. 의경우변경전에는개체당 100개의분열중기상에대하여염색체의구조이상을가진세포출현빈도를계수하였으나, 변경후에는 200개의분열중기상에빈도를계수하도록권장하였다. 특히, 명확한양성과음성일때, 조치방법에대해서는명확하 게추가실험이불필요하다고하였으며, 그외 historical control 결과를추가로요구한다는부분도명시되었다. 또한, 에있어서적어도한농도에서음성대조군과비교하여통계학적으로유의성있게증가하고용량의존적으로증가하며모든결과가 historical negative control data 에포함되지않을경우확실한양성으로판정하고있다. 2.6 In vivo 코멧시험 (OECD TG 489) 21) 설치류를이용한 in vivo 코멧시험의주요가이드라인내용을표 5에정리하였다. 일반적으로사용하는동물은랫드를권장하며투여경로는임상적용경로인경구투여및식음료를통한투여방법을권장하고있다. 시험물질의용량단계는최소 3단계이며투여일은기본 2일이상투여를원칙으로하고있다. 무독성 / 가용성물질의최고농도의경우단기투여시 2,000 mg/kg이며, 14일이상투여하는반복투여시험의경우내성이있을때, 1,000 mg/kg를제시하였다. 그리고은각농도및대조군당최소 150개세포에서평가하도록제시하였다. 그리고은적어도한농

6 206 김주환 안일영 노종윤 박소은 이정선 고경육 손수정 이종권 표 3. 설치류조혈세포를이용한 in vivo 소핵시험주요변경사항항목 OECD TG 474 (1997) OECD TG 474 (2016) 투여경로 경구혹은복강투여원칙투여횟수에표준은없음 임상적용경로 ( 식음료, 경구 ), 복강투여는추천하지않음 투여및채취시간 1일 /1회투여시 - 골수 : 2번채취, 최종투여후 24~48h 사이 1일 /1회투여시 - 말초혈액 : 2번채취, 최종투여후 36~72h사이 - 골수 : 2번채취, 최종투여후 24~48h 사이 2일투여시 (24시간간격투여 ) - 말초혈액 : 2번채취, 최종투여후 36~72h사이 - 골수 : 1번채취, 최종투여후 18~24h 사이 2일이상투여 : 최종투여후 - 말초혈액 : 1번채취, 최종투여후 36~48h사이 - 18~24h ( 말초혈액 : 36~48h 사이에 1회채취 ) 3일이상투여시 (24시간간격투여 ) - 골수, 말초혈액 : 최종투여후 24~40h사이 In vivo comet assay와동시수행가능 : 최종투여후 2~6h 사이 최고한계농도 더높은투여용량이치사를예상케하는독성징후를나타내는용량혹은미성숙적혈구비율의감소를나타내는용량 총적혈구 ( 미성숙 + 성숙 ) 에서미성숙적혈구의비율 : 최소 200 개계수하여 Control 군에비해 20% 미만이되지않아야함미성숙적혈구에서소핵계수 : 1 동물당최소 2,000 개 ( 원칙 ) 용량의존적인증가혹은하나이상의용량에서확실한증가 더높은투여용량이치사를예상케하는독성징후를나타내는용량혹은골수중총적혈구중미성숙적혈구비율감소또는 50% 이상말초혈액비율감소 ( 대조군의 20% 이상일것 ) 하는용량 총적혈구 ( 미성숙 + 성숙 ) 에서미성숙적혈구의비율 : 최소 500 개계수하여 Control 군에비해 20% 미만이되지않아야함미성숙적혈구에서소핵계수 : 1 동물당최소 4,000 개 Equivocal 일때조치 시험조건의변경등을통해결과를명확히함이바람직 전문가판단으로평가또는추가시험 표 4. 설치류를이용한 in vivo 염색체이상시험주요변경사항 항목 OECD TG 475 (1997) OECD TG 475 (2016) 투여경로 stomach tube or cannula or 복강투여 임상적용경로 투여용량결정 전신독성고려 전신독성혹은세포독성고려 채취시간 무독성 / 가용성물질의최고농도 1 일 /1 회투여시 : 2 번채취, 최종투여후수시간 (12~18h) 과 24 시간두번채취 다회일일투여시 : 최종투여후 12~18h 사이 단기 (1-3 회투여 ) 시험 : 2,000 mg/kg 반복투여시험 (14 일이상투여 ), 내성이있을때 : 1,000 mg/kg 1 일 /1 회투여시 : 2 번채취, 최종투여후수시간 (12~18h) 과 24 시간두번채취 다회일일투여 (24 시간간격투여 ) 시 : 최종투여후 2~6h 사이 단기 (1-3 회투여 ) 시험 : 2,000 mg/kg 반복투여시험 (14 일이상투여 ), 내성이있을때 : 1,000 mg/kg 개체당 100 개의분열중기상에대하여염색체의구조이상을가진세포출현빈도계수동시에유사분열지수를개체당최소 1,000 개세포에서구함 개체당 200 개의분열중기상에대하여염색체의구조이상을가진세포출현빈도계수동시에유사분열지수를개체당최소 1,000 개세포에서구함 단회채취시간에서단회투여그룹의경우명확하게염색체이상의세포수가증가하였을때 명확한양성일때조치 언급없음 추가시험불필요 명확한음성일때조치 언급없음 추가시험불필요 Historical control data 언급없음 요구 도에서음성대조군과비교하여통계학적으로유의성있게증가하고용량의존적인증가를보이며모든결과가같은 종, 대조군, 투여경로, 조직등이똑같은 historical negative control data에포함되지않을경우확실한양성으로판정하

7 국제유전독성시험가이드라인최신동향 207 표 5. 설치류를이용한 in vivo 코멧시험주요내용 항목 OECD TG 489 (2016) 시험계 설치류 ( 일반적으로랫드 ) 동물의성별 독성및대사에차이가없다면한가지성별을사용 동물의주령 건강하고성숙한설치류 (6-10 주령권장 ) 군당동물수 최소 5마리 투여경로 임상적용경로 ( 경구, 식음료 ) 투여용량결정 전신적인독성혹은세포독성 시험물질용량단계최소 3단계 채취시간 독성물질의최고농도 무독성 / 가용성물질의최고농도 명확한양성일때조치 24 시간간격으로 2 일이상투여하여최종투여후 2~6h 사이 치사를예상케하는독성징후를나타내는용량 (MTD) 단기 (1-3 회투여 ) 시험 : 2,000 mg/kg 반복투여시험 (14 일이상투여 ), 내성이있을때 : 1,000 mg/kg 각농도및대조군당최소 150 개세포에서평가 모든결과는 historical negative control data 범위밖 추가시험불필요 통합, 양성대조군처리, in vitro 유전독성시험의위양성결과에대한후속시험등을제시하였고, 시험결과평가및후속시험전략에있어서도음성결과판정시고려사항, in vitro 및 in vivo 시혐결과가일치하지않을경우고려사항등을제시하였다. OECD에서는세계적으로사용빈도가낮은 6개유전독성시험가이드라인폐지, in vitro 소핵시험, 형질전환설치류유전자변이시험, in vivo 코멧시험등을새롭게제정하였으며, 기존 in vitro 유전자돌연변이시험을유전자종류에맞게분리하여새로제정하였다. in vitro 유전독성시험에서비독성물질의최고농도, 세포독성기준, 세포독성지표, 결과의통계처리향상을위해관찰세포수등을변경하였다. In vivo 소핵시험에서는반복투여독성시험과연계를위하여샘플채취시간을다양화하였다. 그리고전체적으로구체화된결과해석방법을반영하여확실한양성및음성에대한판정기준을제시하였고, historical data 관리및실험실의숙련도에대한내용도자세히추가하였다. 이러한세계적인추세에도불구하고우리나라의관련규정은일부국제기준에맞게개정되었지만, 유전독성시험분야는반영되지않고있는실정이다. 따라서그동안국제유전독성가이드라인의변화등을반영하여관련국내규정을개정함으로써국내의약품개발에있어국제조화를이룰수있도록하여국내제약산업의국제경쟁력강화에힘써야할것으로사료된다. 명확한음성일때조치 Equivocal일때조치 Historical control data 시험물질에대한표적조직의적절한노출에관한입증 전문가판단으로평가또는추가시험 요구 감사의말씀 본연구는 2015년식품의약품안전처의연구개발과제의연구개발지원 (15181독성국459) 에의해수행되었으며이에감사드립니다. 고있다. 참고문헌 III. 결론 유전독성시험은발암성예측을위한 1차스크리닝방법으로활용되고있으며, 다른독성시험결과를종합적으로판단해야하지만, 발암성시험대상물질의우선순위결정시, 주요단서가되고있다. 전세계유전독성전문가및국제기구에서는최신과학기술발달과기존자료들의분석을통하여국제적으로정확한결과판정및표준화를위하여많은노력을하고있다. ICH에서는다음의사항을새롭게반영하여유전독성평가가이드라인을개정하였다. 표준조합 (1, 2), in vitro 유전독성시험시, 최고농도설정기준, 후속시험전략등을제시하였고, in vivo 유전독성시험에서반복투여독성시험과의 1) 의약품등의독성시험기준해설서, 식품의약품안전평가원 (2012). 2) 의약품등의독성시험기준, 식품의약품안전처고시제 호 (2015). 3) D. Kirkland, M. Aardema, L. Henderson and L. Muller, Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens 1. Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research, 584(1-2), (2005). 4) E.J. Matthews, N. Kruhlak, M. Cimino, R.D. Benz and J.F. Contrera, An analysis of gentic toxicology, reproductive and developmental toxicity and carcinogenicity data : I. identification of carcinogens using surrogate end points, Regulatory Toxicology and Pharmacology, 44(2), 83-96

8 208 김주환 안일영 노종윤 박소은 이정선 고경육 손수정 이종권 (2006). 5) Kirkland, D., Pfuhle,r S., Tweats, D., Aardema, M., Corvi, R., Darroudi, F., Elhajouki, A., Glatt, H., Hastwll, P., Hayashi, M., Kasper, P., Kirchner, S., Lynch, A., Marzin, D., Maurici, D., Meunier, JR., Muller, L., Nohynek, G., Parry, J., Parry, E., Thybaud, V., Tice, R., Benthem, JV., Vanparys, P., White, P. How to reduce false positive results when undertaking in vitro genotoxicity testing and thus avoid unnecessary follow-up animal tests: Report of an ECVAM Workshop, Mutation Research, 628, 31-55, (2007). 6) Thybaud, V., Aardema, M., Clements, J., Dearfield, K., Galloway, S., Hayashi, M., Jacobson-Kram, D., Kirkland, D., MacGregor, J.T., Marzin, D., Ohyama, W., Schuler, M., Suzuki, H., Zeiger, E. Strategy for genotoxicity testing: Hazard identification and risk assessment in relation to in vitro testing, Mutation Research, 627, (2007). 7) P. kasper, Y. Uno, R. Mauthe, N. Asano, G. Douglas, E. Matthews, M. Moore, L. Mueller, M. Nakajima, T. Singer, G. Speit, Follow-up testing of rodent carcinogens not positive in the standard genotoxicity testing battery: IWGT workgroup report, Mutation Research, 627, (2007). 8) ICH Harmonised Tripartite Guideline, Guidance on specific aspects of regulatory genotoxicity tests for pharmaceuticals (S2A), (1995). 9) ICH Harmonised Tripartite Guideline, Genotoxicity : A standard battery for genotoxicity tests for pharmaceuticals (S2B), (1997). 10) ICH Harmonised Tripartite Guideline, Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use (S2(R1)), (2011). 11) ICH, Final Concept Paper, S2(R1) : Guidance on genotoxicity testing on data interpretation for pharmaceuticals intended for human use, (2006). 12) OECD, Guidance document on OECD genetic toxicity test guidelines, (2015). 13) OECD, OECD guideline for the testing of chemicals : in vivo mammalian alkaline comet assay (TG 489), (2014). 14) OECD, Section 4-health effects : replaced and cancelled test guidelines, (2014). 15) OECD, OECD guideline for the testing of chemicals : in vitro mammalian cell gene mutation tests using Hprt and xprt gene (TG 476), (2015). 16) OECD, OECD guideline for the testing of chemicals : in vitro mammalian cell gene mutation tests using the thymidine kinase gene (TG 490), (2015). 17) OECD, OECD guideline for the testing of chemicals : in vitro mammalian chromosomal aberration test (TG 473), (2016). 18) OECD, OECD guideline for the testing of chemicals : mammalian erythrocyte micronucleus test (TG 474), (2016). 19) OECD, OECD guideline for the testing of chemicals : mammalian bone marrow chromosomal aberration test (TG 475), (2016). 20) OECD, OECD guideline for the testing of chemicals : in vitro mammalian cell microuncleus test (TG 487), (2016). 21) OECD, OECD guideline for the testing of chemicals : in vivo mammalian alkaline comet assay (TG 489), (2016). 22) OECD, OECD guideline for the testing of chemicals : bacterial reverse mutation test (TG 471), (1997). ( 투고일 : / 심사일 : / 게재결정일 : )

9 국제유전독성시험가이드라인최신동향 209 Abstract Recent Trend of International Guidelines for Genotoxicity Testing Joohwan Kim, Ilyoung Ahn, Jong Yoon Noh, So-Eun Park, Jung-Sun Yi, Kyung Yuk Ko, Soojung Sohn and Jong Kwon Lee Toxicological Screening and Testing Division, National Institute of Food and Drug Safety Evaluation, Ministry of Food and Drug Safety, Cheoungju-si, Korea Genotoxicity tests are defined as tests designed to evaluate the adverse effects of test substances on genes or chromosomes. These tests are required for selecting candidate substances in the process of developing new pharmaceuticals and for detecting potential carcinogens or mutagens. Genotoxicity tests for pharmaceuticals are generally conducted following International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceutical for Human Use (ICH) or Orgnisation for Economic Cooperation and Development (OECD) guidelines. At the same time, new test methods are being developed as science and technology have advanced and a number of chemicals were found to be false-positive in existing in vitro genotoxicity tests. Taking that into account, ICH and the OECD have established new guidelines for genotoxicity testing or revised existing ones. ICH combined two of its guidelines into the Guidance on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended for Human Use (S2(R1)). S2(R1) includes two options for the standard battery, criteria for determining the highest dose in in vitro tests, integration of repeated dose testing with in vivo genotoxicity testing, application of new genotoxicity tests, evaluation of test results and strategies for follow-up testing. OECD guidelines for genotoxicity testing, meanwhile, state specific test methods that are not addressed in ICH guidelines. The OECD has recently abolished its 6 Test Guidelines, which have been less frequently used, and developed new ones. In addition, it has modified the criteria for test result evaluation, historical data management and laboratory proficiency assessment in its existing Test Guidelines. Changes were also made to the criteria for determining the highest dose in in vitro tests. In step with this global trend, it would be necessary to revise relevant domestic regulations for developing pharmaceuticals in accordance with internationally agreed standards, thus further strengthening the Korean pharmaceutical industry's global competitiveness. Key words : Genotoxicity Test, ICH, OECD, Guideline Corresponding Author : Jong Kwon Lee (Tel: , Fax: , jkleest@korea.kr)

04-다시_고속철도61~80p

04-다시_고속철도61~80p Approach for Value Improvement to Increase High-speed Railway Speed An effective way to develop a highly competitive system is to create a new market place that can create new values. Creating tools and