대한춰 l 담도연구회지 1998; 3: 단순효소법을이용한담석의총콜레스테롤측정의유용성에대한연구 = Abstract = 인하대학교의과대학내과학교실, 외과학교실 * 주명선 권계숙 이돈행 최원 조현근김범수 신용운 안승익 . 신석환 . 김영수 A Study of

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사랑 지
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1 대한춰 l 담도연구회지 1998; 3: 단순효소법을이용한담석의총콜레스테롤측정의유용성에대한연구 = Abstract = 인하대학교의과대학내과학교실, 외과학교실 * 주명선 권계숙 이돈행 최원 조현근김범수 신용운 안승익 *. 신석환 *. 김영수 A Study of Usefullness of Enzymatic Determination Method of Total Cholesterol in Gallstones Myung Sun Joo, M.D., Kye Sook Kwon, M.D., Don Heng Lee, M.D., Won Choi, M.D Hyeon Geun Cho, M.D., Pum Su Kim, M.D., Yong Woon Shin, M.D., Seung Ik Ahn, M.D.* Seok Hwan Shin, M.D.* and Young Soo Kim, M.D. Department 0/ lnternal Medicine and Surgery*, lnha Universiη Coliege 01 Medicine, lnchon, Korea Background: Methods used for gallstone analysis include X-ray diffraction analysis, infrared anaylsis and chemical analysis. We measured total ch이 esterol of gallstones with enzymatic method. This method was shown to be simple and rapid compared with the IR spectrophotometry. Method: 1. Gallstones were obtained from 30 patients' gallbladder. 2. Gallstones were crushed into powder and then dissolved in N-N, dimethylformamide and dimethyl sulfoxide (8:2 by volume) mixture μ 1 of this solvent mixed with 2 ml of reagent mixture and then incubated at 37 0 C for 10 minutes. Reagent mixture contains phosphate buffer 0.1 molfl, 4-aminoantipyrin 0.8 mrnolfl, p -hydroxy-benzensulfonate 20 mrnolfl, esterase 150 U/L, peroxidase 25 KU/L and cholesterol oxidase 200 U/L. 4. The absorbance of these reaction mixtures were measured at 500 nrn using spectrophotometer(beckman-du 650). 5. The ch이esterol calibration curve was made by using standard cholesterols and reagent mixture. 6. The cholesterol concentrations of gallstones were determined using ch이esterol sta띠ard curve and each absorbances. 7. This concentrations were compared with the values using intrared spectrophotometry (Nicolet Inst. corp. Omnic and Quick IR) method. Result: Total cholesterol concentrations of 30 gallstones by enzymatic method correlated with ch이esterol in gallstones determined by IR specπ0- photometry method. Conclusion: Enzymatic method for total cholesterol deterrnination of gallstone showed useful, simple and rapid. Key Words: Gallstone, Total cholesterol, Enzymatic method, Analytic method, Infrared spectrometη 연락처 주영선, 인천광역시중구신흥동 3가, 인하대병원소화기내과내시경센터본논문의요지는 97년대한소화기학회제 36차추계학술대회에서포스터발표되었음. 본연구는 1997년도인하대학교임상연구비의보조로이루어졌음. 2S

2 26 대한취 l 담도연구회지 : 제 3 권제 I 호 1998 등은 Sigma Chemical Co., St. Lo uis 에서구입하였 서론담석은크게두가지종류로나눌수있는데구성성분에따라발생기전과엄상적의의에차이가있다 1,2 하나는담즙내콜레스테롤및담즙산의대사과정과관계가있다고생각되는콜레스테롤담석이고다른하나는담즙색소대사과정과관련이있는색소성담석이며색소성담석은다시흑색담석과갈색담석으로분류된다. 담석은식생활의변화둥으로발생빈도가점차증가하는추세이며 2,3 담석의발생기전을규명하거나담석질환의예방과치료를위해정확한분석방법이필요하다. 담석의구성성분이지역및인종에따라차이 4,5 7} 있지만구성성분을외형적관찰로만정확히알아낼수없어실제외형상색소성담석이성분분석상콜레스테롤담석으로밝혀지는경우도많다. 담석의성분분석은화학적분석법, 가스크로마토그래피법, 방사선회절법적외선홉수분광법 7,8 원자홉수분광법 9등여러가지방법이있으나각각의복잡성및비용, 시간적인문제그리고담석성분중에담즙색소와무기질때문에정확한분석이어려워어느한가지방법 로완전한분석은어려운것으로알려져있다. 이에저자들은담석의총콜레스테롤의농도를측정하기위한방법으로단순한효소법및가시광선홉광기를이용하였다. 다. 시약및담석의무게측정은전자저울 (Mettler A T200 electronic balance) 을이용하였다. 가시광선분광광도계 (UV Spectrophotometer) 는 Beckman-Du 650 기종이었고, Infra-Red spectrophotometry 는 Nicolet Instrument 사의 OMNIC and QUICK IR (Ff-IR) 기종을사용하였다. 1) 효소이용법 (1) 분쇄된담석 5 mg을취하여 DMF/DMSO (8이 20, by volume) 5 ml에섞는다. (2) 이용액중 20 μl을 Reagent mixture 2 ml에 혼합하고 10 분동안 37 0 C 에서 배양후 specπ0- photometer를이용하여 500 nm 에서흉광도를측정한다. Reagent mixture의구성은다음과같이하였다. phosphate buffer 0.1 molfl, 4-aminoantipyrin 0.8 mmolfl, p -hydroxy-benzensulfonate 20 mmolfl, esterase 150 Uι, peroxidase 25 KU/L, ch이 ester이 oxidase 200 U/L (3) 표준콜레스테롤 (1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 mg) 을 isopropan이에녹여 20 μ l을 Reagent mixture 2 ml 에혼합하여 500 nm에서홉광도를측정하고콜레스테롤표준곡선 (Cholester이 standard calibration curve) 를만든다 (Fig. 1). (4) 단계 2에서얻은각담석의흉광도수치를콜레스테롤표준곡선에대업하여각담석의총콜레스테롤농도를구한다. 대상및방법 1. 담석표본인하대병원에입원한 30명의담석증환자에서얻은담석을대상으로하였다. 담석은증류수로세척후실온, 차광상태에서 2주이상건조후밀펴l 용기에보관되었다. 2. 검사시약및재료 선형 (00) 표준콜레스테롤, N,N-dimethylformamide(DMF), 버 methyl sulfoxide(dmso), Reagent mixture 성분, KBr Fig. 1. Cholesterol standard curve using 해강 matic meth 여.

3 주명선외 9 인 : 단순효소법을이용한담석의총콜레스테롤측정의유용성에대한연구 27 2) 적외선홉수분광법 (1) 앞에서사용되고남은담석을분말로만든다. (2) 전자저울을이용하여담석분말 5 mg을측량하여적외선분광계용 KBr 200 mg과같이 Agate mortar에서분말로만들어균일하게혼합한다. (3) 강철제거푸집 (die) 에넣고진공하에서압력 8000 K gjcm 2 으로 3분간가압하여앓은원판을만들어준다. (4) 원판을 IR spectrophotometer에옮겨파장 4000 cm cm. 1 까지의흉수대를기록해준다 (5) 표준콜레스테롤 (1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, 5 o y= x mg% Fig. 2. Cholesterol standard curve using IR method. Table 1. Characteristics of patients and total cholesterol concentration of each gallstones Case Age/Sex Cholesterol Conc. using Cholesterol Conc. using Enzymatic method(%) IR method(%) 6이여자 / 남자 / 남자 이여자 / 여자 / 여자 / 남자 / 여자 / 여자 / 남자 여자 / 남자 / 여자 / 여자 여자 여자 이여자 남자 이남자 여자 여자 남자 여자 여자 이여자 / 여자 끽여자 / 남자 이남자 남자

4 28 대한혜당도연구회지. 제 3 권제 I 호 1998 mg) 을 KBr 2 mg에섞고단계 3과 4의과정을통하여홉수대를기록하여표준콜레스테롤곡션을만든다 (Fig. 2) (6) 각담석의홉수대를표준콜레스테롤곡선에대입하여각담석의총콜레스테롤의농도를구한다. 빈도가점차적으로증가하는추세이다수술을받지못하는상황에있는환자즉심혈관질환이심하거나수술을거부하는경우 ESWL I2,13 및이의보조요법으로경피적담낭천자술로용매를주입하여접촉성용해요법 14-17을받을수있으며, 콜레스테롤담석의일부는경구적용해요법 18을고려할수있어콜레스테롤담석과색소 결 과 성담석의구분은점차중요성이제기되고있다 19,20 담석의분석방법으로는크게화학적분석법 21 방사선회절법 (X-ray diffraction method),6 적외선 위와같은방법로간단하게각담석의 ch 이 ester이의 농도를구할수있었다 (Table 1). 30명의환자중에서총콜레스테롤이 50% 이상인경우를콜레스테롤담석으로분류한다면콜레스테롤담석은 14명 (47%) 였으며, 남자 11 명여자 19명으로남녀비는 1: 1.7 의비율을보였고평균연령은남자 59 :t 13세여자 55:t 17세였다. 효소적방법을이용한담석내총콜레스테롤 흡수분광법 (infrared absorption spectroscopy,)8,9 주사전자현미경 (scanning electron microscopy; SEM) 에의한분석방법들이있으며, 이중어느하나만으로완전하게분석한다는것은불가능한실정이며서로상호보완적이다. 그외 TLC(thin layer chromatography), gas chromatography, emission spectroscopy,22 원자흡수분광법 (atomic ab 농도측정결과는적외선홉수분광법을이용한 sorption specσoscopy) 등의보조적인방법이 있으 결과와일치함을보였다 (Fig. 3). 며담석의비중을측정하여간단하게담석의콜 -. - 찰 레스테롤정량을할수있는다는보고도었다 본연구에사용된효소법은화학적분석법의 일종으로화학적분석법은 3 단계로이루어진다. 담석증은담도계에서가장흔한질환의하나로성인인구의약 10% 가담석및이에의한질환을갖고있으며, 남녀의성비는약 1:2 정도로여성에서호발한다 1, 10, 년대부터는생활환경및식생활의변화등으로콜레스테롤담석의발생 유기용매 (eg. N,N-dimethylformamide, dimethyl s띠 foxide) 를이용하여담석을녹여액체상태로만든후에추출단계와화학반응, 비색정량 (colorimetric analysis) 의단계로이루어지며, 저자들이이용한효소법은용매처리후화학적분석법의화학반응대신에효소2 3 (cholesterol oxidase, ester y=1.0369x ase, peroxidase) 에반응시켜서 colorimetric analysis 를한다. 이의장점은 dimetylformamide와 dimethyl s빠 'o xide 등의용매가 ch이 ester, 이 oxidase, esterase, peroxidase 등효소의촉매작용 (catalytic activiti않 ) 에영향을미치지않는다는점이다 23 담석의성분은수분, 빌리루빈, 콜레스테롤, 지방산, 칼융, 유기인등으로이루어졌으며 24 이를분석하기위한화학적방법 25에사용된용매들은 o o aciditìed chloroform-methanol, dimethylsulfoxide, ac- Fig. 3. Correlation of ch 이 esterol concentration between e:one, hydrochloric acid(hcl), sulfanilic acid, coboth methods. prostanol, heptadecanoic acid, haptane, isopropan 이

주명선외 9 인 : 단순효소법을이용한담석의총콜레스테롤측정의유용성에대한연구 29 등많이필요하였으나, 담석의콜레스테롤성분만의정량분석을위해서는효과적인빌리루밴용매인 DMSO: 와 Dimethy lfonnamide를 2:8 비율로섞었을때 23 담석에서콜레스테롤을추출하는효과가가장좋다고보고되어본실험에서이용하였다.

5 주명선외 9 인 : 단순효소법을이용한담석의총콜레스테롤측정의유용성에대한연구 29 등많이필요하였으나, 담석의콜레스테롤성분만의정량분석을위해서는효과적인빌리루밴용매인 DMSO: 와 Dimethy lfonnamide를 2:8 비율로섞었을때 23 담석에서콜레스테롤을추출하는효과가가장좋다고보고되어본실험에서이용하였다. 본실험에서담석에서콜레스테롤을추출하는데는대략 3-4시간이걸렸으며결국담석의콜레스테롤을측정하기까지의시간은일단콜레스테롤표준곡선이완성된후에는대략 5-6 시간이소요되었고, 좁은공간에서시약만있으면임상활동중에간단하게콜레스테롤농도를측정할수있다는점이다. 결국화학적방법과마찬가지로담석내불용성성분이어느정도포함되어있는지가중요한결정단계가된다. 자외선분광계를이용한담석분석방법은유기물과무기물까지도분석이가능하고결정성이나용해성에관계없이모든성분을분석할수있다 26 소량의시료를이용하여담석과혼합하여않은원판을제조한후자외선분광계를이용하여담석의모든성분의고유한파장을측정하여한번에정성분석을할수있고, 과정이약간복잡하지만정량분석도가능하다하지만앓은원판의제조과정이숙달되어야하며비싼시설이필요하다. 콜레스테롤담석의형성과정에는담즙산, lecithin과콜레스테롤의농도변화에따라담즙내의콜레스테롤이과포화되고담즙의 ph, 핵화조절인자등의작용으로생긴다. 색소성담석 27은 calcium hydrogen bilirubinate의중합체를주성분으로하여, 여기에탄산칼숨이나인산칼습등이더해져형성되며, 주로무균성담냥담즙내에서발견된다. 흑색담석은비포합빌리루빈이칼숨이용과결합하여담즙내녹지않는침전물을형성하여산화기전에장애가있을때잘형성된다. 갈색담석은담낭에서도형성될수있으나주로담도에서형성되며, 담즙의저류와감염이중요한요소로간주되고있다. 본연구에서콜레스테롤담석을콜레스테롤농도가 dη weight의 50% 이상인경우로분류하면 50세이상의환자에서는콜레스테롤담석이 8 명 이었던반면, 11 명은콜레스테롤담석이아니었다. 또한 65세이상의환자에서는단지 2예만이콜레스테롤담석으로나타났다. 이는본원에서입원치료한환자중고령에서는담도결석이많았고담낭결석으로수술받은경우가적어서이러한결과가나타났을가능성도있지만연령에따른식이습관의변화와담즙의정체, 감염의기회증가등에기인하여콜레스테롤담석의발생빈도가달라진것으로생각된다담석구성성분중콜레스테롤의비율이높을수록경구용담석용해제혹은경피적담낭천자를통한접촉성담석용해치료등비수술적치료에잘반응하므로, 담석성분분석에대한향후지속적인연구는병인, 치료및예방에있어중요한의미를강는다. 담석의정확한정량분석은어느한가지방법으로충분하게분석하기는어렵지만담석의비중을이용한콜레스테롤정량의예측방법과효소법을같이이용할경우담석의콜레스테롤비율을간단하고, 신속하며, 경제적으로측정할수있는방법으로생각된다. 요약목적 : 담석의콜레스테롤의측정에효소법의유용성을적외선흉수분광법과의비교를통해 알아보고자본연구를시행하였다. 대상및방법 : 인하대병원에서수술한 30명의환자에서얻은담석을분석하였다. 1) 각담석을분쇄하여 5 mg씩을취하여 DMF/DMSO(8이20, by volume) 5 ml에섞는다. 2) 이용액중 20 μl을 Reagent mixture 2ml에혼합하고 10분동안 37 0 C에서배양후 spectrophotometer를이용하여 500 nm 에서흉광도를측정한다. 3) Standard Cholesterol을 isopropanol에녹여 20 μ l을 Reagent mixture 2 ml 에혼합하여 500 nm에서흉광도를측정하고콜레스테롤표준곡선을얻는다 (Fig. 1). 4) 단계 2에서얻은각담석의흉광도수치를 Cholesterol standard curve에대입하여 total ch이 esterol농도를구한다. 5) 상기실험에쓰인담석을적외선흉수분광법

30 대한웨당도연구회지 : 제 3 권제 l 호 1998 을이용하여콜레스테롤농도를측정하여효소 이용법과비교하였다. 결과 : 위와같은방법로간 단하게각담석의 ch 이 ester' 이의농도를구할수있 었다 (Table 1). 30 명의환자중에서콜레스테롤담 석은 14 명 (47%) 였으며, 남자는 11 명여자는 19 명 으로남녀비는 1: 1.

6 30 대한웨당도연구회지 : 제 3 권제 l 호 1998 을이용하여콜레스테롤농도를측정하여효소 이용법과비교하였다. 결과 : 위와같은방법로간 단하게각담석의 ch 이 ester' 이의농도를구할수있 었다 (Table 1). 30 명의환자중에서콜레스테롤담 석은 14 명 (47%) 였으며, 남자는 11 명여자는 19 명 으로남녀비는 1: 1. 7의비율을보였고효소적방 법을이용한담석내총콜레스테롤농도측정결 과는적외선흉수분광법을이용한결과와일치 함을보였다 (Fig. 3). 결론 : 담석의정확한정량분 석은분석하기는어렵지만효소법을이용하는경 우담석의콜레스테롤비율을간단하고, 신속하 며, 경제적으로측정할수있는방법으로생각된 다. 색인단어 : 담석, 총콜레스테롤농도, 효소법, 적 외선분광법 참고문힌 1. 윤용법, 김정룡 : 한국인담석증환자의담석구성성분, 대한의학협회지 1983; 26: 김광화, 옥창민, 깅병진등. 한국인담석증에대한영상 적고찰. 대한소화기학회지 1996; 28; 문영명 : 한국인당석증의현황. 대한소화기병학회지 1987; 19: 최성근, 김영설, 검진우등 : 적외선분광계에의한담석 구성성분분석, 대한내과학회잡지 1985; 29: 이상숙, 정재홍 : x- 선회절법에의한담석분석. 대한의 학협회지 1989; 32: 검명환, 검순길, 김선주등 : 적외선분팡계를이용한농촌주민의담석분석. 대한의학협회지 1989; 32: 깅영호, 깅용태, 윤용범, 최규완, 검정룡 적외선흉수분 광업에의한간내담석의성분분석. 대한소화기병학회지 1993; 25: 이진우, 문태훈, 송준호등 : 적외선및원자흉수분광법 에의한담석의성분분석과담석비중의유용성에관한연구대한소화기학회지 1995; 27: Yamase H, Mc Namara JJ: Geographic differences in the incidence of gallbladder dis않se; inf1uence of environment and ethnic backround. Am J Surg 1972; 123: Dieh1 AK: Epidemiology and natural history of gallstone disease. Gastroenter 이 Clin North Am 1991; 20: Heaton KW, Braddon FEM, Mountford RA, Hughes AO, Emmett PM: Symptomatic and silent gallstones in the community. Gut 1991; 32: Sackrnann M, Delius M, Sauerbrauch T, Paumgartner G: "Shock-wave lithotripsy of gallbladder stones: 까 le first 175 patients." New Eng J Med. 1988; 318: Peine CJ, Petersen BT, Williams HJ, et al: Extracorporeal shock-wave lithotripsy and methyl tert-butyl ether for partially calcified gallstones. Gastroenterology 1989; 97: Thistle JL, May GR, Bender CE, et al: Dissolution of ch 이 esterol gallbladder stones by metyl tert-butyl ether admistered by percutaneous transhepatic catheter New Eng J Med 1989; 320: Schoenfield LJ, Lachin JM, Baum RA, et al : National Cooperative Gallstone Study Group: chenodiol(chenodeoxycholic acid) for diss이 ution of gallstones: πle National C perative Med 1981 ; 95: Gallstone Study. Ann Intem 16. μsma A, McCullough JE, π 피 stle JL: Muc 이 ytic a gents enhance methyl tert-butyl ether dissolution of ch 이 ester, 이 gallstones in vitro. Gastroenterology 1989; 24: Leuschner U, Hellstem A, Schmidt K, Fisher H, Guldutuna S, Hubner K, et al: Gallstone dissolution with methyl tert-butyl ether in 120 patients: efficacy and safety. Digestive Diseases and Sciences 1991; 36: Thistle JL, Hofmann AF, Ott BJ, Stephens DH: Chenotherapy for gallstone dissolution. 1. Efficacy and safety. JAMA 1978; 239: Baron RL, Rohnnarm CA, Lee SP, et al: CT evaluation of gallstones in vitro: correlation with chemical analysis. Am J Radiol 1988; 151 : Bell GD, Dowling RH, Whitney B, Sutor DJ: 까 le value of radi이ogy in predicting gallstone type when sejecting patients for medical treatment. Gut 1975; 16: Steen G, Blijenberg BG: Chemical analys 잉 of gallstones. Eur J Clin Chem Biochem 1991; 29: D Ascnzo G, Cardarelli E, Magri AD, Bica T, Sabbatini M: Direct analysis for cholesterol in gallstones by use of differential scanning calorimetry transition phase. Clin Chem 1978; 24: Wei JS, Huang HM, Shuy WC, Wu CS: Simple en 양 matic deterrnination of total ch이 esterol in gallstones. Clin Chem 1989; 35:

7 주영선외 9 인단순효소법을이용한당석의총콜레스테롤측정의유용성에대한연구 Johnston DE, Kaplan MM: Pathogenesis and treatment 26. Suzuki N, Nakayama Y, Sato T: Infrared absorption of gallstone. N Engl J Med 1993; 328: spectroscopy of pure pigment gallstones. Tohoku J 25. Norio Yamashita, Jiro Yanagisawa, Fumio Naka- Exp Med 1975; 116: yama: Composition of intrahepatic calculi, eti이 ogical 27. Soloway RD, Trotman BW, Ostrow 10: Pigment gallsignificance. Digestive Disease and Sciences. 1988; stones. Gastroenter이ogy 1977; 72: (4)

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를