JNH 장자용(K16-55).fm

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선우 기
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1 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 420 ~ pissn / eissn Research Article 곤드레 (Cirsium setidens) 에탄올추출물의알코올성지방간손상억제효과 * 김은혜 정자용 경희대학교생활과학대학식품영양학과 Protective effects of Cirsium setidens ethanolic extracts against alcoholic fatty liver injury in rats* Kim, Eun-Hye Chung, Jayong Department of Food and Nutrition, Kyung Hee University, Seoul 02447, Korea ABSTRACT Purpose: In this study, we investigated the effects of Cirsium setidens ethanolic extract (CS) on the development of alcoholic fatty liver and associated injury. Methods: Sprague-Dawley male rats were fed either Lieber-DeCarli control (C) or ethanol (35.5% of total calories) liquid diet with 0 (E), 100 mg/kgbw CS (E+LCS), or 500 mg/kgbw CS (E+HCS) for 8 weeks. Serum alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) activities as well as TG and cholesterol concentrations in the serum and liver tissues were measured by colorimetric assays. Liver histopathology was examined by Hematoxylin-eosin staining of the fixed liver tissues. Protein levels of phosphorylated-amp activated protein kinase (p- AMPK), phosphorylated-acetyl CoA carboxylase (p-acc), phosphorylated-nuclear factor kappa B (p-nfκb), and TNFα were measured by Western blot analyses. Results: Both doses of CS markedly suppressed alcohol-induced lipid droplets accumulation in the liver tissues and significantly inhibited alcohol-induced increases in activities of serum ALT and serum AST. Similarly, CS significantly reduced hepatic and serum TG concentrations. Compared to groups fed alcohol only, CS supplementation strongly increased hepatic levels of p-ampk and p-acc. Further, CS significantly inhibited alcoholinduced phosphorylation of NFκB, which was associated with reduced hepatic protein levels of TNFα. Conclusion: Our data demonstrated that CS has a protective effect against alcoholic liver injury, which was associated with activation of AMPK and inhibition of NFκB. KEY WORDS: alcoholic liver disease, Cirsium setidens, AMP-activated protein kinase, nuclear factor kappa B 서론 알코올은가장흔하게남용되는음료중의하나로우리나라 19세이상성인의월간음주율은평균 60.1% 으로매우높으며, 1 음주로인한사회경제적비용은연간 9조 4,524억원에달하는것으로보고되고있다. 2 알코올성지방간은간세포에중성지방이비정상적으로축적되는상태로습관적인음주자의대부분에서나타난다. 알코올성지방간은알코올성간질환의가장초기단계로수주이상금주하는경우정상적으로회복될수있으나, 간염, 간섬유증, 간경변증등의좀더심각한형태의간손상으로의진 행을가속화할수있으므로, 3-5 초기에예방하는것이필요하다. 곤드레 (Cirsium setidens) 는국화과의다년생초본으로주로해발 700 m 이상의고지에서자생하며, 맛이담백하고부드러워나물등의요리에흔히사용되는식재료이다. 또한, 고려엉겅퀴라고도불리며한방에서염증, 부종, 고혈압등의여러증상에사용되어왔다. 6 곤드레의잎부분에는탄수화물의함량이높고리놀렌산, 리놀레산등의필수지방산이함유되어있으며, 칼륨등총 7가지무기성분이함유되어있는등다양한영양성분을함유하고있다. 7 뿐만아니라, pectolinarin을비롯하여 luteolin, hispidulin, Received: October 18, 2016 / Revised: November 11, 2016 / Accepted: November 30, 2016 *This work was supported by grants from the Basic Science Research Program of the Korean National Research Foundation (2013R1A1A ). To whom correspondence should be addressed. tel: , jchung@khu.ac.kr 2016 The Korean Nutrition Society This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.

2 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 420 ~ 428 / 421 apigenin 등여러종류의플라보노이드를함유하고있는것으로알려져있으며, 8,9 이에따라곤드레의생리활성에대한연구가활발히진행되고있다 특히, CCl 4 로유도된간손상모델에서곤드레추출물 (500 mg/kgbw) 의투여시간손상이유의적으로억제되었으며, 13 이와비슷하게 D-galactosamine으로유도된간손상모델에서곤드레추출물혹은곤드레에서추출한 pectolinarin의투여농도에비례하여간손상지표인혈청 AST와 ALT 농도가유의적으로감소함이보고된바있다. 14 이는곤드레추출물이간손상억제에효과적임을제시하나, 알코올성간손상혹은알코올성지방간에있어곤드레추출물의보호효과에대한연구는미미한실정이다. AMPK (AMP-activated protein kinase) 는세포내의에너지항상성유지에센서역할을하는효소로각종에너지대사조절에밀접하게관여하여소위대사조절의만능스위치 (master switch) 라고도불린다. 15,16 특히 AMPK는지방산의합성과분해를매개함으로써간지방대사의조절에중요한역할을담당하는것으로알려져있다. 뿐만아니라, in vitro 연구를통해간세포에에탄올을처리했을때 AMPK 활성이억제되고, 17 알코올에만성적으로노출된쥐의간조직의경우정상대조군에비해 AMPK 활성이유의적으로감소됨이보고된바있어, 18 알코올성지방간발생에있어 AMPK의역할이주요하게작용할수있음을제시한다. 이에본연구에서는만성적인알코올섭취시곤드레에탄올추출물이간조직의 AMPK 활성및알코올성지방간과간손상에미치는영향을알아보고자하였다. 연구방법 실험동물및식이구성 4주령수컷흰쥐 (Sprague-Dawley rat; Nara Biotech., Seoul, Korea) 28마리를온도 20 ± 2 o C, 습도 50 ± 10%, 12 시간 /12시간명암주기의조건아래일주일간일반사료로적응시킨후, 액상사료인 Lieber-DeCarli diet (DYET# , Dyets Inc., Bethlehem, PA, USA) 를공급하였다. 실험동물은군당 7마리씩총네군 [ 정상대조군 (C), 알코올군 (E), 알코올 mg/kgbw 곤드레에탄올추출물군 (E+LCS), 알코올 mg/kgbw 곤드레에탄올추출물군 (E+HCS)] 으로나누었다. 알코올식이는알코올이전체열량의 35.5% 를차지했으며, 정상식이에는알코올을대체하여말토오스덱스트린 89.6 g을추가하여두식이의리터당열량함량이동일하도록하였다. 이때알코올을포함하는세군은 2주에걸쳐식이알코올 (99% 에탄올, Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 함유량을 2% (v/ v) 부터시작하여최종농도인 6.4% (v/v) 까지점차적으로양을늘려적응시켰다. 이후곤드레알코올추출물을알코올식이에직접섞어매일신선한상태로 8주간공급하였다. 곤드레에탄올추출물은동결건조한곤드레를 70% 에탄올로추출하였으며 ( 수율 18.3%), 공급전까지 -80 o C에보관하였다. 본연구에사용한곤드레에탄올추출물은 HPLC 분석결과, pectolinarin과 pectolinarigenin을각각 46.2 ± 0.8 mg/g과 1.5 ± 0.03 mg/g을함유하고있었다. 그룹간식이와알코올섭취수준을동일하게맞추기위하여, 전날가장적게섭취한그룹의평균섭취량을기준으로하여 pair-feeding 하였다. 본연구는경희대학교동물실험윤리위원회의승인을받아수행하였다 (KHR ). 간조직의병리학적검사적출한간조직을 10% formalin에 48시간고정후파라핀블록을제작하였고 5 µm 두께의절편을만들어슬라이드를제작하였다. Hematoxylin-eosin 용액으로염색을실시한후, 광학현미경 (Olympus, Tokyo, Japan) 을사용하여관찰하였다. 지방구정도는 100배율상태에서관찰면적당지방구를포함하고있는간세포의비율을 4점척도 (1점 = 6% 미만, 2점 = 6~33%, 3점 = 33~66%, 4점 = 66% 이상 ) 로측정하였다. 객관적인평가를위해처리군을알지못하는두명이상의연구원이슬라이드를관찰하여판정하였다. 간조직과혈청의중성지방과총콜레스테롤농도및혈청의 ALT 와 AST 농도측정중성지방과총콜레스테롤정량을위해우선간조직의지질성분을추출하였다. 간조직 100 mg을 PBS-10 mm EDTA (ph 7.4) 용액 1 ml에넣고균질화하였다. 여기에 2 ml isopropanol-hexane-water (80:20:2 v/v/v), 0.5 ml hexane-diethyl ether (1:1), 1 ml 3차증류수순으로용매를넣고잘흔들어지질성분을추출하였다. 30분이상상온에방치하여최종상층액을취하였으며, 질소가스로유기용매를휘발시킨후, isopropanol 20 µl으로재용해하였다. 이후, 간조직의지질추출용액과혈청의중성지방농도와총콜레스테롤농도는상업용시약을이용하여비색정량하였다 (BCS 중성지방측정용키트와 BCS 총콜레스테롤측정용키트 ; JW Medical, Seoul, Korea). 혈청의 aspartate aminotransferase (AST) 와 alanine aminotransferase (ALT) 효소활성을상업용측정키트 (Asan Pharmaceutical, Seoul, Korea) 를이용하여측정하였다. Western blot 분석간조직을 RIPA buffer [50 mm Tris-HCl, ph 7.4, 1%

3 422 / 곤드레의알코올성지방간손상억제효과 NP-40, 0.25% Na-deoxycholate, 150 mm NaCl, 1 mm EDTA, protease inhibitor tablet (Roche, Indianapolis, IN, USA)] 에넣고균질화후, 15분간 14,000 rpm에서상층액을분리하였다. 이렇게얻어진시료의단백질농도는 Bradford assay를 (Coomassie blue protein assay reagent, Waltham, MA, USA) 이용하여정량하였다. 50 µg 간조직균질용액을 2 loading buffer와혼합하여 95 o C에서 5분간끓여준후 10% SDS-PAGE 로분리하였다. 분리된단백질은 PVDF 지 (Merck Millipore, Darmstadt, Germany) 로옮긴후, Ponceau S 용액 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) 염색으로확인하였다. 이후, TBS-T 용액에희석한 5% 탈지분유 (Difco, Sparks, MD, USA) 용액에 2시간이상처리하였다. 1차항체는 phosphorylated- acetyl-coa carboxylase (p-acc), ACC, phosphorylated-ampk (p- AMPK), AMPK, phosphorylated- nuclear factor kappa B (p-nfκb), NFκB ( 이상 Cell signaling, CA, USA), TNFα (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 을 1:500~1,000의비율로희석하여사용하였다. TBS-T 용액로충분히세척한후 2차항체로 goat anti-rabbit IgG (H+L)- horse radish peroxidase conjugate (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 를 1:5,000의비율로희석하여반응시켰다. ECL 용액 (Clarity western ECL substrate, BioRAD) 으로반응시킨뒤, chemiluminescence image system (Clinx Science Instruments Inc., Shanghai, China) 을이용하여밴드의진하기를정량하였다. 인산화된단백질의발현수준은해당단백질의전체단백질발현수준을기준으로상대적인값으로계산하였다. Real-time RT-PCR TRIzol 용액 (Invitrogen, Waltham, MA, USA) 을사용하여간조직의 total RNA를추출하고, 아가로오스겔전기영동으로 RNA 상태를확인하였다. 또한, 260 nm와 280 nm에서흡광도 (Nano 2000 Spectrophotometer; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 를측정하여 RNA 의농도와순도를확인하였다. Total RNA 100 ng 으로부터 Prime Script TM RT 용액키트 (Takara Bio, shiga, Japan) 를이용해 cdna를합성하였다. Real time PCR은 SYBR Premix Ex Taq (Takara Bio) 를사용하여 MJ mini TM thermal cycler (Bio-Rad) 에서수행하였으며, 반응조건은 95 o C에서 5분간 pre-denaturation 시킨후, 95 o C에서 15초, 60 o C에서 1분을총 40회수행하였다. GAPDH를대조유전자로하여지질합성관련유전자인 SREBP1 (sterol regulatory binding protein 1), FAS (fatty acid synthase), SCD1 (stearyl coa desaturase 1) 의상대적인발현정도를 계산하였다. 사용한 primer sequence는 SREBP1: GGA GCC ATG GAT TGC ACA TT, AGG AAG GCT TCC AGA GAG GA, FAS: TGT TCT CAA GGA AGG CAC TG, GAG TCC ACC CAC TGG AAA CT, SCD-1: ATG CCG GCC CAC ATG CTC CAA G, CGC ACA AGC AGC CAA CCC ACG T; GAPDH: TCC TGC ACC ACC ACC TGC TTA G, TTC TGA GTG GCA GTG AT GGC A이다. 통계분석모든값은평균과표준오차로표시하였고, 각군간평균값의차이는 One-way analysis of variance (ANOVA) 로분석후 Duncan s multiple range test로사후검정을실시하였다. p < 0.05 수준에서유의성을검증하였으며, 모든통계분석은 Statistical Analysis Systems (SAS) ver.9.3 (SAS Institute, Cary, NC, USA) 을사용하였다. 결 실험시작시, 네군간의체중의차이는없었다. 식이중알코올함량이증가하면서알코올군들 (E, E+LCS, E+HCS) 에서초기체중증가가잠시정체되었으나이후체중증가가회복되기시작하였으며, 실험종료시네군간평균체중에는유의적인차이가없었다 (Fig. 1). 과 간조직의지방간발생정도를현미경으로관찰한결과, 알코올을공급한 E 군에서는다수의지방구가나타났으며, 정상대조군인 C군은이와대조적으로지방구를거의관찰할수없었다. 한편, 알코올식이와함께곤드레에탄올추출물을투여한 E+LCS 군과 E+HCS군의경우, 지방구 Fig. 1. Effects of Cirsium setidens ethanol extract (CS) on body weight changes in ethanol-fed rats. C: control diet, E: ethanol diet, E+LCS: ethanol diet with 100 mg/kg BW CS, and E+HCS: ethanol diet with 500 mg/kg BW CS

Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 420 ~ 428 / 423 Fig. 3. Effects of Cirsium setidens ethanol extract (CS) on serum ALT and serum AST activities in ethanol-fed rats.

4 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 420 ~ 428 / 423 Fig. 3. Effects of Cirsium setidens ethanol extract (CS) on serum ALT and serum AST activities in ethanol-fed rats. C: control diet, E: ethanol diet, E+LCS: ethanol diet with 100 mg/kg BW CS, and E+HCS: ethanol diet with 500 mg/kg BW CS. Data are the means ± SE (n = 7). Different letter indicate significant difference (p < 0.05). Fig. 2. Effects of Cirsium setidens ethanol extract (CS) on the development of hepatic steatosis in ethanol-fed rats. C: control diet, E: ethanol diet, E+LCS: ethanol diet with 100 mg/kg BW CS, and E+HCS: ethanol diet with 500 mg/kg BW CS (upper) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained sections of liver tissue are shown at 200. (lower) The degree of hepatic steatosis was graded 1 to 4 based on the average percent of fat-accumulated hepatocytes per field at 100X magnification (grading 1 = < 6%, 2 = 6~33%, 3 = 33~66%, 4 = > 66%). Data are the means ± SE (n = 7). Different letter indicate significant difference (p < 0.05). 형성 정도가 크게 감소하는 것으로 나타났다 (Fig. 2). 간 손상 지표인 혈청 ALT와 AST의 활성도를 측정한 결과, 두 가지 효소의 활성 모두 E군에서 C군에 비해 유의적으로 높 았으며, E+LCS군과 E+HCS군의 경우 E군에 비해 유의적 으로 낮았고 C군과는 유의적인 차이가 없었다 (Fig. 3). 간 조직의 중성 지질 농도와 콜레스테롤 농도는 E군에서 C군에 비해 유의적으로 높았으며, 혈청의 중성지질 농도 와 콜레스테롤 농도 또한 E군이 C군에 비해 유의적으로 높 았다 (Fig. 4). 곤드레 에탄올 추출물을 제공한 경우, 두 군 (E+LCS, E+HCS) 모두 간 조직과 혈청의 중성지질 농도 를 E군에 비해 유의적으로 낮추었다. 한편 곤드레 에탄올 추출물 섭취는 간과 혈청의 콜레스테롤 농도에는 유의적 인 변화를 주지 않았다. 알코올 식이와 곤드레 에탄올 추출물의 투여가 AMPK 의 활성 및 관련 signaling에 미치는 영향을 살펴보기 위하 여, 간 조직의 phosphorylated-ampk와 phosphorylatedacc의 수준을 western blot analysis로 측정하였다. 그 결 과, E+HCS군은 E군에 비해 p-ampk의 수준이 유의적으 로 높았고, E+LSC군과 E+HCS군 모두 E군에 비해 p-acc 수준이 높게 나타났다 (Fig. 5). AMPK 활성에 의해 조절되는 지질 합성 관련 유전자 발 현 수준을 측정한 결과를 Fig. 6에 나타내었다. E군은 C군 에 비해 FAS mrna 수준이 유의적으로 증가하였으며, SREBP1 mrna와 SCD1 mrna 수준도 증가하는 경향을 보였으나 유의적인 차이는 아니었다 (Fig. 6). 또한, E+HSC 군은 E군에 비해 FAS mrna와 SCD1 mrna 수준이 유 의적으로 낮게 나타났다. 한편, 염증시 증가되는 TNFα 수준을 측정한 결과, E군에 서 C군에 비해 2배 이상 유의적으로 증가하였다 (Fig. 7). 식이 곤드레 에탄올 추출물 추가 농도에 비례하여 간 조직 의 TNFα 수준이 감소하였으며, E+HCS군의 경우 E군에 비해 유의적으로 감소하였고 C군과는 유의적인 차이가 없 었다. 또한, 염증 반응을 조절하는 NFκB의 활성 정도를 나 타내는 p-nfκb 단백질 수준을 살펴본 결과, E+LCS군과

424 / 곤드레의알코올성지방간손상억제효과 Fig. 4. Effects of Cirsium setidens ethanol extract (CS) on hepatic and serum TG and cholesterol concentrations in ethanol-fed rats.

5 424 / 곤드레의알코올성지방간손상억제효과 Fig. 4. Effects of Cirsium setidens ethanol extract (CS) on hepatic and serum TG and cholesterol concentrations in ethanol-fed rats. C: control diet, E: ethanol diet, E+LCS: ethanol diet with 100 mg/kg BW CS, and E+HCS: ethanol diet with 500 mg/kg BW CS. Data are the means ± SE (n = 7). Different letter indicate significant difference (p < 0.05). Fig. 5. Effects of Cirsium setidens ethanol extract (CS) on the protein levels of phosphorylated-ampk and phosphorylated-acc in the liver tissue of ethanol-fed rats. C: control diet, E: ethanol diet, E+LCS: ethanol diet with 100 mg/kg BW CS, and E+HCS: ethanol diet with 500 mg/kg BW CS. Data are the means ± SE (n = 7). Different letter indicate significant difference (p < 0.05). E+HSC군에서모두 E군에비해 p-nfκb 수준이유의적으로낮게나타났다. 고찰 알코올성지방간은만성적인과도한알코올섭취시나타나는초기증상으로만성간질환의주요원인중의하나 이다. 본연구에서는여러플라보노이드를함유하고있는곤드레에탄올추출물이알코올성지방간의유발및그로인한간손상에미치는영향을알아보고자수행되었다. 본연구에서는알코올을 6.4% (v/v) 농도로함유한 Lieber- DeCarli 액체식이를사용하여만성적인알코올섭취시나타나는알코올성지방간을유도하였다. Lieber-DeCarli 액체식이를사용하는경우별도의식수공급이없으므로

6 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 420 ~ 428 / 425 Fig. 6. Effects of Cirsium setidens ethanol extract (CS) on the mrna levels of SREBP1, FAD, and SCD1 in the liver tissue of ethanol-fed rats. C: control diet, E: ethanol diet, E+LCS: ethanol diet with 100 mg/kg BW CS, and E+HCS: ethanol diet with 500 mg/kg BW CS. Data are the means ± SE (n = 7). Different letter indicate significant difference (p < 0.05). Fig. 7. Effects of Cirsium setidens ethanol extract (CS) on the protein levels of phosphorylated-nfκb and TNFα in the liver tissue of ethanol-fed rats. C: control diet, E: ethanol diet, E+LCS: ethanol diet with 100 mg/kg BW CS, and E+HCS: ethanol diet with 500 mg/ kg BW CS. Data are the means ± SE (n = 7). Different letter indicate significant difference (p < 0.05). 알코올섭취량을늘릴수있고, 이로인해지속적으로혈중알코올농도를높게유지시킬수있다. 19 또한, 알코올투여군은정상대조군에비해혈청 AST와혈청 ALT 농도가유의적으로높게나타나알코올로인한간손상이유발되었고, pro-inflammatory cytokine인 TNFα의간조직에서의발현이증가하는등알코올에의한염증증가가관찰되었다. 한편, 알코올과동시에곤드레알코올추출물을식이에공급한경우, 간조직의알코올에의한지방구증가가현저하게감소되었으며간조직과혈청에서의알코올에의한중성지방농도의증가도유의적으로억제되었다. 본연구에서사용한곤드레알코올추출물의용량인 100 mg/ kg과 500 mg/kg의두가지농도모두에서지방간발생억 제효과가나타났으며, 농도의존적인차이는없었다. 이는낮은농도인 100 mg/kgbw으로도정상대조군의수준으로지방구발생이억제되었으므로더높은농도에의한추가적인변화를살펴볼수없었던것으로생각된다. 만성적인알코올섭취로인해나타나는간조직의지방축적의원인으로여러가지대사변화가제안되고있으며, 특히간세포의지질합성 (lipogenesis) 의증가가필수적으로동반된다. 20 AMPK는간조직을비롯하여많은조직에서지질대사를조절하는데에중추적인역할을하는데, 21 AMPK는 serine/threonine kinase의일종으로하나의촉매단위 (α-unit) 와두개의조절단위 (b-unit과 g-unit) 로이루어져있으며, α-unit의인산화에의해활성화된다. 이때

7 426 / 곤드레의알코올성지방간손상억제효과 AMPK의활성화는지방산합성효소인 ACC를인산화시키는것으로알려져있다. 22 ACC는지방산합성의첫단계이며속도조절단계 (rate-limiting step) 인 acetyl-coa의 malonyl-coa로의전환을촉매하는효소이며, 인산화에의해활성이억제된다. 23 본연구의결과, 식이중곤드레에탄올추출물함유량이높을수록간조직에서의인산화된 AMPK 단백질 (phosphorylated-ampk) 의수준이증가하는것으로나타났다. 또한, 곤드레에탄올추출물을투여한군에서는에탄올단독투여군에비해 AMPK의 downstream 표적단백질인 ACC의인산화를유의적으로증가시켰다. 따라서곤드레에탄올추출물에의한 AMPK 의활성증가는 ACC의인산화를통해 ACC 효소의활성을억제하여간조직에서의지방산합성억제에기여하는것으로보인다. Noh 등 24 의연구에따르면, 고지방식이를공급한마우스모델에서곤드레에탄올추출물의식이보충이간조직에서의 AMPK의인산화를증가시키고고지방식이에의한비알코올성지방간의발생이억제됨이보고된바있어본연구결과를뒷받침한다. 또한, 3T3-L1 세포를이용한 in vitro 연구에서곤드레추출물의처리는지방세포의분화와지방구축적을억제하는것으로나타나, 25 곤드레추출물의지방축적억제효과는특정조직에국한되지않는것으로생각되며, 곤드레추출물중어떤특정성분이지질대사를조절하는역할을하는지에대한추후연구가필요할것으로보인다. 또한, AMPK의활성화는 ACC 활성억제와함께, SREBP1, FAS, SCD1 등지질합성에관여하는여러유전자의발현을억제하는것으로알려져있다. 26 본연구에서도곤드레에탄올추출물에의한 AMPK 활성화는 FAS와 SCD1 유전자발현을유의적으로억제하는것으로나타나, 곤드레에탄올추출물이 AMPK-의존신호전달체계를유의적으로변화시킴을제시한다. 한편, 본연구에서저농도의곤드레에탄올추출물투여군의경우 AMPK 활성에는유의적인변화가없었으나, 지방간은정상수준으로회복됨을보였다. 이는곤드레에탄올추출물의지방간개선효과가 AMPK 활성조절과함께다른기전이복합적으로작용하였을가능성을제시한다. 한예로, 알코올은 NAD + -의존탈아세틸화효소인 sirtuin 1 (SIRT1) 의활성억제를통해지방간발생을촉진함이보고된바있다. 27 추후곤드레에탄올추출물의 SIRT1의활성및관련유전자발현조절에미치는영향에대한연구가필요할것으로생각된다. 알코올성지방간과동반되는간손상의지표로는혈청 AST 및혈청 ALT의활성증가와간조직에서의 TNFα의발현증가가대표적이다. 본연구에서곤드레에탄올추출 물의섭취는알코올에의한혈청 AST와혈청 ALT 농도증가를유의적으로억제하여정상대조군의수준으로낮추었으며, 간조직에서의 TNFα 단백질수준을농도의존적으로감소시켰다. 만성적인알코올섭취는간대식세포의 NFκB를활성증가를통해 TNFα의발현및분비를촉진하고, 알코올성간손상을가속화하는것으로알려져있다. 28,29 흥미롭게도본연구에서곤드레에탄올추출물을공급한경우간조직의활성형 NFκB (phosphorylated- NFκB) 의수준을알코올만단독으로공급한경우에비해거의절반수준으로감소시키는것으로나타났다. NFκB 가염증성반응을조절하는과정의중추적인전사인자임을고려할때곤드레추출물의 NFκB 활성억제는알코올성간손상을억제하는관련경로를제시한다. 기존의몇몇연구에서 CCl 4 혹은 D-galactosamine 등으로유도된간손상모델을사용하여곤드레추출물의간손상으로부터의억제효과가일부보고되었으나, 그작용기전으로는대부분곤드레플라보노이드의항산화활성으로제한되어연구된바있다. 14,30 본연구결과나타난곤드레에탄올추출물의 NFκB 활성억제효과는곤드레추출물의또다른새로운생리활성을제시한다. 곤드레에는 pectolinarin, luteolin, hispidulin, apigenin 등의여러플라보노이드가함유되어있으며, 다른엉겅퀴류 (Cirsium 속식물 ) 에비해특히 pectolinarin의함유량이높다. 8 추후 pectolinarin의항염증활성에대한 in vitro 및 in vivo 연구가요구되며, 염증성반응을동반하는비만, 당뇨등의질병에서의곤드레추출물또는 pectolinarin의질병발생억제또는증상완화를살펴보는것도의의가있을것으로생각된다. 본연구의결과, 흰쥐동물모델에서곤드레에탄올추출물 100 mg/kg 투여는알코올에의한지방간발생및이로인한간손상을유의적으로억제하는것으로나타났다. 미국 FDA의가이드라인에따르면 31,32 동물실험에서사용된용량을인체에올바르게적용하기위해서는해당실험동물의체표면적을고려한계산법을사용할것을권장하고있다 [ 인체해당용량 (human equivalent dose) (mg/ kg) = 실험동물용량 (animal dose) (mg/kg) * 실험동물의 Km factor/ 인체의 Km factor]. 이때 Km factor는체중 (kg) 을체표면적 (m 2 ) 으로나눈값으로, 사람과랫트의 Km factor는각각 37과 6이다. 이들값을대입하여본연구에사용된곤드레에탄올추출량을성인체중인 60 kg 인체에해당하는양으로환산하면하루 mg (= 100 mg/kg 6/37 60 kg) 이된다. 건조곤드레에서곤드레알코올추출물의수율이 18.3% 였음을고려하면, 이는건조곤드레약 5.3 g에해당하며일상식이에서쉽게섭취할수있는수준이다. 따라서본실험연구에서사용된용량은인체

8 Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2016; 49(6): 420 ~ 428 / 427 에충분히적용될수있는용량인것으로판단된다. 요 본연구에서는 Sprague-Dawley 종흰쥐수컷을정상대조군 (C), 알코올군 (E), 알코올 mg/kgbw 곤드레에탄올추출물군 (E+LCS), 알코올 mg/kgbw 곤드레에탄올추출물군 (E+HCS) 으로나누어 Lieber-DeCarli control diet 혹은 Lieber-DeCarli ethanol diet를 8주간공급하였으며, 이때곤드레에탄올추출물은액상사료에직접섞어공급하였다. 알코올과곤드레에탄올추출물의식이공급종료후간조직의지방구축적정도를살펴본결과, E+LCS군과 E+HSC군은 E군에비해지방간발생이유의적으로억제되었으며, 정상대조군인 C군과유의적인차이가없었다. 이와비슷하게, 곤드레에탄올추출물의공급은알코올에의해증가된간조직과혈청의중성지방농도를유의적으로낮추었으며, 혈청 AST와혈청 ALT 활성도정상대조군수준으로회복시키는것으로나타났다. 한편, 곤드레에탄올추출물의공급은 p-ampk과 p-acc 단백질수준을농도의존적으로증가시켰으며, 두단백질모두 E군에비해 E+HSC군에서유의적으로높게나타났다. 또한 FAS mrna 와 SCD1 mrna 수준은 E 군에비해 E+HSC군에서유의적으로낮게나타났다. 곤드레에탄올추출물은간조직에서알코올공급에의해증가된 NFκB 의활성을유의적으로낮추었으며, NFκB의표적단백질인 TNFα 단백질수준을농도의존적으로낮추었다. 본연구결과를통해곤드레는알코올에의한지방간발생및관련된간손상을유의적으로억제할수있음을확인하였으며이과정에서 AMPK 활성증가와 NFκB 활성억제가관여함을제시하였다. 약 References 1. Ministry of Health and Welfare, Korea Centers for Disease Control and Prevention. Korea Health Statistics 2013: Korea National Health and Nutrition Examination Survey (KNHANES VI-1). Cheongju: Korea Centers for Disease Control and Prevention; Lee SM, Yoon DY, Paik JH, Hyun KR, Kang HR. Socioeconomic impacts of major health risk factor and effectiveness evaluation of regulatory policy report. Seoul: National Health Insurance Service; Purohit V, Gao B, Song BJ. Molecular mechanisms of alcoholic fatty liver. Alcohol Clin Exp Res 2009; 33(2): Deleuran T, Grønbaek H, Vilstrup H, Jepsen P. Cirrhosis and mortality risks of biopsy-verified alcoholic pure steatosis and steatohepatitis: a nationwide registry-based study. Aliment Pharmacol Ther 2012; 35(11): Haflidadottir S, Jonasson JG, Norland H, Einarsdottir SO, Kleiner DE, Lund SH, Björnsson ES. Long-term follow-up and liverrelated death rate in patients with non-alcoholic and alcoholic related fatty liver disease. BMC Gastroenterol 2014; 14(1): Lee WB, Kwon HC, Cho OR, Lee KC, Choi SU, Baek NI, Lee KR. Phytochemical constituents of Cirsium setidens Nakai and their cytotoxicity against human cancer cell lines. Arch Pharm Res 2002; 25(5): Lee SH, Jin YS, Heo SI, Shim TH, Sa JH, Choi DS, Wang MH. Composition analysis and antioxidative activity from different organs of Cirsium setidens Nakai. Korean J Food Sci Technol 2006; 38(4): Thao NT, Cuong TD, Hung TM, Lee JH, Na M, Son JK, Jung HJ, Fang Z, Woo MH, Choi JS, Min BS. Simultaneous determination of bioactive flavonoids in some selected Korean thistles by highperformance liquid chromatography. Arch Pharm Res 2011; 34(3): Jeong DM, Jung HA, Choi JS. Comparative antioxidant activity and HPLC profiles of some selected Korean thistles. Arch Pharm Res 2008; 31(1): Lee JH, Jung HK, Han YS, Yoon YM, Yun CW, Sun HY, Cho HW, Lee SH. Antioxidant effects of Cirsium setidens extract on oxidative stress in human mesenchymal stem cells. Mol Med Rep 2016; 14(4): Chung MJ, Lee S, Park YI, Lee J, Kwon KH. Neuroprotective effects of phytosterols and flavonoids from Cirsium setidens and Aster scaber in human brain neuroblastoma SK-N-SH cells. Life Sci 2016; 148: Ahn MJ, Hur SJ, Kim EH, Lee SH, Shin JS, Kim MK, Uchizono JA, Whang WK, Kim DS. Scopoletin from Cirsium setidens Increases Melanin Synthesis via CREB phosphorylation in B16F10 cells. Korean J Physiol Pharmacol 2014; 18(4): Yoo YM, Nam JH, Kim MY, Choi J, Park HJ. Pectolinarin and pectolinarigenin of cirsium setidens prevent the hepatic injury in rats caused by D-galactosamine via an antioxidant mechanism. Biol Pharm Bull 2008; 31(4): Yoo YM, Nam JH, Kim MY, Choi J, Park HJ. Pectolinarin and pectolinarigenin of Cirsium setidens prevent the hepatic injury in rats caused by D-galactosamine via an antioxidant mechanism. Biol Pharm Bull 2008; 31(4): Long YC, Zierath JR. AMP-activated protein kinase signaling in metabolic regulation. J Clin Invest 2006; 116(7): Towler MC, Hardie DG. AMP-activated protein kinase in metabolic control and insulin signaling. Circ Res 2007; 100(3): You M, Matsumoto M, Pacold CM, Cho WK, Crabb DW. The role of AMP-activated protein kinase in the action of ethanol in the liver. Gastroenterology 2004; 127(6): García-Villafranca J, Guillén A, Castro J. Ethanol consumption impairs regulation of fatty acid metabolism by decreasing the activity of AMP-activated protein kinase in rat liver. Biochimie 2008; 90(3): Mathews S, Xu M, Wang H, Bertola A, Gao B. Animals models of gastrointestinal and liver diseases. Animal models of alcoholinduced liver disease: pathophysiology, translational relevance, and challenges. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2014;

9 428 / 곤드레의알코올성지방간손상억제효과 306(10): G819-G Steinberg GR, Kemp BE. AMPK in health and disease. Physiol Rev 2009; 89(3): Noh H, Lee H, Kim E, Mu L, Rhee YK, Cho CW, Chung J. Inhibitory effect of a Cirsium setidens extract on hepatic fat accumulation in mice fed a high-fat diet via the induction of fatty acid betaoxidation. Biosci Biotechnol Biochem 2013; 77(7): Viollet B, Lantier L, Devin-Leclerc J, Hebrard S, Amouyal C, Mounier R, Foretz M, Andreelli F. Targeting the AMPK pathway for the treatment of type 2 diabetes. Front Biosci (Landmark Ed) 2009; 14: Steinberg GR, Kemp BE. AMPK in health and disease. Physiol Rev 2009; 89(3): Noh H, Lee H, Kim E, Mu L, Rhee YK, Cho CW, Chung J. Inhibitory effect of a Cirsium setidens extract on hepatic fat accumulation in mice fed a high-fat diet via the induction of fatty acid betaoxidation. Biosci Biotechnol Biochem 2013; 77(7): Lee YJ, Kim DB, Lee JS, Cho JH, Kim BK, Choi HS, Lee BY, Lee OH. Antioxidant activity and anti-adipogenic effects of wild herbs mainly cultivated in Korea. Molecules 2013; 18(10): Ding RB, Tian K, Huang LL, He CW, Jiang Y, Wang YT, Wan JB. Herbal medicines for the prevention of alcoholic liver disease: a review. J Ethnopharmacol 2012; 144(3): You M, Liang X, Ajmo JM, Ness GC. Involvement of mammalian sirtuin 1 in the action of ethanol in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2008; 294(4): G892-G Nagata K, Suzuki H, Sakaguchi S. Common pathogenic mechanism in development progression of liver injury caused by nonalcoholic or alcoholic steatohepatitis. J Toxicol Sci 2007; 32(5): McClain CJ, Hill DB, Song Z, Deaciuc I, Barve S. Monocyte activation in alcoholic liver disease. Alcohol 2002; 27(1): Lee SH, Heo SI, Li L, Lee MJ, Wang MH. Antioxidant and hepatoprotective activities of Cirsium setidens Nakai against CCl4- induced liver damage. Am J Chin Med 2008; 36(1): U.S. Department of Health & Human Services, U.S. Food & Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (US). Guidance for industry: estimating the maximum safe starting dose in initial clinical trials for therapeutics in adult healthy volunteers. Rockville (MD): Center for Drug Evaluation and Research; Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J 2008; 22(3):

농림수산식품부장관귀하 이보고서를 팥의대사성질환개선및기능성규명 에관한연구의최종보고서로제출 합니다 년 2 월 11 일 - 1 -

농림수산식품부장관귀하 이보고서를 팥의대사성질환개선및기능성규명 에관한연구의최종보고서로제출 합니다. 2013 년 2 월 11 일 - 1 - 연구기관명 : 부산대학교 연구책임자 : 정명호 연구원 : 손용해 연구원 : 장민경 - 2 - Ⅰ. 제목 팥의대사성질환개선및기능성규명 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 팥의대사성질환개선소재발굴과그기능성을과학적으로증명하기위해, 팥의당뇨,