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1 KOREAN J. FOOD SCI. TECHNOL. Vol. 44, No. 3, pp. 343~349 (2012) The Korean Society of Food Science and Technology 복분자주에서분리한 Mannan 다당의면역증진활성 이호 * 경기대학교식품생물공학과 Immuno-stimulating Activities of Mannose-rich Polysaccharides Isolated from Korean Black Raspberry Wine Ho Lee* Department of Food Science & Biotechnology, Kyonggi University Abstract Polysaccharides isolated from Korean black raspberry wine were examined for their chemical properties and immuno-modulating activities. The molecular mass of RB-1b-I, the main polysaccharide in black raspberry wine, was estimated as 180 kda and it contained a significant proportion of mannose (76.8%) and 4 different minor component sugars such as galactose (15.8%), arabinose (3.8%), glucose (2.6%) and rhamnose (1.2%). This indicated that RB-1b-I was mainly present as a mannan, which had originated from the cell walls of fermenting yeasts. On the other hand, RB-1b-I induced high levels of macrophage activation as well as mitogenicity regarding murine splenocytes in vitro. The intravenous administration of RB-1b-I significantly augmented NK cytotoxicity against YAC-1 tumor cells. RB-1b-I also showed potent anti-complementary activity in a dose-dependent manner via both alternative and classical pathways. Results indicated that Korean black raspberry wine contains peculiar polysaccharides which provide beneficial immuno-stimulating activities for human health. Keywords: raspberry wine, polysaccharide, mannan, immuno-stimulating activity 서 과실주로대표되는저알코올주류의적절한음용은심혈관계질환의예방및개선에효과가있다고보고 (1,2) 되고있어최근그수요가크게증가하고있다. 특히적포도주의경우, flavonoid 를비롯한다양한 polyphenol(3,4) 이존재하고이들이갖는항산화효과 (5,6) 때문에건강에유익한것으로알려져있으며항염증작용, 항고혈압작용, 항응고작용및저밀도지방단백 (LDL) 의산화억제등다양한기능들이보고되고있어관심과연구가집중되고있다 (4). 그러나전통발효음료에서기대되는모든약리활성이단지 polyphenol 만의기능이라고는할수없으며, 생리활성을갖는타화합물의존재가능성이있을수있다. 발효주의원료가되는생과에는저분자및고분자의다양한생리활성물질이존재할것으로기대되고있으며특히이들을발효한발효주의경우, 발효과정동안화학적변화에의해원료에는함유되어있지않은미지의물질과생리활성을가지는물질을함유할가능성이높다고할수있다. 일반적으로다당은고농도의알코올용액에서침전되는성질때문에그동안발효주중의활성성분으로주목받지못하였지만, 비교적낮은알코올농도 (10-12%) 에서 *Corresponding author: Ho Lee, Dept. of Food Science and Biotechnology, Kyonggi University, Suwon, Gyeonggi , Korea Tel: Fax: hlee@kyonggi.ac.kr Received February 4, 2012; revised March 6, 2012; accepted March 6, 2012 론 선택적으로용해되어존재할가능성이여전히남아있다고할수있다. 복분자 (Rubus coreanus Miquel) 는주로우리나라의남부지방에서야생또는재배되고있는대표적과실중하나로일본및중국에서도다량생산되고있다. 복분자는생과또는냉동과형태로소비되거나주스, 잼및아이스크림형태로가공되는데많은부분은복분자주형태로발효되어음용되고있다 (7). 복분자에는 anthocyanin, flavonoid, tannin, stilbenoids, phenolic acid 및 lignan 과같은다양한 phytochemical 을다량함유 (8,9) 하고있어높은항산화활성이보고되고있다 (10,11). 최근에는인간유래의다양한종양세포주 ( 대장암 ; HT-29, HCT116, 구강암 ; KB, CAL- 27 유방암 ; MCF-7, 전립선암 ; LNCaP) 에대한복분자의증식억제능 (12) 이보고된바있으며, 복분자추출물이갖는 cyclooxygenase- 2 및 nitric oxide synthase 발현저해능이보고 (13) 되기도하였다. 한편 Jung 등 (14) 은수입적포도주에상당하는높은항산화활성이복분자주에존재하며인간선암 (adenocarcinoma) 및간모세포종 (hepatoblastoma) 에대한높은항암활성을보고하기도하였다. 그러나이러한복분자유래의다양한생물활성에대한연구는대부분저분자의 phytochemical 류에집중되어있으며, 복분자주에대한연구도주로발효특성 (15) 및성분분석연구 (16) 가대부분으로생리기능성의과학적해명, 특히복분자주유래다당의기능성에대한연구는전무한실정이다. 따라서본연구에서는우리나라특산의복분자주를대상으로다당을분리, 정제하고이들의화학적특성을검토하였으며, 각종면역자극활성을평가함으로써전통발효주의새로운기능성해명에대한기초자료를제공하고자하였다. 343

2 344 한국식품과학회지제 44 권제 3 호 (2012) 재료및방법 재료본실험에사용한복분자주 (raspberry wine) 는 2009 년 6 월전북고창군농가에서채취하여지역농가의전통방법에따라발효하고약 1 년간숙성된제품을사용하였다. 사용된복분자주는알코올함량약 11.5% 로제공받은즉시 Whatman No. 1(Maidstone, UK) 필터로여과하고회전감압농축장치 (Eyela, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan) 를이용 1/5 부피로농축하고실험에사용하였다. 일반분석방법중성당함량은 galactose 를표준물질로하여 phenol-sulfuric acid 법 (17) 으로, 산성당함량은 galacturonic acid 를표준물질로하여 m-hydroxydiphenyl 법 (18) 으로, 단백질함량은표준물질로 bovine serum albumin 을사용하여 Bradford 법 (19) 으로측정하였다. 한편분자량및정제도측정에사용한 HPLC 는 Asahipak GS-520+GS- 320+GS-220( 각 cm, Showa Denko Co., Tokyo, Japan) 을장착한 HPLC-9500(Young-Lin Co. Ltd., Anyang, Korea) 를사용하여 0.2 M NaCl 를용매로 0.5 ml/min 로용출하였으며, refractive index detector(waters, Milford, MA, USA) 로검출하였다. 정제다당의분자량은 standard pullulans(p-800, P-400, 200, 100, 50, 20, 10 및 5; Showa Denko Co.) 를표준물질로하여얻어진표준곡선과비교하여측정하였다. 구성당분석은다당시료를 2 M trifluoroacetic acid(tfa) 로 121 o C 에서 1.5 시간가수분해한후, 각각 alditol acetate 유도체 (20) 로전환시킨후, GC 로분석하였다. GC 의분석은 SP-2380 capillary column(0.2 µm film, 0.25 mm i.d. 30 m, Supelco, Bellefonte, PA, USA) 이장착된 GC M600D(Young-Lin Co. Ltd.) 를이용하였으며표준온도조건 (60 o C (1 min), o C (30 o C/min), 220 o C(12 min), o C(8 o C/min), 250 o C(15 min)) 에서분석을실시하였다. 구성당의 mole % 는 peak 의면적비, flame ionization detector(fid) 에대한반응계수및각구성당의 alditol acetate 유도체의분자량으로부터계산하였다. 면역활성다당의분리및정제복분자주를회전감압농축장치 (Eyela Co., Tokyo, Japan) 를이용하여 5배농축하고최종농도가 80% 가되도록에탄올을첨가하여하룻밤방치한후, 발생한침전물을회수하고 80% 에탄올을이용, 적색색소가제거될때까지수차례세척하였다. 침전물은소량의증류수에용해하여 Spectra/Por 2 투석막 (MWCO; 12,000-14,000, Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA, USA) 을이용하여 2-3일간투석을행하고동결건조를행하여조다당시료인 RB-0를얻었다. 조다당 RB-0는 50 mm acetate buffer(ph 5.2) 로평형화된 Sephadex G-75 column( cm, Amersham Bio-sciences, Uppsala, Sweden)) 에 loading하고동일 buffer를이용하여용출시켜분자량이상이한 2개획분, RB-1 및 RB-2로분획하였다. 이중활성이양호한고분자획분인 RB-1은증류수로평형화된 DEAE-Sepharose FF(Cl form, cm, Amersham Bio-sciences) 에흡착시킨후증류수, 0.1, 0.2 및 0.3 M 의 NaCl 용액으로단계적으로용출시켰으며, 이때활성과수율이우수했던 RB-1b획분 (0.1 M NaCl 용출 ) 을이후의정제과정에사용하였다. RB-1b 획분은 50 mm acetate buffer(ph 5.2) 로평형화된 Biogel P-100 column( cm, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) 을이용, 겔여과를행하여최종활성획분인정제 RB-1b-I을얻었다 (Fig. 1). 비장세포 mitogen 활성능측정 ICR mouse(6-8 주령, 웅성, Koatec Co., Seoul, Korea) 에서비장을적출하여마쇄및여과를거쳐비장세포를획득한후, 0.2% 식염수를이용적혈구를제거하고, RPMI 1640-FBS 배지 (7% fetal bovine serum 함유 RPMI 배지, Gibco BRL Co., NY, USA) 로 2-3 회세척하여세포수를 cell/ml 가되도록조정하였다. 이때얻어진세포부유액은 96 well plate 에 90 µl 씩분주하고 10 µl 의시료용액을첨가하여 37 o C, 5% CO 2 incubator 에서 72 시간배양한후, 각 well 당 10 µl 의 CCK-8 kit(dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) 용액을첨가하여 37 o C, 5% CO 2 incubator 에서 3 시간배양하고 450 nm 에서흡광도를측정하여활성을비교하였다. Macrophage 활성화능측정 Macrophage 활성능측정은 Suzuki 등 (21) 의방법을실험실여건에맞게변형하여사용하였다. 즉, BALB/c mouse( 웅성, 6-8 주령, Koatec Co.) 의복강에 5% thioglycollate 배지 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 를 2mL 주입하고 시간내에유도된 macrophage 를회수한후, RPMI 1640(Gibco BRL Co.) 으로 2-3 회세척하고세포수를 cell/ml 로조정하여 96 well plate 에 100 µl 씩분주하였다. 이를 5% CO 2 incubator 에서배양 (37 o C, 2 h) 하여 macrophage monolayer 를형성시키고상등액을제거한후, 미부착 macrophage RPMI 1640-FBS 배지 (Gibco BRL Co.) 를이용하여세척하였다. 여기에 RPMI 1640-FBS 을각 well 당 180 µl 를분주하고, 20 µl 의시료를첨가하여 37 o C, 5% CO 2 incubator 에서 24 시간배양하였다. 배양후활성화된 macrophage monolayer 를배지로세척하고, 1% Triton X-100(Sigma) 25 µl 씩을가하여세포막을용해한후, macrophage 로부터유리된 lysosomal phosphatase 를기질인 p-npp(p-nitrophenylphosphate, 1 mg/ ml of M citrate buffer, ph 5.0, Sigma) 200 µl 와반응시킨다음 microplate reader(molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 를이용하여 405 nm 에서흡광도를측정하였다. 자연치사세포 (NK cell) 의살해능측정복분자주에서정제한다당물질을 6-8 주령의웅성 BALB/c 마우스에정맥주사하고 3 일후에비장을적출하여비장세포를조제하였다. 96-well plate 에마우스로부터얻은비장세포 (effector cell, E) 와 NK cell 감수성으로알려진종양세포 YAC-1(target cell, T) 을, E/T 비율이 100:1, 50:1, 25:1, 12.5:1 이되도록조정하여 6 시간동안배양하였다. 이때비장의 NK cell 의살해능에의해표적세포로부터유리되는 lactate dehydrogenase(ldh) 의발생량을 CytoTox 96 kit(promega, San Luis Obispo, CA, USA) 을사용하여측정하였다. NK cell 의종양세포살해능은다음식에의해계산하였다 (22). Cytotoxicity (%)=((experimental LDH release-spontaneous LDH release)/(maximum LDH release-spontaneous LDH release)) 100. 보체계활성화능항보체활성은 Mayer 법 (23) 을이용하여시료에의한보체활성화후, 잔존하는보체에의한적혈구용혈활성에근거를둔 complement fixation test 로측정하였다. 즉정상인의혈청과 2% gelatin, 3 mm Ca 2+, 10 mm Mg 2+ 이함유된 GVB 2+ 완충용액 (gelatin veronal buffered saline, ph 7.4) 및시료를각각 50 µl 씩혼합하여 37 o C 에서 30 분동안 1 차반응시킨후, 이반응액에 GVB 2+ 를 350 µl 씩첨가하고이를 배까지연속희석하였다. 여기

3 에 750 µl 의 GVB 2+ 와양의감작적혈구 (IgM-sensitized sheep erythrocytes, EA Cell, Biotest Co. Tokyo, Japan) 를 250 µl 씩가하여 37 o C 에서 1 시간반응시키고, 4 o C 의 PBS(phophate buffered saline) 를 2.5 ml 가하여반응을정지시켰다. 각반응액을 4 o C, 2,500 rpm 에서 10 분간원심분리하였으며상등액의흡광도를 412 nm 에서측정하였다. 항보체활성은총보체용혈저지율 (Inhibition of 50% total complement hemolysis, ITCH 50 ) 로나타내었다. 복분자다당의면역조절활성 차원면역전기영동 (Crossed Immunoelectrophoresis) GVB 2+ buffer, 10 mm EDTA 가함유된 EDTA-GVB 2 buffer, 2 mm MgCl 2 및 10 mm ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)- N,N,N',N'-tetraacetic acid(egta) 가함유된 Mg 2+ -EGTA-GVB 2 buffer 에정상인의혈청과시료를각각혼합하여 37 o C, 30 분간반응시킨후, ph 8.6 barbital buffer(ionic strength, 0.025) 를사용하여조제한 1% agarose gel 상에서 1 차원전기영동을행하였다 (3 ma/cm). 이후 0.5% anti-human C3 serum(sigma-aldrich Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 이함유된 1% agarose gel 상에서약 15 시간동안 2 차전기영동을행하였다 (1 ma/cm). 전개된 gel 은 bromophenol blue 로염색시켜항체와반응하여형성된침강선을관찰함으로써 C3 의분해산물을확인하였다 (24). 보체계활성의측정보체계활성화경로를조사하기위해 GVB 2+ 와 GVB 2+ 에서 Ca 2+ 이온만을제거한 Mg 2+ -EGTA-GVB 2 및금속이온을모두제거한 EDTA-GVB 2 buffer 에시료및정상인의혈청을각각첨가하고상기방법과같이총보체용혈의저지율을측정함으로써시료의보체계활성화경로를비교검토하였다. 통계처리실험결과는평균값 ± 표준오차 (mean±standard deviation) 로나타내었고 Student t-test 를이용하여통계처리한후 p<0.01 수준에서유의성을검정하였다. 결과및고찰 복분자주로부터다당의분리및정제전북지역농가에서 2010 년발효생산한복분자주를 5 배감압농축하고에탄올침전과투석및동결건조를행하여조다당 RB- 0 를얻었다. 수율은복분자주 L 당총 1.65 g 으로, 복분자주에는비교적많은양의수용성다당이존재함을알수있었다. 복분자에서분리된수용성다당 RB-0 은 Sephadex G-75 를이용한겔여과를행하여분자량이상이한 RB-1 및 RB-2 2 개획분으로분리되었다 (Fig. 1). RB-1 과 RB-2 획분은조다당 RB-0 대비각각 51% 와 19% 의수율을보여 RB-1 이상대적으로높은비율로복분자주에함유되어있었다. 100 µg/ml 농도에서비장세포 mitogen 활성을기준으로하였을때의면역활성은 RB-1 이 298% 로조다당 260% 보다우수하였으며, RB-2 의경우는 250% 를나타내어조다당보다다소낮은활성을보였다. 수율과면역활성측면에서상대적으로양호했던 RB-1 은 DEAE-Sepharose FF 를이용하여음이온교환 chromatography 를행하여비흡착 1 개획분 RB-1a 과 0.1, 0.2, 0.3 M NaCl 용액으로용출되는 3 개의흡착획분 RB-1b, RB-1c, RB-1d 로분획할수있었다. 이들중수율은 RB-1b 가가장높았으며면역활성은흡착 3 개획분에서비흡착획분 (168%) 보다우수한약 300% 의활성을나타냈으며흡착획분간활성의 Fig. 1. Column chromatographies for the purification of immuno-stimulating polysaccharide, RB-1b-I from Korean black raspberry wine. (A) The crude polysaccharide (RB-0) was applied to a column ( cm) of Sephadex G-75 and eluted with 50 mm acetate buffer (ph 5.2), (B) RB-1 fraction was rechromatographed on the column ( cm) of DEAE-Sepharose FF (Cl form) and eluted with linear concentration gradient M NaCl, (C) RB-1b fraction was finally loaded to a Biogel P-100 column ( cm) and eluted with 50 mm acetate buffer (ph 5.2)., Neutral sugar (490 nm);, Uronic acid (520 nm);, NaCl. 유의차는없었다. 따라서높은수율과활성을보였던 RB-1b 는 Biogel P-100 를이용하여다시겔여과를행하였다. RB-1b 는각각 RB-1b-I 및 RB-1b-II 로정제할수있었다 (Fig. 1). 복분자주에서정제한다당, RB-1b-I 의순도및분자량을확인하기위하여 HPLC 를행한결과, RB-1b-I 은대체로좌우대칭을유지한단일 peak 를나타내어비교적순수하게정제되었음을확인할수있었으며, 표준물질 (pullulan series) 을이용한분자량측정결과분자량이 180 kda 의다당체임을알수있었다 (Fig. 2). 복분자주유래정제다당의화학적특성복분자주에서정제된다당 RB-1b-I 의일반화학특성을살펴본결과는 Table 1 과같다. RB-1b-I 은 100% 중성당만으로구성되어있었으며일반적으로식물추출물에서검출되는산성당및단백질등은함유하고있지않았다. 한편 RB-1b-I 을가수분해하여 alditol acetate 유도체로전환하고구성당을분석한결과, RB-1b-I 은 mannose 가 76.8% 로주를이루고있었으며, 그외에 galactose (15.8%), arabinose(3.8%), glucose(2.6%) 및 rhamnose(1.2%) 의순으로함유되어있었다. 이러한화학조성은단순식물추출물에서는잘관찰되지않는특이한당조성으로, 산성당이전혀검출되지않은점과 mannose 의함량이특히높은점등의사실로미

4 346 한국식품과학회지제 44 권제 3 호 (2012) Table 1. Chemical composition of the purified polysaccharide, RB-1b-I from Korean black raspberry wine Chemical property (%) Component sugar 1) (mole%) Molecular weight 180 kda Rhamnose 1.2 Arabinose 3.8 Neutral sugar Mannose 76.8 Uronic acid 0.0 Galactose 15.8 Protein 0.0 Glucose 2.6 1) Monosaccharides were analyzed using alditol acetates. Mole% was calculated from the detected total carbohydrate. Fig. 2. HPLC profile and molecular weight of the purified polysaccharide, RB-1b-I from Korean black raspberry wine. RB-1b-I was injected into combined columns ( cm, each) of Asahi-pak GS-520+GS-320+GS-220 and then eluted with 0.2 M NaCl at a flow rate of 0.5 ml/min. 루어볼때, 재료인복분자의다당성분이발효및숙성과정에서변형되었거나또는발효미생물에의한새로운다당의혼입가능성이제기되었다. 복분자주의주다당 RB-1b-I 에서 mannose 가높은비율로존재한다는사실은 RB-1b-I 이 mannan 으로존재할가능성을시사하지만식물체특히과실에서 mannan 이관찰된경우는드물며, 특히세포벽성분으로 mannan 의존재가보고된예는거의찾아볼수없다. 따라서 RB-1b-I 에존재하는고 mannose 함량은발효중사용된미생물기원의 mannan 에서유래한것으로추정되었다. 복분자주발효는크게알코올발효단계와숙성단계로나뉘며알코올발효단계에는 Saccharomyces cerevisiae 와같은효모가관여하는데, 동효모의세포벽은 β-glucan 및 chitin 이주성분으로되어있으며세포벽최외각에는 mannoprotein 이결합되어있는것으로보고 (25) 되고있다. 따라서발효및숙성과정중알코올발효를담당하였던효모가자가분해되어이중용해도가낮은 β-glucan 과 chitin 은숙성과정중침전하게되고, 복분자주중에는효모세포벽기원의 mannan 이선택적으로용해됨을추론할수있었다. 한편식물체의대표적수용성다당인펙틴물질 (pectic substance) 은고등식물의 1 차세포벽과중엽 (middle lamella) 에주로존재하는다당류로써과거 D-galacturonic acid 가 α-1.4 결합으로연결된고 분자물질 (α-d-1,4-polygalacturonic acid) 로만구성되어있다고알려져왔으나, 실제로자연계에존재하는펙틴은이보다훨씬복잡한구조를가지고있다고보고되어있다 (26,27). 펙틴은전체분자의많은부분은 homogalacturonan 으로구성되어있지만 (28), 여기에다양한 oligo- 및 polysaccharide 로분지된 rhamnogalacturonan-i(rg-1) 및 rhamnogalacturonan-ii(rg-ii) 가공유적으로결합되어있는것으로알려져있다 (26,27). 이들중 RG-I 은 rhamnogalacturonan 주쇄 (main chain) 에 arabinan, galactan 및 arabinogalactan 과같은다양한중성곁사슬 (side chain) 을갖는다당 (29) 으로보고되어있다. 따라서 RB-1b-I 에서 mannose 외에 galactose 와 arabinose 가검출된사실은복분자주의원재료인복분자중에존재하는 pectin 이발효과정중분해되어그 side chain 이복분자주중용해된형태로존재함을강력히시사하였다. 따라서 RB-1b-I 는발효과정중발효제인효모의세포벽기원의 mannan 계다당이주를이루며재료인복분자에서유래한 arabinogalactan 이일부함유되어있는것으로추정된다. 복분자주유래다당의비장세포 mitogen 활성비장 (spleen) 은혈액으로부터항원을수집하며, B 및 T 림프구의성숙과항원에의해자극을받은후에림프구의분화가이루어지는주요림프기관으로비장내림프구의증식은면역시스템에서매우중요한의미를갖는다 (30). 복분자주유래다당의비장세포내임파구에대한 mitogen 활성을측정한결과, Table 2 에나타난바와같이복분자주유래조다당인 RB-0 의경우, 100 µg/ml 의농도에서임파구증식활성은 immune modulator 인 LPS 에비해낮았지만, 무첨가대조군에비해 260% 활성을보였다. 고분자정제다당 RB-1b-I 는조다당 RB-0 보다우수한 307% 의높은활성을보였다. 따라서복분자주유래다당은인 Table 2. Immuno-stimulating activities of the purified polysaccharide, RB-1b-I from Korean black raspberry wine Immuno-stimulating activity Spenocyte mitogenic activity (CCK-8 assay, %) Macrophage activity (Lysosomal phosphatase, %) NK cell-mediated tumor cytotoxicity (LDH assay, % at 200 µg/mouse) 1) Concentration (µg/ml) or E/T ratio 2) Polysaccharide from Korean Control black raspberry wine Saline LPS 4) RB-0 RB-1b-I ±0.1 3) 354±13.4* 190±9.8* 246±16.1* ±11.0* 307±14.4* ± ±6.3* 133±5.3* 125±4.5* ±3.8* 130±0.3* 100:1 16.5± ±8.1* 50:1 14.2± ±4.4* 25:1 9.8± ± :1 7.25± ±2.8 1) Three mice per group were administered i.v. with 200 µg of sample. NK cell activity was determined as described in Materials and Methods. 2) E/T ratio, effector-to-target cell ratio. 3) The data were expressed as means±sd of triplicate cultures. 4) LPS, lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8 was used as a positive control. *p<0.01; Significant difference between control (saline only) and sample.

5 체내임파구증식에도유용하게작용할가능성이있음을확인할수있었다. 복분자다당의면역조절활성 347 복분자주유래다당의 macrophage 활성화능 Macrophage 는체내로이물질 ( 감염성미생물등 ) 이침입하였을때이들을초기에비특이적으로제거시키는탐식세포로써, 세포매개성면역에중요한역할을담당하는면역세포로알려져있으며염증반응 (inflammatory) 이나종양치사작용 (tumoricidal) 등다양한기능을수행하고있다고보고되고있다 (31). 또한 macrophage 는항원을탐식, 분해 (processing) 하여그일부를자신의세포표면에부착, 제시 (presentation) 함으로써 T 림프구에의한면역반응을유도하여후천성면역계가작동할수있도록해주는 effector cell 로써작용한다 (32). 복분자주유래다당 RB-1b-I 의 macrophage 의활성을측정한결과, Table 2 에나타난바와같이양성대조군 LPS 와비교하였을때전체적으로다소낮은활성을보였지만무첨가대조군에비해약 130% 의활성을나타냈다. 복분자주에서분리한조다당인 RB-0 의경우는 LPS 보다도높은활성을보이는것으로나타났으며정제획분인 RB-1b-I 에비해서도다소높은활성을보였는데, 이는정제과정중에제거된 RB-2 가높은활성을갖는데기인할것으로판단되었다. 이상의결과로부터복분자주유래다당들은면역기능성식품소재또는 biological response modifier(brm) 로의이용가능성이있음을추측할수있었다. 복분자주유래다당의 NK cell activity 인체내에서활성화된 NK-cell 은광범위하게바이러스감염세포및종양세포에대하여비특이적으로세포독성을나타내는작동세포로서 (33,34), 특히암세포에직접작용할수있다는점에서최근많은연구가진행되고있는면역세포이다. 복분자주유래의고분자다당을각각 mouse 당 200 µg 씩정맥주사한후 YAC-1 세포에대한 NK-cell 의살해능을측정한결과, Table 2 에나타난바와같이, 복분자주유래정제다당인 RB-1b-I 은 E/T 비율 100:1 에서최대의활성이관찰되었다. 따라서복분자주의고분자정제다당은 NK-cell 의활성인자로작용할가능성이확인되었다. 이상의결과는복분자주에서정제한주다당 RB-1b-I 이임파구, macrophage 및 NK cell 과같은면역관련세포에유효하게작용함을지적하였으며, 현재 RB-1b-I 의상세한생물학적작용기구가실험중에있다. 보체계활성화능복분자주유래다당에대한보체계활성화능을측정한결과, 조다당인 RB-0 는 1,000 µg/ml 농도에서 ITCH 50 값이약 60% 에이르는매우우수한보체계활성화능을보였다 (Fig. 3). 이는보체계의강력한활성인자로알려져있으며, 본실험에서양성대조군으로사용한구름버섯 (Coriolus versicolor, 운지 ) 기원의 PSK(35) 와유사한활성이었다. 또한이들의활성은 500 µg/ml 농도에서 1,000 µg/ml 보다높은약 80% 의활성을나타냈다. 그러나 RB- 0 에서정제된고분자다당인 RB-1b-I 은농도의존적인활성의경향을보였으며 1,000 µg/ml 농도에서 PSK 보다우수한약 80% 의활성을보였다. 정제저분자다당인 RB-2 는각농도에서모두 20% 이내의낮은활성을보여항보체활성이거의없는것으로평가되었다. 따라서복분자주유래다당의항보체활성은주로고분자부분이담당함을확인할수있었으며, RB-1b-I 은보체계의강력한활성인자임을재차확인할수있었다. Fig. 3. Complement activation by the purified polysaccharide, RB-1b-I from Korean black raspberry wine. 1) The anticomplementary activity was expressed as the inhibition of 50% total complement hemolysis by Mayer s method. 2) PSK, a known immuno-active polysaccharide from Coriolus versicolor was used as a positive control (1,000 µg/ml). 3) The data were expressed as mean±sd of three separate experiments. *p<0.01; Significant difference between control (H 2 O only) and sample. 보체계활성화경로검토보체계는 C1-C9 의활성단백질과조절인자를포함하여약 20 여종의혈중순환단백질들로구성되어있으며, 외부감염병원체등침입인자를항체의존재또는비존재하에비특이적으로제거하는생체의주요방어기구이다 (36). 보체계가활성화되면연속적인 cascade 반응에의하여보체단백질이활성분자로분해되고이들이침입인자의표면에부착되어최종적으로 MAC(membrane attack complex) 를형성하여감염병원체등을제거하는것으로알려져있다 (37). 또한보체활성화과정중생성되는여러보체분해산물은각종생리반응을매개한다고알려져있으며, 특히 macrophage 와 lymphocyte 의활성화, 면역증강등과밀접한상관관계가있다고보고되고있다 (37). 보체계활성화경로는보체의중요성분인 C3 의활성화방법에따라보체계의활성화경로는크게 classical pathway 와 alternative pathway 로구성되어있는데, classical pathway 의활성에는 Ca 2+ 및 Mg 2+ 모두, alternative pathway 에는 Mg 2+ 만이선택적으로관여하고있는것으로알려져있다 (36). 따라서활성화에관여하는금속이온의존재여부에따라반응계를조절하면보체계활성화경로를예측할수있게된다. 보체계에대해높은활성을나타내었던 RB-1b-I 을대상으로 GVB 2+ 기본반응계와 2 가금속이온을모두제거한 EDTA-GVB 2 반응계및 Ca 2+ 이온만을선택적으로제거한 Mg 2+ -EGTA-GVB 2 반응계로나누어농도별로항보체활성 (ITCH 50 ) 을비교측정하였다. Fig. 4 에서보는바와같이복분자주유래활성다당 RB-1b- I 의경우, Ca 2+ 및 Mg 2+ 이모두존재하는기본반응계에서의활성과비교할때 2 가금속이모두제거된반응계에서는대조군에비해거의완전한활성의소실이관찰되었으나, Mg 2+ 이온만존재하는반응계에서는고농도에서활성이상당량유지 ( 약 20% 수준 ) 되는결과를보였다. 이러한사실은복분자주유래활성다당 RB-1b-I 이보체계의 classical pathway 와 alternative pathway 양경로를모두활성화시킬수있음을의미하는것으로, 특히 alternative pathway 는항체에의한면역반응이일어나기전에활성화되기때문에항원에의해감작되지않은숙주에있어중요한 1 차적방어기작이므로그의미가크다고할수있다 (38).

6 348 한국식품과학회지제 44 권제 3 호 (2012) Fig. 5. Crossed immunoelectrophoretic patterns of C3 converted by the purified polysaccharide, RB-1b-I from Korean black raspberry wine. Normal human serum was incubated with the samples in GVB 2+ (A), Mg 2+ -EGTA-GVB 2 (B) and EDTA-GVB 2 (C) at 37 o C for 30 min. The sera were then subjected to immunoelectrophoresis using anti-human C3 antibody to locate C3 cleavage products. The anode is to the left. Fig. 4. Effect of calcium and magnesium ions on complement activation by the purified polysaccharide, RB-1b-I from Korean black raspberry wine. 1) The anti-complementary activity was expressed as the inhibition of 50% total complement hemolysis by Mayer s method. 2) PSK, a known immuno-active polysaccharide from Coriolus versicolor was used as a positive control (1,000 µg/ ml). 3) The data were expressed as mean±sd of three separate experiments., in GVB 2+ ;, in Mg 2+ -EGTA-GVB 2 ;, in EDTA-GVB 2. *p<0.01; Significant difference between control (H 2 O only) and sample. 2 차원면역전기영동에의한 C3 산물의동정 Mayer 법 (23) 에의한항보체활성측정법은 1 차반응단계에서시료성분의보체계활성화에의한보체의소모정도를측정하는방법으로만일시료중보체의활성화가아닌특정한저해성분이존재할경우에도높은항보체활성을보일수있는문제점을갖고있다 (39). 따라서 RB-1b-I 의항보체활성이보체계활성화에기인한것인지, 혹은시료의보체저해활성에의한것인지를확인하기위하여보체계활성화에서가장중요한성분으로알려진 C3 의활성화여부를조사하였다. 일반적으로보체계가활성화되면 C3 는 C3a 와 C3b 로분해되므로 (38) 시료와정상인혈청을반응시킨후 1 차전기영동을실시하고 anti-human C3 를이용하여 2 차면역전기영동을행함으로써 C3 분해산물을동정하고자하였다. Fig. 5(A) 에나타난바와같이복분자주유래 RB-1b-I 와혈청을기본반응계에서반응시킨경우는 C3 의활성화가일어나두개의침강선이형성된것을관찰할수있었다. 따라서 RB-1b-I 의항보체활성은보체계의저해가아닌직접활성화에기인함을확인할수있었다. RB-1b-I 을 Mg 2+ -EGTA-GVB 2 및 EDTA-GVB 2 반응계에서반응시킨후그분해산물을관찰한결과는 Fig. 5(B) 및 Fig. 5(C) 항에나타난바와같다. 금속이온을모두제거한 EDTA-GVB 2 반응계에서는 C3 의활성화가진행되지않아 1 개의침강선이관찰된반면, Ca 2+ 이온을선택적으로제거한 Mg 2+ -EGTA-GVB 2 반응계에서는 2 개의침강선이관찰되었다. 교차면역전기영동의결과에서 well(fig. 5 의사진에서우측방향 ) 로부터첫번째침강선은 C3 를, 두번째침강선은활성화된 C3a 와 C3b 의혼합물에기인한침강선 (40) 임을고려해볼때, 기본반응계인 GVB 2+ 에서는첫번째침강선이상대적으로불분명하고두번째침강선이뚜렷한반면 (Fig. 5(A)), Ca 2+ 을선택적으로제거한반응계에서는첫번째침강선이분명하게남아있는것으로나타남으로써 (Fig. 6(B)) 기본반응계에서보체의활성화가훨씬강력하게진행되었음을확인할수있었다. 참고로전혀활성화가진행되지않은경우 (EDTA- GVB 2 ) 에서는 Fig. 5(C) 처럼 well 로부터첫번째침강선만이관 찰된다. 따라서 RB-1b-I 은보체계의 classical pathway 와 alternative pathway 의두경로를모두활성화시킴을재차확인할수있었다. 이상의결과로부터복분자중존재하는다당은 macrophage, 임파구및 NK cell 등면역관련세포의활성인자로작용할수있으며, 특히강력한보체활성능을가지고있음이확인되었다. 이들은주로발효제인효모의세포벽성분이발효와숙성과정중분해되어선택적으로용해된것으로추정되며, 이들다당이복분자주의생리활성에중요한역할을담당하고있음을확인할수있었다. 이러한사실은전통발효음료의우수성을홍보하는데중요하게활용될수있으리라판단된다. 요 한국전통발효음료중에존재하는특이다당류의화학적특성및생물활성을규명할목적으로, 농가에서직접발효한복분자주로부터다당류를분리하고이들의각종면역증강활성에대해검토하였다. 복분자주에 80% ethanol 침전을행하여얻어진조다당획분 RB-0 를이용, 연속적인 3 회의 column chromatography 를행하여, 복분자주의주요다당인 RB-1b-I 으로정제할수있었다. RB-1b-I 획분은 HPLC 상에서대칭을유지하는단일 peak 로검출되었으며, 분자량은약 180 kda 으로평가되었다. 정제다당인 RB- 1b-I 의구성당조성을확인한결과, mannose 가 76.8% 로주를이루고있었으며, 그외에 galactose(15.8%), arabinose(3.8%), glucose(2.6%) 및 rhamnose(1.2%) 의순으로함유되어있었다. 이러한결과는복분자중에존재하는주다당이발효효모의세포벽에서기원한 mannan 임을추정하게하였다. 한편복분자주에서정제한다당 RB-1b-I 은 in vitro 상에서 macrophage 의활성화를높은비율로유도하였으며, 비장세포에대해높은증식능을보였다. 또한 RB-1b-I 을정맥투여한경우, NK cell 을활성화하여 YAC-1 종양세포에대한세포독성을증가시킴이관찰되었다. 한편고분자정제다당인 RV-1b-I 은비특이적면역계에있어중요역할을담당하고있는보체계에대하여농도의존적인활성화경향을보였다. 이들은 Ca ++ 이온이제거된상태에서의항보체활성과 antihuman C3 를이용한 2 차원면역전기영동에의하여 C3 산물을동정한결과로부터보체계의 classical pathway 와 alternative pathway 양경로를모두경유하여활성을나타냄을확인할수있었다. 이상의결과로부터복분자주에는인체건강에유익한면역증진활성을제공하는다당류가함유되어있음을알수있었다. 약 감사의글 본연구는 학년도경기대학교학술연구비 ( 일반연구과제 ) 지원에의하여수행되었음.

7 복분자다당의면역조절활성 349 문 1. Wollin SD, Jones PJH. Alcohol, red wine, and cardiovascular disease. J. Nutr. 131: (2001) 2. Estruch R. Wine and cardiovascular disease. Food Res. Int. 33: (2000) 3. Kerry NL, Abbey M. Red wine and fractionated phenolic compounds prepared from red wine inhibit low density lipoprotein oxidation in vitro. Atherosclerosis 135: (1997) 4. Tedesco I, Russo M, Russo P, Iacomino G, Russo GL, Carraturo A, Faruolo C, Moio L, Palumbo R. Antioxidant effect of red wine polyphenols on red blood cells. J. Nutr. Biochem. 11: (2000) 5. Whitehead TP, Robinson D, Allaway S, Syms J, Hale A. Effect of red wine ingestion on the antioxidant capacity of serum. Clin. Chem. 41: (1995) 6. Fuhrman B, Lavy A, Aviram M. Consumption of red wine with meals reduces the susceptibility of human plasma and low-density lipoprotein to lipid peroxidation. Am. J. Clin. Nutr. 61: (1995) 7. Hager A, Howard LR, Prior RL, Brownmiller C. 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