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한선 난
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1 1) 대한한방부인과학회지 J Korean Obstet Gynecol. VOL.27 NO.2 : (2014) 靈芝추출물이 Rat fetus 두개골로부터분리한조골세포에미치는영향 대전대학교한의과대학부인과교실정은혜, 유동열 ABSTRACT The Effects of Ganoderma lucidum Extract on Osteoblast in Rat Fetus Calvarial Cells Eun-Hye Jung, Dong-Youl Yoo Dept. of Oriental Cynecology, College of Oriental Medicine, Dae-Jeon University, Graduate School, Dae-Jeon University Objectives: In this study, the author aimed to evaluate the effect of EtOH extract of Ganoderma lucidum (GLE) on osteoblast proliferation in rat fetus calvarial cells. Methods: The osteoblast separated from rat fetus calvariae was cultivated for 6~21 days and evaluated the cell function. After the addition of GLE on the culture medium, we determined the effect of GLE on the cell viability, cell proliferation, bone matrix protein synthesis, alkaline phosphatase (ALP) activity, collagen synthesis and calcified nodule formation of the cultivated osteoblast. Results: GLE did not change the survival rate of rat calvarial osteoblast. GLE increased the proliferation of rat calvarial osteoblast. GLE increased ALP activity of rat calvarial osteoblast. GLE increased bone matrix protein synthesis of rat calvarial osteoblast. GLE increased collagen synthesis of rat calvarial osteoblast. GLE slightly affected calcified nodule formation of rat calvarial osteoblast. Conclusions: This study suggests that Ganoderma lucidum might improve the osteoporosis resulted from augmentation of osteoblast proliferation. Key Words: Ganoderma lucidum, Osteoblast, Osteoporosis, Osteoblastogenesis, Rat Fetus Calvarial Cell Corresponding author(dong-youl Yoo) : Dept. of Gynecology, Dun-san Korean Medicine Hospital of Dae-Jeon Univ. 1136, Dunsan-dong, Seo-gu, Dae-jeon City, Republic of Korea Tel : ydy1010@dju.kr 23

2 靈芝추출물이 Rat fetus 두개골로부터분리한조골세포에미치는영향 Ⅰ. 서론 골다공증은대표적인노인성질환의하나로골강도가감소되어골절위험이증가되는상태를정의하는것으로 1), 인구의고령화로인해전세계보건학적으로중요한질환이되고있어그예방과치료에사회적관심이증대되고있다 2). 2010년국민건강영양조사에따르면 50세이상의여성가운데약 34.9%, 70대이상의남녀전체의 47.8% 가골다공증환자인것으로조사되었다 3). 골다공증은여러합병증을야기하는데, 그중가장심각한합병증은고관절골절이며 4), 강등 5) 은골다공증으로고관절골절이생길경우사망률은약 2.85배증가한다고보고하였다. 일반적으로뼈에는칼슘의흡수를담당하는파골세포와침착과정을담당하는조골세포가균형을이루고있으나, 골다공증에서는골침착의감소와골흡수의증가로인해골대사의불균형이나타난다 1). 특히골다공증유병률은평균 50세인폐경기이후급격히증가하는데이는폐경후에스트로겐결핍상태로인하여조골세포의수명을단축시키고파골세포의수명과활성도가증가되기때문이다 1,6). 그러므로폐경기와노년기의골다공증에서조골세포의기능을활성화시키는것은골다공증을예방하고치료하는데중요하다고할수있다 7). 골다공증치료약제는골흡수억제제와골형성촉진제로나뉘는데 8), 각각비스포스네이트와 9,10) 부갑상선호르몬제가주로사용되고있다 11). 한의학에서는 素門宣明五氣論 12) 에 骨屬腎 이라고하였고, 素門五藏生成論 12) 에서는 腎之合, 骨也 라고하여腎과骨과의밀접한관계를논하였다. 또한 素門上古天眞論 12) 에서남성은 六八天癸竭, 腎氣衰, 形體皆極, 八八, 則齒髮去 라고하였으며, 여성은 七七, 任脈虛, 太衝脈衰小, 天癸竭, 地道不通, 故形壞而無子也 라고하였는데이는여성과남성의노화에대하여말한것으로腎氣와밀접한관계를가진天癸가竭해짐에따라외형과골격에있어서의쇠약해짐을표현한것이다 6). 따라서腎虛하면骨과骨髓도약해지는것으로, 이는현대의학적으로에스트로겐의결핍으로인한폐경기골다공증과조골세포에의한골생성능력이저하되어발생하는노인성골다공증과유사한것으로생각된다 8,14). 靈芝 (Ganoderma lucidum) 는性味가平하고甘微苦하며無毒하여養心安神, 補氣益血, 止咳平喘하는효능이있으며, ergosterol, ricinoleeic acid, fumaric acid 등의유기산, glucosamine, 다당류, 수지, mannitol 등을함유하고있다 15). 神農本草經 16) 에서는靈芝를赤芝, 黑芝, 紫芝등이라칭하여益腎氣, 益精氣하며堅筋骨한다고하였다. 최근연구결과에서도靈芝는간보호작용노화억제및기억력개선효과등이보고되었으며, 항암작용도있는것으로밝혀졌지만 17-19), 골에대한효능이나골다공증치료제로서의가능성에대한연구보고는아직접하지못하였다. 이에저자는한의학적으로益腎氣, 益精氣하여堅筋骨하며 16) 滋養强壯의효과가있으며 20) 실험연구에서도노화억제에효과가있는것으로나타난 17-19) 靈芝가腎虛로인한폐경기및노년기골다공증에 24

3 J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.2 May 2014 효과가있을것이라판단하여, 靈芝에탄올추출물이조골세포의생존율과조골세포의분열능에미치는영향을관찰하고, 조골세포에의한 alkaline phosphatase 활성, bone matrix protein( 골기질단백질 ) 합성, collagen 생합성및 calcified nodule 생성에미치는영향을평가한결과유의한성적을얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 실험 1. 재료 1) 동물실험동물은임신한암컷 Sprague-Dawley (SD) 系 rat를대한바이오링크에서구입하여실험실에적응시킨후사용하였다. 실험기간동안고형사료와물을충분히공급하여자유롭게섭취하도록하였다. 2) 약재靈芝 (Ganoderma lucidum) 는대전대학교둔산한방병원에서구입한것을정선하여사용하였다. 2. 방법 1) 검액제조靈芝 100 g에 30% EtOH 500 ml를가하고 6시간이상가열하여환류추출하였다. 여과지를이용하여여과한다음, 여액을 evaporator(eyera, Japan) 을이용하여감압농축한후동결건조하여실험대상에적용할때까지냉동보관하였다. 냉동보관된추출분말을배지에녹인후 pore size 0.45 μm의여과지에통과시켜靈芝에탄올추출물 (Ganoderma lucidum extract, GLE) 을만들어실험에사용하였다. 2) 약물처리실험은 3개군, 즉 (1) 정상대조군 (Normal control ; C), (2) 1 μg/ml의靈芝추출물을투여한군 (GLL), (3) 10 μg/ml의靈芝추출물을투여한군 (GLH) 으로나누어시행하였다. 3) Fetal calvarial cell culture 임신 21일된쥐의자궁을절개하여 fetus 를꺼낸후, 후두부를절개하고 calvarie 를적출하였다. Calvarie에붙어있는결체조직을제거하고, Hank's balanced salt solution(hbss) 로세척했다. Calvarie를 1.5 ml의 collagenase, trypsin, 0.5 mm ethylene diamine tetraacetic acid(edta) 용액에넣어 37 에서반응시켰다. 상등액을취하여 500 rpm에서원심분리하여침전된 calvarial cell을얻었다. Phosphate buffered saline(pbs) 에재현탁하여 1,500 rpm에서원심분리하여세척한후, 이를 Dulbecco s modified eagle s medium(dmem) 배지에넣어현탁한후 37, 5% CO 2 에서배양하였다. 상등액을제거하고남은 calvarie에다시 1.5 ml의효소를넣고, 상기반응을수회반복하였다. 세포의배지는 3일에한번씩교환하였다. 배양한세포는 2주후 trypsin 처리하여세포수를측정한후실험에사용하였다. 4) 조골세포생존율측정 GLE를첨가하여 3일간배양한후조골세포에대한 MTT assay 를시행하였다. Cell suspension을 hemocytometer를사용하여 counting한다음, 96 well plate의각 well 에 cell 부유액 180 μl를넣고, GLE를 PBS 에녹인후농도별로각 well에첨가한후 incubation하였다. 3일후 GLE를제거하고, 각 well에 MTT solution을 100 μl씩첨가하고 4시간동안 incubation시킨후 25

4 靈芝추출물이 Rat fetus 두개골로부터분리한조골세포에미치는영향 MTT 희석액을조심스럽게제거하였다. 각 well에 100 μl의 DMSO 를첨가하여 분간 plate shaker로흔들어준후, ELISA reader를사용하여 wave length 540 nm 에서흡광도를측정하였다. 5) 조골세포의분열능측정 Subculture 를통하여조골세포가 1~ cells/well 이되도록 24well plate에 seeding 하였으며, 6일간배양한세포의수를세기위하여세포의배지를제거하고, HBSS 로세포를세척하였다. 이후 collagenase, trypsin, 0.5 mm EDTA 를가하여세포를 culture plate로부터분리하였다. 세포를 Isoton-2 solution을이용하여 20배희석한후세포계수기 (Sysmax F-820) 로세포의수를측정하였다. 6) Alkaline phosphatase 활성측정 ALP 활성은 ALP-K Kit를이용하여측정하였다. 6일간세포를배양한 plate를냉각한 PBS로세척한후세포를 scraper 로긁어내어 leupeptin이함유된냉각된 PBS에현탁하였다. 이현탁액을냉각상태에서 ultrasonicator로 sonication한후 3000 rpm에서 10분간원심분리하였다. 원심분리후상등액을취하여 0.56 M 2-amino -2-methy l-propanol, 1 mm MgCl 2, 10 mm p-nitrophenylphosphate를함유한반응액과 37 에서 10분간반응시켰다. 0.2N NaOH 1 ml를가하여반응을중단시킨후 405 nm에서흡광도를측정하였다. 7) Bone matrix protein 합성측정 10일간세포를배양한 plate를 PBS로세척한후 cell scraper를이용해세포를긁어내어 5 mm dithiothreitol(dtt) 이함유된 PBS에현탁하였다. 이현탁액을냉각상태에서 ultrasonicator로 sonication 하였다. 현탁액을취하여뷰렛트시약과 37 에서 10분간반응시킨후 550 nm에서흡광도를측정하였다. 8) Collagen 생합성측정 10일간세포를배양한 plate를 PBS로세척한후 cell scraper를이용해세포를긁어내었다. 이를 5 mm dithiothreitol이함유된 50 mm tris buffer 에현탁시킨후 ultrasonicator로 sonication 시켰다. 이후, 100,000 xg에서 30분간원심분리하여상등액을제거한후 pellet에 6 N HCl을가하여 24시간동안 100 에서가수분해하였다. 이를조심스럽게 6 N NaOH로중화시킨후, 물을이용하여적정한농도로희석하였다. Hydroxy-proline은 amino acid analyzer를이용하여정량하였다. 9) Calcified nodule 생성측정세포를 21일간배양한후냉각한 PBS 로세척하였다. Neutral buffered formalin (100 ml formalin, 16 g Na 2HPO 4, 4 g NaH 2 PO 4, H 2 O in 1 l) 을가하고, 15분간고정시킨후, PBS로세척하였다. Von Kossa's reagent(2.5% silver nitrate in H 2 O) 를가하여상온에서 30분간반응시켰다. 다시세척한후 toluidine blue solution (0.1% w/v in 30% v/v ethanol) 을가하여수초간반응시키고 PBS로세척한다음, 공기중에서건조한후형성된 calcified nodule의면적을측정하였다. 3. 통계분석각군과의유의성검증을위하여 Student's T-test를실시하고, P값이 0.01 및 0.05보다작은경우유의성이있는것으로인정하였다. 26

5 J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.2 May 2014 Ⅲ. 결과 1. 조골세포생존율에미치는영향 GLE의세포독성을평가하기위하여미분화된세포에 GLE를첨가한후, 3일간배양한후 MTT assay를시행하였다. 실험결과, 정상대조군의경우조골세포생존율은 46% 이며, GLL과 GLH를처리한경우에는각각 46%, 45% 로 GLE 추출물은조골세포의생존율에영향을주지않았다 (Fig. 1). Fig. 1. Effect of GLE on Survival Rate of Calvarial Cell. Each bar represents Mean±SD of 6 cultured wells. Fig. 2. Effect of GLE on Cell Proliferation of Rat Calvarial Cell. Each bar represents Mean±SD of 6 cultured wells. ** : p<0.01 vs C by Student's t-test 3. Alkaline phosphatase 활성에미치는영향 Rat fetus의두개골로부터분리한조골세포를 6일간배양한결과 alkaline phosphatase(alp) 활성은정상대조군에서 21.9 unit/ml였으며, GLL과 GLH을처리한경우에는각각 28.6 unit/ml, 31.0 unit/ml 로서정상대조군에비해 ALP 활성을유의성있게 (p<0.01) 증가시켰다 (Fig. 3). 2. 조골세포분열능에미치는영향 Rat fetus의두개골로부터분리한조골세포를 6일간배양한결과, 정상대조군의세포수는 cells/well이었으며, GLL과 GLH를처리한경우에세포수는각각 cells/well과 cells/well로서정상대조군에비해유의성있게 (p<0.01) 증가하였다 (Fig. 2). Fig. 3. Effect of GLE on Alkline Phosphatase (ALP) Activity of Rat Calvarial Cell. Each bar represents Mean±SD of 6 cultured wells. ** : p<0.01 vs C by Student's t-test 27

靈芝추출물이 Rat fetus 두개골로부터분리한조골세포에미치는영향 4. Bone matrix protein 합성에미치는영향 Rat fetus의두개골로부터분리한조골세포를 10일간배양한결과, 정상대조군의세포가생성하는골기질단백질량은 3.21 μg/ml 이었고, GLL을처리한경우에는 3.59 μg/ml로증가하였지만통계적으로유의성은없었다. GLH를처리한경우에는 3.

6 靈芝추출물이 Rat fetus 두개골로부터분리한조골세포에미치는영향 4. Bone matrix protein 합성에미치는영향 Rat fetus의두개골로부터분리한조골세포를 10일간배양한결과, 정상대조군의세포가생성하는골기질단백질량은 3.21 μg/ml 이었고, GLL을처리한경우에는 3.59 μg/ml로증가하였지만통계적으로유의성은없었다. GLH를처리한경우에는 3.81 μg/ml로나타나골기질단백질량을정상대조군에비해유의성있게 (p<0.01) 증가시켰다 (Fig. 4). Fig. 4. Effect of GLE on Protein Synthesis of Rat Calvarial Cell. Each bar represents Mean±SD of 6 cultured wells. ** : p<0.01 vs C by Student's t-test 5. Collagen 생합성에미치는영향 Rat fetus의두개골로부터분리한조골세포를 10 일간배양한결과, 정상대조군의세포가생성하는 collagen량은 3.37 μg/well이었고, GLL과 GLH를처리한경우에는각각 3.92 μg/well, 3.98 μg/well로 collagen량을정상대조군에비해유의성있게 (p<0.01) 증가시켰다 (Fig. 5). Fig. 5. Effect of GLE on Collagen Synthesis of Rat Calvarial Cell. Each bar represents Mean±SD of 6 cultured wells. ** : p<0.01 vs C by Student's t-test 6. Calcified nodule 생성에미치는영향 Rat fetus의두개골로부터분리한조골세포를 21일간배양한후, 조골세포의작용으로나타나는칼슘침착결절의면적을측정한결과, 정상대조군에서 3.70 mm 3 이었고, GLL으로처리한경우는 3.80 mm 3 이었으며 GLH로처리한경우 3.86 mm 3 로각각의농도에서증가하는경향을보였으나유의성은없었다 (Fig. 6). Fig. 6. Effect of GLE on Calcified Nodule Formation in Rat Calvarial Cell. 28

7 J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.2 May 2014 Ⅳ. 고찰 골다공증은골강도의감소로인하여골절위험이증가되는상태로 1), 인구의고령화로그유병률및골절등의합병증이증가하는질환이다 2). 골다공증은발병원인에따라크게원발성골다공증과속발성골다공증으로나눌수있다 21). 원발성골다공증은전체골다공증의 90% 정도를차지하는데, 폐경후골다공증과노인성골다공증으로나눌수있다 21). 폐경기골다공증은폐경기이후에에스트로겐이부족해지면서 50세에서 60 세사이의여성에게주로일어나며 14,22), 노인성골다공증은 70세이상의남녀에게서모두볼수있는데, 연령증가와함께조골세포에의한골생성능력이저하되어발생하는것으로 8) 척추골절, 고관절부위골절, colles골절등의순으로골절이발생하며, 고관절골절의경우사망률은약 2.85배증가하며 5), 골절후 1년내사망률은 16.8% 정도로상당부분이사망과직접적인관련이있다 14,23). 골다공증을치료하는약물은크게골흡수억제제와골형성촉진제로나눌수있다 8). 현재골흡수를억제시키는약물로는칼슘과비타민D, 그리고파골세포의기능을약화시키고세포사멸을유도하여골흡수를억제하는비스포스포네이트가기본으로처방되나 8,10), 최근보고에따르면비스포스포네이트를복용하게되면식도염, 위장장애같은소화장애가흔히발생하며 3년이상의복용시골재형성의과도한억제로인해대퇴골골절등의부작용이발생한다고하였다 24,25). 그밖에여성호르몬요법으로에스트로 겐, 프로게스테론병용요법등이시행되지만, 5년이상장기간사용할경우유방암발생위험을 24% 증가시킨다고보고되었다 11,26). 일반적으로골흡수억제제는골의재형성이항진되어있고현재진행중인폐경후골다공증의예방과치료에효과가있으나, 진행된골다공증에는효과적이지못하다 27). 반면, 골형성촉진제는골재형성이감소된노인성골다공증또는이미진행된골다공증환자들에게유용하게쓰일수있다고알려져있어골형성촉진약물이필요한경우가많다 27). 골형성촉진약물은 sodium fluoride, 부갑상선호르몬, anabolic steroid 등이며그중 FDA승인을받아사용할수있는약물은부갑상선호르몬제이나 14), 부갑상선호르몬제는가격이비싸고매일피하주사를해야한다는단점이있어골절입원환자에게만제한적으로사용하고있다 1,28,29). 따라서상용할수있는골형성촉진약물의개발필요성이절실히요구되고있으나실질적으로임상에서상용될만한골형성촉진약물은아직개발되어있지못한실정이다 29). 한의학에서骨은 素門宣明五氣論 12) 에따르면 骨屬腎 이라하였고, 素門五臟生成論 12) 에서 腎之合, 骨也 이라고하였다. 素門痿論 12) 에서는 腎主身之骨髓 라하였으며, 靈樞經脈 30) 에는 少陰者伏行而濡骨髓者也 라하여骨의생장과기능은腎氣의盛衰에따라결정된다고하였다 31,32). 또한 素門上古天眞論 12) 에서남성은 六八天癸竭腎氣衰, 形體皆極, 八八, 則齒髮去 라고하였으며, 여자는 七七, 任脈虛, 太衝脈衰小, 天癸竭, 地道不通, 故形壞而無子也. 라고 29

8 靈芝추출물이 Rat fetus 두개골로부터분리한조골세포에미치는영향 하였다. 이는여성과남성의노화에대하여말하는것으로腎氣가쇠약해지고, 腎의소산물로腎과밀접한작용을가지고있는天癸가 6) 나이가듦에따라竭하여생기는것으로, 形體皆極, 齒髮去와形壞는외형과골격에있어서의쇠약해짐을표현한것으로, 이는현대의학적으로폐경후에스트로겐의결핍으로인한폐경후골다공증과연령증가와함께조골세포에의한골생성능력이저하되어발생하는노인성골다공증의개념과유사한것으로사료된다 8,14). 이처럼腎虛하면骨과骨髓도부족해지는한의학적인이론을바탕으로많은임상연구가진행되었다 13). 골질환에대한연구는鹿茸 33), 牛膝 34) 35), 杜仲등의補腎强筋骨, 强壯하는약제를이용한연구가많았으며, 박 36) 등은補肝腎, 補腎陽, 强筋骨하는三氣飮加味方을이용하여골세포의분화및조골세포의활성에미치는영향을연구하였다. 靈芝 (Ganoderma lucidum) 는구멍쟁이버섯과에속하는진균인靈芝 Ganoderma lucidum(l EYSS. ex F R.) K ARST. 또는紫芝 G. japoncicum (F R.) L LOYD 의자실체를건조한것으로성미는平하고甘微苦하며無毒하고養心安神, 補氣益血, 止咳平喘하는효과가있는것으로알려져있으며 15), 神農本草經 에서는靈芝를益腎氣, 益精氣하며堅筋骨한다고하였다 16). 약리작용으로는진정, 진통작용, 항산화, 항노화작용, 항암작용, 면역조절작용등이있으며 37), 中藥大辭典 에는强壯, 鎭靜藥으로虛勞, 咳嗽, 호흡곤란, 불면, 신경쇠약, 소화불량등의증상을치료하는데사용한다고기재되어있다 20). 또한靈芝는노화로인한신체허약과氣血이부족해 서일어나는각종장부의기능실조에사용할수있는滋養强壯의약물로 37), 폐경과노화가진행됨에따라腎이허약해지고骨과骨髓가약해짐으로인해생기는폐경기및노인성골다공증에응용할수있을것으로보인다. 먼저, rat의두개골로부터분리배양한조골세포에靈芝에탄올추출물을투여한후세포에미치는영향을평가하였다. 연구지표로는조골세포의생존율과분열능에미치는영향, 골석회침착 (calcification) 에관여하는조골세포표면의 ALP(alkaline phosphatase) 활성에미치는영향, 조골세포의골기질단백질합성과교원질 (collagen) 생합성에미치는영향, 그리고칼슘침착결절형성에미치는영향을선정하였다. 조골세포의생존율에미치는 GLE의영향을측정한결과, 두개골세포에 GLE 를 1 μg/ml와 10 μg/ml 농도로처리한경우에각각생존율에변화를주지않아생존율을증가시키지는못하였지만, 직접적인세포독성또한없는것으로판단되었다 (Fig. 1). 배양된골세포에 GLE를처리한후 6 일간배양한결과, GLE는 1 μg/ml 와 10 μg/ml 농도에서각각정상대조군에비해유의성있는 (p<0.01) 증가를나타내조골세포의분열능을향상시키는것으로나타났다 (Fig. 2). 조골세포분열시조골세포에특이적인효소인 ALP의활성이현저히증가하는것으로보고되어있는데 38), 배양된골세포에 GLE를처리하고 6일간배양한후 ALP 활성을측정한결과, GLE를 1 μg/ml 와 10 μg/ml 농도로처리한경우각각정상대조군에비해 ALP 활성이유의성있게 (p<0.01) 증가하였다 (Fig. 3). 30

9 J Korean Obstet Gynecol Vol.27 No.2 May 2014 Vitamin D3 등의자극에의해활성화된조골세포에서발현되는 bone morphogenetic protein은 osteocalcin, ALP, bone sialoprotein 등의합성을증가시키며, collagen 합성을증가시킨다 39,40). 이는 vitamin D3 등의작용으로조골세포의활성화와골에서의 matrix mineralization의중요기전으로알려져있는데 rat fetus 의두개골로부터분리한골세포를 10일간배양하고, 10 μg/ml 의 GLE를처리한경우에는정상대조군세포군에비해단백질량을유의성있게 (p<0.01) 증가시켰다 (Fig. 4). 조골세포에의해생성되는골기질물질인교원질 (collagen) 생합성에미치는 GLE 의영향을측정한결과, 두개골조골세포에 GLE를 1 μg/ml와 10 μg/ml 농도로처리한경우각각정상대조군에비해교원질량을유의성있게 (p<0.01) 증가시켰다 (Fig. 5). 이는 GLE가골기질물질의특이단백질인 collagen 1) 의생합성을증가시킴을의미한다. 조골세포의작용으로나타나는칼슘침착결절생성에 GLE가미치는영향을측정한결과, 1 μg/ml와 10 μg/ml 농도로처리한경우각각의농도에서결절면적이증가하는경향을보였으나유의적인변화는없었다 (Fig. 6). 이상을종합하면, 靈芝에탄올추출물 (GLE) 은조골세포의생존율에영향을주지않아세포독성이없는것으로보이며, 조골세포의분열능을증가시켰고, 조골세포분열시에증가하는 ALP의활성을증가시켰으며, 골기질단백질량도고용량의투여에서유의하게증가시켰고, 골기질물질의특이단백질인 collagen량을증가시켰으나, calcified nodule 생성에는큰영향을주지못하였다. 따라서, 靈芝에탄올추출물 (GLE) 은조골세포에생존율에변화를주는부작용이없고상용할수있는골형성촉진약물로사료되는바, 골다공증의치료및예방에활용하기위해靈芝를단방이나복합방에가미하여활용할수있을것으로보인다. V. 결론 Rat fetus의두개골로부터조골세포를분리, 배양하여靈芝에탄올추출물 (GLE) 을첨가한다음, 조골세포의생존율, 조골세포분열능, ALP 활성, bone matrix protein 합성, collagen 생합성및 calcified nodule 생성을측정하여다음과같은결과를얻었다. 1. GLE는두개골조골세포의세포생존율에는변화를주지않았다. 2. GLE는두개골조골세포의분열능을유의성있게 (p<0.01) 증가시켰다. 3. GLE는두개골조골세포의 ALP 활성을유의성있게 (p<0.01) 증가시켰다. 4. GLE는두개골조골세포의단백질량을유의성있게 (p<0.01) 증가시켰다. 5. GLE는두개골조골세포의 collagen량을유의성있게 (p<0.01) 증가시켰다. 6. GLE는 calcified nodule 생성에는영향을주지않았다. 이상의연구결과, GLE는세포독성이없으며, 조골세포의분열능을증가시키고, 골기질물질의생합성을증가시켜골형성에도움이되는것으로나타났다. 31

10 靈芝추출물이 Rat fetus 두개골로부터분리한조골세포에미치는영향 투고일 : 2014년 4월 23일 심사일 : 2014년 4월 28일 게재확정일 : 2014년 5월 8일 참고문헌 1. 대한내과학회. Harrison's Principles of Internal Medicine. 17th edition. 서울 : 도서출판 MIP. 2010: , Cooper C, Campion G, Melton LJ 3rd. Hip fracture in the elderly: a worldwide projection. Osteoporos Int. 1992; 2(6): 보건복지부질병관리본부건강영양조사과. 2010국민건강통계. 서울 : 보건복지부건강정책과. 2011: Gabriel SG, et al. Vertebral fracture risk factors in postmenopausal women over 50 in Valencia. Bone. 2013;52(1) : Kang HY, et al. Incidence and mortality of hip fracture among the elderly population in South Korea: a population -based study using the national health insurance claims data. BMC Public Health. 2010;4(10): 대한한방부인과학회. 한방여성의학상. 서울 : 의성당. 2012:173, 김덕구, 유동열. 육계추출물이 Rat fetus 두개골로부터분리한조골세포에미치는영향. 대한한방부인과학회지. 2012; 25(3): 서울대학교의과대학내과학교실편저. 임상내과학. 서울 : 고려의학. 2004: 하승우. 골다공증 ( 골다공증의치료 : 골흡수억제제 ). 대구 : 경북대학교병원 : Estell R, et al. Bisphosphonates for postmenopausal osteoporosis. Bone. 2011;49(1): 정윤석. 골다공증의최신치료. 대한류마티스학회지. 2012;19(1): 程士德主編. 內經. 第 2 版. 北京 : 人民衛生出版社. 2006:198, 410, 정우열, 안규석. 한방임상병리학. 서울 : 영림사. 1998:507, 정승필. 노인에서의골다공증의진단및치료. 가정의학회지. 1998;19(11) : 전국한의과대학공동교재편찬위원회. 본초학. 서울 : 영림사. 2008: 馬繼興主編. 神農本草經輯注. 北京 : 人民衛生出版社. 1995: 이준호, 박광순. 영지 ( 靈芝 ) 가알코올섭취한흰쥐의간기능및지질대사에미치는영향. 한국영양학회지. 1999; 32(5): 유재권등. 노화촉진마우스의기억력및산화스트레스에미치는영지 (Ganoderma lucidum) 추출물의영향. 생명과학회지. 1999;9(5): 이병훈등. 영지약침액이인체위암세포성장억제및세포사멸유발에미치는영향. Korean Journal of Acupuncture. 2012;29(2): 강소신의학원편. 중약대사전. 상해 : 상해과학기술출판사. 1978: Futoshi S. Steps to internal medicine part 9. 서울 : 도서출판정담. 2008: 지제근. 의학용어큰사전. 서울 : 아카데미아. 2004: The Writing Group for the PEPI. Effects of hormone therapy on bone 32

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,