목차 1. 배경 필요성 현황

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예진 천
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1 세포치료제시험정보집 4 줄기세포치료제의 유전체안정성평가시험 [ 염색체핵형분석법 ] 식품의약품안전평가원 줄기세포치료제심사평가연구사업단

2 목차 1. 배경 필요성 현황 세포유전학적방법 염색체핵형분석법 형광제자리부합법 인시투염색체분석법 상세시험방법 분석법조건확립및적용사례 참고문헌

3 1. 배경 - 1 -

4 2. 필요성 - 2 -

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6 3. 현황 - 4 -

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구분세포유전학적방법 DNA 기반방법 RNA 기반방법 분석법 G 밴딩핵형분석 (G banding karyotyping) 특수핵형분석 (Special

(Expression array) 검사방법 해상도 ~ 10Mb 비정상형의종류에 따라다양함 1Mb 미만 1Mb 미만단일염기쌍 ~ 10Mb 민감도 ~

균형전위 (balanced translocation) 와역위 (inversion) 검출도가높다 Ÿ Ÿ Mosaic 배양에서민감도가높다균형전위

검출이 가능하다. Ÿ Ÿ 최고의해상도점돌연변이 (point mutation) 검출이가능하다.

단점 Ÿ 해상도가낮다 Ÿ 단가대비해상도가낮다. Ÿ 작은유전자중복 (small duplication) 과결손 (deletion) 검출율이낮다.

10 구분세포유전학적방법 DNA 기반방법 RNA 기반방법 분석법 G 밴딩핵형분석 (G banding karyotyping) 특수핵형분석 (Special karyotyping) acgh SNP 어레이 (SNP array) 전장유전체분석 (Whole-genome sequencing) 발현어레이 (Expression array) 검사방법 해상도 ~ 10Mb 비정상형의종류에 따라다양함 1Mb 미만 1Mb 미만단일염기쌍 ~ 10Mb 민감도 ~ 5% ~ 5% 20% 이상 20% 이상 20% 이상 30% 이상 장점 Ÿ 검사가간편하고, 신뢰도가높다 Ÿ Mosaic 배양에서민감도가높다 Ÿ 균형전위 (balanced translocation) 와역위 (inversion) 검출도가높다 Ÿ Ÿ Mosaic 배양에서민감도가높다균형전위 (balanced translocation) 와복합핵형 (complex karyotype) 검출도가높다 Ÿ 해상도가높다 Ÿ 해상도가높다 Ÿ LOH 검출이 가능하다. Ÿ Ÿ 최고의해상도점돌연변이 (point mutation) 검출이가능하다. Ÿ Ÿ Expression profiling 및 genomic integrity 분석과동일한검체사용관련유전자확인이가능하다. 단점 Ÿ 해상도가낮다 Ÿ 단가대비해상도가낮다. Ÿ 작은유전자중복 (small duplication) 과결손 (deletion) 검출율이낮다. Ÿ Ÿ Mosaic 배양에서 민감도가낮다. 배수성 (polyploidy) 을 검출할 수 없다. Ÿ Mosaic 배양에서민감도가낮다. Ÿ 비용이너무고가이다. Ÿ Ÿ 성염색체의분석이용이하지않다. Mosaic 배양에서민감도가낮다

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12 4. 세포유전학적방법 l l l l l l

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15 참고 : 고전적인 G-Bandign 핵형분석법 가. 시약및기구 1 도립현미경 (inverted microscope) 2 37, CO 2 incubator 3 배양액 ( 각줄기세포에맞게선택 ) 4 Colcemid (Gibco ) 5 Hypotonic solution: Potassium chloride solution (0.075M), 37 6 Ethidium bromide solution 7 Serological pipette 8 15mL conical tube 9 원심분리기 나. 시약조제 1 Carnoy's fixative solution (2-3:1(v/v) methanol/glacial acetic acid) 2 Leishmans' stain: - Na 2 HPO g / D.W. 50 ml ( 냉장보관 ) ( 분자량 142, stock 67 mm) % Trypsin-EDTA ( 냉동보관 ) - Gurr buffer tablets (Gibco ) in 1l D.W. ( 상온보관 ) 다. 시험방법 1) 세포배양 1 세포는적절한배양액이포함된용기에서배양하며 50%~70% confluence하게유지될때에핵형분석을실시한다. 2 세포는 trypsin으로처리하여새로운 flask에 reinoculation 시행한다. 3 배양은 37, 5% CO 2 에서시행한다. 2) 염색체의수확 (harvest) M KCl 용액은수확하는당일오전에제조하여 37 수조에가온해둔다. 2 배양 3일째각 flask당 EtBr 반응액 (EtBr, 10μg / ml ) 100μl를첨가하고 40분배양후에, 100μl colcemid ( 최종농도 0.1μg / ml ) 를첨가하여잘섞어주고, 37 배양기에 50분동안항온한다

16 3 세포부유액을 15ml튜브에옮기고 200g (1000 rpm) 에서 8분간원심분리한다. 4 상층액을제거한후세포층을재부유시킨다. 5 미리가온한 KCl 용액 12ml을한방울씩서서히떨어뜨리며손으로튜브의옆면을치거나 vortex로천천히섞어준다 수조에 20분을초과하지않고항온을시킨다. 7 고정액을 1ml첨가하여혼합한후에, 200 g (1,000 rpm) 에서 8분간원심분리하여상청액은버리고세포층을재부유한다. 8 고정액 7ml을한방울씩서서히떨어뜨리며손으로튜브의옆면을쳐준다. metaphase의상태를결정짓는가장중요한단계이다. 9 실온에 20~30분방치한다.( 습도가유지되는곳 ) 10 고정액을 10ml까지채운다 g (1,200 rpm) 에서 8분간원심분리한다. 상층액을제거하고, conical tube의벽에붙어있는세포덩어리와각종찌꺼기를면봉을이용하여조심스럽게제거한다. 이때층의 cell pellet을건드리지않아야한다. 신선한고정액 12ml를더하여재부유한다. 12 위의 10 및 11의세척과정을세포부유액의갈색기가없어지고, 무색투명해질때까지 3~6회를반복한다. 3) 세포고정및 slide 제작가능하다면세포수확과정이시행되는당일에슬라이드표본제작을하는것이좋다. 만일냉장고에서하룻밤동안보관하였다면표본제작전에시험관을냉장고에서꺼내어상온이되게한후에고정액으로 1회더세척한다. 1 고정단계에서한검체당 2장씩 slide를준비한다 ( 미리 slide의 Frosted area에연필로검사번호환자이름및배양방법날짜를기록하여 D.W. 에담궈냉장고에보관해둔다 ). 2 세포부유액의농도를고정액으로적절히조절한다 ( 세포층 : 고정액 = 1:3). 슬라이드를하나씩제작하여 inverted microscopy로세포밀도를확인한후재조정한다. 3 실험온도는 23±1, 상대습도는 55±5% 가적당하다. 또한슬라이드의기울기와가습, 바람이세포의 spread 상태에도움이되기도한다

17 4) 핵형분석 (G-banding, Karyotyping) 1 염색체수의계산 : 20개이상의분열중기상을판독한다. 2 분석 : 최소한 5개의분열중기세포를분석한다. 3 핵형분석 : 증례마다최소한 2개의핵형분석을시행하고, 클론성염색체의이상은 ISCN 2013에따른다. 4 평균해상도는 400 band 이상이다. 단, 400 band 정의에만족하려면다음의 4가지중 3가지가만족해야한다 ( 참고문헌 1. 참고 ). a. 3 dark bands on mid-4q (q22-q28) b. 3 dark bands mid-5q (5q14, 5q21,5q23) c. 2 dark bands on 9p (9p21 및 9p23) d. 뚜렷한 13q33 5 ISCN 2013 명명법에따라염색체핵형을명명하여판정한다

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19 5. 인시투염색체분석법

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28 저장액농도 인시투전통적방법염색체분석법 (arbitrary unit, AR) (AR) P -value M KCl M KCl

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31 Cell Normal signal (%) * A-MSC A-MSC Cell /21 14/ A-MSC A-MSC

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34 참고문헌 1. Association for Clinical Cytogenetics. Professional guidelines for clinical cytogenetics. General Best Practice Guidelins (2007) v European Medicines Agency. Reflection paper on stem cell-based medicinal products. EMA/CAT/571134/ eneral/general_content_ jsp 3. Guidance for FDA Reviewers and Sponsors, Content and Review of Chemistry Manufacturing, and Control Information for Human Somatic Cell Therapy Investigational New Drug Applications U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. 4. International Society for Stem Cell Research. Guidelines for the clinical translation of stem cells Barch MJ, Knutsen T, Spurbeck JL: The AGT cytogenetics laboratory manual: Lippincott-Raven Philadelphia, PA Barkholt L, Flory E, Jekerle V, Lucas-Samuel S, Ahnert P, Bisset L, Buscher D, Fibbe W, Foussat A, Kwa M, Lantz O, Maciulaitis R, Palomaki T, Schneider CK, Sensebe L, Tachdjian G, Tarte K, Tosca L, Salmikangas P. Risk of tumorigenicity in mesenchymal stromal cell-based therapies-bridging scientific observations and regulatory viewpoints. Cytotherapy :753~ Ben-David U, Mayshar Y, Benvenisty N: Large-Scale Analysis Reveals Acquisition of Lineage-Specific Chromosomal Aberrations in Human Adult Stem Cells. Cell Stem Cell :97~ Ben-David U, Benvenisty. Analyzing the genomic integrrity of stem cell. Stembook

35 9. Catalina P, Cobo F, Cortes JL, Nieto AI, Cabrera C, Montes R, Concha A, Menendez P: Conventional and molecular cytogenetic diagnostic methods in stem cell research: a concise review. Cell biology international :861~ Ferreira RJ, Irioda AC, Cunha RC, Francisco JC, Guarita-Souza LC, Srikanth GV, Nityanand S, Rosati R, Chachques JC, de Carvalho KA. Controversies about the chromosomal stability of cultivated mesenchymal stem cells: their clinical use is it safe? Curr Stem Cell Res Ther : Goldring CE, Duffy PA, Benvenisty N, Andrews PW, Ben-David U, Eakins R, French N, Hanley NA, Kelly L, Kitteringham NR, Kurth J, Ladenheim D, Laverty H, McBlane J, Narayanan G, Patel S, Reinhardt J, Rossi A, Sharpe M, Park BK. Assessing the safety of stem cell therapeutics. Cell Stem Cell :618~ Hirsh B, Brothman AR, Jacky PB, Rao KW, Wolff DJ: Section E6 of the ACMG technical standards and guidelines: Chromosome studies for acquired abnormalities. Genetics in Medicine (7): Hwang SM, See CJ, Choi J, Kim SY, Choi Q, Kim JA, Kwon J, Park SN, Im K, O IH, Lee DS. The aplication of an in situ karyotyping technique for mesenchymal stromal cells: a validation and comparison study with classical G-banding. Experimental and Molecular Medicine , e Meisner LF, Johnson JA. Protocols for cytogenetic studies of human embryonic stem cells. Methods :133~ Moralli D, Yusuf M, Mandegar MA, Khoja S, Monaco ZL, Volpi EV. An Improved Technique for Chromosomal Analysis of Human ES and ips Cells. Stem Cell Reviews and Reports : Prockop DJ, Keating A. Relearning the lessons of genomic stability of human cells during expansion in culture: implications

36 for clinical research. Stem Cells :1051~ Rosland GV, Svendsen A, Torsvik A, Sobala E, McCormack E, Immervoll H, Mysliwietz J, Tonn JC, Goldbrunner R, Lonning PE, Bjerkvig R, Schichor C. Long-term cultures of bone marrow-derived human mesenchymal stem cells frequently undergo spontaneous malignant transformation. Cancer research :5331~ Sensebe L, Tarte K, Galipeau J, Krampera M, Martin I, Phinney DG, Shi Y. Limited acquisition of chromosomal aberrations in human adult mesenchymal stromal cells. Cell Stem Cell :9~ Shaffer LG, McGowan-Jordan M, Schmid M. (eds): ISCN (2013): An international system for human cytogenetic nomenclature. S. Karger, Basel, Taapken SM, Nisler BS, Newton MA, Sampsell-Barron TL, Leonhard KA, McIntire EM, Montgomery KD. Karotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nature Biotechnology (4):313~ Takeuchi M, Takeuchi K, Ozawa Y, Kohara A, Mizusawa H. Aneuploidy in immortalized human mesenchymal stem cells with non-random loss of chromosome 13 in culture. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal (5):290~ 의학사전. 제3판영한 / 한영. 이우주엮음 아카데미서적

37 줄기세포치료제의유전체안정성평가시험 발행일 : 2014년 5월 16일발행인 : 식품의약품안전평가원장왕진호편집위원장 : 의료제품연구부장강신정편집위원 : 첨단바이오제품과백선영, 류승렬, 김재옥, 이보연, 엄준호, 김병철, 박지원외부전문가서울대학교이동순줄기세포치료제심사평가연구사업단 발행부서 : 식품의약품안전평가원첨단바이오제품과 연락처 : 식품의약품안전평가원첨단바이오제품과전화번호 : 043) ~7 팩스번호 : 043)

Can032.hwp

Can032.hwp Chromosomal Alterations in Hepatocellular Carcinoma Cell Lines Detected by Comparative Genomic Hybridization Sang Jin Park 1, Mahn Joon Ha, Ph.D. 1, Hugh Chul Kim, M.D. 2 and Hyon Ju Kim, M.D. 1 1 Laboratory