대한진단검사의학회지제 26 권제 4 호 2006 Korean J Lab Med 2006;26:233-40 원저 진단혈액학 급성골수성백혈병의예후적인자로서 FLT3 유전자변이 장순희 1 이난영 2 김동환 3 손상균 3 서장수 4 대구파티마병원진단검사의학과 1, 성윤검사센터진단검사의학과 2, 경북대학교의과대학혈액종양내과학교실 3, 임상병리학교실 4 FLT3 Gene Mutations as a Prognostic Factor for Acute Myeloid Leukemia Soon Hee Chang, M.D. 1, Nan Young Lee, M.D. 2, Dong Hwan Kim, M.D. 3, Sang Kyun Sohn, M.D. 3, and Jang Soo Suh, M.D. 4 Department of Laboratory Medicine 1, Daegu Fatima Hospital, Daegu; Sungyoon Reference Laboratory 2, Daegu; Departments of Hematology/Oncology 3 and Clinical Pathology 4, School of Medicine, Kyungpook National University, Daegu, Korea Background : Two distinct types of fms-like tyrosine kinase 3 (FLT3) gene mutations have been identified in acute myeloid leukemia (AML): D835 and internal tandem duplication (ITD) mutations. These mutations are known to cause the proliferation of leukemic cells and inhibit the apoptosis of leukemic cells due to ligand-independent activation of their receptors. Therefore, the current study attempted to investigate the frequency of FLT3 gene mutations and their prognostic implications for AML in terms of treatment response, survival, and relapse. Methods : Polymerase chain reaction (PCR) was performed to detect D835 and ITD mutations in 84 newly diagnosed AML patients from February 2001 to October 2004. Restriction fragment length polymorphism (RFLP) and direct sequencing were performed to analyze the D835 mutations. The results were examined based on a comparison with previously known prognostic factors, and the treatment outcomes analyzed according to the existence of the mutations in relation to the event free survival (EFS), overall survival (OS), and complete remission (CR) rates. Results : D835 and IDT mutations were detected in 4.7% (4/84) and 19.0% (16/84), respectively, of the AML patients. The FLT3 gene mutations were not found to be associated with previously known prognostic factors, such as the WBC count, age, and cytogenetic risk group, but were associated with the lactate dehydrogenase levels. The EFS and OS rates were also significantly lower in the FLT3 gene mutation group, especially in AML with normal karyotypes. Conclusions : FLT3 gene mutations were observed in 23.8% of AML patients and appeared to have a prognostic implication on patient survival. Accordingly, the presence of FLT3 gene mutations, which could be tested easily by using PCR/RFLP methods, should be investigated routinely at the time of diagnosis. (Korean J Lab Med 2006;26:233-40) Key Words : FLT3, Acute myeloid leukemia, Prognostic implications 서 론 급성골수성백혈병에서유전자변이는진단이나잔류병소의검출 접 수 : 2005년 11월 15일 접수번호 : KJLM1903 수정본접수 : 2006년 4월 20일 게재승인일 : 2006년 5월 28일 교신저자 : 서장수 우 700-721 대구광역시중구삼덕 2가 50 경북대학교병원진단검사의학과 전화 : 053-420-5293, Fax: 053-426-3367 E-mail: suhjs@mail.knu.ac.kr 뿐만아니라치료에대한반응이나재발유무, 생존율과같은예후를예측하는데에이용될수있으며, 이러한유전자로는 French- American-British (FAB) 분류에따른아형에서특징적으로나타나는 t(8;21), t(15;17), t(9;11), inv(16) 등 [1] 과그외 fmslike tyrosine kinase 3 (FLT3)[2], N-RAS[2], p53[3], Wilms' 종양유전자 [4] 등현재까지약 110여종이있는것으로알려져있다. 이중 FLT3는 stem cell tyrosine kinase-1 (STK-1) 혹은 fetal liver tyrosine kinase-2 (FLK-2) 로도알려져있으며, KIT (CD117), FMS, 혈소판유래성장인자 (platelet derived grow- 233
234 장순희 이난영 김동환외 2 인 th factor) 수용체와함께 class Ⅲ tyrosine kinase 수용체에속하고, 특징적인구조적상동성을가진다. 즉, 세포외부위에 5개의면역글로불린이고리형태를이루는영역, 세포내막곁 (juxtamembrane) 영역, 2개의 tyrosine kinase 영역 (tyrosine kinase domains; TKD) 으로구성되며 [5], 조혈모세포에현저하게표현되어세포의생존, 증식, 분화, 세포자멸사등에관여한다 [6-8]. 관련유전자는 13번염색체의장완 (q12) 에위치하며, 24개의엑손 (exons) 으로구성된다 [9]. FLT3 유전자변이는급성골수성백혈병에서가장흔한것으로세포내두번째 TKD (D835) 돌연변이와 internal tandem duplication (ITD) 변이의두가지형태가알려져있다. D835 돌연변이는 exon 20에서, ITD 변이는 exon 14와 exon 15 사이에서나타나며 [10-20], 모두체세포돌연변이로서로독립적으로발생하고, 같이나타나는경우에도서로다른대립형질에서발생되는것으로보고되고있다 [11, 12]. 이러한 FLT3 유전자변이는조혈계의많은세포들에서생성되는배위자 (ligand) 에의존하지않는수용체활성을유발하여세포증식을초래할뿐만아니라세포자멸사를억제하는데도관여한다 [6-8]. D835 돌연변이는 835번 codon이정상적으로는 GAT' 로 aspartic acid를만들게되나이부위가결손됨에따라 aspartic acid 가결손되거나혹은 TAT' 등으로돌연변이가생김에따라 tyrosine, histidine, valine, glutamate 등으로치환되며, 836번 codon 의 isoleucine이결손되거나 methionine 등으로치환되는 [6, 10-13] 과오돌연변이로정상인에서는발견되지않는다 [10-12]. 이를분석하는방법으로는유전자부위를중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR) 법으로증폭후제한효소분절길이다형성분석과염기서열을분석하는방법이이용되며 [10-13, 15], 급성골수성백혈병에서이변이의의의는백혈병유발에관여하거나질환의진행에어떤역할을할것으로보고되었으며 [10], 백혈구수나백혈병세포의백분율과관련되는보고 [13] 도있으나흔히생존율에영향을미치는예후적의미는없는것으로보고되고있다 [10-12]. ITD 변이는막곁영역에서발생하는데 exon 14와 exon 15 사이에서나타나며 [9], 그크기나위치는다양한것으로알려져있다. 대개그크기는 12 204 bp로보고되며, 흔히발견되는염기서열은없으나 589, 591, 597, 599번 tyrosines 중적어도하나를포함하는것으로알려져있고하나이상의 ITD 변이가존재하는경우도보고되고있다 [2, 6, 14, 17]. 이변이를분석하는방법으로는유전자부위를 PCR법으로증폭후염기서열을분석하는방법이이용된다 [12, 13, 15-20]. 이변이의처음발견시백혈병유발과관련되거나 [17] 백혈병의진행에중요한역할을할것으로보고되었다 [18]. 그후여러연구에서백혈구증가증, 백혈병세포백분율이높은것과관련되거나 [6, 12, 13, 18], 전체생존율, 무병생존율, 재발과관련되는등의예후적의미를가지는것으로보고되고있어 [2, 12-14, 16, 19, 20] 급성골수성백혈병에서통상적인검사로시행되어야한다는주장도있다 [20]. 또한이두가지변이는염색체분석결과, 정상핵형인경우좀더흔히관찰되므로이러한환자군에서위험도를예측할수있다는데더욱예후적의미를가진다 [12, 13, 20]. 그러나, 한국인을대상으로한백혈병에서의 FLT3 유전자변이의예후적의미에관한연구가없기에저자들은급성골수성백혈병에서 FLT3 유전자의 D835 돌연변이와 ITD 변이두가지를분 석하여그빈도를알아보고유전자변이유무에따른예후적인자 및생존율, 치료에대한반응과의관련성을분석하여그예후적의미를알아보고자하였다. 1. 대상 대상및방법 2001년 2월부터 2004년 10월까지급성골수성백혈병으로처음진단받은환자 84명을대상으로하였으며, 평균연령은 47.5 (15-86) 세였고, 여자 39명, 남자 45명이었다. FAB 분류에따른환자의분포는 M0 5명, M1 2명, M2 42명, M3 7명, M4 11명, M5 9명, M6 5명, M7 3명이었다. 이중치료를시행한환자군은 63 명이었다. 2. 방법 1) DNA 추출환자의진단당시채취한골수검체에서 Histopaque-1077 (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO, USA) 을사용하여단핵세포들을분리하고단백분해효소 K를처리한후 phenol-chloroform법으로 DNA를추출하였다. 일부환자에서는진단당시의골수도말슬라이드에서동일한방법으로 DNA를추출하였으며, 추출된 DNA는 PCR 검사전까지 -80 에냉동보관하였다. 2) D835 돌연변이분석 FLT3 유전자의 exon 20 부위를증폭하도록 Yamamoto 등 [12] 이고안한시발체를사용하여 PCR 을시행하였다. PCR 반응 액구성은 AccuPower PCR PreMix (Bioneer, Daejeon, Korea) 에시발체를각각 20 pm씩, DNA는약 500 ng 정도넣고 0.1% diethylpyrocarbonate (DEPC) (Amresco, Solon, OH) 처리한 Q-water (Merck, Darmstadt, Germany) 로총량 20 L로맞추었다. GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster city, CA) 을이용하여 94 에 7분간사전변성시킨후 94 에 45 초간변성반응, 60 에 45 초간결합반응, 72 에 60 초간연장 반응을 30 회반복후 72 에 10 분간추가연장반응을시행하였다. PCR 산물 5 L를 2% agarose gel에 110 V에서 30분간전기영동후 UV 하에서 114 bp의띠를확인한후 PCR 산물 5-10 L에 EcoRⅤ 제한효소 (Roche diagnostics, Penzberg, Germany)
급성골수성백혈병에서 FLT3 유전자변이 235 5 U와완충액, 0.1% DEPC (Amresco) 처리한 Q-water (Merck) 를넣어총량 25 L가되도록하여 37 에 1시간항온한후 3% Low Melt agarose (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) gel에 110 V에서 45분간전기영동하였다. 야생형은 68 bp와 46 bp의두개의띠로나타나는반면, 변이형은잘려지지않은 114 bp의띠로나타난다 [12]. 이잘려지지않은띠를포함한겔을오려내어 High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Diagnostics) 를사용하여정제한후한국생명공학연구원 (Daejeon, Korea) 에염기서열분석을의뢰하였다. 3) Internal Tandem Duplication (ITD) 분석 FLT3 유전자의 exon 14와 exon 15 부위를증폭하도록 Nakao 등 [17] 이고안한시발체를변형한 Tiesmeier 등 [16] 의시발체를사용하여 PCR을시행하였다. PCR 반응액구성은 AccuPower PCR PreMix (Bioneer) 에시발체를각각 20 pm씩, DNA는약 500 ng 정도넣고 0.1% DEPC (Amresco) 처리한 Q-water (Merck) 로총량 20 L로맞추었다. GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) 을이용하여 94 에 2분간사전변성시킨후 94 에 30초간변성반응, 56 에 30초간결합반응, 72 에 30초간연장반응을 37회반복후 72 에 5분간추가연장반응을시행하였다. PCR 산물 10 L를 2% agarose gel에 110 V에서 30분간전기영동을실시한후 UV 하에서띠를확인하였다. 328 bp의하나의띠만관찰되는경우는 ITD 변이가없는것으로보았으며, 이러한예중무작위로 7예를선택하여이띠를포함한겔을오려내어상기와동일한방법으로 PCR 산물을정제하여염기서열분석을의뢰하였다. 328 bp 이외에더긴분절의띠가동시에관찰되는경우 ITD 변이가있는것으로보고다시 3% Low Melt agarose gel (Bio-Rad) 에 110 V에서 45분간전기영동하여띠를확인하였다. 5) 통계 SPSS (version 11.5, SPSS Inc., Chicago, IL) 를이용하여 FLT3 유전자변이유무에따라예후인자들과의관련성을분석하였는데빈도분석을통해실시하였으며, 카이제곱검정을시행하였다. 단변량관련성분석은 Fisher 정확검정으로분석하였으며, 독립적으로관련된예후인자에대해서는다변량회귀분석을시행하였다. FLT3 유전자변이유무에따른생존율분석은치료가다른 M3를제외하고 Kaplan-Meier 분석을실시하였다. P 값이 0.05 미만인경우통계학적으로의미가있는것으로판정 하였다. 결 1. D835 돌연변이분석결과 변이형이관찰된경우는 4.8% (4/84) 였으며, M1 1명, M2 1 명, M3 1명, M5 1명이었다 (Table 1, Fig. 1). 이 4예중염기서열분석결과를얻을수있었던 3예모두 GAT 가 TAT' 로돌연변이가일어난것을확인할수있었다 (Fig. 2). 2. ITD 분석결과 변이형이관찰된경우는 19.0% (16/84) 였으며, M2 7명, M3 2명, M4 4명, M5 2명, M6 1명이었다. 이변이가관찰된예중 D835 변이가동시에검출된예는없었다 (Fig. 3, Table 1). 염기서열분석을의뢰했던 7예모두에서변이가일어나지않은야생형임을확인할수있었다. 과 4) 생존율및예후인자완전관해는치료후골수도말검사상백혈병세포가 5% 미만이면서적혈구, 백혈구, 거핵세포생성이정상적인소견을보이고, 적어도 4주이상말초혈액세포가정상소견을보이는시기로하였다. 무병생존율 (event free survival, EFS) 은치료일로부터재발이나질환의지속혹은사망까지로하였으며, 전체생존율은진단일로부터어떠한원인으로든사망까지로정의하였다. 예후적인자로는이미알려져있는것과같이진단시백혈구수를 50,000/ L 이상과미만으로, 젖산탈수소효소 (lactate dehydrogenase, LD) 치를 1,000 U/L 이상과미만으로, 나이를 50 세이상과미만으로나누었다. 염색체결과에서 t(15;17), t(8;21), inv(16)/del(16q) 은예후가좋은군으로, -7, del(7q), -5, del(5q), 11q23 이상, 3q21과 3q26 이상, 복잡한핵형을보이는경우는예후가나쁜군으로분류하였으며, 정상핵형을포함한그외에는모두중간군으로나누었다 [1]. Table 1. Results of analysis for D835 and ITD mutations in the FLT3 gene Subtype of AML N of patient FLT3 mutations (%) D835 mutations (%) ITD mutations (%) M0 5 0 (0) 0 (0) 0 (0) M1 2 1 (50.0) 1 (50.0) 0 (0) M2 42 8 (19.0) 1 (2.4) 7 (16.7) M3 7 3 (42.9) 1 (14.3) 2 (28.6) M4 11 4 (36.4) 0 (0) 4 (36.4) M5 9 3 (33.3) 1 (11.1) 2 (22.2) M6 5 1 (20.0) 0 (0) 1 (20.0) M7 3 0 (0) 0 (0) 0 (0) Total 84 20 (23.8) 4 (4.8) 16 (19.0) Abbreviations: FLT3, fms-like tyrosine kinase 3; AML, acute myeloid leukemia; ITD, internal tandem duplication.
236 장순희 이난영 김동환외 2 인 3. FLT3 유전자변이유무에따른예후인자들과의관련성분석결과 FLT3 유전자변이를예후인자들과분석한결과, 백혈구수, 나이, 염색체분석결과와는상관관계가없었으나, LD치와는순상관관계가있는것으로나타났다 (P=0.013)(Table 2). 4. FLT3 유전자변이유무에따른생존율분석 치료를시행한환자군에서 M3 를제외한 51 명에대해서분석한 600 bp 결과, 무병생존율에서 D835 돌연변이유무는유의한차이를보이지않았으며, ITD 변이가없는군에비해있는군에서유의하게낮은결과를보였다 (P=0.015). 전체생존율이나완전관해율은두가지각각의변이유무에따라유의한차이를보이지않았다. 또한 FLT3 유전자변이의존재는무병생존율 (P=0.018) 과전체생존율 (P=0.007) 에유의한차이가있는것으로나타났다 (Table 3, Fig. 4). 5. 예후인자들과생존율간의다변량회귀분석결과사용한변수들은 FLT3 유전자변이, 염색체분석결과, 진단당시백혈구수, LD치, 나이였다. 무병생존율에대해서는 FLT3 G A T TG G C T C G A T A T A T C A T G A 100 bp 114 bp 68 bp 46 bp SM 1 2 3 4 Fig. 1. Results of D835 mutations in the FLT3 gene. The amplified product (lane 1) of wild type was digested to two bands (68 bp and 46 bp) by EcoRV in lane 2. When amplified products contained D835 mutations, undigested bands (114 bp) were visualized on low melting point agarose gel electrophoresis (lane 3 and 4). Lane SM, molecular size markers (100 bp DNA ladder). Abbreviation: FLT3, fms-like tyrosine kinase 3. Fig. 2. Sequence analysis in 3 patients with D835 mutations in the FLT3 gene. The results revealed that the first nucleotide G of codon 835 was substituted with T. Abbreviation: FLT3, fms-like tyrosine kinase 3. Table 2. Relationship between known prognostic factors and the FLT3 mutations Prognostic factors N of patient FLT3 mutations Positive Negative P value 328 bp 1 2 3 4 5 SM 600 bp Fig. 3. Results of ITD mutations in the FLT3 gene. The amplified product of wild type was shown in lane 5. When amplified products contained ITD mutations, another bands were visualized on low melting point agarose gel electrophoresis (lane 1-4). Lane SM, molecular size marker (100 bp DNA ladder). Abbreviations: FLT3, fms-like tyrosine kinase 3; ITD, internal tandem duplication. WBC (/ L) 50,000 22 5 17 NS <50,000 62 11 51 LD (U/L) 1,000 33 12 21 0.013 <1,000 43 5 38 Age (years) 50 35 6 29 NS <50 49 14 35 Cytogenetic findings* Favorable group 17 6 11 NS Intermediate group 45 11 34 Unfavorable group 15 3 12 *Favorable group: t(15;17), t(8;21), and inv(16); intermediate group: normal karyotype and other karyotypes; unfavorable group: -7, -5, del(11q23), and complex karyotype. Abbreviation: NS, not significant.
급성골수성백혈병에서 FLT3 유전자변이 237 Table 3. Comparison of survivals and complete remission rates excluding M3 according to the FLT3 mutation status FLT3 mutations Positive (N=9) Negative (N=42) P value EFS Median (days) 135 429 0.018 1 YEFS rate (%) 0 57.0±8.5* OS Median (days) 336 793 0.007 1 YOS rate (%) 45.7±16.6 67.8±8.0 CR Rate (%) 77.8 71.4 NS *Mean±SD. Abbreviations: FLT3, fms-like tyrosine kinase 3; EFS, event free survival; YEFS, year event free survival; OS, overall survival; YOS, year overall survival; CR, complete remission; NS, not significant. 유전자변이만이독립적예후인자인것으로나타났으며 (P=0.020, HR 0.354 (95% C.I. 0.148-0.851)), 전체생존율에대해서도 FLT3 유전자변이만이독립적인예후인자인것으로나타났다 (P=0.016, HR 0.317 (95% C.I. 0.124-0.809)). Table 4. Comparison of survivals excluding M3 according to the FLT3 mutation status among the patients with a normal karyotype FLT3 mutations Positive (N=11) Negative (N=28) P value EFS Median (days) 135 NR 0.001 OS Median (days) 336 NR 0.005 Abbreviations: See Table 3. FLT3, fms-like tyrosine kinase 3; NR, not reached. 1.0 1.0 Event free survival (%) 0.8 0.6 0.4 0.2 FLT3 + (N=9) P=0.018 FLT3 - (N=42) Overall survival (%) 0.8 0.6 0.4 0.2 FLT3 + (N=9) P=0.007 FLT3 - (N=42) 0.0 0 365 730 1,095 1,460 0.0 0 365 730 1,095 1,460 Days from treatment A Days from treatment B Fig. 4. Event free (A) and overall (B) survival in patients with AML according to the FLT3 mutation status. Abbreviations: AML, acute myeloid leukemia; FLT3, fms-like tyrosine kinase 3; ITD, internal tandem duplication; FLT3 +, FLT3 mutation; FLT3 -, no FLT3 mutation. 1.0 1.0 Event free survival (%) 0.8 0.6 0.4 0.2 FLT3 + (N=11) P=0.001 FLT3 - (N=28) Overall survival (%) 0.8 0.6 0.4 0.2 FLT3 + (N=11) P=0.005 FLT3 - (N=28) 0.0 0 365 730 1,095 0.0 0 365 730 1,095 Days from treatment A Days from treatment B Fig. 5. Event free (A) and overall (B) survival rate in patients with normal karyotype in AML according to the FLT3 mutation status. Abbreviations: AML, acute myeloid leukemia; FLT3, fms-like tyrosine kinase 3; ITD, internal tandem duplication; FLT3 +, FLT3 mutation; FLT3 -, no FLT3 mutation.
238 장순희 이난영 김동환외 2 인 6. 정상핵형인환자에서 FLT3 유전자변이유무에따른생존율분석결과 염색체분석결과, 정상핵형을보인환자는 39명이었으며, 이중치료를받은환자는 28명이었다. FLT3 유전자변이가없는환자는 28명, 변이가있는환자는 11명이었다. FLT3 유전자변이유무에따라무병생존율과전체생존율에서유의한차이가있는것으로나타났다 (Table 4, Fig. 5). 고 급성골수성백혈병에서가장흔한유전자변이인 FLT3 유전자변이에는 D835 돌연변이와 ITD 변이가있다. 이는백혈병유발이나질환의진행, 세포증식이나세포자멸사의억제와관련되며, 생존율이나재발과관련되는등의예후적의미를가진다 [10-14, 16, 19, 20]. D835 돌연변이는급성골수성백혈병에서 2.7-10.8% 로 [10-14], 본연구에서는 4.8% (4/84) 로나타나국내의손등 [21] 이보고한 2.9% (2/68) 보다는약간높게나타났다. M3에서분석한 Shih 등 [15] 은 18.7% 로높게보고하였으며, 국내의유등 [22] 은 6.9% (6/87) 로보고하였으나본연구에서는 M3에서 14.3% (1/7) 로나타났다. Yamamoto 등 [12] 은 M5에서 22.5% (9/40) 로보고하였으나본연구에서는 11.1% (1/9) 로나타났다. 본연구에서 D835 돌연변이가있는 4예중염기서열분석이가능했던 3예모두 GAT' 가 TAT' 로돌연변이가일어나 aspartic acid가 tyrosine 으로된것을확인할수있었으며, 여러문헌에서이돌연변이가가장흔한것으로보고하고있다 [6, 10-13]. ITD 변이는급성골수성백혈병에서 13.2-22.6% 로 [12-20], 본연구에서도 19.0% 로나타났다. ITD 변이는막곁영역에서발생하며, Nakao 등 [17] 이 exon 11과 exon 12 사이에서발견되었다고처음보고하였으나후에각각이 exon 14와 exon 15인것으로밝혀졌으며 [9], 그크기나위치는다양한것으로알려져있다. M3 에서만분석한 Kiyoi 등 [18] 은 20.3% 로보고하였는데본연구에 서는 28.6% (2/7) 로나타났으나국내의유등 [22] 은 9.2% (8/87) 로낮게보고하였다. Kiyoi 등 [2] 은 M4/5에서 35.5% (22/62) 로, Nakao 등 [17] 도 44.4% (4/9) 로, Thiede 등 [13] 은 M5에서약 40% 정도로흔히관찰된다고하였는데본연구에서도 M4/5에서 30% (6/20) 로나타났으며, 이는단핵구의분화동안 FLT3가지속적으로발현됨을의미한다. 그러나, Abu-Duhier 등 [20] 은 M4/ 5에서 18.8% (9/48) 로낮게보고하기도하였다. 이와같이 D835 돌연변이와 ITD 변이의보고에따른검출률의차이는검사방법이다른것이하나의원인으로생각되며, 직접염기서열분석이나폴리아크릴아미드겔전기영동법등의보완적인방법에의해검출률의향상에기여할수있을것이다. Shih 등 [10] 은 D835 돌연변이가백혈구수, 골수의백혈병세 찰 포백분율, 전체생존율에유의한차이가없다고하였는데본연구에서도자료는제시하지않았으나이변이의유무는백혈구수, LD치, 나이, 염색체분석결과에있어서유의한차이가없었다. 그러나, Thiede 등 [13] 은 D835 돌연변이와 ITD 변이모두에서백혈구수및백혈병세포백분율과유의한관련성을보고하였다. ITD 변이는백혈구수와백혈병세포의백분율이유의하게높은것과관련되어예후가나쁜것으로보고되는데 [2, 12, 13], 본연구에서는백혈구수, 나이, 염색체분석결과에서유의한차이를보이지않았으나질환의공격성을보여주는 LD치에서유의한차이가있는것으로나타나 ITD 변이가불량예후인자임을알수있었는데 Kiyoi 등 [2] 은야생형 FLT3인경우LD치가낮은경향을보였다고하였으며, Yamamoto 등 [12] 은야생형군에비해 ITD 변이군에서 LD치가유의하게높았으나 D835 돌연변이군에서는동일하였다고보고하였다. Shih 등 [15] 과 Kiyoi 등 [18] 은 M3 환자에서 ITD 변이를분석한결과, 전체생존율과무병생존율및완전관해율에유의한차이가없어예후적의미가없는것으로보고하여서본연구에서도 M3의경우치료방법에서도다른아형과는차이도나기때문에생존율및완전관해율과의관련성분석시에는 M3를제외하고시행하였다. D835 돌연변이는생존율에영향을미치는예후적의미가없는것으로보고되지만 [10-12], ITD 변이가있는경우에는생존율이유의하게낮거나재발과관련되는등예후가나쁜것으로보고된다 [2, 12-14, 16, 19, 20]. 그러나, Thiede 등 [13] 은두가지변이중어느변이가존재하든지전체생존율과무병생존율에유의한차이가있는것으로보고하기도하였다. 본연구에서 D835 돌연변이와 ITD 변이각각의유무에대해생존율과완전관해율을분석한결과, 무병생존율에서 ITD 변이가없는군에비해있는군에서유의하게낮은결과를보였다. 또한 Table 3과같이 FLT3 유전자변이유무에따라분석한결과, 이유전자변이가존재시무병생존율과전체생존율이유의하게낮은것을알수있었는데 FLT3 유전자변이는완전관해율에는영향을미치지않으면서생존율에영향을미침으로써예후적인의미를가지는것을확인할수있었다. Thiede 등 [13] 은급성백혈병환자 979명에서 FLT3 유전자변이를분석한결과, 정상핵형인경우에는 37.5% (169/451) 양성을보인반면, 염색체이상이동반된경우는 14.6% (65/445) 양성을보여정상핵형에서더높은양성률을보고하였는데본연구에서는정상핵형을가지는환자군에서 28.2% (11/39) 양성을보이고염색체이상이동반된경우도 28.1% (9/32) 로유사한양성률을보였다. 그러나, 정상핵형을보인환자군에서생존율을분석한결과, FLT3 유전자변이유무에따라무병생존율과전체생존율에서유의하게차이가나는것을알수있었는데이변이가존재시유의하게생존율이감소되어있어정상핵형을가지는환자에서위험도를예측할수있는인자로서의가능성을시사한다. 또본연구에는포함되지않았지만최소잔류질환의검출에서 FLT3 유전자변이의역할에대해서도보고가있었는데, Shih 등
급성골수성백혈병에서 FLT3 유전자변이 239 [10] 은재발한급성골수성백혈병에서처음진단때보다 ITD 변이가의미있게더높은빈도로나타났지만 D835 돌연변이는빈도가더높지않고오히려소실되는경우도있어서진단시 D835 돌연변이가있는환자라도초기재발이나최소잔류질환을찾는데는적절하지못하다고보고하였다. Kottaridis 등 [6] 은상당수의환자에서재발시 FLT3 유전자변이가생기거나소실되는경우가있으며, 진단시존재하던 ITD 변이가소실되고완전히다른변이가생기는경우도있다고보고하여현재최소잔류질환에서 FLT3 유전자변이의역할은확실하지않으며, 더많은연구가필요할것으로사료된다. 결론적으로급성골수성백혈병환자에서 FLT3 유전자변이는생존율과같은예후를예측할수있는인자로사용될수있으므로 FLT3 유전자변이가있는경우동종골수이식등의좀더적극적인치료가필요하다는것을시사하며, PCR과제한효소처리의비교적쉬운방법으로검사를할수있어통상검사로시행할필요가있을것으로사료되었다. 또한앞으로는현재 imatinib mesylate (Gleevec; Norvatis, Basel, Switzerland) 가만성골수성백혈병치료에사용되는것처럼급성골수성백혈병에도 tyrosine kinase 억제제와같은치료약제의새로운유전자표적이될수있을것으로도기대된다. 요약배경 : 급성골수성백혈병에서 fms-like tyrosine kinase 3 (FL- T3) 유전자변이에는 D835 돌연변이와 internal tandem duplication (ITD) 변이의두가지분명한형태가있다. 이러한변이는배위자 (ligand) 에의존하지않는수용체활성을유발하여세포증식을초래하며, 세포자멸사를억제하는것으로알려져있다. 본연구는급성골수성백혈병에서 FLT3 유전자변이의빈도및치료에대한반응이나생존율, 재발에관한그예후적의미를알아보고자하였다. 방법 : 2001년 2월부터 2004년 10월까지급성골수성백혈병으로처음진단받은환자 84명을대상으로하여 D835 돌연변이와 ITD 변이에대한중합효소연쇄반응을시행하였으며, D835 돌연변이분석을위해서는제한효소분절길이다형성과염기서열을분석하였다. 그결과와예후인자들을비교분석하였으며, 이유전자변이유무에따른환자의무병생존율, 전체생존율, 완전관해율에대한치료성적을분석하였다. 결과 : D835 돌연변이는 4.7% (4/84), ITD 변이는 19.0% (16/ 84) 에서검출되었다. FLT3 유전자변이를예후인자들과분석한결과, 백혈구수, 나이, 염색체분석결과와는상관관계가없었으나, 젖산탈수소효소 (LD) 치와는순상관관계가있는것으로나타났다. 이유전자변이가존재시무병생존율과전체생존율이유의하게낮은것으로나타났으며, 특히정상핵형에서이유전자변이존재시무병생존율과전체생존율이유의하게낮은것으로 나타났다. 결론 : 급성골수성백혈병에서 FLT3 유전자변이는 23.8% 에서나타났으며, 이변이는생존율에영향을미침으로써예후적의미를가지는것으로보였다. FLT3 유전자변이검사는 PCR과제한효소처리의쉬운방법으로시행할수있어진단시통상검사로시행할필요가있을것으로사료된다. 참고문헌 1. Hutchison RE and Davey FR. Leukocytic disorders. In: Henry JB, ed. Clinical diagnosis and management by laboratory methods. 20th ed. Philadelphia: WB Saunders, 2001:586-622. 2. Kiyoi H, Naoe T, Nakano Y, Yokota S, Minami S, Miyawaki S, et al. Prognostic implication of FLT3 and N-RAS gene mutations in acute myeloid leukemia. Blood 1999;93:3074-80. 3. Wattel E, Preudhomme C, Hecquet B, Vanrumbeke M, Quesnel B, Dervite I, et al. p53 mutations are associated with resistance to chemotherapy and short survival in hematologic malignancies. Blood 1994;84:3148-57. 4. Bergmann L, Miething C, Maurer U, Brieger J, Karakas T, Weidmann E, et al. High levels of Wilms tumor gene (wt1) mrna in acute myeloid leukemias are associated with a worse long-term outcome. Blood 1997;90:1217-25. 5. Matthews W, Jordan CT, Wiegand GW, Pardoll D, Lemischka IR. A receptor tyrosine kinase specific to hematopoietic stem and progenitor cell-enriched populations. Cell 1991;65:1143-52. 6. Kottaridis PD, Gale RE, Linch DC. Flt3 mutations and leukaemia. Br J Haematol 2003;122:523-38. 7. Stirewalt DL and Radich JP. The role of FLT3 in haematopoietic malignancies. Nat Rev Cancer 2003;3:650-65. 8. Lisovsky M, Estrov Z, Zhang X, Consoli U, Sanchez-Williams G, Snell V, et al. Flt3 ligand stimulates proliferation and inhibits apoptosis of acute myeloid leukemia cells: regulation of Bcl-2 and Bax. Blood 1996;88:3987-97. 9. Abu-Duhier FM, Goodeve AC, Wilson GA, Care RS, Peake IR, Reilly JT. Genomic structure of human FLT3: implications for mutational analysis. Br J Haematol 2001;113:1076-7. 10. Shih LY, Huang CF, Wu JH, Wang PN, Lin TL, Dunn P, et al. Heterogeneous patterns of FLT3 Asp (835) mutations in relapsed de novo acute myeloid leukemia: a comparative analysis of 120 paired diagnostic and relapse bone marrow samples. Clin Cancer Res 2004; 10:1326-32. 11. Abu-Duhier FM, Goodeve AC, Wilson GA, Care RS, Peake IR, Reilly JT. Identification of novel FLT-3 Asp835 mutations in adult acute myeloid leukaemia. Br J Haematol 2001;113:983-8.
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