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환경기술개발사업최종보고서 초록 1. 최종보고서제출서 08 년도환경기술개발사업에의하여완료한 골프장의화학농약저감을위한 IPM 모 델개발에관한연구 의최종보고서를첨부와같이제출합니다. 첨부 : 1. 최종보고서 10부. 2. 보고서내용이수록된 CD 1개. 3. 자체평가의견서 ( 주관연구기관, 참여기업 ) 각 1부. 4. 연구성과활용계획서 1부. 5. 기술개발성과확약서 ( 참여기업대표 ) 1부. 2008 년 3 월 31 일 주관연구기관 : ( 주 ) 그린바이오텍 연구책임자 : 이재호 ( 인 ) 주관연구기관장 : 이재호직인 환경부장관 귀하 - 1 -

제출문 환경부장관귀하 본보고서를 골프장의화학농약저감을위한 IPM 모델개발에관한연 구 과제 ( 세부 ( 위탁 ) 과제 화학농약저감을위한친환경 IPM 체계확립에관 한연구 ) 의보고서로제출합니다. 2008 년 3 월 31 일 주관연구기관명 : ( 주 ) 그린바이오텍 연구책임자 : 이재호연구원 : 신택수 : 김봉수 : 정우철 : 임재성 : 하병덕 : 서효진 : 원석민 : 황순진 ( 세부 ) 위탁연구기관명 : ( 재 ) 서울시립대학교산학협력 ( 세부 ) 위탁연구책임자 : 김진원연구원 : 김지성 : 전봉관 - 1 -

과제번호 021-071-051 연구사업명 대분야명 중분야명 연구개발과제명 국문명 영문명 연구책임자이재호 연구기관명및소속부서명 해당단계연구기간 보고서초록 07/04/02-08/03/31 차세대핵심환경기술개발사업 친환경소재 제품 환경오염유발물질대체물질 ( 소재 ) 개발 구분 2 차년도 / 2 년도 골프장의화학농약저감을위한환경친화형 IPM 기술개발 Development of IPM for reducing chemical pesticide in a golf course 해당단계참여연구원수 총연구기간참여연구원수 ( 주 ) 그린바이오텍부설생명공학연구소 총 : 12 명내부 : 12 명외부 : 0 명총 : 21 명내부 : 21 명외부 : 0 명 해당단계연구개발비 총연구개발비 정부 : 기업 : 계 : 정부 : 기업 : 계 : 참여기업명 ( 주 ) 그린바이오텍 국제공동연구상대국명 : 상대국연구기관명 : 191,000 천원 64,000 천원 255,000 천원 410,000 천원 137,000 천원 547,000 천원 연구기관명 : ( 재 ) 서울시립대학교위탁연구연구책임자 : 김진원산학협력단보고서요약 ( 연구개발결과를중심으로개조식 500 자이내 ) 128 면수 상업적골프장을포함한잔디식재지역에서의길항미생물제의적용 1. 길항미생물제제를이용하여라이족토니아마름병, 피시움마름병, 갈색잎마름병, 동전마름병등의난방제성주요잔디병을효과적으로방제 2. 화학농약의사용량을목표인 30% 에서 50% 이상으로대폭감소 길항미생물제제의사용을통한현장관리자의인식변화 1. 기존잔디관리용미생물제제의불신을해소. 2. 사용편리성의제공을통해길항미생물제의수요촉진 길항미생물제제의상품화추진 1. Bacillus subtilis CJ-9, Bacillus subtilis EW42-1 두균주의미생물농약등록추진 2. 길항미생물혼용제제의비료제품공급 ( 상품명 : 트리코골드, 바이오믹스골드 ) 길항미생물제의타작물적용을통한부가가치의향상 한글길항미생물, 잔디병. 친환경, 종합적방제, 생물농약색인어 ( 각 5개이상 ) Antagonistic microorganism. turf disease, eco-friendly, IPM, 영어 Biological control - 2 -

요약문 Ⅰ. 제목 : 골프장의화학농약저감을위한 IPM 모델개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성화학농약에의존한골프장의잔디관리는환경오염, 인축독성, 저항성병원균의발생등주변생태계에악영향을끼치므로, 이를해결하기위한환경친화적인방제법의개발이필요하다. 길항미생물을이용한생물학적방제는그대안으로높은가능성을가지지만, 골프장에적용되기에는관리자의인식부족, 제품의불신등해결해야할과제가많으므로본연구과제는경쟁력있는생물농약과골프장의화학농약저감을위한 IPM 모델을개발함으로써골프장에생물학적방제법이적용되게하는것에목적이있다. Ⅲ. 연구개발의내용및범위 1. 기존길항미생물제제의개선위한연구 (1) 길항미생물제제의배양수율향상을위한연구 (2) 길항미생물제제의제형보완연구 (3) 효력증가를위한첨가제의선발과적용 2. 길항미생물제제의외부포장시험을통한효력검정 3. 길항미생물제제의상업골프장적용을통한효력의검정및 IPM 모델개발 (1) 길항미생물제제의현장시험결과 (2) 길항미생물제를이용한 IPM 모델의구축및적용 4, 길항미생물제제의잔디외타작물적용 (1) 균주의항균활성검정 (2) 타작물에대한적용확대시험 5. 미생물농약등록추진 - 3 -

Ⅳ. 연구개발결과 1. 기존길항미생물제제의개선위한연구 (1) 길항미생물제제의배양수율향상을위한연구 Bacillus subtilis GB-0365, B. subtilis EW42-1, B. subtilis CJ-9 3종의세균은선행연구에서개발한 50lscale 의액상배양조건을응용하여기존의불안정한 5,000l 이상규모의대량배양 scale 의조건을탐색하였다. 수율은 16.0% 이상향상되었고, 소요시간은 6시간이상단축되어인건비및배양조가동경비등이절약되어원가의감소가이루어졌다. Trichoderma harzianum GBF-0208 은선행연구에서개발한액상배양의불안정성을보완하고자고체배양조건을탐색하였으며, 이를통해 1년경시안정성테스트에서도 1.0E+08 cfu/g 이상의안정성을가진제품을얻을수있게되었다. (2) 길항미생물제제의제형보완연구기존액상수화제의단점인큰부피의개선을위해수화제를개발하였고, 현장적용시경시안정성불안과노즐의막힘등과같은문제가생기지않도록연구하였다. 에어제트밀 (Airjetmill) 을이용하여입도를 10μm이하로낮추어노즐막힘문제를해결하였고, carrier 선발과정에서제올라이트를이용하여높은경시안정성을획득하였다. 액상수화제의건조과정은경제성을고려하여 Spray Drying이가장적합한것으로생각된다. 이밖에관리의편의와방제효력향상을고려하여통기와배토작업시동반처리할수있는 TAC(topdressing Aeration Core) 제형을개발하였고, 입제를추가개발하여처리방법의다양성을획득하였다. (3) 효력증가를위한첨가제의선발과적용미생물제제의단점을보완하고, 효력을증가시키기위한일종의 synergist 로써현재농업에서많이이용되고있는천연물을첨가하였다. 천연물은생리활성작용과비료효과, 면역성강화등의작용을하는것으로미생물과함께처리되었을때더욱높은효과를얻을수있었다. 2. 길항미생물제제의외부포장시험을통한효력검정. 배양및제형, 효력증진을위한연구결과얻어진결과물들을외부포장시험을통해서효력검정하였다. 라이족토니아마름병과브라운패취대상실험에서새롭게보완된길항미생물제제가기존길항미생물제제에비해높은효과를보였고, 골프장의예비묘포지에서실시된 TAC 제형의처리실험에서높은생육촉진 - 4 -

와병방제효과를거둘수있었다. 3. 길항미생물제제의상업골프장적용을통한효력의검정및 IPM 모델개발 (1) 길항미생물제제의현장시험결과 1차년도에는경기도파주의 3홀미니골프장 3곳, 춘천한화제이드팰리스 GC 등에서실험을실시하였고, 2차년도에는경기도파주서서울 CC와홍천비발디파크, 춘천한화제이드팰리스 GC에서상업골프장을대상으로길항미생물제제의생물학적방제실험을실시하였다. 실험을실시한모든지역에서관행관리와비교하여효과적으로병을방제할수있었고, 화학농약을 30% 이상저감하였다. (2) 길항미생물제를이용한 IPM 모델의구축및적용 1차년도의현장적용시험결과와현장관리자들과의협의를통해길항미생물을이용한 IPM 모델을구축하였고, 이를 2차년도현장시험에적용하였다. 적용결과높은방제효과를얻을수있었고, 2차년도의적용에따른효과와문제점을이용하여 2건의 IPM 모델을개발하고이를추후길항미생물제제의상업화와보급에적용하고자한다. 4, 길항미생물제제의잔디외타작물적용 (1) 균주의항균활성검정 Bacillus subtilis GB-0365 를대상으로각종작물에병을일으키는병원균에대해항균활성을검정하였고, 이중잿빛곰팡이병, 입고병, 푸른곰팡이병, 모잘록병, 잘록병등을일으키는병원균에대해높은항균활성결과를얻을수있었다. (2) 타작물에대한적용확대시험벼, 토마토, 인삼등에대해잿빛곰팡이병, 역병, 점무늬병, 잘록병, 입집무늬마름병등 5가지병해에대해방제효과를검정하고, 이중벼에발생하는잎집무늬마름병, 잘록병과인삼에발생하는잿빛곰팡이병, 잘록병, 점무늬병, 토마토의잿빛곰팡이병방제효과를확인하였다. 5. 미생물농약등록추진 B. subtilis CJ-9과 B. subtilis EW42-1 의미생물농약등록을위해잔디의라이족토니아마름병과동전마름병의약효 약해에대한공공시험을진행하여무처리구대비방제가 50% 이상인미생물농약등록기준을상회하는방제효과를얻었다. 미생물농약에 - 5 -

대한독성시험을실시하여포유동물과환경에무해, 무독성인것으로판명되었 다. Ⅴ. 연구개발결과의활용계획 현재 B. subtilis CJ-9은공공약효 약해시험과자체시험을모두마치고, 독성시험결과포유동물과환경에무독 무해한것으로밝혀져 2008 년 3월말미생물농약등록신청준비중이다. 2008 년 9월중등록여부가판명되므로이후농약등록여부에따라 2009 년부터잔디라지패취방제제미생물농약으로판매할예정이다. B. subtilis EW42-1 은독성시험이진행중이고, 금년 2008 년에공공약효 약해시험을진행할예정이다. 결과가나오는 2009 년경에미생물농약등록을추진할예정이고, 역시잔디관리용미생물농약으로판매할예정이다. 현재계속적으로기등록된생물농약과길항미생물제제로시장판매가이루어지고있지만, 지금추진중인생물농약 2품이등록된이후, 액상수화제에서수화제, 입제로생물농약품목을확대할예정이며, 당사의잔디관리용생물농약등록과제품개발이완료되는시점인 2010 년부터는골프장의친환경종합관리전문회사로거듭날예정이다. - 6 -

S U M M A R Y The microbial pesticides, an alternative promising bio-pesticide, can exchange the practice pest control methods into eco-friendly one as well as reduce the chemical pesticide usage. Up to now, microbial pesticides have not been widely used in golf course, because golf course managers have not trust and understood microbial pesticides. Also, microbial pesticides had been inconvenient to use in the golf course. In this study, we improved existing microbial pesticides by increasing mass of culture, diversifying formualtion of goods, and reinforcing antagonistic effect against turf diseases. And we applied these microbial pesticides to golf course for establishing IPM model. We expect that improved microbial pesticides and IPM model will contribue to the spread of microbial pesticides in the golf courses. - 7 -

C O N T E N T S Chaper 1. Introduction Ⅰ. Purpose...11 Ⅱ. Necessity...11 Ⅲ. Research Range...13 Chapter 2. Current Status of the Technology Ⅰ. Abroad...15 Ⅱ. Domestic...16 Ⅲ. Creativity of the other Technology...17 Chapter 3. Research Contents and results Ⅰ. Optimization of Fermentation Condition...19 Ⅱ. Optimization of Formulation Process...30 Ⅲ. Field Assessment of Improved Microbial Pesticides...52 Ⅳ. Development of IPM for reducing chemical pesticide dosage in a golf course...56 Ⅴ. Tests for Registration of Microbial Pestcides...106 Ⅵ. Field Trials against Other Agricultural Crop Diseases...118 Chapter 4. Discussion and Conclusion...127 Chapter 5. Using Plans of the Results of Studies...129 Chpater 6. References...133-8 -

목 차 제1장연구개발과제의개요제1절연구개발의목적...11 제2절연구개발의필요성...11 제3절연구개발의범위...13 제2장국내외기술개발현황제1절국외...15 제2절국내...16 제3절국내외유사기술과의차별성...17 제3장연구개발수행내용및결과제1절길항미생물의배양조건개선...19 제2절길항미생물의제형개선및신제형개발...30 제3절길항미생물제제의방제효과검정시험...52 제4절 IPM 모델의개발과상업골프장적용시험...56 제5절미생물농약품목등록시험...106 제6절개발미생물농약의타작물적용확대를위한연구...118 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 1 절 1 차년도연구목표및달성도...127 제 2 절 2 차년도연구목표및달성도...128 제 5 장연구개발결과의활용계획 제1절연구개발사업성과의사업화가능성...129 제2절추가연구의필요성및타연구에의응용가능성...130 제3절향후해당기술을이용한기업화추진방안...131 제 6 장참고문헌...133-9 -

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제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적 골프에대한국민관심의증가와골프대중화로인해현재국내골프장의수는 2008 년건설중인골프장까지합쳐약 300 개에이른다. 골프장은잔디의원활한관리를위해화학농약과비료를사용하고있으며, 이들이부작용을일으킬경우주변생태계에큰위협이아닐수없다. 특히, 수도권의상수원내에분포하고있는골프장의경우화학농약이포함된방류수로인한수질오염이발생할경우돌이킬수없는큰재앙이될수도있다. 이에정부는맹독성 고독성농약에대한사용을규제하고있지만, 일반농약의사용량이줄어들지않고있고, 골프장에따라서는오히려늘어나기도하여큰문제가되고있다. 또한, 화학농약의지속적인사용은저항성병원균의발현으로더욱많은양의화학농약혹은고독성농약의사용을요구하게하고, 비선택적인독성으로인축독성을일으키며, 토양혹은지하수에잔류하여주변생태계를교란시킬수있다. 이에화학농약의사용을저감할수있는방안이필요하다. 길항미생물제제, 특히미생물농약은화학농약을대체할수있는대안으로가장유력한후보중하나이다. 길항미생물자체혹은그들이생산하는항균활성물질을이용한미생물농약은화학농약의단점인저항성병원균의발현, 인축독성, 환경오염등에서비교적자유로우며, 높은방제효과를기대할수있다. 그러나, 기존미생물농약은코스관리자들의인식부족과제품의효력에대한불신, 코스관리여건상의문제등으로현장에서널리사용되지못하고있다. 현장으로의진입장벽을넘기위해본연구과제에서는기존연구를통해개발된잔디병방제용길항미생물제제를이용하여현장사용이원활히이루어지도록제품가치를향상시키고, 적용가능한종합관리체계 (Intergrated Pest Managment), IPM 모델을개발하여골프장의화학농약사용량을저감하고자한다. 제 2 절연구개발의필요성 1. 골프장의관리특성과문제점골프장의잔디는한번조성이되면특별한사유가없는경우별도의갱신없이지속적으로한곳에서재배되기때문에유기물의축적층인탯취층 (Thatch layer) 이생겨나고, 토양의상태가불량하며, 토양병원균의밀도가해마다증가하는악조건이계속된다. 하지만, 골프장의잔 - 11 -

디는일반농작물과다르게수확을목적으로하는것이아닌경기의플레이그라운드로써이용되므로항상최상의상태를유지하기위해빈번한예초와화학농약, 화학비료등의처리가계속된다. 이는당장의잔디생육과병방제, 품질유지에는도움이될지모르지만, 토양의산성화, 저항성병원균의증가, 유용미생물 천적의감소로인한병의대발생과이로인한화학농약사용량증가등많은문제점에노출되어있다. 그럼에도불구하고관리자들은기존의관행관리외에특별한대안이제공되지않는상황에서기존관행관리의유혹을벗어나기어려운실정이다. 2. 길항미생물제제의개발현황 2007 년 12월기준으로국내등록된미생물농약은총 28종으로살균제가 14종, 살충제가 Bt 제를포함하여 14종이다. 이외에수많은길항미생물제제가비료, 미량요소, 생장조절제형태로판매되고있다. 하지만국내의미생물농약시장은 2005 년도기준매출액이 1360( 백만원 ) 으로전체농약시장의 0.14% 수준으로대단히미약하며, 기타의길항미생물제제의판매액을추정한금액인약 100 억원을더하더라도규모면에서걸음마수준을벗어나지못하고있는실정이다. 이는국내사용자들이미생물농약을화학농약에비해사용이까다롭고약효가낮아서자주살포해야하며, 제품선택의폭이좁다는등의기본적인요인에의해외면하기때문이고, 그밖에도정부의지원이천적사업과비교하여미흡하기때문에미생물농약의초기시장정착이어렵다는것도원인으로추정되고있다. 3. 길항미생물제제의사용상의문제점화학농약의부작용이심각한문제로대두되기훨씬전부터미생물을이용한식물병방제가시도되었지만실용화과정에서쉽게해결되지않는원가절감, 제형화, 충분한현장시험, 생물농약등록등의문제때문에잔디를포함한일반작물에보급이활성화되지못하고있다. 화학농약의빠르고정확한효과를기대하는관리자들에게길항미생물을이용한미생물농약은불안감을주었고, 이는잔디병방제에있어서미생물농약의적용을어렵게하였다. 또한, 미생물농약은작물의생육기간언제나처리할수없고, 농약처럼간단한제형을개발하는것이어렵고, 적당부위에미생물을도입하는것또한쉽지않은단점이있다. 길항미생물제제는기존의관행관리에비해관리자들의신뢰와인식이낮다. 지금까지사용되어온화학농약위주의관리체계를변화시키기위해서는길항미생물제제의사용에따른기대효과와사용상의이점, 타자재와의차별성등에대한충분한자료와현장적용결과가제공되어야한다. 하지만, 기존의길항미생물제제의경우에는이를충족시키기에부족한면이많았고, 이런문제를해결하기위한충분한지원과연구가부족하였다. 4. 길항미생물제제의실용화를위한방안 기존길항미생물제제의실용화를위해서는비료또는미량요소, 생장조절제등애매한 농용자재로판매되며저급자재로인식되었던기존의이미지에서벗어나야한다. 본연구과제 - 12 -

에서는기존연구를통해개발된길항미생물제제중이미미생물농약으로등록이된 Bacillus subtilis GB-0365( 제품명 : 그린올 ) 외에두가지균주 Bacillus subtilis CJ-9, B. subtilis EW42-1 을각각잔디의라지패취와달라스팟을대상으로하는미생물농약으로등록하여병방제효과와성분의보증, 약해등의면에서시장의인식을받고자한다. 길항미생물은방제원리의특성상화학농약과비교하여단기간에병을방제하는효과는떨어질지모르지만예방적인측면과지속적인방제효과는뛰어나다. 계속적인화학농약의사용에따른피해를줄이고, 지속가능한방제전략을구축하기위해골프장잔디의재배학적특성과병발생과정을면밀히파악하여경종적 생물학적 화학적방제법을모두이용한 IPM 모델을개발함으로써길항미생물제제의사용을늘릴수있을것이다. 이는단순히미생물만을이용하여병을방제하는것에대해신뢰를보일수없었던관리자들로하여금미생물농약을도입할수있게해줄뿐만아니라, 적용사례의축적을통해관리자들의길항미생물제제에대한인식의변화를유도할수있을것이다. 또한, 관리자들의신뢰획득을위한연구의일환으로미생물제제의현장적용에따른효과의검정을위한측정기준을다각화하고자한다. 미생물제제의처리전후의병원균의밀도감소효과검정, 잔디밀도, 엽록소함량, 탯취축적량감소효과등의수치화된데이터의제공을통해현장에서더욱신뢰할수있는제품과연구가될수있도록하고자한다. 또한, 잔디의주요병방제를위해개발한본길항미생물제제는타작물의유사병원균에도방제효과가있으리라기대되는만큼이를검정하고제품화함으로써미생물농약의등록과개발에필요한비용을줄여제품의경제성을향상시킴으로써실용성을증대시킬수있다. 제 3 절연구개발의범위 1. 연구개발의방향과수행방법본연구과제는기존실용화과제를통해개발된미생물제제의시장성확대와신뢰성획득에초점을두고있다. 제품의시장성확대를위해원가절감과제형의개선을연구하였고, 관리자들의신뢰성제고를위해서상업용골프장의실제코스에서미생물제제를적용하여병방제와화학농약사용량감소효과를중점적으로검정하였고, 미생물제제의미생물농약으로의등록을수행하였다. 또한, 본연구의제품의사용지침이되고, 향후유사연구시참고가될수있도록 골프장의화학농약저감을위한 IPM 모델 을개발하였다. 본연구는제품의제조와제형의개선, 생물농약등록과정, 시제품의생산등은주관기관인 ( 주 ) 그린바이오텍에서수행하고, 현장시험을통해얻고자하는미생물제제의병방제효과와화학농약감소효과, 잔디품질개선효과등에대한다각적인접근은위탁연구기관인서울시립대학측과주관기관인 ( 주 ) 그린바이오텍이공동으로수행하였다. 2. 연구개발의상세내용및범위 - 13 -

가. 길항미생물의배양조건개선을통한경제성향상 (1) 기존개발된길항미생물제제의원가절감및제품안정성향상을위해배양조건을개선 (2) 액상배양과정에서의교반속도와산소공급량등의배양조건을조정하여배양수율과배양시간소요량을개선 (3) 기존보다배양규모를증량하여제품생산량을늘리고원가를절감하여경제성을향상 (4) 제품의경시안정성을향상시키기위한기존배양방법의개선 나. 길항미생물의제형개선및신제형개발 (1) 기존미생물제형의단점인큰부피를개선하기위한제형의변경 (2) 잔디의생육방식과경종적관리법에대한고찰을통해기존제형을탈피 (3) 노즐의막힘같은수화제의물리적단점을해결하기위한분쇄공정도입 다. 길항미생물제제의방제효과검정시험 (1) 연구개발을통해개선된길항미생물제제의외부포장시험검정 (2) IPM 모델의수립을위한다양한조건아래서의길항미생물제제의효력검정결과수집 라. IPM 모델의개발과상업골프장적용시험 (1) 파 3홀의소규모골프장적용을통해병방제효과를검정 (2) 상업골프장대상으로길항미생물제제의도입을통한병방제효과의검정 (3) IPM 모델의수립을위한골프장의주요병해에대한방제효과시험 (4) 화학농약사용량의측정을통한농약사용량감소효과의검정 (5) 길항미생물제제의사용을통한토양생태계의회복과잔디품질향상효과검정 (6) 상업용골프장적용 IPM 모델의전반적인평가 마. 미생물농약품목등록시험 (1) 길항미생물균주의생물농약등록을위한약효 약해시험 (2) 미생물농약등록을위한원제와제품의독성시험 바. 개발미생물농약의타작물적용확대를위한연구 (1) 기타병원균에대한항균활성검정 (2) 타작물로의적용확대를통한미생물농약의가치상승효과연구 - 14 -

제 2 장국내외기술개발현황 제 1 절국외 1. 1926 년유럽에서최초로길항미생물을이용하여병원균생장억제효과를얻은이후근래에미생물농약에대한연구가급격히이루어지고있다. 2. 1960 년대에는 European Spruce sawfly( 잎벌류 ) 와나방류를각각바이러스 (virus) 와 Bt(Bacillus thuringiensis) 를이용하여방제에성공하였고, 1991 년도에는식물유도저항성미생물을종자처리제로개발하여식물병의발생을억제하는수준에도달하였다. 3. 잔디병해의생물학적방제연구사례로는온실실험에서 Serratia marcescens 와 X anthomonas maltophilia 의섬머패취 (Summer Patch) 방제효과가보고되었으며, 온실과포장시험에서 Bacillus subtilis와 Enterobacter cloacae 의섬머패취방제효과가 Thompson 등 (1996) 에의해서보고되었다. 4. 일본이시오까골프장에서는 1996 년과 1997 년 Bacillus spp., Azospirillum brasilense, Pseudomonas aureofaciens 등의미생물을이용한골프장잔디의종합적방제관리시험을실시한결과유효미생물살포에의한 23% 의농약사용량절감효과가있는것으로보고하였다. 5. 제품화는비교적초기단계에머무르고있다. 미국에서는 Trichoderma harzianum T-22 균주가골프장용미생물농약으로서최초로 EPA에등록되어 Biowork, Inc, 에서이길항곰팡이을주성분으로하는 TurfShieldR 라는제품을출시하여판매하고있다. 이밖에 Bacillus subtilis 균주를주성분으로한 Growth Products 사의 CompanionR, Pseudomonas aureofaciens 를이용한 Eco Soil Systems, Inc. 의 Spot-lessR 정도가알려져있다. 6. 미생물농약에서제제화연구는매우중요하나국내뿐만아니라국외도화학농약에비하여제제화연구가매우취약한형편이다. 예를들어, Trichoderma harzianum 을주성분으로한미국의대표적인두제품 Biowork, Inc. 의 T-22 Planter BoxR와 JH Biotech, Inc. 의 Promot PlusR를본연구진이입수하여입도와수화성등의물리적성질을조사한결과국내제품에비해서그다지우수하지않은것으로나타났다. 7. 다수의기업이미생물농약을생산하고있으나효율적인배양기술과설비를가지고있지못한기업은도산하였다. 대표적인예로 Evans사를들수있다. 8. 1975 년미국에서처음으로미생물농약에대한관련법규가제정된이래영국 (1980 년 ), 프랑스 (1980 년 ), 독일 (1983 년 ), 캐나다 (1986 년 ), 일본 (1997 년 ), 대한민국 (2000 년 ) 등이관련법규정비에뒤따르고있으며, 세계각국에서미생물농약을포함하는길항미생물제제가등록, 판매되고있다. 9. 2006 년해외미생물농약시장의규모는약 260 백만달러로추정되고있으며 (CPL Business - 15 -

Consultants, 2006), 이중 Bt 제가 159 백만달러로대부분을차지하고있다. 앞으로해외미생 물농약의시장규모는각국의화학농약사용저감정책에따라확장되어 2014 년에는약 330-400 백만달러로성장할것으로예상되고있다. 제 2 절국내 1. 인삼연초연구소에서는 1980 년대인삼뿌리썩음병방제용으로개발한 3종의곰팡이와 3종의세균의복합미생물제제를 1995 년에폿트 (Pot) 와묘포 (nursery) 에서잔디를대상으로적용확대시험한결과피시움마름병 (Pythium Blight) 의방제와탯취층 (Thatch Layer) 의분해효과를얻었다. 2. 충북대학교정등 (1998) 은폿트시험에서 Gliocladium virens와 Pseudomonas spp. 의브라운패취 (Brown Patch) 와라지패취 (Large Patch) 의방제효과가능성을보고하였다. 3. 황등 (1996) 은유용미생물을이용한골프장잔디의관리를통해잔디의품질향상, 탯취축적감소, 주요병발생등의감소효과를얻었다. 4. 그린바이오텍은국내최초로 Bacillus subtilis GB-0365 균주를이용하여잔디의피시움마름병을대상으로미생물농약을등록하여현재판매중이며, Bacillus subtilis spp. 를이용하여잔디의라지패취와달라스팟을대상으로미생물농약등록진행중이다. 5. 현재본사를비롯한몇몇회사에서는미생물농약으로잔디병방제용길항미생물제제를판매하고있지만, 대다수영세한규모의회사에서는정식등록제품이아닌비료형태의토양미생물제제로제품을등록하고판매하고있다. 6. 2003 년 3월첫제품이미생물농약으로등록된이후 2007 년까지 15원제, 28품목이미생물농약으로정식등록되어판매중이고, 농약효과가있다고주장하는 100 여종이상의미생물자재가판매되고있다. 7. 현재국내미생물제는 14종의살균제와 14종의살균제가미생물농약으로등록되어있고, 이중 4종의살균제가잔디의브라운패취, 라지패취, 피시움마름병등의주요병해를대상으로하고있다. 8. 살균제는세균을원제로사용한제품이대다수를이루고있으며, 흰가루의중복기생균을이용한큐팩트같은균주가곰팡이를원제로하여개발되어있다. 9. 국내미생물농약시장은 2005 년도기준매출액이 13.6 억원으로전체농약시장의 0.14% 수준으로대단히미약하며, 정식으로미생물농약등록이되지않은토양미생물제제의판매추정액인 100 억원을합하여도아직화학농약의매출액과비교하여걸음마수준이라고할수있다. - 16 -

제 3 절국내외유사기술과의차별성 (1) 현재국내에약 50여개이상의미생물제제기업이있지만, 대부분영세성을면치못하는규모이며, 자체배양설비및배양기술을가지고있지못하는구조적으로취약한상황에있다. (2) 동부하이텍, 한국삼공, 경농, LG 등의화학농약을생산하고있는일부대기업및중견기업의경우미생물농약의등록작업에는참여하고있지만미생물균주의자체개발에는몇몇경우를제외하고는소극적인상황으로미생물농약의개발과보급에대한투자가이루어지지않고있다. (3) 미생물균주를자체개발한대부분의국내기업은현재배양기술및배양시설을가지고있지않은상황으로미생물농약의보급과경제성향상을위한배양원가절감과배양기술의개발이어려워미생물농약경쟁력향상에어려움이있다. (4) 당사는그동안많은연구를통해자체개발균주를다량확보하고있고, 대량혹은시험생산을진행할수있는배양시설을보유하였으며, 1994 년창사이래축적된배양기술과노하우를가지고있다. 이는생산단가를크게낮출수있는고활성및고농도배양기술을통해제품의가격경쟁력을확보할수있다. (5) 미생물을이용한골프장의잔디관리면에있어 10년이상의경력과제품판매실적, 각지역의코스관리자들과의교류는미생물농약이상품화되었을경우즉각적인매출로연결시킬수있는시장확보에매우유리하다. (6) 다른연구기관과기업의경우주로한집단의길항미생물에대해서만연구하고있지만, 본연구기관은그램양성 (Gram(+)) 및그램음성 (Gram(-)) 세균, 방선균, 곰팡이등다양한그룹의미생물에대한배양기술과제제화기술을보유하였으므로향후관련연구에지속적으로효과적으로대응할수있다. (7) 미생물농약의제형과제제화개발및개선에있어본연구과제의지원을통해구매한에어제트밀 (airjetmill) 과교반기 (Mixer) 를보유하고있으며. 다양한자체보유설비를통해길항미생물의산업화에가장큰단점에하나인제형의물리성을해결하고, 제형을다양화할수있다. - 17 -

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제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절길항미생물의배양조건개선 1. 대량생산배양공정의확립 가. Bacillus subtilis GB-0365 의최적생산조건 선행연구에서확인한최적배양조건을이용하여배양 scale 을증대시켜 500L fermenter 를종균배양조로이용하고 5,000L-fermenter 를 main fermenter 로하여 plant 설비에서의 Bacillus subtilis GB-0365 의포자및활성을높이기위한수율향상을도모하였다. Plant 설비에서배지조성성분들의균체생육과포자형성에미치는영향과 RPM, Aeration, DO level, initial ph 및배양중 ph변화에따른영향들을검토하였다. 또한제품화를위한경제성검토를위하여배지성분들의원가분석을하였으며이에따른제품의품질변화에대해검토하였다. Bacillus subtilis GB-0365 의최적배양조건을검토한결과 carbon source 로 corn starch 1.0%(w/v) 가활성물질생산및균체생육에가장좋은효과를나타내었으며 nitrogen source 로는 soybean meal과 yeast extract 가각각 0.8%(w/v), 0.5%(w/v) 농도에서가장효과가좋은것으로나타났다. < 표 3.1> Bacillus subtilis GB-0365 의최적생산조건 배지성분명 농도 (g/l) Corn starch Soybean meal Yeast extract MgSO 4 7H 2 O (NH 4 ) 2 SO 4 KH 2 PO 4 10g/L 8g/L 5g/L 1.5g/L 2.5g/L 3g/L RPM 100-120, aeration : 0.5-0.7vvm, Temp. 30 Cultivation time 24hrs, DO and ph non control - 19 -

5L jar fermenter 에서검토한최적배양조건을이용하여 Scale up하여종균배양 fermenter 로 500L-fermenter 를사용하였으며 main fermenter 로 5,000L-fermenter 를이용하였다. Plant설비에서멸균의공정의최적화및 DO level, initial ph, RPM, Aeration 등의조건변화에따른생산수율 ( 균체수, 포자수및활성물질생산성 ) 향상시키기위한최적조건을검토하였다. < 그림 3.1> 500L jar fermenter system - 20 -

< 표 3.2> 500L jar fermenter system 배양조건 항목 조건 Fermenter volume 500l Working volume 300l Cultivation time 24 hrs Inoculum volume 10l(3.0%) ph control Not Temperature control 30± 0.3 Aeration rate 100-250l/min Agitation speed 120-200rpm Foam control 10-20% silicone oil Dissolved oxygen control 2.0-20ppm Sterilization condition 121-123, 30min, steam directed injection < 그림 3.2> 5,000L-fermentor system - 21 -

< 표 3.3> 5 ton jar fermenter system 배양조건 항목 조건 Fermenter volume 5.0 ton Working volume 2.0 ton Cultivation time 24 hrs Inoculum volume 60l(3.0%) ph control Not Temperature control 30± 0.3 Aeration rate 500-1500l/min Agitation speed 80-100rpm Foam control 10-20% silicone oil Dissolved oxygen control 2.0-20ppm Sterilization condition 121-123, 40min, steam directed injection - 22 -

나. 실험의세부공정및내용균체의성장속도는 small scale 에서는배양 12hrs 에 stationary phase에도달하여가장높은균체량을생산하였으나 5,000L-fermenter 를이용하여배양한결과약 4시간정도배양시간이단축되는배양 8시간에서최대치를나타내었고 ( 이는생산비용을낮추는효과가있어결과적으로제품의원가절감효과를기대할수있다.) 균체량은 O.D 값을기준으로 9.52 을나타내었다. 배양중균체수율을향상시키기위하여 agitation speed 를초기 80rpm 에서균체의 lag phase가종료되는시점인배양 3hrs이경과하였을때 Dissolve oxygen value를향상시키기위해 100rpm 으로상향조정하였으며 aeration rate 값도 900 L/min에서 1200 L/min로증대시켜다. 일반적으로 Bacillus subtilis는배양중 exponential phase에진입할시점에서다량의 oxygen 를요구하는특성이있으므로균체의수율향상을위해서는이러한 factor 의조절이필수적이다. LB agar plate 30, rotary shaking incubater(130rpm) 24 시간배양 1 차종균플라스크 (30 ml /500 ml ) 30, rotary shaking incubater(130rpm) 12 시간배양 2 차종균플라스크 (1l/5l) 30, rotary shaking incubater(130rpm) 12 시간배양 3 차종균플라스크 (40l/50l) 본배양 (2ton/5ton) 30, aeration=0.5vvm, Agit= 150rpm 12 시간배양 30, aeration=0.4-0.7vvm, Agit= 80-110rpm ph control not, inside pressure=0.5-0.7kgf/ cm2 Antifoamer=10% silicone oil(dow corning 사 ) 14-20 시간배양 배양종료 < 그림 3.3> 5,000L-fermenter 배양공정도 - 23 -

0.8 120 2000 200 100 Agit, rpm 1800 Inside Presure kgf/cm 2 0.7 0.6 0.5 Agitation Speed, rpm 80 60 40 20 Inside Pree., kgf/cm2 Aeration rate, L/min 1600 1400 1200 1000 800 Aeration Rate, L/min 150 100 50 Bio-assy Activity, % 600 0.4 0 0 20 10.0 16 9.5 14 Optical Density, 600nm 10 9 8 7 6 5 4 3 2 ph DO, ppm 7.0 O.D.,600nm 1 Activity, % 6.5 0 2 4 6 8 10 12 14 Time, hrs 9.0 8.5 8.0 7.5 ph 12 10 8 6 4 2 Dissolved Oxygen, ppm < 그림 3.4> 5,000L-fermenter 에서의 Bacillus subtilis GB-0365 의 profile 다. 배양조건검토결과 (Spore and active production yield up-grade) 배양 3hrs 이후에균체의생육이대수기에도달하여급격하게균체수가증대되었으며 6hrs 이 경과하였을때 maxium growth rate 를나타내었고 8hrs 경과하였을때균체의성장이둔화되는 stationary phase 에도달하여선행연구에서나타난배양의 profile 과비교하여약 6hrs 간정 - 24 -

도빠른진행속도를나타내었다. 포자의형성이시작된시점도배양 12hrs 에서시작되어 4-6hrs 에포자형성율이 95% 를나타내었으며이는 small sacle 에서의경과시간보다 8-6hrs 이단축된것이며이는향후생산성분석에서중요한장점으로원가절감의한요소로평가될수있다. 생균수는 6.7E+9cfu/ml 로나타났으며이는 lab scale 에서의수율과비교하여 16.0% 의향상효과를나타내었다. 배양중활성물질의 activity가배양 5hrs 과 10hrs 전후에서감소하는경향이나타나는데이는배양중발생하는 foam을억제하기위해투여한 antifoam(silicon oil) 의영향으로판단된다. 향후에균체의물질생산에적합한 antifoam 의선별연구가수행되어야한다. 5,000L-fermenter 를이용하여배양조건을검토한결과배양수율이 16.0% 향상되었으며이를제품생산원가에적용하여수율향상된것과 Scale-up 했을경우절감되는비용을환산하였을경우아래표와같이나타났다. 또한 Bacillus subtilis EW42-1 과 Bacillus subtilis cj-9의경우도유사한결과를나타내었으며과도한 foam 의발생에따른 antifoam 의과다한사용이수율의향상에 negative effect 를나타내는것으로나타나향후에 antifoam 종류의선별시험이수행되어야할것으로판단되며생산공정상의보완시험이수행된다면원가절감요인이추가적으로발생할것으로판단된다. Bacillus subtilis GB-0365 와동일한균종인 Bacillus subtilis EW42-1 과 Bacillus subtilis cj-9 의경우 scale up 조건이유사하게나타났다. 또한 Bacillus subtilis GB0365, Bacillus subtilis cj-9과 Bacillus subtilis EW42-1의포자수율을높이기위해포자유도물질인 Dipicolinic acid 를각각 10ppm, 50ppm, 100ppm 의농도로배양시간에따른영향을검토하였다. Bacillus subtilis GB0365 의경우배양 8hrs 이경과될때 exponential phase에도달하여균체생육이종료되고 stationary phase로집입하는데생육이종료되는 8hrs-9hrs 사이에 50ppm 을처리하였을때포자전환율이 98% 이상으로효과가가장좋았으며최종포자수는 8.0E+9cfu/ml 로나타났다. Bacillus subtilis GB0365 의경우병원균에대한활성을나타내는물질이 surfactin 계열로 production type은 growth association type으로균체생육과 active product의생산곡선이동일한 type으로나타난다. surfactin 은계면활성능을갖는물질로배양중에발생하는 foam을제거하기위해 antifoam(silicon 계 ) 을과도하게처리할경우 active product의 production yield 가낮아지는현상이발생하였다. Active prodcut 의 production yield를높이고 foam발생을억제하기위한방법으로식물성오일류를적용하여 ( 콩기름 ) 을사용하여적용한결과 active product 의생산성에영향을주지않으면서 foam 을방지할수있는 2가지의효과를얻을수있었다. Bacillus subtilis cj-9의경우 exponential phase가 Bacillus subtilis GB0365 와동일한시간이 8hrs-9hrs 에서종료되었으며포자유도물질인 DPA 50ppm 을처리한결과유사한효과를얻을수있었다. 단, Bacillus subtilis cj-9과 EW42-1 경우 active product 가 surfactin 계열이아닌 antibiotics 로추정되며 Bacillus subtilis GB0365 와는달리 silicon 계의 antifoam 을처리하더라도생산수율이감소하는현상은나타나지않았다. - 25 -

< 표 3.4> 발효조 Scale 에따른배양추정원가비교 ( 단위 : 원 /l) 비용 Capacity(Ton) 5.0 ( 자체 ) 15.0 ( 외주 ) 30.0 ( 외주 ) 원재료비 1,095.0 1,095.0 1,095.0 직접노무비 485.8 - - 감가상각비및수용비 366.8 - - 외주가공비 ( 발효조임대 ) - 800.0 550.0 외주가공비 ( 농축 ) 320.0 - - 직접비용합계 2,267.6 1,895 1,645.0 간접비용 1,133.8 947.5 822.5 이윤 (30%) 1,020.4 852.8 320.8 총 계 4,421.8 3,695.3 2,788.3 위 < 표 3.4> 에서나타낸것과같이 scale up 을수행했을때수율이 16% 정도로소폭향상되더 라도 small scale 에서나타낸수율과동일하거나그이상의수율만나타난다면원가의절감효 과가보다높게나타난다. - 26 -

2. Trichoderma harzianum GBF-0208 대량생산최적화검토 선행연구결과에서 Trichoderma harzianum GBF-0208 균주의산업적으로적합한대량액상배지로서 Corn strach 0.5%, Glucose 2.0%, Yeast extract 0.5%, Corn steep liquor 0.5%, MnCl 2 0.03%, Sodium Molybdate 0.05% 를최종선발하여포자의수율을 2.0E+9cfu/ml 을얻었으나경시보존성에서낮은 longivity를나타내었다. 액상최적배양방법을이용하여초기포자수 2.0E+9cfu/ml 의 product 를 40 에서 8주간가혹경시시험을수행한결과 (1년경시보존가능성시험 ) 아래 < 그림3.5> 와같다. 2.00E+09 Spore count(cfu/ml) 1.50E+09 1.00E+09 5.00E+08 1.00E+05 0 10 20 30 40 50 60 Time(days) < 그림 3.5> Trichoderma harzianum GBF-0208 의 40 가혹시험시간에따른경시안정성 40 가혹시험에서 7일경과후에초기포자수의약 10% 정도만이회수되었으며 21일경과되었을때에는초기포자수의 1% 정도만이 viable counting 되었었다. 1년의경시보존성을판단할수있는 56일 (8주) 후에는 4.0E+5 CFU/ml 만이회수되어포자의경시안정성이매우낮은것으로나타났다. 곰팡이의경우액상배지에서다량의포자수를얻을수있으며안정성이높은경우도많으나 Trichoderma harzianum GBF-0208 균주의경우액상배양을할경우높은포자수에비해경시안정성이낮으므로고체배양을검토하는것이효율적인방법인것으로판단되었다. 많은선행연구에서곰팡이의경우고체배양을할경우포자의안정성이높고활성도 (germination rate, activity) 높게나타나는것으로보고되고있다. 위와같이경시안정성이낮은액상배양보다는활성과포자의안정성을확보하는방법으로고체배양을검토하였다. - 27 -

< 그림 3.6> Trichoderma harzianum GBF-0208 고체배양및건조시료 가. 배지조성및사용원료 Spec (1) 접종원 (Seed) 배지 : PDA(Potato dextrose agar) 배지 (2) 생산용배지 < 표 3,5> 생산용배지조성 조성질석미강흑설탕물 배합량 (1batch) 12.5 Kg 12.5 Kg 100 g 10.0 L ( 참고 ) 생산용배지의원료 Spec 질석 물리적특성 비중 ph EC 색상 입도 유효수분함량 0.07-0.18 6.5-7.5 0.05-0.14 골드 3.5-5.0 mm 20% 이상 주요화학성분 (%) SiO 2 Al 2O 3 Fe 2O 3 TiO 2 MgO CaO K 2O Water 39.5 12 7 1 23 1.5 2 12-28 -

미강 : 일반미강사용 흑설탕 : 일반시중에판매용흑설탕또는설탕사용 (3) 배양 ( 가 ) 접종원준비 1 PDA 배지에종균을배양 - Stock plate 에서 1 block 씩취하여 PDA 배지에계대배양한다. - 25 에서 5~6 일배양한다. 2 포자수거 - 18L 멸균수를준비 (Nalgene 10L 증류통이용, 각각의통에 9L씩멸균 ) 한다. - 2L 멸균수를준비 (1L flask에 500ml 씩분주하여멸균 ) 한다. - 준비된 stock plate에서배지자체를메스로적당히자른후준비된 500ml 멸균수가담긴 flask에담는다. - 25 shaking incubator 에 1시간정도 shaking하여포자를 PDA 배지로부터분리한다. - 2개의 flask의포자액만 (PDA배지잔유물제외 ) 을 9L 멸균수가담긴증류수통에분주한후골고루섞어준다. (10L 포자수거액 2통준비됨 ) - 이것을본배양의접종원으로사용한다. ( 나 ) 본배양 1 고체배지제조 - 미강 12.5kg 과질석 12.5kg 을잘섞은후, 100g 의흑설탕을녹인물 10L 를첨가하여 ribbon mixer 에서골고루혼합한다. 2 멸균 - Tray( 규격 : 44 44 15) 에혼합된배지조성물을 1.0kg 씩담는다. (35ea Tray) - 121, 1h 1회멸균한다. - 또다른멸균법으로간헐살균이가능하다. 살균은 8h 간격으로 80 40 80 40 로한다. 3 접종 - 멸균된고체배지에준비된접종원을 300~500ml/1tray 비율로접종한다. 이때작업은무균상자또는무균룸 (clean room) 을이용한다. - 접종완료후접종원과배지가골고루섞일수있도록접종 tray를 2~3 회흔들어준다. - 29 -

4 배양 (25, RH 70% 이상, 5-6day) - 접종이완료된고체배양상자를배양기에옮긴후배양한다. 배양기 ( 트리코전용배양기이용, 현재식품동에위치 ) 현재 2대사용가능 / 1대당 21 tray 배양가능 ( 그러나 17~18 개적당함 ) - 접종후 2일배양체가건조해있으면멸균수를약 300ml/tray 에공급하여준다. 또한배양체가골고루섞일수있도록배양체를골고루혼합시켜준다. - 배양 2일후부터아침 저녁으로항상배양상태를 check 하여주고통기가잘되도록하여준다. - 배양종료는배양체상부에트리코균주가골고루자라있는것을 1차기준으로한다. - 2차로상부하부의배양용기 3개를골라각각의용기로부터트리코배양체를 2g씩취해 20ml 멸균수에현탁한후에배양체를침전시키고상등액을 100 μl씩취하여 MFU를측정한다. - 검사결과 1.0 10^10 spore / g 이상이면배양을종료한다. - 주의사항 배양 1일후생육이활발히일어나면서높은열이발생하므로배양기온도를항시 check 하여온도조절이안될경우환기를시켜준도록한다. 습도조절은가습기를이용하여너무과습하지않게조절하여준다. 나. 배양조건검토결과 Trichoderma harzianum GBF-0208 의고체배양을수행하여수율및경시보존성을검토한결과고체배양의수율은 5.0E+8 CFU/g으로액체배양보다낮은수율을나타내었으나경시안정성은 40 에서 8주동안 ( 상온에서 1년경시확보검증 ) 시험한결과 1.0E+8 CFU/g으로높은안정성을나타내었고활성도동일포자수의액상배양포자보다높게나타났다. 고체배양결과로얻어진포자를 1년동안상온경시를관찰한결과포자수가초기수의 90% 생존하는것으로나타났으며이는액상배양의포자보다는고체배양을수행하여얻는포자의구조가단단한것을나타낸다. 액상배양의포자와고체배양의포자를상온에서 1년동안보관한후 germination 시켰을때액상배양의포자는현미경에서관찰되는포자수도다약 1.0E+3 정도감소는경향을나타낸반면에고체배양의포자는 min 90% 이상의포자수가 germination 되었으며 18개월이경과한후에는 min 1.0E+2 cfu/g 정도감소하는것으로나타나제품의품질을보증하는데보다유리한것으로나타났다. - 30 -

제 2 절길항미생물의제형개선및신제형개발 1. 최적제형개발 가. 개요 (1) 이전연구과제에서얻은결과물은크게액상수화제와수화제두제형이다. (2) 이중이전과제에서현장실험에이용된것은 4 균주중 B. subtilis CJ-9, B. subtilis EW42-1, B. subtilis GB-0365 가액상수화제, T. harzianum GBF-0208 은수화제제형이다. (3) 본연구를통해서현장에서사용되기에가장적합한제형을현장실험과코스관리자들의의견을수렴하여찾아내었고, 이를개발하기위한공정을수립하고자하였다. (4) 통기와배토작업에적합한 TAC(Topdressing Aeration Core) 제형은코스관리현장에노동력과시간을절약할수있으며, 제품의효력을증진시킬수있는제형이며, 이제형은과립혹은크기가작은입제형태가적합하기때문에액상배양액을건조하고, 분쇄, 성형하는공정을수립하였다. (5) 완성된제형의경우미생물균주의안정성과이화학성에대한연구를통해제품효력의유지ㆍ향상에대해평가하였고, 공정시소요되는비용을고려하여경제성에대한평가를내려최종적으로공정을확립하고자하였다. 나. 전체개발과정공정 scheme 제형의공정은배양액준비, 건조, 분쇄, 제제성형으로이루어져있다. 제형의개발공정은춘천생물벤처지원센터에서진행하였다. (1) 제형의개발시고려한점 ( 가 ) 수화제 1 기존수화제에비해이화학성을향상 2 기존수화제의제조공정불완전성을해소 3 기존공정에비해단가를낮추어경제성을향상 ( 나 ) 입제ㆍ과립 1 TAC 즉배토에적합성제형인입제를개발 2 입제의사이즈에따른배토시배토사와의균일한혼합여부측정 - 31 -

3 기계적합성측정 4 공정시소요되는경비에따른경제성고려 5 미생물상측정을통한경시보존성과제품성능유지능력측정 6 제품의이화학성의측정 다. 제품개발공정도 (1) 수화제 액상배양액 건조과정 동결건조 Spray Drying 기타건조 방식 분쇄과정 pinmill airzetmill cuttermill 기타분쇄 품질 QC 과정 수화성 check 균보존성 check 입도분포 check 연구완료 시작품제작 < 그림 3.7> 수화제개발계획공정도 - 32 -

(2) 입제ㆍ과립 액상배양액 건조과정 동결건조 Spray Drying 기타건조 방식 분쇄과정 pinmill airzetmill cuttermill 기타분쇄 입제성형 사출성형 유동층 조립기 기타제형 품질 QC 과정 TAC 적합성 check 균보존성 check 입도분포 check 연구완료 시작품제작 < 그림 3.8> 입제개발계획공정도 - 33 -

라. 최적제형개발내용 (1) 건조공정의과정 ( 가 ) 동결건조 기존공정에서선정된담체인탈지분유를이용하여동결건조를진행하였다. Trichoderma harzianum GBF-0208 의경우고체배양을통해생산되므로별도의건조연구를진행하지않음. 1 대상균주가 Bacillus subtilis CJ-9 나 Bacillus subtilis EW42-1 다 Bacillus subtilis GB-0365 2 제조공정조건가배합 : 원제 : 담체 = 1 : 2 (W:W) 나시료냉동조건 : -28 ~ -33 4시간이상다시료건조조건 < 표3.6> 시료의건조조건온도 ( ) -30-20 -10 0 10 20 30 35 40 40 진행시간 (min.) 120 120 120 180 120 120 240 240 900 ( 계속 ) 3 결과 : 회수율 95% 이상 ( 나 ) 분무건조 기존의경우벤토나이트, 제올라이트, 규조토, 버미큘라이트등의담체가사용되었다. 이들의경우담체로이용되기에부적합한것은아니지만, 경시보존성과포자수율, 외부이용시의안정성및경제성을고려하여덱스트린과화이트카본을적용하였다. 이들담체는현재본사의종균제의담체로사용되고있는것으로안정성이입증되었고, 제조공정의단순화를통한경제성향상에도기여할것으로생각된다. 1 대상균주가 Bacillus subtilis CJ-9 나 Bacillus subtilis EW42-1 - 34 -

다 Bacillus subtilis GB-0365 2 제조공정조건가배합 : 원제 100L + 덱스트린 10kg + 화이트카본 10kg 나시료건조조건 : Inlet 온도 :198 ± 1 Outlet 온도 : 104 ± 2 다공정소요시간 : 13hr/Batch 3 결과 : 회수율 80% ± 5% ( 다 ) 열풍건조 이전과제에서열풍건조를이용한건조방식을채용하고자하였으나, 건조물의이화학성이수준이하였기때문에제품을얻을수없었다. 이를극복하고자보완연구를진행하였다. 1 대상균주가 Bacillus subtilis CJ-9 나 Bacillus subtilis EW42-1 다 Bacillus subtilis GB-0365 2 제조공정가배합 : 원제 20L + 덱스트린 10% + 화이트카본 10% 나건조조건 : 대류열풍건조기 50 다건조시간 : 6일 /Batch 3 결과 : 회수율 95% 이상 < 그림 3.9> 동결건조작업. 시료동결 ( 좌 ); 동결건조 ( 우 ) - 35 -

< 그림 3.10> 분무건조작업. 분무건조기 ( 좌 ); 분무건조진행 ( 우 ) < 그림 3.11> 열풍건조작업. 열풍건조기 ( 좌 ); 열풍건조결과물 ( 우 ) (2) 건조공정결과와그의분석 ( 가 ) 균수측정을통한안정성분석 < 표 3.7> 각제형의균수 (cfu/ml) 측정결과 동결건조 (cfu/g) 분무건조 (cfu/g) 열풍건조 (cfu/g) B. subtilis CJ-9 6.80E+09 5.20E+09 - B. subtilis EW42-1 3.50E+09 3.20E+09 - B. subtilis GB-0365 3.40E+09 8.50E+09 - 균에미치는악영향 건조영향거의없음 건조영향거의없음 - - 36 -

1 동결건조와분무건조는균수측정결과액상배양액의포자수율이거의유지되므로건조방식으로적합 2 열풍건조의경우기준측정범위인 10 9 수준에못미침. 균에데미지가있을뿐만아니라시료자체가너무단단히굳기때문에후공정에이용하기가어려움 3 최종적으로건조방식중동결건조와분무건조가경시안정성면에서우수함 ( 나 ) 제조공정의경제성 ( 가 ) 공정시간가동결건조 : 약 36hr/Batch 나분무건조 : 약 13hr/Batch 다열풍건조 : 약 6days/Batch -> 제품의생산소요시간면에서분무건조가가장바람직함 ( 나 ) 공정소요경비 ( 소요비용이큰순서 ) 동결건조 >> 분무건조 > 열풍건조 ( 본소요비용은기계사용료와인건비만을고려한것으로정확한산출근거를첨부하기에는더많은시장조사가필요함.) -> 현실적으로분무건조가가장바람직함 ( 다 ) 건조공정전체분석결론 최종적으로건조방식의경우, 분무건조방식이경시안전성과경제성면에서가장바람 직한것으로결론짓고이후실험진행하기로결정. - 37 -

< 그림 3.12> 동결건조결과물 < 그림 3.13> 분무건조결과물. Bacillus subtilis GB-0365( 제품명 : 씰러스 )( 좌 ) 와 B. subtilis GB-0365, B. subtilis CJ-9, B. subtilis EW42-1( 우 ) (3) 분쇄공정 분쇄공정의개선을통해길항미생물제제의이화학성을향상시켜사용의편리성을향상시키고자하였다. 분쇄공정은기존미생물제제의제조에사용한핀밀 (pinmil)l 과본연구과제의지원을통해구매한에어제트밀 (airjetmill) 2종을이용하였다. 최적분쇄공정은공정의경제성과결과물의이화학성의향상정도에기초하였다. - 38 -

( 가 ) 분쇄공정의과정및방법 1 핀밀 (pinmill) pinmill 은이전연구과제에서선발한분쇄공정의방법으로현재 Trichoderma harzianum GBF-0208 의고체배양후조분쇄에이용하고있는분쇄공정이다. 본연구과제에서는전제품에본분쇄공정의적용가능여부를검정하였다. pinmill 은본연구기관의생산시설에있는것을이용하였다. 가 pinmill의분쇄공정 screen size를 6목으로조정한다. 분쇄기내부로건조물이이송되는속도를 1.5-2.0 으로조정하여진행한다 분쇄기작동시간은연속구동시간을 30min 내외로한다. screen 의규모에따라차이가있음 screen 의미통과분은수거후다시분쇄공정에사용함 나대상균주 Bacillus subtilis CJ-9 Bacillus subtilis EW42-1 Bacillus subtilis GB-0365 Trichoderma harzianum GBF-0208 다분쇄결과물의기대입도분포사이즈 : 100 μm - 150 μm 2 에어제트밀 (airjetmill) airjetmill 은강한공기압력으로입자간의충돌을유발시켜분쇄하는기기, 공정중온도의상승이적고, 분쇄대상물에대한영향이가장적은분쇄기기로알려져있음. 주로입경이 100 μm수준의건조물을 10 μm내외의매우미세한입자로분쇄하기위해사용 미생물제제의경우, 매우작은입자사이즈의제제를만들경우미생물에영향을최소화하기위해 airjetmill 의사용이필요 이번분쇄실험은본사가이번연구과제수행중구입한 Seishin 社 ( 日 ) 의 Co-Jet mk-Ⅲ를사용 - 39 -

가분쇄공정 < 표 3.8> 각균주별에어제트밀을이용한분쇄공정조건 대상균주 투입량 P. Nozzle(MPa) G. Nozzle(MPa) Bacillus subtilis CJ-9 100g/min 0.6 0.75 0.5 0.55 Bacillus subtilis EW42-1 100g/min 0.6 0.75 0.5 0.55 Bacillus subtilis GB-0365 100g/min 0.6 0.75 0.5 0.55 Trichoderma harzianum GBF-0208 120g/min 0.6 0.75 0.5 0.55 나대상균주 Bacillus subtilis CJ-9 Bacillus subtilis EW42-1 Bacillus subtilis GB-0365 Trichoderma harzianum GBF-0208 3 분쇄공정결과와분석 가핀밀 (pinmill) < 표 3.9> 분쇄결과 ( 입도측정결과 ) 대상균주 분쇄전 ( μm ) 분쇄후 ( μm ) Bacillus subtilis CJ-9(SD 건조물 ) 40 40 Bacillus subtilis EW42-1(SD 건조물 ) 40 40 Bacillus subtilis GB-0365(SD 건조물 ) 40 40 Trichoderma harzianum GBF-0208 ( 고체배양물 ) 200 이상 50 100 SD 건조물 : 분무건조결과물 ; 입도분포사이즈 ( μm ) 는평균입경으로함 - 40 -

< 표 3.10> 분쇄결과 ( 경시안정성 ) 대상균주 분쇄전 (cfu/g) 분쇄후 (cfu/g) Bacillus subtilis CJ-9(SD 건조물 ) 5.20E+09 3.10E+09 Bacillus subtilis EW42-1(SD 건조물 ) 3.20E+09 2.70E+09 Bacillus subtilis GB-0365(SD 건조물 ) 8.50E+09 5.00E+09 Trichoderma harzianum GBF-0208 ( 고체배양물 ) 7.0E+07 1.70E+07 분쇄결과분석 - Bacillus spp. 균주의 SD 건조물은 pinmill에의한분쇄가필요없음 - 입도사이즈는수화제의경우 325mesh 통과해야함. Bacillus spp. 은별도의분쇄공정필요없이수화제로사용가능 - Trichoderma harzianum GBF-0208 은 pinmill에의한분쇄결과수화제로사용불가 - 2차분쇄공정필요 - 전문가 (Seishin( 日 ) 의 Inaba 박사 ) 의의견에따르면, 기존의 SD 건조물제조시사용한부제에비해담체의응집력이작고공정조건이적절하기때문에건조물의입자크기가작은결과물이나오는부가효과를얻은것으로보임. 나에어제트밀 (airjetmill) < 표 3.11> 분쇄결과 ( 입도측정결과 ) 대상균주 분쇄전 ( μm ) 분쇄후 ( μm ) Bacillus subtilis CJ-9(SD 건조물 ) 40 10 이하 Bacillus subtilis EW42-1(SD 건조물 ) 40 10 이하 Bacillus subtilis GB-0365(SD 건조물 ) 40 10 이하 Trichoderma harzianum GBF-0208 ( 고체배양물 ) 100 12 이하 - 41 -

< 표 3.12> 분쇄결과 ( 경시안정성 ) 대상균주 분쇄전 (cfu/gl) 분쇄후 (cfu/g) Bacillus subtilis CJ-9(SD 건조물 ) 5.20E+09 4.70E+09 Bacillus subtilis EW42-1(SD 건조물 ) 3.20E+09 3.20E+09 Bacillus subtilis GB-0365(SD 건조물 ) 8.50E+09 8.50E+09 Trichoderma harzianum GBF-0208 ( 고체배양물 ) 7.0E+07 4.30E+07 분쇄결과분석 - 미생물제제의경우비교적분쇄에있어적은압력으로도높은분쇄결과를기대할수있음 - 미생물의분쇄에따른미생물상의변화는거의없으므로분쇄에의한균데미지는미미한수준 - Trichoderma harzianum GBF-0208 의경우 pinmill에의한조분쇄결과물을 2차분쇄한것으로충분히수화제로이용가능할것으로보임 - 분쇄결과물의평균입도가 12 μm이하로새로운제형의개발연구에적용가치가있음 4 분쇄공정전체결론및활용방안 입도분포가 325 mesh 이하 (43μm이하 ) 일경우수화제로이용가능 분무건조를진행한 Bacillus spp. 들은별도의분쇄공정없이수화제로직접이용. Trichoderma harzianum GBF-0208 의경우는 pinmill로 1차분쇄후, airjetmill 을이용하여 2차분쇄하여수화제로이용. < 그림 3.14> 분쇄기기. pinmill( 좌 ) 와 airjetmill( 우 ) - 42 -

<그림 3.15> Bacillus subtilis EW42-1의 분쇄 후 입도 분포 측정 결과 예시 - 43 -

라. 수화제의최적공정도 앞선건조, 분쇄공정의연구결과를응용한수화제의최적공정은아래와같고, 최적공정도를이용하 여나타내었다. 1 Bacillus subtilis CJ-9, Bacillus subtilis EW42-1, Bacillus subtilis GB-0365 해당 액상배양액 액상배양액 건조과정 동결건조 Spray Drying 기타건조 방식 Spray Drying 분쇄과정 pinmill airzetmill cuttermill 기타분쇄 제품제작 분쇄공정 불필요 연구완료시제품제작 ( 기존공정도 ) ( 최적공정도 ) < 그림 3.16> 수화제제조최적공정도 - 44 -

2 Trichoderma harzianum GBF-0208 해당 ( 기존공정도 ) ( 최적공정도 ) 액상배양액 고체배양 건조과정 동결건조 Spray Drying 기타건조 방식 Pinmill 1 차분쇄 분쇄과정 pinmill airzetmill cuttermill 기타분쇄 Airjetmill 2차분쇄 연구완료시작품제작제품제작 < 그림 3.17> 수화제최적생산공정도 마. 입제의개발과정 입제의경우, 과립, 타정, 유동층과립기를통해과립을개발코자하였다. 입제의개발공정은춘천생물벤처지원센터내에서진행하였다. (1) 입제의제조공정 입제의각원료는 Bacillus spp. 의경우분무건조물 (SD powder) 로 Trichoderma harzianum GBF-0208 은고체배양물 100mesh 통과분으로진행하였다. 입제제조를위한조성과공정은 < 표 3.13> 에나타내었다. - 45 -

< 표 3.13> 입제제조를위한조성과제조공정 타정 과립 유동층 과립기 부제 원제유당옥수수전분 스테아린산 마그네슘 제품량 GB-0365 700g 280g 280g 33g 2.5kg EW-42 700g 280g 280g 33g 2.7kg CJ-9 700g 280g 280g 33g 2.65kg Trichoderma harzianum GBF-0208 700g 280g 280g 33g ( 결탁제 ) 2.5kg GB-0365 1.25kg EW-42 CJ-9 Trichoderma harzianum 2.1kg 1.3kg 1.8kg GBF-0208 작 1. 유동층과립기로제품성형하고자하였으나여건이여의치 않음. 2. 일본으로원료보내어유동층과립으로제품성형에대 한조건수립을요청 비고 물성이다른제품과틀 린관계로탁제를더추 가해도경도가약함 ( 타정형태는부서짐 ) 3kg정도의시료와물 400ml 혼합후제작과립 작업의특성상손실량이 30% 이상으로많음물성이틀린관계로덱 스트린 500g 혼합후제 ( 가 ) 유동층과립제조공정 ( 별도로제조공정을명기함 ) 1 춘천생물벤처지원센터의협조아래일본 FREUND CORPORATION 기술개발연구소에서제조 2 Granurex model GX-20을이용하여제조 3 제조목표가 4가지균주에대한유동층과립을제조하고자함나 4가지균주는모두평균입경 600 μm이상의샘플을제작하고자함 4 제조공정 - 균주당원료약 400g 에 10% HPMC 수용액을분무 - 가열전동방식으로조립을진행하여 150 μm의과립을얻음 - 위에서얻은과립을핵으로분말피복조립을실시 - 본피복조립을 4회반복하여 600 μm이상의유동층과립을얻음 - 46 -

5 제조조건 < 표 3. 14> 유동층과립의제조조건 Batch Size 400g Spray Nozzle Type: ATU-G02 Nozzle Dia.: 1.0mm Cap Dia.: 1.0mm Number: 1 Spray Air Air Pressure: 0.1MPa Air Volume: 16L/min Pump Type: MP-3N Tube: 6 * 3 Pulse Jet Interval: 1/5 sec Pressure: 0.25MPa Results Total time:51 min Total Liquid: 283g Weight discharged: 392.6g < 그림 3.18> 입제성형과정. 유동층과립기 ( 좌 ) 와타정제작과정 ( 우 ) (2) 제조공정과결과물에따른입제의분석 ( 가 ) 타정 평균입경이 150mm 이상인 Tablet 제형 제제의다양화측면에서도움이될것으로보임 ( 나 ) 로드형과립 토양개량제에적합한제형으로입자의크기가토양이상 토양의공극을넓혀주는역할을할수있음 ( 다 ) 유동층과립 - 47 -

배토시 배토사와 혼합하여 사용할 수 있는 제형 입경의 크기가 약 600 이상으로 분진이 날리지 않음 TAC 적합성 제형으로 충분히 이용될 가치가 있음. <그림 3.19> 로드형 과립. 로드형 과립(좌)와 로드형 과립의 개개의 형태(우) <그림 3.20> 타정의 전체 형태(좌)와 유동층 과립 제형(우) (3) 입제 성형의 결론 입제의 성형 실험 결과, 입제의 입도 분포를 고려하였을 때, 유동층 과립 제형 배토 (TAC) 적 합성 제형에 가장 가까운 형태인 것으로 보인다. 사출 성형을 통한 로드형 입제의 경우 입도 분포의 크기와 제형의 형태를 고려하였을 때, 토양 개량제로 사용이 가능할 것으로 보인다. 본 입제는 원료의 특성상 초고농도 처리가 아닐 경우, 잔디에 약해 우려가 없고, 수화에 문 제가 없으므로 물에 희석하여 처리하거나 인력에 의한 점멸 처리에 유용하게 사용될 수 있 - 48 -

다. 향후입제는 TAC 제형으로사용되거나, 주요발병지의부분처리를위한제형으로효용 가치가높을것으로사료된다. 바. 입제개발공정도 액상배양액 건조과정 동결건조 Spray Drying 기타건조 방식 고체 배양물 분쇄과정 pinmill airzetmill cuttermill 기타분쇄 분쇄 원료 입제성형 사출성형 유동층 조립기 기타제형 사출 성형 유동층 조립기 연구완료시작품제작제품제작 < 그림 3.21> 입제최적생산공정도 ( 최적공정도 ) 사. TAC(topdressing Aeration Core) 제형의산업화과정 (1) TAC 제형 TAC 제형은골프장의통기 배토작업시발생하는구멍에배토사를메울때혼합하여처리할수있도록만든제형이다. TAC 제형으로제조하기위해서는배토사와입자의크기가유사하여야하고, 약제가배토사와혼합시마찰에의해부스러지지않도록일정강도를유지해야한다. TAC 제형은길항미생물이잔디에병을일으키는토양병원균에직접도달할수있도록도와주어약제의효력을상승시킬수있다. 수화제와같은물에희석하여살포하는제형에비해길항미생물의외부환경과의접촉을줄일수있어미생물의사멸과유실을줄일수있다. - 49 -

별도로방제작업을펼치지않고배토사와함께처리할수있어노동력감소와작업의편리성을제공 할수있다. (2) TAC 제형의개발 1차년도연구를통해개발한기존유동층과립제품의경도를강화하고, 배토사와의혼합이용이하도록평균입경의조절이용이한담체 (carrier) 를선정하였다. ( 가 ) 담체의선정담체는길항미생물의경시안정성향상과평균입경조절의편의성, 경제성, 토양개량효과를종합적으로고려하여결정하였다. B. subtilis GB-0365 와 B. subtilis EW42-1 의담체에대한미생물배양액흡착후, 흡착당일부터 7일간격으로 2회 g당미생물밀도를측정함으로써경시안정성을검정하였다. 미생물배양액과담체의혼합비율은 1:10(Wt:Wt) 로하였고, 혼합후완전히흡착된것을확인한후상온에서음지에건조보관하였다. 미생물상의측정은식염수 10ml 에 1g의시료를처리한후, serial dilution 하여플레이트 (plate) 에 1ml 치상하고 24시간경과후 colony 의개수를 counting하여검정하였다. < 표 3.15> 담체의길항미생물경시안정성보존능력측정결과 B. subtilis GB-0365(cfu/g) B. subtilis EW42-1(cfu/g) 0day 7days 14days 0day 7days 14days 제올라이트소성제올라이트버미큘라이트이소라이트 1.3E+08 3.4E+08 3.3E+08 2.7E+08 2.4E+08 2.4E+08 1.5E+08 1.7E+09 1.8E+09 3.0E+08 3.2E+09 3.2E+09 3.0E+08 2.4E+08 2.5E+08 3.5E+08 2.9E+08 2.5E+08 1.8E+08 1.9E+08 1.9E+08 2.7E+08 2.5E+08 2.5E+08 펄라이트 1.2E+08 8.0E+07 8.0E+07 2.5E+08 1.4E+08 1.5E+08 < 표 3.15> 의경시안정성측정결과에따르면, 소성제올라이트가가장높은경시안정성보존능력을가지고있으며, 약 2주경과후균수가 1.8E+09 cfu/g으로오히려 10배이상증폭한것을알수있다. 이는배양액내의잔존영양성분이소성제올라이트의공극내에서길항미생물의먹이원으로사용되어길항미생물의밀도를상승시키는요인으로작용한것으로본다. 본연구를통해소성제올라이트가가장높은 - 50 -

경시안정성보존능력을가진것으로사료되나경제성과토양개량능력등을종합적으로고려한결과제올라이트와소성제올라이트 2 담체가최종적으로선발되었다. 향후제품의가격선정과정에서두담체의비중을조절하여최종제품을생산하기로결정하였다. 최종적으로결정된제올라이트의일반적성상과 TAC 제형에이용가능성을볼수있는특성은다음의 < 표 3.16> 과같다. < 표 3.16> 제올라이트와소성제올라이트의특성 항 목 소성제올라이트 CEC (me/100g) 투수계수 (mm/h) Total pore Space(%) 보수성 30cm tension(%) 가비중 EC (ds/m) ph (1:10) 3.5 7206 67 25.7 0.84 0.14 6.24 1.0 강도 (kgf) 제올라이트 130 4250 60 18.0 0.84 0.16 7.0~9.0 3.0 일반적으로소성제올라이트와제올라이트는토양개량제로써가장많이이용되는자재중하나로단독처리로도토양의화학적 물리적성질의개선에좋은역할을한다. 제올라이트와길항미생물의동시처리는높은병방제효과와잔디의재배환경개선효과를기대할수있다. ( 나 ) TAC 제형의제조공정기존 TAC 제형의제조를위해연구하였던입제의성형공정을개선하고자하였다. 대규모생산을위해기존의유도층과립, 사출성형의제조공정연구에서얻은노하우 (Know-How) 를접목하여산업화가능한제조공정을개발하였다. 담체를교반하면서길항미생물배양액을노즐을이용하여분사하는방식으로흡착하여 TAC 제형을제조하고자하였다. 기존사출성형과유동층과립성형에비해경제성과대량생산에유리할것으로사료된다. STEP 1 STEP2 STEP 3 STEP 4 길항미생물의 담체의교반 노즐을이용한 안정화와통풍 준비 ( 배양액 : 담체 ( 제올라이트, 분사 ( 분사속도 : 건조 ( 교반진행, =1:10) 미강, 질석등 ) 200-600ml/min.) 24hr 이상 ) < 그림 3.22> TAC 제형의제조공정도 배양액과담체는무게기준 1 대 10 의비율이처리시현장에서혼합공정을조정하기가가 - 51 -

장적합할것으로생각되고, 미강과질석의첨가목적은처리직후잔디와미생물의영양공급원으로사용하기위해서이다. 노즐의분사속도는생산소요시간을 6-24hr 으로가정하였을때, 적정속도를가정한것으로실제적용결과약 500ml/min. 의분사속도로 8시간에걸쳐약 10ton 의 TAC 제형을생산할수있었다. 본 TAC 제형에사용되는길항미생물은호기성세균으로충분히건조되지않은상태에서는혐기성세균과곰팡이의오염이가능할수있으므로마지막단계에서배양액내의수분을완전히제거하기위해팬을이용하여통풍을강제로시키면서건조하였다. ( 다 ) TAC제형의제조에대한고찰 TAC 제형은산업화가가장유리한제형중하나로외부환경에의한효력손실이적고, 현장에서사용이편리하며, 노동력감소와관리시간절감효과를가지고있어기대가큰제형이다. 본제제의제조과정에서본연구에사용중인균주중곰팡이인 Trichoderma harzianum GBF-0208 은기타의 B. subtilis spp. 에의해경시안정성이저해되어적용할수없었다. 그러나, Azotobacter spp. Aspergillus spp. Lactobicillus spp. 등의유용미생물과의혼용가능성이있으므로추후필요에따라혼합처리를통한시너지 (Synergy) 효과를기대할수있으리라사료된다. 본 TAC 제형의잔디병방제효과와잔디품질의상승효과는다음 3절에서진행하였다. < 그림 3.23> 제조된 TAC 제형 ( 좌 ) 와현장에서사용하기위해 TAC 제형을기계에담는모습 ( 우 ) - 52 -

제 3 절길항미생물제제의방제효과검정시험 1. TAC 제형 가. 개요 TAC 제형은 Topdressing Aeration Core의약자로통기 배토작업시발생하는통기구멍에배토사와혼합하여처리할수있는입제형태의제형을말한다. 본 TAC 제형의처리는토양에서식하고있는병원균에직접적인도달이가능하여기존관주 엽면처리에비해미생물의유실이적고, 높은방제효과가기대된다. 현재국내에는 TAC제형의길항미생물제가시장에소개되어있지않은관계로생소한상황이지만, 국내외의학술지를통한몇몇발표를통해그효용성을인정받고있다. ( 주 ) 그린바이오텍에서는 TAC 제형의산업적생산을위해토양개량제로널리사용되고있는제올라이트에길항미생물을흡착하고, 천연물등을첨가하는제제를개발하였고, 제조공정또한확립하였다. 실험은제품화가이미이루어져판매되고있는 B. subtilis GB-0365 를이용하여피시움마름병방제를대상으로실시하였다. 나. 실험내용 (1) 실험방법 2007 년 6월서서울 C.C 예비묘포지에서크리핑벤트그라스를대상으로난괴법 3반복으로시험구 ( 시험구하나의크기는 4m2 ) 를배치하여진행하였다. 피시움마름병의접종원은 1일간격으로 2회연속살균한 sand-oatmeal 배지 ( 무게비율로 oatmeal 1 : 모래 20 : 물 4) 에 1/10 strength PDA 또는 Czapek-Dox agar에서 3일간배양한병원균 (Pythium apahnidermatum) 의균총을코르크보아로잘라 5개씩이식하여 30 항온기에서 10일간배양하여준비하였다. 병원균접종은길항미생물처리직전에시험구당접종체 100g 수준으로처리하였으며, 길항미생물처리는기개발된최적배양조건과제형공정에따라제조된액상수화제와 TAC 제형을대상으로실시하였다. 액상수화제는 1.00E+07 cfu/ml 수준으로균수를조정하기위해물을이용하여약 100 배희석하여처리하였고, TAC 제형은배토사모래를이용하여역시 1.00E+07 cfu/g으로혼합하여처리하였다. TAC 제형의처리에있어서는길이 10cm, 반지름 1cm의실린더를이용하여 1m2당 160 개의구멍을뚫고, 약 10kg/ m2를손을이용하여투입하였고, 남은양은잔디배토에이용하였다. 또한, TAC 제형의경우, 잔디표면에구멍을내는통기작업을실시하여야하므로잔디에부담이되어연속 2주실시할수없었다. 이때문에잔디의회복을위해 TAC 제형은 1회처리로제한하고, 이후 1회는액상수화제를대신처리하였다. 액상수화제는총 2회 7일간격으로면적당 1L/ m2를처리하였다. 발병면적율 (%) 의조사는최종약제처리 7일후실시하였고, 구체적인처리내역은 < 표 3.17> 과같다. - 53 -

< 표 3.17> 처리내역 1 차처리 (07.0619) 2 차처리 (07.06.26) 비고 실험구 1 실험구 2 B. subtilis GB-0365 액상수화제 1L/ m2 B. subtilis GB-0365 TAC제형 10kg/ m2 B. subtilis GB-0365 액상수화제 1L/ m2 B. subtilis GB-0365 액상수화제 1L/ m2 통기작업실시 통기작업실시 무처리대조구배토사 10kg/ m2물 1L/ m2통기작업실시 (2) 실험결과피시움마름병의방제효과는무처리대조구대비기준방제가를이용하여측정하였다. B. subtilis 액상수화제 + B. subtilis 액상수화제처리구인실험구 1의방제가는 64.0%, B. subtilis TAC + B. subtilis 액상수화제처리구인실험구 2의방제가는 80.1% 이었다. 이를통해 TAC 제형의처리는기존액상수화제처리에비해더욱높은효과를기대할수있음을알수있었다. < 표 3.18> 피시움마름병방제처리결과 시험약제 최종약제처리 7 일후피해면적율 (%) 반복 1 반복 2 반복 3 평균 방제가 (%) 비고 실험구 1 15.0 10.0 20.0 15 64.0 실험구 2 10.0 5.0 10.0 8.3 80.1 무처리대조구 50.0 30.0 45.0 41.7 - 잔디피복률향상 효과확인 다. 고찰 TAC 제형의처리는길항미생물이병의원인인토양병원균에직접처리된다는점과표면에서 UV와표면복사열에의해많은양이유실되는액상수화제의단점을극복할수있다는점에서큰방제효과를기대할수있었다. 실험결과피시움마름병방제효과가단순히액상수화제만처리한것에비해 TAC 제형과액상수화제를복합처리한것이약 25% 이상효과가향상되어기대가입증되었다. 향후 IPM모델의개발에있어통기 배토작업시동반처리를통해더욱효과적인방제효과를거둘수있으리라생각된다. 부가적으로통기작업시발생하는구멍은추후잔디뿌리가영역을넓혀가면서구멍을채워나가 1주일에서 10일정도사이에잔디피복이완전히이루어지는것이보통인데, TAC 제형의처리시피복기간이다른처리구에비해 2일이상빨라져잔디의생육촉진효과와통기작업에따른스트레스의회복능력이있 - 54 -

는것으로생각된다. 2. 천연물과미생물의혼합제형가. 개요잔디병은대부분토양병원균에의해발생하므로, 길항미생물이병을방제하기위해서는토양에길항미생물이정착하여밀도를높이고, 항균활성물질을방출함으로써병원균에영향을미칠수있어야한다. 이런일련의과정이이루어지기위해서는화학농약보다방제효과에더욱많은시간이필요하므로예방시약이필요한데, 이는현재의관리시스템에서는적용하기에어려움이많다. 이의해결을위해현재 IPM 모델을개발하고있으며, 관련기술의일환으로천연물과미생물의혼합처리를통해약효를증진하고속효성인천연물을통해방제시간을단축하고자한다. 본실험은천연물과길항미생물의혼합처리를통해방제효과를증대하고자여러종류의천연물을적용하였고, 최종적으로해조추출물을선발하여 Trichoderma harzianum GBF-0208 과의혼용을통해잔디브라운패취방제효과를검정하였다. 나. 실험내용 (1) 실험방법 2007 년 8월서서울 C.C 예비묘포지에서크리핑벤트그라스를대상초종으로난괴법 3반복으로시험구 ( 시험구하나의크기는 4m2 ) 를배치하여진행하였다. 브라운패취의접종원은 1일간격으로 2회연속살균한 sand-oatmeal 배지 (1,000ml 삼각플라스므데모래 380g, oatmeal 20g 을넣어혼합하고, 증류수 76ml 첨가 ) 에감자한천배지 (PDA) 에서 5일간배양한병원균 (Rhizoctonia solani AG1-1) 의균총을코르크보아로잘라 5개씩이식하여 25 항온기에서 20일간배양하여준비하였다. 병원균접종은길항미생물처리직전에시험구당접종체 180g 수준으로처리하였으며, 길항미생물은기개발된최적배양조건과제형공정에따라제조된 Trichoderma harzianum GBF-0208 의분상수화제를이용하였고, 해조추출물은해조류 (Ascophyllum nodusum) 의지상부, 뿌리, 과육 1.2kg 을 100 에서 5분간블랜칭 (blanching) 하여열수추출의경우시료의 5배량의증류수를가하여환류추출하였고, 감압농축한후건조하여해조열수추출물을얻었다. 처리구는 T. harzianum GBF-0208 의분상수화제와해조추출물을단독처리한것과 T. harzianum GBF-0208 과해조추출물을무게기준으로 2:1 로혼합하여처리한것으로나누었고, 병원균접종직후 1주일간격으로 4회물을이용하여 500 배희석하여 1L/ m2처리하였다. 대조화학약제는지오판수화제를사용하였으며, 1500 배희석액을역시 1주일간격으로 4회처리하였다. (2) 실험결과 잔디브라운패취의방제효과는무처리대조구대비기준방제가를이용하여측정하였다. T. harzianum GBF-0208 의단독처리구는방제가 69%, 해조추출물은 18.8%, T. harzianum - 55 -

GBF-0208 과해조추출물의혼합처리구는방제가 97%, 지오판수화제의방제가는 94% 를얻어 T. harzianum GBF-0208 과해조추출물의혼합처리구는화학약제와비교하여더욱높은방제효과를거둘수있었다. 해조추출물단독처리는무처리대조구에비해방제효과에유의수준의차이가없었다. < 표 3.19> 잔디브라운패취방제효과 처리약제 최종약제처리 7 일후피해면적율 (%) 반복 1 반복 2 반복 3 평균 방제가 (%) T. harzianum GBF-0208 20.0 10.0 20.0 16.6 69 해조추출물 50 50 30 43.3 18.8 T. harzianum GBF-0208 + 해조추출물 5 0 0 1.7 97 지오판수화제 5 5 0 3.3 94 무처리대조구 60 50 50 53.3 - 다. 고찰해조추출물과 T. harzianum GBF-0208 의혼합처리구는단독처리구에비해훨씬높은방제효과를얻을수있었다. 해조추출물은브라운패취의방제효과를기대할수없지만, 잔디의양분흡수능력을증대시키고, 건전성을향상시킴으로써병원균의공격으로부터잔디의저항성을향상시킨것으로생각되고, 이는 T. harzianum GBF-0208 의브라운패취방제효과를증대시켰다고생각된다. 또한, 길항미생물처리와함께잔디의생육을촉진할수있는기능을함께부여함으로써현장에적용시시장에서더욱높은수요를촉진할수있으리라생각된다. - 56 -

제 4 절 IPM 모델의상업골프장적용시험 1. 퍼블릭골프연습장에서의친환경 IPM 적용모델수립 (1 차년도시행 ) 국내의골프대중화열풍에따라현재많은수의퍼블릭골프연습장이생겨나고있다. 일반상업용골프장의경우페어웨이와퍼팅그린의분포는골프장에따라차이가있지만, 약 20 30배정도페어웨이가넓은분포를차지하고있다. 하지만, 퍼블릭골프연습장은숏트게임에적합하도록페어웨이와퍼팅그린이 5 10 배정도의분포를가지고있다. 이런골프장의코스구성은퍼팅그린의답압을심하게하고, 답압으로인한잔디의스트레스로인해병충해발생이매우심각하다. 이는병방제를위해더많은화학농약의사용을유도하게되므로오히려상업용골프장보다퍼블릭골프연습장에서친환경골프코스 IPM 모델의적용이필요할수도있다. 당연구는다양한시장에미생물농약을진입시키기위한전략의일환으로생각할수있다. 가. 실험장소와일정및약제처리내역 (1) 실험장소인퍼블릭골프연습장파주소재퍼블릭골프연습장 2개소에서실험이이루어졌다. 타워골프연습장과유니언골프연습장으로정규 18홀이아닌 9홀로이루어진숏트게임용퍼블릭골프연습장이다. 각각 2004 년과 2005 에개장하였고, 시공사가같아서비교적토양과잔디의생육기간등의골프코스의환경조건이유사하다. 내장객의수는시즌의경우일일평균 100 팀이상으로골프코스에답압스트레스가매우심한곳으로실험하기에적합하였다. 해당시험골프장의전반적인특성은 < 표 3.10> 과같다. < 그림 3.24> 파주소재퍼블릭골프장실험현장 - 57 -

< 표 3.20> 실험골프장의전반적특성 면적 ( m2 ) 초종화학농약사용유무 (2005) 타워골프연습장 유니언골프연습장 미생물처리구 (1 2 3 4) 관행관리구 (5 6 7 8) 미생물처리구 (1 2 3 4) 관행관리구 (5 6 7 8) 페어웨이 12000 6100 퍼팅그린 420 430 250 240 페어웨이 Zoysiagrass Zoysiagrass Zoysiagrass Zoysiagrass 퍼팅그린 Bentgrass Bentgrass Bentgrass Bentgrass 살균제 사용 사용 사용 사용 살충제 사용 사용 사용 사용 화학농약사용 살균제 미생물제혼용 사용 미생물제혼용 사용 유무 (2006) 살충제 사용 사용 사용 사용 병발생유무 (2005 년 ) 브라운패취브라운패취브라운패취브라운패취달라스팟달라스팟피시움마름병피시움마름병 개장년도 2004 년 2005 년 (2) 실험일정및처리약제 골프코스의관리는미생물제제와화학농약을함께이용한 IPM 처리구와화학농약만을 처리한관행관리구크게두체제로진행하여결과를확인하였다. 전체실험은 5 월부터 11 월까 지실시되었다. ( 가 ) 미생물을이용한 IPM 처리구토양병원균에의해발생하는잔디병의특성을고려하여전년병발생상황을토대로예방시약과치료시약일정을진행하였다. 미생물제제의경우예방시약이더높은병억제력을얻을수있으므로병이발생하기 1-2 주전에미리약제를처리하였다. 1 처리약제와대상병해 - Bacillus subtilis GB-0365 ( 액상수화제 ) : 피시움마름병 - Bacillus subtilis EW 42-1 ( 액상수화제 ) : 달라스팟 - Bacillus subtilis CJ-9 ( 액상수화제 ) : 라지팻취 - Trichoderma harzianum GBF-0208 ( 수화제 ) : 브라운팻취, 미생물비료 - 현재잔디병방제를위해이용되고있는화학농약살균제 : 살림꾼-녹병 ; 안타-피시움마름병 ; 톱네이드-브라운팻취 ; 호리쿠어-범용살충제 : 지오릭스-거세미나방, 굼벵이 ; 데시스-거세미나방 - 58 -

2 처리방법 ( 미생물제제 ) - Cushman에골프장의지하수를이용하여액상수화제의경우 100 배희석, 수화제의경우 500 배희석하여희석액을제조 - 희석액을처리할대상퍼팅그린에관주로고루처리 (1m2당 1L 처리 ) - 희석액살포 4-5 분후스프링클러를이용하여물을살포 - 희석액의제조후 6 시간이내에모두사용할것을권장 3 처리시기 미생물제제의경우한낮 (12-2 시 ) 에는처리를피하였고, 화학농약의경우특별한제약이없 었다. ( 나 ) 관행처리구 병발생상황을관찰하여치료시약위주로방제를진행하였다. 일반적인화학적방제에준하 게처리하였고, 해당골프장의관리용역업체의관리스케쥴을따랐다. 1 처리약제와대상병해 - 살균제 : 살림꾼-녹병 ; 안타-피시움마름병 ; 톱네이드-브라운팻취 ; 호리쿠어-범용 - 살충제 : 지오릭스-거세미나방, 굼벵이 ; 데시스-거세미나방 ( 잔디병방제용으로시중에서판매되고있는화학농약 ) 2 처리방법 : 화학농약사용지침서에따라처리 3 처리시기 : 화학농약의경우특별한제약없음 전체적인관리일정은당시위탁관리를맡고있던관리업체의도움을받아전년병발생 상황을참고하였고, 다음그림! 에나타내었다. 병방제외에해충의방제및시비, 통기, 깍기등의관리는위탁관리업체의관행관리에 따라진행함. - 59 -

< 표 3.21> 파주지역골프연습장 2 개소의관행관리와미생물처리구의관리일정 5 월 6 월 7 월 8 월 9 월 10 월 11 월 상중하상중하상중하상중하상중하상중하상중하 타워골프연습장유니언골프연습장 미생물처리구관행처리구미생물처리구관행처리구 살균제라 B 다라 B나살충제 D A A 살균제 B E C B B F F 살충제 D A A 살균제라 B 다라 B 살충제 D A 살균제 B E C B B F F 살충제 D A A: 데시스 B: 살림꾼 C: 안타 D: 지오릭스 E: 톱네이드 F: 호리쿠어 가 : Bacillus subtilis CJ-9 나 : B. subtilis EW42-1 다 : B. subtilis GB-0365 라 : Trichoderma harzianum GBF-0208 (3) 미생물제제의병방제효과와골프코스에미치는영향 ( 가 ) 골프코스의발병상황 1 타워와유니언두골프연습장에서관행관리지역인 5,6,7,8,9 홀과미생물제제를이용한 IPM 처리구 1,2,3,4 홀은거의대등한발병억제력을보였음. 2 전체적으로브라운팻취가문제가되었으나약제처리를통해모두방제되는결과를얻을수있었음. 3 평가소견금년의경우덥고습한발병호조건을보임으로써브라운패취의발병률이높았으나, 미생물처리구의경우발병시기인 6월이전에예방시약을하였으므로효과적으로브라운팻취를방제할수있었음 - 60 -

< 그림 3.25> 타워골프장에서촬영한브라운팻취 ( 좌 ) 와달라스팟 ( 우 ) 발생사진. < 그림 3.26> 타워골프연습장의발병현황. 미생물을이용한 IPM 처리구 ( 좌 ), 관행관리 ( 좌 ) < 그림 3.27> 유니언골프연습장의발병현황. IPM 처리구 ( 좌 ), 관행관리 ( 좌 ) - 61 -

( 나 ) 토양분석결과 1 세균밀도조사 (MPN method) < 표 3.22> 세균밀도조사결과 구분 홀번호 5월 2일 10월 25일 비고 타워 IPM 1.7 10 6 cfu/g 1.2 10 7 cfu/g 7.2 배증가관행 2.5 10 6 cfu/g 5.5 10 6 cfu/g 2.2 배증가 유니언 IPM 1.9 10 6 cfu/g 1.2 10 7 cfu/g 6.5 배증가관행 2.0 10 6 cfu/g 6.1 10 6 cfu/g 3.1 배증가 2 곰팡이밀도조사 (MPN method) < 표 3.23> 세균밀도조사결과 구분 홀번호 5월 2일 10월 25일 비고 타워 IPM 1.0 10 3 cfu/g 1.0 10 3 cfu/g 변화없음관행 1.3 10 3 cfu/g 6.0 10 2 cfu/g 2배감소 유니언 IPM 1.7 10 3 cfu/g 1.9 10 3 cfu/g 약간증가관행 1.7 10 3 cfu/g 2.0 10 3 cfu/g 약간증가 3 병원성곰팡이밀도조사 (MPN method) : 검출되지않았음.( 선택배지상에서 1000 개체 /g 미만 ) ( 다 ) 토양이화학상조사 1 결과 < 표.3.24> 타워골프연습장토양이화학상조사결과 관리 방법 조사일 ph EC (ms/cm) NO 3 (ppm) NH 4 (ppm) PO 4 (ppm) K (ppm) IPM 관행 5월 12일 6.70 0.54 130 50 이하 70 115 10월 9일 6.91 0.036 30 25 이하 30 10 이하 5월 12일 6.75 0.44 90 50 이하 60 113 10월 9일 6.90 0.034 40 25 이하 20 10 이하 - 62 -

< 표.3.25> 유니언골프연습장토양이화학상조사결과 관리 방법 조사일 ph EC (ms/cm) NO 3 (ppm) NH 4 (ppm) PO 4 (ppm) K (ppm) IPM 관행 5월 3일 6.61 0.54 130 50 이하 68 98 9월 24일 6.92 0.033 50 25 이하 28 10 이하 5월 3일 6.79 0.42 90 50 이하 75 110 9월 24일 6.90 0.034 60 25 이하 40 10 이하 2 평가소견가세균상의증가로미루어보아서처리미생물의정상적인정착이이루어지고있는것으로보임나곰팡이상의변화가없는것은전체미생물의분포중처리유용미생물이병원성미생물을대체하기때문인것으로보이지만, 눈에띄는변화를주지는못하는것으로보임다토양이화학상조사결과미생물처리로인한토양이화학상의변화를기대할수는없음 ( 라 ) 농약사용량의감소효과 1 결과 < 표.3.26> 타워골프연습장농약사용량감소효과 IPM 관행 비고 화학농약처리횟수 5 회 10 회 50% 저감 화학농약사용량 10.5kg 27kg 62% 저감 미생물제제사용량 WP 2kg, SC 8L 0회 WP : 수화제 ; SC : 액상수화제 < 표.3.27> 유니언골프연습장농약사용량감소효과 IPM 관행 비고 화학농약처리횟수 4 9 56% 저감 화학농약사용량 8.4kg 24.3kg 65% 저감 미생물제제사용량 WP 2kg, SC 5L 0회 WP : 수화제 ; SC : 액상수화제 - 63 -

( 마 ) 실험에대한전반적평가 1 전반적인미생물제제의처리결과화학농약은살균제와살충제모두를포함하여 60% 이상저감되어목표인 30% 이상화학농약의저감을달성했다. 2 전체적인토양미생물상조사결과세균의밀도증가가이루어지므로사용된약제는충분히토양에정착하는모습을보인다. 3 브라운팻취를포함하여발생한병을관행관리와버금가는수준에서방제함으로써충분히화학농약을대체할수있음을알수있다. 4 즉효성은화학농약에비해떨어질수있으므로예방시약위주의방제전략이필요할수있다. 5 퍼블릭골프연습장의경우일반회원제골프장에비해내장객의수가많고, 전체적인관리가소홀하기때문에화학농약에의존한방제전략에치우치기쉽다. 이에퍼블릭골프연습장의경우화학농약의사용량을줄이면서도병방제효과를얻을수있는미생물제제의이용이더욱필요하다. 2. 상업용골프장 1( 비발디파크 9 홀골프장, 대중골프장 ) (2 차년도시행 ) 가. 실험개요및추진전략 (1) 실험개요본실험지에서는크게 4가지구체적인목적을가지고실험을진행하였다. 농약사용량의 30% 이상을저감하는환경친화형 IPM 모델수립과미생물제제의적용에따른병방제및잔디품질향상효과의검정, 관행관리코스와의비교를통한경쟁력평가, 새로운제형인배토사의사용을통한실용화여부검정이다. 주요연구항목은다음과같다. ( 가 ) 농약사용량 30% 이상저감환경친화형 IPM 모델수립. 1 선행과제를통해도출된기준 IPM 체계를현장적용시험을위해강원도홍천군에위치한비발디파크 Par 3 골프코스 ( 페어웨이 -한국잔디, 퍼팅그린 -벤트그라스 ) 를대상으로시험. 2 IPM 체계처리 2개 hole 과기존관행처리 hole(ipm 체계처리주변 1개 hole) 간의미생물제제를이용한방제효과및농약저감효과조사. ( 나 ) 미생물제제적용에다른병방제및잔디품질향상효과. 1 골프장에발생하고있는주요병해중기존의미생물제제의사용을통한방제가가능하다고인정되는잔디병을대상으로방제효과를조사. 2 한지형잔디에발생하는달라스팟 (5월), 브라운패취및피시움블라이트 (6월-8 월 ) 에대한방제효과조사. 3 한국잔디에발생하는라지패취 (5월-6 월, 9월-10 월 ) 에대한방제효과조사. - 64 -

4 미생물제제의사용에따른잔디품질향상효과조사. 5 미생물제제의처리구와무처리구간의시기별코스내토양중미생물상조사 6 미생물제제의처리구와무처리구간의토양의이화학성조사 ( 다 ) 관행관리코스와 IPM 처리구와의적용결과비교 1 화학적방제에의존하는관행관리가이루어지는코스에서의농약사용량과 IPM체계에의해방제가이루어지는코스와의병방제효과가인정되는수준에서의화학농약사용량의저감효과를조사. 2 기본적으로미생물제제처리를위주로하되여름철그린에문제가되는병해 ( 브라운패취및피시움블라이트 ) 에대해서는선행연구로도출한미생물제제와의혼용가능한농약의최소사용을통한농약저감효과의평가. 3 관행처리에의한화학농약사용의최소 30% 이상저감수준에서의방제효과조사. ( 라 ) 배토시적용할수있는제형의현장적용실험 1 코스관리상병방제를위한미생물제제의처리을위해개발된제형 ( 입상 ) 의효율적인처리를위한방안으로여름철에그린에발생하는브라운패취및피시움블라이트의방제를위해 5월-6 월에실시하는그린통기작업후배토사처리시입상미생물제제를처리하여방제효과를조사하고관리자의관리상만족도및효과적인처리방법을도출. 2 페어웨이에식재된한국잔디의주요병해인라지패취의방제를위한입상미생물제제를처리하여방제효과를조사하고관리자의관리상만족도및효과적인처리방법을도출. (2) 실험추진전략 상업골프장관리체계에부합하되농약만미생물제제로대체되고다른사항은변화를최소화하였다. 선행과제를통해도출된미생물과화학농약의혼용여부를기준으로골프장에이용하였다. IPM 시행후환경에미치는영향을조사함으로써화학농약대체효과를측정하고타골프장에도적용가능한결과가도출될수있도록하였다. < 표 3.28> 추진일정 연구내용 07년 3월 07 년 4 월 2007-2008 년도연구추진일정 07년 07년 07년 07년 07년 07년 07년 07년 5월 6월 7월 8월 9월 10월 11월 12월 08 년 1 월 08 년 2 월 - 미생물제제적용에따른병방제및잔디품질향상효과 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- - 관행관리코스와 IPM 처리구와의적용결과비교 - 배토시적용할수있는제형의현장적용실험 - 보고서작성 --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- - 65 -

나. 연구내용 (1) IPM 모델적용에따른주요잔디병방제결과 ( 가 ) 재료및방법 1 실험장소강원도홍천군소재 비발디파크 Par 3 골프장 에서 5월부터 11월까지총 7개월간실험을실시하여미생물을이용한친환경골프코스관리 IPM을수립하고자하였다. 골프코스의퍼팅그린 (G) 과페어웨이 (F/W) 에발생하는질병중가장심각한문제가되고있는 4대질병 ( 브라운팻취, 달라스팟, 피시움마름병, 라지팻취 ) 에대한방제효과를검증하고자하였으며, 미생물제제의사용으로인한잔디의종합적품질의상승효과에대하여부가적으로조사하고자하였다. 실험은한국잔디로식재되어있는페어웨이지역을미생물처리구 (A-1, 2) 와무처리구 ( 나머지지역 ) 로구분하여실시하였고, 퍼팅그린의경우는 6, 7, 8, 16, 17, 18번그린을미생물처리구로하였고, 나머지그린을무처리구로하여시기별병의발생유무를조사하였다. 표 1은 Par 3 골프코스내미생물제제처리구와무처리구의전반적특성을나타낸것이다. 아울러인접한비발디파크대중골프장 8번홀을추가적으로무처리구로선정하여병발생을조사하였다. 그림 28은 Par 3 골프코스내미생물제제처리구와무처리구지역을표시한것이고특히, 시험기간중라지패취병의발생지역 ( 청색부분 ) 을표시하였다. < 표 3.29> 비발디파크 Par 3 골프코스내미생물제제처리구와무처리구의전반적특성과대조 구의특징 면적 ( m2 ) 페어웨이 (F/W) 퍼팅그린 (G) 처리구 A-1(10,000), A-2(10,000) #6-#8, #16-#18 ( 총 1,573) 무처리구처리구를제외한지역 #1-#5, #9-#15 ( 총 3,350) 대중골프장 #8 홀 ( 대조 ) 24,556 900 농약사용유무 (2006) 농약사용유무 살균제사용사용사용 살충제사용사용사용 살균제사용사용사용 (2007) 살충제 사용 사용 사용 F/W: 춘고병 F/W: 라지패취발생 F/W: 라지패취발생 병발생유무 (2007 년 ) G: 피시움블라이트병, G: 피시움블라이트병, G: 브라운패취병, 브라운패취병브라운패취병피시움블라이트병, 달라스팟 - 66 -

12 미생물처리구 (F/W) 13 11 100m 14 10 10m 15 미생물처리구 (G) 16 17 9 18 A-1 A-2 7 8 6 LP 발생지역 5 4 3 2 Green( 홀 ) 1 < 그림 3.28> 비발디파크 Par 3 골프장 - 67 -

2 코스관리및약제처리방법시험이수행된비발디파크 Par 3 골프 F/W와그린은거의같은환경조건을가지고있으므로통상적인관리계획으로수행하였다. 병방제외에해충의방제및시비, 통기, 예초등의관리는비발디파크 Par 3 골프코스의관행관리에따라진행하였다. 각각의잔디병에대한적용미생물약제는다음과같다 < 표 3.30>. < 표 3.30> 미생물농약의종류에따른적용대상잔디병및사용법 미생물농약 * 적용잔디병해 < 적용장소 > 제형및사용법 트리고 (Trichoderma harzianum GB-0208) 동전마름병 ( 달라스팟 ), 브라운패취 ( 갈 색잎마름병 )< G> 분상수화제, 1000 배희석 씰러스 (Bacillus subtilis GB-0365) 피시움블라이트병 <G> 액상수화제, 300 배희석 CJ-9(Bacillus subtilis CJ-9) 라지패취 ( 라이족토니아마름병 ) <F/W> 액상수화제, 300 배희석 EW 42-1(Bacillus subtilis EW42-1) 동전마름병 <G> 액상수화제, 300 배희석 * 선행연구에의해적용잔디병해에효과가인정되는미생물농약임. 미생물제제의처리는골프장의지하수를이용하여해당미생물농약의희석배수를준용하여 희석액을제조하고, 희석액을처리할대상페어웨이와퍼팅그린에관주처리 (1l/1 m2처리 ) 하 며, 희석액은살포직전에제조후사용하였다. 3 약제처리일정비발디파크 Par 3 골프코스의관행관리계획을반영하여발생예상되는질병에대한예방및치료를위한미생물제제및농약처리일정을 5월초에코스관리자와협의하여작성하였고 < 표 3.31>, 발병예상시기 1주전에병의예방시약과발병시치료시약을처리하기로계획하였다. 그러나 2007 년의경우 7월중에 19일, 8월중에 24일, 9월중에 20일비가와서당초계획대로미생물제제의처리가이루어지지않았다. 이는비발디파크 Par 3 골프코스의특성상겨울철스키슬로프로이용됨으로상대적으로급격한경사로인해강우시에는미생물농약처리를위한작업차량의진입이어려운관계로당초계획대로미생물을처리하지못하였다. 그결과그린에는주로브라운패취병방제를위해총 5회, 페어웨이에는라지패취병방제를위해총 7회가처리되었고, 화학농약은그린에총 6회, 페어웨이에 7회처리되었다 < 표 3.32>. - 68 -

< 표 3.31> 미생물농약적용일정 ( 계획 ) 일시 미생물농약및내용 주요병해및대체되는농약 LP(F/W) YP(G) DS(G) BP(G) PB(G) 5월 14일 트리코 (G) ( 호리쿠어 ) 5월 21일 CJ-9(F/W), EW42-1(G) ( 호리쿠어 ) 5월 28일 EW42-1(G) ( 호리쿠어 ) 6월 4일 CJ-9(F/W), 씰러스 (G) ( 안타 ) 6월 11일 트리코 (G) ( 호리쿠어 ) 6월 18일 CJ-9(F/W), 씰러스 (G) ( 안타 ) 6월 25일 트리코 (G) ( 헤리티지 ) 7월 2일 씰러스 (G) ( 안타 ) 7월 9일 트리코 (G) ( 호리쿠어 ) 7월 16일 씰러스 (G) ( 안타 ) 7월 23일 트리코 (G) ( 헤리티지 ) 7월 30일 8월 6일 트리코 (G) ( 호리쿠어 ) 8월 13일 8월 20일 트리코 (G) ( 헤리티지 ) 8월 27일 CJ-9(F/W) 9월 3일 트리코 (G) ( 호리쿠어 ) 9월 10일 CJ-9(F/W), 씰러스 (G) ( 안타 ) 9월 17일 9월 24일 CJ-9(F) 10월 1일 10월 8일 CJ-9(F) 10월 15일 10월 22일 CJ-9(F) 10 월 29 일트리코 (G) (YP) ( 헤리티지 ) 11 월 5 일 11 월 12 일트리코 (G) (YP) ( 호리쿠어 ) 11 월 19 일 CJ-9(F/W) ( 춘고병 ) 11 월 26 일트리코 (G, F/W) (YP) ( 호라쿠어 ) a 용어설명 (F/W= 페어웨이 ; G= 퍼팅그린 ), LP( 라지패취 ), YP( 옐로우패취 ), DS( 달라스팟 ), BP( 브라운패취 ), PB( 피시움 블라이트 ) - 69 -

< 표 3.32> 실제로사용한미생물농약및화학농약처리내역 일시 미생물농약및내용 주요병해대상및처리된화학농약 LP(F/W) YP(G) DS(G) BP(G) PB(G) 5월 30일 CJ-9(F/W), EW42-1(G) 6월 2일 리도밀엠지 6월 5일 씰러스 (G), 트리코 (G) 7월 10일 CJ-9(F/W) 7월 12일 호리쿠어 7월 25일 호리쿠어 7월 27일 호리쿠어 8월 10일 호리쿠어 호리쿠어 8월 23일 CJ-9(F/W), 트리코 (G) 호리쿠어 8월 24일 호리쿠어 8월 27일 호리쿠어 9월 3일 CJ-9(F/W) 9월 5일 호리쿠어 9월 10일 트리코 (G) 9월 16일 호리쿠어 9월 19일 CJ-9(F/W) 9월 27일 트리코 (G) 10월 1일 CJ-9(F/W) 10월 5일 호리쿠어 10월 8일 트리코 (G) 10월 10일 CJ-9(F/W) 11월 2일 호리쿠어 a 용어설명 (F/W= 페어웨이 ; G= 퍼팅그린 ), LP( 라지패취 ), YP( 옐로우패취 ), DS( 달라스팟 ), BP( 브라운패취 ), PB( 피시움 블라이트 ) 4 병발생조사본연구에서조사대상잔디병 ( 라지패취병, 브라운패취병, 피시움블라이트병, 달라스팟 ) 의발생을여부를조사하기위해 5월하순부터주기적으로골프코스를방문하여미생물처리구와무처리구에서의병발생여부를조사하였다. 아울러병발생시코스관리자의관리일지상의발생시기를준용하였다. - 70 -

( 나 ) 결과및고찰 1 라지패취골프코스에는 7월중순과 10 월중순에발생하였으며 < 표3.33>, 미생물처리구 (A-1과 A-2) 에서는라지패취병이발생하지않았고미생물을처리하지않은지역지역에서발생하였다. 7월중순에미생물무처리지역인 5번과 6번그린사이의전년도발생지역 < 표3.33> 에서다시발병하였고, 3번과 5번그린사이 < 그림 3.31> 에서다수의병반이새로발생하였으며, 10월초순에 5번그린위작업도로변 < 그림 3.32> 에도다수의병반이새로발생하였다. 그러나 5월 (1회), 7월 (1회), 9월 (2회) 과 10월 (2회) 에본병관련미생물제제 (Bacillus subtilis CJ-9) 를처리 < 표3.33> 한처리구인 A-1과 A-2의경우라지패취병이발병하지않아미생물제제의효과가인정되었다. < 그림 3.30> 7 월중순에무처리구 (5 번과 6 번그린사이 ) 에 발생한라지패취병반의 6 월초순의모습 - 71 -

< 그림 3.31> 7 월중순에무처리구 (3 번과 5 번그린사이 ) 에 발생한라지패취병반모습 < 그림 3.32> 10 월초순에무처리구 (5 번그린위작업도로 ) 에발생한라지패취병반모습 2 브라운패취 7 월초순에발생하기시작하여 8 월하순까지발생하였으며 < 표 3.33>, 미생물제제처리구에서 7 월초순에 1 회발생한후이후발생하지않았다. 3 피시움블라이트 6 월초순경에무처리구인 #15 그린에서발생하였으며 < 표 3.33>, 미생물제제처리구에서는발 생하지않았다. 4 달라스팟 조사대상병해인달라스팟은시험기간중에발생하지않았다. - 72 -

< 표 3.33> 미생물제제처리구및무처리구의월별병발생과병반수 병명 ( 대상지역 ) 처리 5월 6월 7월 8월 9월 10월 11월 라지패취 (F/W) 처리구 0 0 0 0 0 0 0 무처리구 0 0 7 0 0 6 0 브라운패취 (G) 처리구 0 0 2 0 0 0 0 무처리구 0 0 4 3 0 0 0 피시움블라이트 (G) 처리구 0 0 0 0 0 0 0 무처리구 0 0 2 2 0 0 0 달라스팟 (G) 처리구 0 0 0 0 0 0 0 무처리구 0 0 0 0 0 0 0 병반수 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 5 월 6 월 7 월 8 월 9 월 10 월 11 월 라지벳취 (F/W) 처리구라지벳취 (F/W) 무처리구브라운벳취 (G) 처리구브라운벳취 (G) 무처리구피시움블라이트 (G) 처리구피시움블라이트 (G) 무처리구달라스팟 (G) 처리구달라스팟 (G) 무처리구 < 그림 3.33> 월별주요잔디병의발생현황 (2) 미생물을이용한 IPM 모델적용에따른토양미생물상의변화골프코스의관리에있어문제가되는병의대부분은토양병원성곰팡이에의해발생한다. 이들병원균은토양에존재하다가밀도가높아지고, 발병호조건이충족된다면잔디에병을일으키게되는데, 미생물제제의사용은토양내병원균의밀도를조절할수있다고알려져있다. 본실험에서는미생물제제의사용에따른토양중병원균 (Rhizoctonia solani 와 Pythium sp.) 의밀도를선택배지 (selective medium) 를이용해조사하였다. - 73 -

( 가 ) 재료및방법 1 Bacillus subtilis CJ-9처리에따른토양중 Rhizoctonia solani의밀도조사가대상코스에서샘플러를이용하여미생물처리구와무처리구를대상으로각 3반복씩토양샘플을채취한다. 나토양을음지에서 24시간이상풍건한다. 다토양 5g을 50ml물한천배지 (water agar, WA; agar 함량 0.03%) 에넣고 voltexing 한후 serial dillution 한다. 라다에서 serial dillution 한토양함유 WA를 micro-pipet 으로 1ml취하여 Rhizoctonia solani 선택배지 < 표 3.34> 를분주한 petri-dish 에 drop 한다 ( 보통 250 개이상 drop 한다. petri-dish 당 30개씩 drop). 마 72시간경과후, 선택배지위에 drop 한토양함유 WA에서형성된 Rhizoctonia 균을현미경하에서동정 < 그림 3.34> 하고, 배지에형성된균총의수를계수한다. < 표 3.34> Rhizoctonia solani 선택배지 a Rate K 2HPO 4 1.0g MgSO 4 7H 2O 0.5g KCl 0.5g FeSO 4 7H 2O 10.0 mg NaNO 2 0.2g gallic acid 0.4g dexon 70% WP 90.0 mg fosetyl-al 0.25g chloramphenicol 50.0 mg streptomycin 50.0 mg agar 20.0g distilled water 1,000 ml a Ko and Hora, 1971. A selective medium for the quantitative determination of Rhizoctonia solani in soil. Phytopathology 61:707-710. 2 씰러스 (Bacillus subtilis GB-0365) 처리에따른토양중 Pythium spp. 의밀도조사 가대상코스에서샘플러를이용하여미생물처리구와무처리구를대상으로각 3 반복씩토양 샘플을채취한다. - 74 -

나토양을음지에서 24시간이상풍건한다. 다토양 5g을 50ml물한천배지 (water agar, WA; agar 함량 0.03%) 에넣고 voltexing 한후 serial dillution 한다. 라다에서 serial dillution 한토양함유 WA를 micro-pipet 으로 1ml취하여 Pythium sp. 선택배지 < 표 3.35> 를분주한 petri-dish 에 drop 한다 ( 보통 250 개이상 drop 한다. petri-dish 당 30 개씩 drop). 마 72시간경과후, 선택배지위에 drop 한토양함유 WA에서형성된 Pythium sp. 을현미경하에서동정 < 그림 3.37> 하고, 배지에형성된균총의수를계수한다. a < 표 3.35> Pythium sp. 선택배지 a Rate Sucrose 2.40g Asparagine 0.27g KH 2 PO 4 0.15g K 2HPO 4 0.15g MgSO 4 7H 2O 0.10g Cholesterol 0.01g Benlate (50% Benomyl) 0.02g Terrachlor (75% PCNB) 0.027g Neomycin Sulfate 0.10g Chloroamphenicol 0.01g Distilled water 1,000 ml Agar (Difco) 20.00g Schmitthenner. A. F. 1980. Pythium species. Isolation, biology and identification. Pp 33-36. In: Advances in Turfgrass Pathology. Larsen, P. O. and Joyner, B. G., eds. Harcourt Brace Jovanovich, Duluth, M. N. 197pp. ( 나 ) 결과및고찰 1 Bacillus subtilis CJ-9 처리에따른토양중 Rhizoctonia solani 의밀도조사 라지패취병방제를위한전용미생물제제인 Bacillus subtilis CJ-9 처리에따른토양중 Rhizoctonia solani 의밀도를조사하기위하여선택배지상에서 R. solani 를확인 < 그림 3.34> 하 - 75 -

여계수한결과 B. subtilis CJ-9을 5월 30일에최초처리후 6월 16일토양을채취하여무처리구와비교한결과처리구 (A-1) 의토양 g 당 R. solani 의검출빈도는평균 49.7 10 2 CFU로무처리구 (71.0 10 2 CFU) 에비해현저하게낮았고, 7월 10일 2차처리후 7월 13일토양을채취하여무처리구와비교한결과토양 g 당 R. solani 의검출빈도는평균 25.0 10 2 CFU로무처리구 (42.0 10 2 CFU) 에비해낮았다 < 표 3.36>, < 그림 3.34>. 상대적으로 7월 13일과 8월 3일의검출빈도가 6월 16일에비해낮은것은기온이높아져상대적으로검출빈도가낮았던것으로판단되며, 이는 8월중신규병해의발생이없었던것 < 그림 3.35> 과관련이있다고판단된다. 무처리구로선정된비발디파크대중골프장 (8번 F/W) 에서는 7월중순에라지패취병이신규로발생하였고, 10월하순까지계속발생하였다. 10 월중순에새로발생한라지패취병발생지역인 5번그린위작업도로변 < 그림3.32> 을대상으로 B. subtilis CJ-9을처리하기전에토양을채취하여토양 g 당 R. solani의검출빈도을조사한결과처리구예정지역은평균 19.7 10 2 CFU로무처리구 (22.0 10 2 CFU) 와비슷하였으나, B. subtilis CJ-9을처리 (10월 12일 ) 7일후토양을채취하여무처리구와비교한결과토양 g 당 R. solani 의검출빈도는평균 15.3 10 2 CFU로무처리구 (26.0 10 2 CFU) 에서는증가하였으나처리구에서는감소하는경향을나타내 B. subtilis CJ-9 처리에따른병방제효과가인정되었다 < 표 3.36 과그림 3.36>. < 그림 3.34> Rhizoctonia solani 선택배지에서형성된균총의모습 ( 왼쪽 ) 과 R. solani 의전형적인모습 ( 오른쪽 ) - 76 -

< 표 3.36> 6 월중순부터 8 월초순에걸쳐미생물제제 (Bacillus subtilis CJ-9) 처리구와무처리 구간의토양중 Rhizoctonia 균의검출빈도 조사일시 ( 시료채취일 ) 6/16 7/13 8/3 No. Rhizoctonia solani ( 10 2 CFU/g soil) 처리구 1반복 2반복 3반복 평균 무처리구 67 67 79 71.0 처리구 64 49 36 49.7 무처리구 46 33 48 42.0 처리구 22 24 29 25.0 무처리구 24 51 34 36.3 처리구 17 28 23 22.7 ( 10 2 CFU/g soil) 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 무처리구처리구 0.0 6 월 16 일 7 월 13 일 8 월 3 일 < 그림 3.35> 6 월중순부터 8 월초순에걸쳐미생물제제 (Bacillus subtilis CJ-9) 처리구와 무처리구간의토양중 Rhizoctonia 균밀도 < 표 3.37> 10 월중순에발생한라지패취병발생지역에서의미생물제제 (Bacillus subtilis CJ-9) 처리구와무처리구간의토양중 Rhizoctonia 균의검출빈도 조사일시 ( 시료채취일 ) 10/12 10/19 No. Rhizoctonia solani ( 10 2 CFU/g soil) 처리구 1반복 2반복 3반복 평균 무처리구 23 23 20 22.0 처리구 (CJ-9 처리전 ) 19 20 20 19.7 무처리구 26 29 23 26.0 처리구 (CJ-9 처리후 ) 12 19 14 15.3-77 -

10 2 CFU/g soil 30.0 25.0 20.0 15.0 10.0 5.0 무처리구처리구 0.0 10 월 12 일 10 월 19 일 < 그림 3.36> 10 월중순에발생한라지패취병발생지역에서의미생물제제 (Bacillus subtilis CJ-9) 처리구와무처리구간의토양중 Rhizoctonia 균밀도변화 2 Bacillus subtilis GB-0365 처리에따른토양중 Pythium spp. 의밀도조사피시움블라이트병의방제를위한전용미생물제제인씰러스 (Bacillus subtilis GB-0365) 처리에따른토양중 Pythium sp. 의밀도를조사하기위하여선택배지상에서 Pythium sp. 를확인 < 그림 3.37> 하여계수한결과 씰러스 를 6월 5일처리후 6월 16 일과 7월 13 일에그린에서채취한토양중 Pythium sp. 균의분포를조사한결과무처리구에비해현저하게감소된것을확인하였다 < 표 3.38>. < 그림 3.37> Pyhtium sp. 선택배지에서형성된균총의모습 ( 왼쪽 ) 과 Pyhtium sp. 의전형적인모습 ( 오른쪽 ) - 78 -

< 표 3.38> 6 월중순부터 7 월초순에걸쳐씰러스 (Bacillus subtilis GB-0365) 처리에따른토양 중 Pythium sp. 균의검출빈도 조사일시 ( 시료채취일 ) 처리구 No. Pythium sp. ( 10 1 CFU/g soil) 1 반복 2 반복 3 반복평균 6/16 7/13 무처리구 (#4G) 55 44 48 49.0 처리구 (#7G) 8 5 8 7.0 무처리구 (#4G) 82 91 79 84.0 처리구 (#7G) 13 1 10 8.0 10 1 CFU/g soil 90.0 80.0 70.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0 0.0 6 월 16 일 7 월 13 일 무처리구 (#4G) 처리구 (#7G) < 그림 3.38> 6 월중순부터 7 월초순에걸쳐 씰러스 (Bacillus subtilis GB-0365) 처리에따른토양중 Pythium sp. 균의밀도변화 - 79 -

(3) 미생물제제의사용에따른토양의이화학상조사 ( 가 ) 재료및방법본조사의토양이화학적특성분석은서울시립대토양환경연구실에시험분석을의뢰하였다. 분석은 SSSA(Soil Science Society of America) 의 Method of Soil Analysis 를준용하여수행하였으며, 각항목에대한세부방법은아래와같다. 1 토성 (Soil Texture) 토성은 micro-pipette 법 (Miller 와 Miller, 1987) 을이용하였다. 풍건토양 2g을 50ml centrifuge tube에넣고분산제 40ml를가한후 end-over-end shaker 에넣고 50rpm 으로 12시간진탕하였다. 진탕후현탁액이고루섞이도록흔든후 Stokes 의법칙에의거하여 2μm이하의입자가침강하는데걸리는시간 (20, 1시간 56분 3초 ) 후 micro pipette 으로 2.5 cm깊이에서 5초간에걸쳐서서히 2.5 ml의현탁액을취하여미리무게를달아놓은 weighing pan에이현탁액을옮겨 10 5 건조기에건조후 0.1 mg까지칭량하였다 (clay의분리 ). No. 270(53 μm ) 체에현탁액 2.5 ml를취하고남은시료를거르고증류수로맑은물이나올때까지세척한후미리무게를달아놓은 weighing pan에옮겨 105 건조기에건조한후칭량하였다. 미사는실험에사용한토양무게에서모래와점토의무게를뺀값으로나타내었다. 2 유기물함량 (Soil Organic Matter) 토양시료의유기물함량은 Walkley-Black 법으로정량하였다. 0.5 mm체에통과시킨풍건시료 0.5g 을 500 ml삼각 flask 에취하고 1N-K2Cr2O7 용액 10ml와진한황산 20ml를차례로가한후서서히흔들어준다음 30분간방치하였다. 증류수 200 ml를가하고지시약 (0.025M o-phenanthroline-ferrous Complex) 을넣은후 0.5N-FeSO 4 로적정하여유기물함량을구하였으며계산방법은아래와같다. 유기탄소 (%) = (B - T) (FeSO4 농도 ) 12 100 S 1000 4 77 B : blank 적정시소모된 FeSO 4 의양 ( ml ) T : 시료적정시소모된 FeSO 4 의양 ( ml ) S : 토양시료무게 (g) 100 유기물함량 (%) = 유기탄소 (%) 1.724(Van Bemmelem factor) 3 토양반응 (ph) ph 는풍건토 5 g 을 50 ml 시험관에취하여증류수 25 ml를가하고 1 시간진탕한후 ph meter(mp 220, Mettler, UK) 로측정하는초자전극법 (Thomas, 1996) 으로분석하였다. 4 유효인산 (Available Phosphorus) 유효인산은 Bray No. 1 법 (Kuo, 1996) 에따라정량하였다. 풍건토양 2.85g 을 100 ml삼각플라 - 80 -

스크에취하여 Bray No. 1 침출액 (0.025N HCl+ 0.03N NH 4 F) 20ml을가하고 1분간흔든다음여과지 (Whatman No. 42) 에여과하였다. 50ml용량메스플라스크에여액을 1~5 ml취하고, 발색시약 (ammonium molybdate + H 2 SO 4 + antimony potassium tartarate + ascorbic acid) 을 6ml가하여증류수를표선까지채운다음혼합하고, 이용액의일부를측정용기 (cell) 에옮겨서파장 880 nm에서 UV-Spectrophotometer(UV-160A, Shimadzu, Japan) 를이용하여흡광도를측정하였다. 이때표준용액의인산함량 (0, 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0 ppm) 에따른흡광도도시료액의조작과정과똑같은과정을거쳐측정하고표준곡선을작성하고, 이표준곡선으로부터유효인산의양을구하여 ppm-p 로나타내었다. 5 전기전도도 (EC: Electrical Conductivity) EC 는농촌진흥정표준분석법에따라풍건토 5g 을 50 ml시험관에취하여증류수 25 ml를가 하고 1 시간진탕한후 EC meter(mc 226, Mettler, UK) 로측정하였다. 6 양이온교환용량 (CEC: Cation Exchange Capacity) 양이온교환용량은 ammonium acetate 법 (1N CH 3 COONH 4, ph=7.0) 으로정량하였다. 양이온교환용량분석용침출관에 2mm체를통과한풍건세토 5g을취하고 50ml의 1N CH 3 COOH 4 용액으로시료를 NH + 4 로포화시킨다음 ethyl alcohol 60ml로흡착되지않은 NH + 4 를세척제거하고, 1N KCl 용액 60ml로써흡착된 NH + 4 를치환하고이용액 10ml의 NH + 4 를 Kjeldahl 증류하여 0.01N H 2 SO 4 용액으로적정하여정량하였다. 따로증류수를써서같은조건에서바탕시험을행하고, 다음식으로계산하였다. 7 치환성양이온 (Exchangeable Cation) 치환성양이온 (Ca, Mg, K, Na) 은 1 N 초산암모니아법 (Sumner와 Miller, 1996) 에따라구하였다. 양이온치환용량분석용침출관 (column) 의하부에여과지 (Whatman No. 2) 를깔고, 풍건토양 5g을취하여양이온치환용량분석세트에연결시켰다. 침출관에 1 N CH 3 COONH 4 (ph = 7.0) 용액을 50ml넣고, 하루밤정치한후침출관하부에연결된삼각플라스크에방울방울떨어지게하여침출관내토양을 NH + 4 로포화시키고토양시료에흡착된양이온을침출하였다. 침출된용액은 (Whatman No. 42) 에여과한후여액중의양이온함량을원자흡광분석기 (atomic absorption spectroscopy AA-6800, Shimadzu, Japan) 로측정하였다 (Helmke와 Sparks, 1996; Suarez, 1996). 필요에따라여액을적절하게희석하여원자흡광분광분석기로측정하였다. ( 나 ) 결과및고찰토양이화학상의경우조사된결과그결과퍼팅그린과페어웨이의경우조사일자별로별다른차이가없어큰유의성을발견할수없었으며 < 표 3.39, 3.40>, 보통의경우 ph, EC, 유기물 (O.M) 함량, 유용인산, CEC는한국잔디연구소에서추천하는적정범위 < 표 3.41> 를유지하였다. - 81 -

< 표 3.39> 비발디파크 Par 3 골프코스토양이화학상분석 ( 그린 ) IPM=#7G, 관행 =#4G 관리방법 IPM 조사일 ph EC ( 월 / 일 ) (W 1:5) (ds/m) O.M. Avail.-P Ca Mg K Na Soil Texture CEC (%) ( mg / kg ) cmol/ kg ( 토성 ) 6/16 6.31 0.02 0.95 46.25 2.64 0.82 0.29 0.32 1.89 Sand 7/13 6.49 0.02 0.07 39.60 4.47 0.48 0.35 0.21 0.16 Sand 8/3 5.72 0.05 0.61 19.06 2.12 1.46 0.22 0.22 0.78 Sand 평균 - 6.17 0.03 0.54 34.97 3.08 0.92 0.29 0.25 0.94-6/16 6.55 0.02 0.82 36.98 3.19 1.30 0.33 0.37 1.88 Sand 관행 7/13 6.94 0.02 1.02 57.98 4.78 0.53 0.27 0.17 0.15 Sand 8/3 6.54 0.04 1.91 46.20 3.53 2.33 0.37 0.27 3.55 Sand 평균 - 6.68 0.03 1.25 47.05 3.83 1.39 0.32 0.27 1.86 - < 표 3.40> 비발디파크 Par 3 골프코스페어웨이토양의이화학상분석결과 관리방법 IPM 조사일 ph EC O.M. Avail.-P Ca Mg K Na Soil Texture CEC ( 월 / 일 ) (W 1:5) (ds/m) (%) ( mg / kg ) cmol/ kg ( 토성 ) Loamy sand 5/12 6.52 0.11 6.19 95.52 10.95 7.39 1.96 0.76 0.93 ( 사양토 ) 6/16 6.55 0.08 6.74 76.53 12.44 7.45 1.87 0.79 1.98 Loamy sand 7/13 6.66 0.06 0.14 19.51 12.36 4.64 1.63 0.55 0.22 Loamy sand 8/3 6.61 0.17 4.76 109.95 13.96 10.62 2.50 1.19 1.99 Loamy sand 평균 - 6.59 0.11 4.46 75.38 12.43 7.53 1.99 0.82 1.28-5/12 6.64 0.11 6.40 75.93 7.66 6.11 1.38 0.54 0.83 Loamy sand ( 사양토 ) 관행 6/16 6.53 0.10 5.78 55.75 9.15 4.70 1.51 0.83 1.97 Loamy sand 7/13 6.60 0.04 1.70 66.80 10.35 2.93 1.23 0.52 0.30 Loamy sand 8/3 6.67 0.11 5.10 83.02 15.13 10.89 2.27 1.06 0.15 Loamy sand 평균 - 6.61 0.09 4.75 70.38 10.57 6.16 1.60 0.74 0.81 - < 표 3.41> 한국잔디연구소에서추천하는토양의적정양분상태 구 분 ph (W 1:5) EC (ds/m) O.M. (%) Avail.-P ( mg / kg ) CEC 퍼팅그린 5.5-6.5 0.2 이하 0.5-1.5 30-60 5-15 페어웨이 6.0-7.0 0.3 이하 1.5-2.5 75-150 10-20 - 82 -

(4) 미생물제제의사용에따른잔디품질의변화 미생물제제를이용한병방제의경우단순히병의억제및치유뿐만아니라종합적인잔디품질의향상효과를고려할수있다. 그러나본연구에서는미생물처리에따른잔디품질의변화에구체적인조사를할수없었다. 이는본시험이수행된 비발디파크 Par 3 골프코스 의경우시약이나시비등이일반골프코스에비해집약적인관리가이루어지지않는관계로골프코스내지역에따른잔디상태가가시적으로도차이가나서시료채취지역에따라품질에대한편차가있으므로미생물제제의처리유무에따른절대적인잔디품질비교가이루어질수없었다. (5) 미생물을이용한 IPM 모델적용에따른화학농약의저감효과 비발디파크 Par 3 골프코스 의미생물제제처리구와미생물제제를사용하지않은관행구로서집중적인관리가이루어지고있는 대중골프장 #8 홀 을대상으로화학농약의사용횟수와사용량을비교하였다. 비발디파크 Par 3 골프코스 와 대중골프장 #8홀 의퍼팅그린에사용된화학농약은터부코나졸액상수화제 (tebuconazole, 유효성분 20%, 호리쿠어 R ) 와메타실엠수화제 [metalaxyl( 유효성분 7.5%)+ mancozeb( 유효성분 56%), 리도밀엠지 R ] 이고, 페어웨이에사용된화학농약은터부코나졸액상수화제이다. 이들농약을농약사용지침서상에사용방법은농약희석액을 1l/ m2로토양관주처리하도록되어있어 1,000 m2당사용량으로환산할경우페어웨이와그린에서의사용량은표 25와같다. 라지패취병방제를위해페어웨이에사용된화학농약은미생물제제처리구에서는사용하지않았고, 무처리구에서는터부코나졸액상수화제 ( 호리쿠어 ) 를 7회사용하였다. 피시움블라이트병과브라운베취병의방제를위해미생물제제처리구에서는 2회사용하였고, 반면에무처리구에서는메타실엠수화제 ( 리도밀엠지 ) 1회, 터부코나졸액상수화제 ( 호리쿠어 ) 를 5 회등총 6회사용하였다. 면적대비화학농약의사용량은페어웨이의경우전혀사용하지않았고, 퍼팅그린의경우는미생물제제처리구에 6월초순에피시움블라이트병과 7월중순의브라운패취병의발생으로인한화학농약의사용이각각 1회사용되었다. 비발디파크 Par 3 골프코스 에서는전반적으로그린에병의발생이상대적으로 대중골프장 #8 홀 의퍼팅그린에비해적었지만사용된화학농약사용량에있어 60.2% 의저감효과를나타내목표치인 30% 를훨씬상회하는저감효과를얻을수있었다. 본시험기간중페어웨이의미생물제제처리구에서는라지패취병이발생되지않아그린보다는페어웨이에서높은저감효과를얻을수있었고, 골프코스의절대적인면적을차지하는페어웨이의위치상전체적인저감효과를주도하여높은저감효과를얻을수있었다. 그러나미생물제제의사용에따른비용적인문제는별도로고려해야할부분이다. < 표 3.42> 1,000 m2당 Par 3 골프코스 와 대중골프장 #8 홀 의농약사용횟수및사용량비교 - 83 -

구분페어웨이 (F/W) 퍼팅그린 (G) 처리내용 Par 3 골프코스대중골프장 #8 홀 ( 미생물제제처리구 ) ( 미생물제제무처리구 ) 비고 화학농약처리횟수 0 회 7회 ( 호리쿠어 ) - 화학농약사용량 0.0l 70.0l 100.0% 저감 미생물제제사용량 23.1l(CJ-9. 7회 ) 0회 화학농약처리횟수 2회 ( 리도밀엠지 1회, 6회 ( 리도밀엠지 1회, 호리쿠어 1회 ) 호리쿠어 5회 ) - 화학농약사용량 1.65 kg, 1.0l 1.65 kg, 5.0l 60.2% 저감 미생물제제 4kg ( 트리고, 4회 ), 사용량 ( 횟수 ) 0.3l( 씰러스, 1회 ) 0회 WP : 수화제 ; SC : 액상수화제 터부코나졸액상수화제 ( 호리쿠어 ) = 10ml/20l/20 m2 메타실엠수화제 ( 리도밀엠지 ) = 33g/20l/20 m2 다. 실험결과종합고찰 (1) 미생물제제의병방제효과 비발디파크 Par 3 골프코스 의미생물제제처리구와무처리구를비교하였을때페어웨이에서의라지패취병의발생은미생물제제처리구에서는발생하지않았으며, 무처리구에서는 7 월과 10월에신규발생이조사되어 Bacillus subtilis CJ-9처리에의한라지패취병의발병억제효과가인정됨. 퍼팅그린의경우 6월에피시움블라이트병이미생물제제처리구와무처리구에서일부발생하였으나이후처리구에서는발생이조사되지않았으며, 브라운패취병의경우 7월중순에전반적으로발생하여문제가되었으나이후처리구에서는신규발생이관찰되지않아 트리고 (Trichoderma harzianum GBF-0208) 처리에따른효과가인정됨. 금년의경우 7월부터 9월에걸쳐잦은강우로인해상대적으로라지패취병과의브라운패취의발병이많았다. 그러나이와같은환경조건에의해미생물제제가계획대로처리되지않았으나처리구에서의라지패취병의발생이없었던것은 5월하순과 7월초순의미생물제제처리효과라고인정됨. (2) 미생물제제처리에따른주요병원균의밀도변화 한국잔디 (zoysiagrass) 로식재되어있는페어웨이에발생하는라지패취병방제용 Bacillus subtilis CJ-9처리에의해처리구와무처리구에서의토양중대상병원균인 Rhizoctonia solani 의밀도감소가확인되었으며, 또한발병지역에서의처리에의한 R. solani 의밀도감소현상을통해라지패취병균에대한본미생물제제의방제효과가인정됨. - 84 -

벤트그라스로식재된퍼팅그린에서의 Pythium spp. 의밀도감소는 씰러스 (Bacillus subtilis GB-0365) 처리에의한효과로인정됨. (3) 토양이화학상의변화결과요약과분석 조사기간중그린과페어웨이토양의이화학상은한국잔디연구소에서추천하는적정범위를유지하였음. 페어웨이와퍼팅그린구별없이이화학상의변화는본미생물제제의처리에따른유의성을찾아볼수없음. 따라서미생물처리로인한토양이화학상의변화를기대할수는없음 (4) 미생물제제의잔디품질향상결과요약과분석 비발디파크 Par 3 골프코스 는상대적으로일반골프코스에비해상대적으로집중관리되고있지않으며, 조사지역에따라잔디의생육에차이가커서페어웨이에서의미생물제제의처리구와무처리구간의잔디품질에대한차이는구별하기가곤란하였음. 그러나 Trichoderma spp. 이일반적으로가지고있는뿌리생육촉진과양분흡수능력의향상에대한기존의연구결과등을미루어볼때, 재배환경이동일한지역에서의잔디생육에대한별도의시험이추가되어야할것으로판단됨. (5) 농약사용량의감소효과 비발디파크 Par 3 골프코스 는일반골프코스에비해상대적으로시비나예초등과같은집약관리가이루어지지않아병의발생이적었으나집중적인관리가이루어지고있는 대중골프장 #8 홀 을대상으로화학농약의사용횟수와사용량을비교한결과미생물제제가처리된페어웨이에서는라지패취병의발생이관찰되지않았고, 퍼팅그린에서의농약사용도현저히줄여사용하여도관련병의방제에효과가인정되어화학농약의감소효과가인정됨. 6. 실험에대한전반적평가 전반적인미생물제제의처리결과화학농약은살균제와살충제모두를포함하여 60% 이상저감되어목표인 30% 이상화학농약의저감을달성하였음. 미생물제제의처리에의한주요병원균의밀도감소효과로인한병방제효과가인정됨. 기후환경적인영향 ( 잦은강우 ) 으로예정된미생물제제의예방위주의처리가이루어지지않아일부퍼팅그린에서의병발생이관찰되었으나관행관리와버금가는수준에서방제함으로써충분히화학농약을대체할수있음을확인하였음. 코스관리상병방제를위한미생물제제의처리을위해개발된제형 ( 입상 ) 의효율적인처리 - 85 -

를위한방안으로여름철에그린에발생하는브라운패취및피시움블라이트의방제를위해 5월-6 월에실시하는그린통기작업후배토사처리시입상미생물제제를처리하여방제효과를조사하여관리자의관리상만족도및효과적인처리방법을도출하고자하였으나, 코스관리일정상해당시기에처리하지못하여관련시험이수행되지못하였음으로이는추후시험이수행되어야할것임. 2. 상업용골프장 2( 서서울 C.C) (2 차년도시행 ) 가. 개요 파주에위치한서서울 C.C에서길항미생물제제를이용한 IPM 모델을적용하였다. 본실험지는수도권에위치하여접근성이좋아성수기인 3-10 월에는약 150 팀이상이방문하는내장객의수가매우많은골프장이다. 1993 년개장하여 15년이상운영하여왔기때문에본연구과제의실험에적합한환경이라할수있다. 총 18홀규모의골프장으로약 32만평의면적을가지고있고, 한홀에 2개의그린을가지고있는 2그린시스템의골프장이다. 내장객수가매우많은관계로답압스트레스가심각하고, 잔디관리에어려움이많은전형적인수도권소재골프장의모습을보이므로현시스템에적용할수있는미생물농약과 IPM 모델의개발은미생물농약보급에큰역할을할것으로기대한다. 본실험지에서는관리자의도움을받아평년의병충해발생상황과관리작업일정을입수하였고, 이를기준으로미생물농약을이용한 IPM 모델을세웠다. 약제처리는액상수화제, 수화제, TAC 제형을복합적으로처리하였고, 미생물농약에의해방제가어려운병혹은해충은관행관리에서사용하는화학농약을처리하였다. 관행관리와 IPM 모델의처리에따른효과의평가는병발생량과화학농약사용량의저감효과를기준으로하였다. 나. 연구내용 (1) 실험방법및재료 1 실험장소 본실험지는파주광탄면에위치한 18홀규모 (32만평 ) 의골프장으로 15년역사의골프장이다. 매년매우많은내장객이방문하는골프장중한곳으로많은답압스트레스가존재하며, 경기운영에방해되지않는관리작업이필요한곳이다. 전체적으로코스는 Lake 코스와 Hill 코스로나뉘어져있으며, 본실험은 Lake 코스 5번홀에서이루어졌으며, 페어웨이실험은면적기준으로횡으로분할하여좌측은대조구, 우측은실험구로정하였고, 그린은해당페어웨이에위치한그린을실험구와대조구로정하였다. 전반적인특성과조감도는 < 표 3.43>, < 그림 3.39, 그림 3.40> 과같다. - 86 -

< 표 3.43> 실험지의전반적특성 면적 ( m2 ) 잔디식재분포농약사용유무 (2006) 농약사용유무 (2007) IPM 관행 페어웨이 (F/W) 1500 m2 1450 m2 퍼팅그린 700 m2 550 m2 (G) 실험구페어웨이한국잔디 ( 중지 ) 한국잔디 ( 중지 ) (F/W) 퍼팅그린벤트그라스 (G) 대조구 벤트그라스 살균제 사용 사용 살충제 사용 사용 살균제 사용 사용 살충제 사용 사용 병발생유무 (2007 년 ) F/W: 라지패취 G: 피시움마름병, 브라운패취병 F/W: 라지패취 G: 피시움마름병, 브라운패취병 < 그림 3.39> 골프장조감도 (5 번홀 ) - 87 -

< 그림 3.40> 실험지 5 번홀의조감도 2 코스관리및약제처리방법 시험이수행된서서울 CC의코스중그린은매우집중적인관리가이루어지고, 페어웨이는조방적인관리가이루어진다. 미생물을이용한 IPM 처리구역시그린에더욱집중적인관리를진행하였고, 병방제외에해충의방제및시비, 통기, 예초등의관리는서서울 CC 골프코스의관행관리에따라진행하였다. 각각의잔디병에대한적용미생물약제는다음과같다 < 표 3.44>. < 표 3.44> 미생물농약의종류에따른적용대상잔디병및사용법 미생물농약 * 적용잔디병해 < 적용장소 > 제형및사용법 트리고 (Trichoderma harzianum GB-0208) 동전마름병 ( 달라스팟 ), 브라운패취 ( 갈 색잎마름병 )< G> 분상수화제, 1000 배희석 씰러스 (Bacillus subtilis GB-0365) 피시움블라이트병 <G> 액상수화제, 300 배희석 CJ-9(Bacillus subtilis CJ-9) 라지패취 ( 라이족토니아마름병 ) <F/W> 액상수화제, 300 배희석 EW 42-1(Bacillus subtilis EW42-1) 동전마름병 <G> 액상수화제, 300 배희석 * 선행연구에의해적용잔디병해에효과가인정되는미생물농약임. 미생물제제의처리는골프장의지하수를이용하여해당미생물농약의희석배수를준용하여희석액을제조하고, 희석액을처리할대상페어웨이와퍼팅그린에관주처리 (1l/1m2처리 ) 하며, 희석액은살포직전에제조후사용하였다. 3 약제처리일정서서울 CC 골프코스의관행관리계획을반영하여발생예상되는질병에대한예방및치료 - 88 -

를위한미생물제제및농약처리일정을 4월초에코스관리자와협의하여작성하였고 < 표 3.45>, 발병예상시기 1,2 주전에병의예방시약과발병시치료시약을처리하기로계획하였다. 그러나, 8월중 CJ-9을이용한 Rhizoctonia solani에의해발생하는패취종합방제, 9월트리코약제처리는계속된비로시행할수없었다. < 표 3.45> 미생물농약적용일정 일시 미생물농약및내용 주요병해및대체되는농약 LP(F/W) DS(G) BP(G) PB(G) 4월하 트리코 (green) ( 호리쿠어 ) 5월상 트리코 (Green) ( 호리쿠어 ) 5월중 트리코 (fairway) ( 호리쿠어 ) 5월하 EW42-1(green), CJ-9 (fairway) ( 호리쿠어 ) ( 호리쿠어 ) 6월상 EW42-1(green), CJ-9 (fairway) ( 호리쿠어 ) ( 호리쿠어 ) ( 호리쿠어 ) 6월중 트리코 (Green) 6월하 씰러스 (Green), CJ-9(Fairway) ( 호리쿠어 ) ( 헤리티지 ) ( 안타 ) 7월상 씰러스 (Green) ( 안타 ) 7월중 CJ-9(Fairway) ( 헤리티지 ) ( 호리쿠어 ) 7월하 트리코 (Green) ( 안타 ) 8월상 트리코 (Green, fairway), CJ-9(green) ( 헤리티지 ) ( 헤리티지 ) 8월중 트리코 (Green, fairway), CJ-9(green) ( 헤리티지 ) ( 헤리티지 ) 8월하 트리코 (Green) ( 호리쿠어 ) 9월상 CJ-9(Fairway), 트리코 (fairway) ( 헤리티지 ) 9월중 트리코 (Green) ( 헤리티지 ) 9월하 트리코 (Green), TAC 제형 (Green) 10월상 트리코 (Green) ( 헤리티지 ) 10월중 ( 헤리티지 ) a 용어설명 (F/W= 페어웨이 ; G= 퍼팅그린 ), LP( 라지패취 ), DS( 달라스팟 ), BP( 브라운패취 ), PB( 피시움블라이트 ) a 견고딕체 : 처리 O ; 신명조 : 처리 X 2007 년여름의경우계속된비와많은강수량으로세균을원료로한길항미생물제제의경우효과를발휘하기전유실된양이많은것으로보아경우에따라서미생물농약처리지역에화학농약을이용한방제작업을펼치기도하였다. 4 병발생조사본연구에서조사대상잔디병 ( 라지패취병, 브라운패취병, 피시움블라이트병, 달라스팟 ) 의발 - 89 -

생을여부를조사하기위해 4 월초부터주기적으로골프코스를방문하여미생물처리구와무처 리구에서의병발생여부를조사하였다. 아울러병발생시코스관리자의관리일지상의발생시기 를준용하였다. (2) 병발생량 1 관행처리구화학농약을이용한방제작업을진행한관행관리지역에서는브라운패취와피시움마름병, 라지패취등의병해가나타났다. 브라운패취는 7월과 8월연중 2회에걸쳐발생하였고, 피시움마름병은 7월상순에발생하였으며, 7월상순에달라스팟이발생하여약제처리를통해방제하였다. 9월 2주차에라지패취가약 30m 에걸쳐발생하여문제가되었고, 발병초기에약제처리를하였음에도불구하고방제가쉽게이루어지지않았다. < 그림 3.41>. 실험지의라지패취집중발생지역 ( 관행처리구내 ) < 그림 3.42> 브라운패취발병지 ( 좌 ) 전면사진 ( 우 ) 2 IPM 처리구 길항미생물을이용하여예방시약한 IPM 처리구에서는브라운패취이발병이 8 월상순에관 - 90 -

측되어초기에약제처리를통해방제하였다. 당해의그린주변환경과기후가발병호조건상 황인관계로초기방제를위해화학농약을 2-3 회에걸쳐사용하였다. 페어웨이에서는라지패 취를비롯한기타병의발생이관측되지않았다. < 표3.46> 미생물제제처리구및무처리구의월별병발생과병반수 병명 ( 대상지역 ) 처리 5월 6월 7월 8월 9월 10월 11월 라지패취 (F/W) IPM 처리구 0 0 0 0 0 0 0 무처리구 0 0 0 0 8 0 0 브라운패취 (G) IPM 처리구 0 0 0 2 0 0 0 무처리구 0 0 4 7 0 0 0 피시움블라이트 (G) IPM 처리구 0 0 0 0 0 0 0 무처리구 0 0 4 0 0 0 0 달라스팟 (G) IPM 처리구 0 0 0 0 0 0 0 무처리구 0 0 4 0 0 0 0 * 달라스팟의경우병반의무리를기준으로병반수를계산함. (3) 화학농약사용량저감효과 서서울 CC의퍼팅그린에사용된화학농약은터부코나졸액상수화제 (tebuconazole, 유효성분 20%, 호리쿠어 R ) 와아족시스트로빈수화제 (azoxystrobin, 유효성분 10%, 헤리티지 R) ), 에트리디아졸수화제 (etridiazole, 유효성분 35%, 안타 R ) 이고, 페어웨이에사용된화학농약은터부코나졸액상수화제와아족시스토로빈수화제이다. 이들농약을농약사용지침서상에사용방법은농약희석액을 1l/ m2로토양관주처리하도록되어있어 1,000 m2당사용량으로환산할경우페어웨이와그린에서의사용량은 < 표 3.47> 와같다. 라지패취병방제를위해페어웨이에사용된화학농약은미생물제제처리구에서는사용하지않았고, 무처리구에서는터부코나졸액상수화제 ( 호리쿠어 ) 를 3회사용하였고, 아족시스트로빈수화제 ( 헤리티지 ) 를 5회사용하였다. 피시움블라이트병과브라운베취, 달라스팟위방제를위해 IPM 처리구에서는터부코나졸액상수화제 ( 호리쿠어 ) 를 2회사용하였고, 아족시스토로빈수화제 ( 헤리티지 ) 를 1회사용하였고, 반면에관행처리구에서는터부코나졸액상수화제 ( 호리쿠어 ) 와아족시스트로빈수화제 ( 헤리티지 ), 에트리디아졸수화제 ( 안타 ) 를 12회에걸쳐부분혹은전면처리하였다. 전반적으로 IPM처리구는관행처리구에비해적은횟수와양의화학농약을처리하였고, 페어웨이의경우전혀화학약제를사용하지않고도병이발병하지않는좋은결과를거둘수있었다. 전반적인처리횟수와농약사용량은다음의 < 표3.47> 과같다. < 표 3.47> 1,000 m2당 Par 3 골프코스 와 대중골프장 #8 홀 의농약사용횟수및사용량비교 - 91 -

구분처리내용 IPM 처리구관행처리구비고 페어웨이 (F/W) 퍼팅그린 (G) 화학농약처리횟수 0 회 8회 - 화학농약사용량 0.0l 9.6l 100.0% 저감 미생물제제사용량 75l(CJ-9 5회 ) 9kg( 트리코-3회 ) 0회 화학농약처리횟수 호리쿠어 6회호리쿠어 2회헤리티지 3회헤리티지 1회안타 3회 - 화학농약사용량 1kg 3kg, 1.5l 77.8% 저감 9kg ( 트리고, 9회 ), 미생물제제 30l( 씰러스, CJ-9, 사용량 ( 횟수 ) EW42-1 각 2회 ) 0회 다. 고찰길항미생물을이용한 IPM 처리구는화학농약을이용한관행처리구에비하여화학농약의사용량은페어웨이와그린을모두포함하여약 80% 이상의저감을보이고도높은병방제효과를얻을수있었다. 길항미생물처리를위해문헌과현장조사를통해토양병원균의밀도와병의상관관계를조사해본바로는브라운패취의병원균인 Rhizoctonia solani AG1-1 의경우약 1달전부터밀도의증가를보인다. 이를감안할경우길항미생물의처리는병발생시점 1달혹은적어도 2주전에는시작하여야한다. 피시움마름병과달라스팟, 라지패취의경우도이와비슷한양상을보이므로길항미생물제제는적어도 1-2 주전예방처리를원칙으로하였다. 길항미생물제제의가장큰단점인사용의불편함은이전연구를통해조사한농약과의혼용가능여부를이용하여화학약제혹은비료처리시함께처리할수있도록함으로써일부분해결하였고, 신제형개발을통해앞으로해결의가능성이더욱클것으로생각된다. 길항미생물제제의처리를통해얻을수있는부가적인효과로토양내병원균의밀도를낮추고, 유용미생물의밀도를증가시킴으로써잔디뿌리를서석처로하는근권미생물성장과함께잔디양분흡수를촉진하는것을들수있다. 이번실험에이용된균주 Bacillus spp. 와 Trichoderma spp. 는모두일반적으로이런기능을가졌다고알려진대표적인미생물중하나로결과를발표할수준은아니지만, 높은뿌리생장효과와지상부생육촉진효과를얻을수있었다. 본실험과관련해서는상업골프장 3에서자세히진행하여결과를기재하였다. - 92 -

4. 상업용골프장 3( 춘천한화제이드팰리스 GC) < 1,2 차년도시행 > 가. 연구목표 - 본연구의최종목적은잔디의라지패취등골프장의고질적인병해들의효과적인관리를위해미생물제를이용한친환경적종합적방제 (IPM) 모델은정립하고자하는것이다. - 이를위해상업용골프장에서농약에의한병해방제력에따라농약대신해당효능을가진미생물제를시용함으로나타나는병해발생상황과잔디의품질과관련된요인들을분석평가하였다. 나. 연구내용및결과 (1) 연구내용 ( 처리내용및방법 ; 조사내용및방법 ) ( 가 ) 시험장소및시기 이시험은강원도춘천시소재하고있는환화그룹계열골프장의하나인제이드팰리스에서 2006 년 7월부터 2008 년 3월까지수행되었다. 1년차인 2006 년도에는두홀을대상으로시험을수행하였으며, 2007 년도에는두홀을추가하여총네홀에서시험을수행하였다. 각홀의시험내역은표 31과같다. 각각홀의초종은동일하여그린은벤트그라스, 티는켄터키블루그라스, 페어웨이는한국잔디육성품종 ( 중지 ) 였다. < 표 3.48> 골프장의시험홀현황및시험내역 홀번호 면적 (hebe<m 2 >) 그린티페어웨이 사용연도 사용내용 7번홀 785 467.5 9,033 2007 처리구 8번홀 580 506.5 11,686 2007 대조구 13번홀 545 610 15,733 2006, 2007 대조구 15번홀 615 647 12,675 2006, 2007 처리구 ( 나 ) 시험방법및평가 잔디의주요병해발생환경과발생시기에대한문헌및연구자의경험을통해알려진정보와제이드팰리스골프장의연중코스관리에서월별작업현황을참조하여미생물제의종류와살포시기를정하여해당미생물제를제조하여골프코스관리팀장에게전달하여처리하게하거나연구자들이직접처리하였다. 미생물처리외에다른코스작업은모두본골프장의관리작업과동일하나미생물처리구는살균제전면살포는 2006 년도에는전혀실시하지않았으며 2007 년도에는기상조건으로인하여병발생의우려로 1/10 의수준의살균제를살포하였다. 미생물제처리후처리효과를보기위해병발생조사하였고, 몇가지잔디의생육을조사하여 - 93 -

무처리와비교평가하였다. ( 다 ) 길항미생물의종류및처리내역 ( 주 ) 그린바이오텍에서개발한미생물제로서시험골프장의관리체계와주요잔디병 ( 라지패치 < 갈색퍼짐병 >, 브라운패치 < 갈색마름병 >, 피시움마름병, 달라스팟 < 동전마름병 > 등 ) 의병발생시기에대비하여살포를계획하고이시기에맞추어배양하여제조하였다. 이들미생물제들은유효활성유지기간에따라사전에충분한양을준비하여기상변화에따른병의만연을대비할수있게하였다. 대상잔디병의종류에따른미생물제와각각의제형및사용방법은 < 표 3.49> 와같다. 각각의미생물제는적용면적에따라적량을물로희석하여분무기로 1 hebe(m 2 ) 당 1 L씩고루살포하였다. 미생물농약이적용된일정과내용은 < 표 3.50> 과같다. < 표 3.49> 미생물농약의종류와적용잔디병해, 제형및사용방법 미생물농약종류 제형및사용법 적용잔디병해 트리고 (Trichoderma 동전마름병 ( 달라스팟 ), 갈분상수화제, 1000 배희석 harzianum GB-0208) 색마름병 ( 브라운패취 ) 씰러스 (Bacillus subtilis GB-0365) 액상수화제, 300 배희석 피티움마름병 CJ-9(Bacillus subtilis CJ-9) 액상수화제, 300 배희석 갈색마름병 ( 라지패취 ) EW42-1(Bacillus subtilis 액상수화제, 300 배희석 EW42-1) 동전마름병 ( 달라스팟 ) - 94 -

< 표 3.50> 미생물농약적용일정및내역 2006 년 2007 년 일시미생물농약및살포장소대상주요병해 7월1주 CJ-9( 페어웨이, 주변지역 ), GB-0365( 그린, 티 ) 갈색퍼짐병, 피티움마름병 7월3주 GB-0365( 그린 ) 피티움마름병 8월1주 트리코 ( 그린 ) 갈색마름병 8월5주 CJ-9( 페어웨이, 그린 ) 갈색퍼짐병, 갈색마름병 9월4주 트리코 ( 페어웨이, 그린, 티 ) 갈색마름병, 갈색퍼짐병, 동전마름병 10월 1주 CJ-9( 페어웨이 ) 갈색퍼짐병 3월2주 트리코 ( 그린과티 ) 살포 갈색마름병, 춘고병방제 3월5주 EW42-1( 그린 ), CJ-9( 티, 페어웨이 ) 동전마름병, 갈색퍼짐병 4월2주 CJ-9( 페어웨이, 주변지역 ) 라지벳취 ( 갈색퍼짐병 ), 4월3주 CJ-9( 페어웨이, 주변지역 ), GB-0365( 그린, 티 ) 라지벳취 ( 갈색퍼짐병 ), 5월1주트리코 ( 그린, 페어웨이 ), GB-0365( 그린 ) 브라운벳취 ( 갈색마름병 ), 피티움마름병갈색퍼짐병 5월3주 트리코 ( 그린, 티, 페어웨이 ) 브라운벳취 ( 갈색마름병 ), 갈색퍼짐병 5월5 주 트리코, EW 42-1, CJ-9( 페어웨이 ) 종합벳취병방제 6월2주 CJ-9( 페어웨이 ) 갈색퍼짐병 7월2주 CJ-9( 페어웨이, 주변지역 ), EW42-1( 그린, 티 ) 동전마름병, 갈색퍼짐병, 피티움마 0GB-0365( 그린, 티 ) 름병 7월4주 트리코 ( 그린, 티, 페어웨이 ), CJ-9( 페어웨이 ) 갈색마름병, 갈색퍼짐병 8월5주 CJ-9( 페어웨이, 그린 ) 갈색퍼짐병, 갈색마름병 9월2주 EW42-1( 페어웨이, 그린 ) 동전마름병 10월 1주 CJ-9( 페어웨이, 그린 ), 트리코 ( 페어웨이 ) 갈색퍼짐병, 갈색마름병 * 예방위주의방제 ( 라 ) 시험조사항목 1 병발생조사미생물농약처리에의한홀 ( 제이드팰리스 15th hole) 과관행농약처리양옆홀의주요잔디병 ( 갈색퍼짐병, 갈색마름병, 동전마름병, 피티움마름병등 ) 발생율을비교함 ( 시기별로병발생여부와발생면적 ). 2 토양의미생물상조사토양병발생과환경의지표인토양미생물상을조사하기위하여희석평판법에의하여토양중 acid PDA 를사용하여 total fungi의밀도를조사하고, nutrient agar 배지를사용하여 total bacterial의밀도를조사하였다. 병적토양의판단기준이되는유해곰팡이인 F usarium spp. 와유해세균인 E rwinia spp. 는각각의각각을분리하는선택배지를사용하여희석평판법에의해그밀도를조사하였다. - 95 -

3 잔디의생육과탯취축적조사잔디생육으로는잔디밀도, 뿌리길이, 엽폭, 탄력성등을관찰하였다. 잔디를홀컷트로약 10cm 깊이로채취한후단위면적당개체수, 개체별뿌리길이및최장엽폭을조사하였다. 잎의엽록소함량은 acetone에하루동안잎을침지하여엽록소를추출하고 Spectrophotometer 로 663nm 와 645nm 파장에서흡광도를조사하여이를무게로환산하여 chlorophyll-a 와 chlorophyll-b 의함량을구하였다. 탄력성의경우는골프공을 1 m 높이에서떨어뜨렸을때첫번째튀어오르는높이로가름하였다. 균일성은각홀의페어웨이를조망하여잔디의생육과패취병발생여부를고려하여등급화하였다. A등급은병발생부위나훼손된지역이전혀없을경우이며, B등급은그러한지역이부분적으로발생한경우이다. 마농약 ( 살균제 ) 사용량절감효과분석병발생가능성이높은기상조건이었던 2007 년도에는미생물제뿐만아니라부분적으로농약이시용되었으므로이를종합적방제 (IPM ) 를실시함으로간주하고농약사용량을미생물처리구와대조구를비교함으로그절감효과를분석하였다. 농약살포자료는 2007 년도제이드팰리스골프코스농약사용현황을분석정리하였다. (2) 연구결과 ( 가 ) 병해발생비교 2006 년도시험에서는 9월말까지미생물제처리홀 (15홀 ) 과대조홀인관행농약처리홀 (13홀 ) 에서는특이한병발생이관찰되지않았으나 10월하순조사에서 13홀일부페어웨이가장자리에서라지팻취 ( 갈색퍼짐병 ) 의발생이관찰되었다 < 그림 3.43> 2007 년도에도 15 홀은아무런병해의발생이관찰되지않았고, 13홀에서도라지팻취발생부위의집중관리로인하여확대되지않았으며오히려감소되거나없어졌다. 2007 년도에시작된미생물처리구인 7홀과대조구인 8 홀에서도눈에띄는병해발생은관찰할수없었다. 미생물처리홀에서병해가발생하지않은이유와 13홀에서의라지팻취발생이유모두지리적차이에의한것으로간주할수있지만이실험을통해알수있는것은살균제대신해당미생물제로대체함으로써병해발생위험에유의적으로노출시키지는않을것으로생각된다. 이로서 2006 년도에는페어웨이 3회, 그린 4회의화학약제대체효과가달성되었다. - 96 -

< 그림 3.43>. 2006 년도 13 홀라지팻취발생지역 ( 나 ) 토양미생물상비교 2006 년도골프장페어웨이에서한달간격으로토양중미생물상을조사하였다. 초기두홀간의곰팡이와세균의밀도는별반차이가없었고후기까지유의적인밀도차이를보이지않았다 < 표 3.51, 표 3.52>. 그러나무처리에서세균의밀도가다소높게나타나는경향을보였고특히유해세균인 Erwinia spp. 는대조홀인 13홀에서만검출되어토양환경이미생물처리홀인 15홀보다다소불량함을나타내었다. 총곰팡이의밀도는 15홀이다소높게나타났으나유해곰팡인 Fusarium spp. 의밀도는두홀이거의같았다. < 표 3.51> 골프장페어웨이토양의곰팡이밀도 No. of fungi ( X10 3 /g ) 홀번호 Total fungi Fusaium 7월 11일 8월 25일 9월 27일 9월 27일 13홀 - 5.9±4.9 16.4±14.1 0.5±0.3 15홀 - 10.0±12.9 23.8±10.9 0.4±0.5 < 표 3.52> 골프장페어웨이토양의세균밀도 홀번호 No. of bacteria 총세균 ( X10 6 /g ) Erwinia (X10 5 /g ) 7 월 11 일 8 월 25 일 9 월 27 일 9 월 27 일 13 홀 39.8±15.7 85.9±63.7 64.3±26.8 2.4±1.1 15 홀 41.2±22.3 68.9±29.1 42.2±13.9 0.0±0.0-97 -

2007 년도조사에서각홀의총곰팡이, 총세균, 유해곰팡이 (Fusarium spp.), 유해세균 (Erwinia spp.) 의밀도를구역별로시기별로조사한결과는 < 표 3.53, 3.54, 3.55, 3.56> 와같다. 전체적으로미생물밀도에있어서는예외적인일부구간을제외하고는처리홀과대조홀간미생물밀도는큰차이가없었다. 1년차시험에들어간 7홀과 8홀의경우는전년도 15홀과 13홀과유사한미생물상변이가관찰되었는데즉처리홀인 7번홀이총곰팡이밀도가다소높아졌고대조홀인 8번홀은총세균밀도가상대적으로높았다. 그러나그린과티에서는 1년차에서도 2년차에서도이러한경향이없었다. 이는곰팡이와세균의밀도변화가초종과토양의구조에따라달라질수있음을의미한다. 그러나 2년차에의후기밀도조사에서는미생물처리홀과관행대조홀모두미생물의밀도가유사해짐을알수있었다. 유해세균의경우 2007 년도 1년차홀에서는전년도 1년차홀에서와유사한경향을보여관행대조홀인 8홀이 7홀보다다소높았고 2년차에서도이경향은페어웨이에서유지되었다. 또한유해곰팡이의경우 1년차에는처리와대조홀간별차이가없었는데 2년차후반부에그밀도가관행대조홀의페어웨이가처리대조홀보다현저히높아졌음을알수있었다. 이를종합해볼때단순농약살포에의한방제보다미생물을이용한종합적방제 (IPM) 가미생물투여에의한현저한토양미생물의밀도상승에는기여하지않지만토양의전체적인미생물상의개선에기여할수있다고생각된다. < 표 3.53> 골프장토양내총곰팡이밀도 7th 8th 13th 15th Hole number Total fungi ( X10 3 /g ) Sampling date 5월 10일 6월 7일 10월 9일 tee 16.3±1.5 20.7±0.6 4.0±1.7 Green 2.0±1.5 0.7±0.0 3.3±1.5 Fairway Low 3.8±1.0 82.0±0.6 16.7±3.8 Fairway High 12.3±3.6 14.3±1.5 42.0±10.5 tee 18.8±3.1 17.3±0.6 4.7±0.6 Green 4.0±1.0 1.0±0.6 1.7±0.6 Fairway Low 5.0±5.7 51.0±1.5 5.0±2.0 Fairway High 5.0±3.0 22.3±3.8 30.7±3.2 tee 1.8±1.2 2.7±0.0 6.7±1.2 Green 1.5±0.6 2.0±0.6 0.3±0.6 Fairway Low 5.3±3.0 8.0±0.0 11.0±5.0 Fairway High 6.3±1.0 6.3±1.0 18.7±8.1 tee 5.3±1.0 13.0±1.0 6.3±1.5 Green 1.8±0.6 4.3±0.6 3.3±0.6 Fairway Low 20.3±10.4 5.3±1.5 18.7±12.7 Fairway High 7.8±1.0 22.7±1.7 10.3±4.0-98 -

< 표 3.54> 골프장토양내총세균밀도 7th 8th 13th 15th Hole number Total bacteria ( X10 5 /g ) Sampling date 5월 10일 6월 7일 10월 9일 tee 57.5±1.7 44.7±10.7 12.5±0.3 Green 17.0±4.7 31.7±4.7 5.9±0.2 Fairway Low 63.3±11.6 43.0±6.1 18.0±0.2 Fairway High 75.0±12.2 39.7±10.8 14.4±0.1 tee 37.3±16.8 64.3±3.1 10.2±0.0 Green 17.0±1.5 11.7±1.5 6.2±0.2 Fairway Low 75.0±14.0 141.3±14.8 22.7±0.2 Fairway High 51.5±12.2 51.0±10.5 30.3±0.3 tee 21.0±7.8 16.7±2.1 13.9±0.3 Green 9.0±4.4 13.7±1.5 5.4±0.2 Fairway Low 39.5±10.6 29.3±11.9 12.1±0.4 Fairway High 43.5±9.5 49.0±2.7 12.2±0.1 tee 61.8±8.5 28.7±4.1 8.2±0.2 Green 7.5±2.1 10.7±4.4 10.4±0.2 Fairway Low 32.8±2.5 19.0±8.0 17.8±0.2 Fairway High 37.5±13.5 24.3±6.0 14.4±0.1 < 표 3.55> 골프장토양유해곰팡이 (Fusarium spp.) 밀도 7th 8th 13th 15th Hole number Total Fusarium ( X10 2 /g ) Sampling date 5월 10일 6월 7일 10월 9일 tee 5.7±2.5 159.3±33.1 11.7±2.1 Green 0.0±0.0 0.3±0.6 3.3±0.6 Fairway Low 6.7±0.6 14.7±2.1 5.3±0.6 Fairway High 27.7±2.5 22.0±5.0 13.0±1.0 tee 0.0±0.0 4.7±1.5 7.7±2.3 Green 0.0±0.0 1.3±0.6 0.0±0.0 Fairway Low 18.7±0.6 29.7±1.2 3.3±0.6 Fairway High 3.3±0.6 22.3±9.7 20.0±5.0 tee 0.0±0.0 20.0±2.0 0.0±0.0 Green 0.0±0.0 0.0±0.0 1.7±1.2 Fairway Low 41.3±8.5 6.0±2.7 13.0±2.6 Fairway High 26.7±6.8 29.7±3.5 17.7±3.21 tee 7.3±2.1 0.3±0.6 8.0±1.0 Green 0.0±0.0 0.7±0.6 0.0±0.0 Fairway Low 2.3±0.6 42.0±46.5 0.7±0.6 Fairway High 5.3±1.2 8.7±9.0 1.7±0.6-99 -

< 표 3.56> 골프장토양내유해세균 (Erwinia spp.) 밀도 7th 8th 13th 15th Hole number -: 검출되지않음 Total bacteria ( X10 5 /g ) Sampling date 5월 10일 6월 7일 10월 9일 tee 3.0±0.0-2.0±0.5 Green 5.0±0.0-1.1±0.8 Fairway Low 0.0±0.0-3.5±0.6 Fairway High 0.0±0.0-3.7±1.2 tee 0.0±0.0-2.5±1.6 Green 0.0±0.0-2.8±0.4 Fairway Low 3.0±3.5-6.9±0.9 Fairway High 1.7±2.9-4.8±0.9 tee 0.0±0.0-1.4±0.9 Green 10.3±5.8-2.1±0.3 Fairway Low 0.7±0.6-3.8±1.0 Fairway High 0.0±0.0-4.1±1.2 tee 2.0±0.3-2.1±0.2 Green 1.3±1.2-1.0±0.6 Fairway Low 3.7±0.6-2.7±0.4 Fairway High 2.0±3.5-2.6±0.9 ( 다 ) 잔디의생육과품질비교 2006 년에는페어웨이에서잔디생육과품질지표로잔디밀도와탯취축적량을조사하였다 < 표 3.57>. 잔디밀도는미생물처리홀 (15홀 ) 과관행대조홀 (13홀 ) 사이에유의적인차이가없었으나탯취축적량은 15홀보다 13홀에서상대적으로높았다. 또한육안으로잔디의생육을관찰한결과, 13홀의잔디는군데군데잔디가누워있거나서로엉클어져있는반면, 15홀은전반적으로곧추서고정돈된모습을보여모습으로보다양호한질감 (texture) 을보였다 < 그림 3.44>. 탄력성은자세히측정하지는않았으나연구자가답압으로비교할때 15홀이다소양호한것으로판단되었다. 이러한점을모두감안할때 15홀의잔디품질은 1등급으로판단된다. - 100 -

< 표 3.57> 골프장페어웨이의잔디밀도및탯취축적량 (2006 후반기 ) 잔디밀도탯취축적량홀번호 ( 개체수 /cm 2 ) (g/8-cm 2 ) 13홀 1.98±0.25 1.05±0.23 비고 15 홀 2.04±0.52 0.72±0.38 탄력성양호 < 그림 3.44> 페어웨이잔디생육상태 (2006 년후반기 ) - 101 -

2007 년도시기별잔디밀도조사결과는 < 표 3.58> 과같다. 1년차시험홀인 7홀과 8홀을비교할때모든구역에서잔디밀도의시기별변화추이가그린을제외하고는유사하여 6월에증가하였고최종조사일인 10월에는다소감소하였다. 그린에서는미생물처리홀인 7홀에서밀도가증가하였고, 관행대조홀인 8홀은초기밀도보다다소낮게나타났다. 2년째시험홀에있어서도처리홀과대조홀의잔디생육은그린, 페어웨이, 티모든구역에서 15홀이평균적으로높은밀도를보였다. 이러한실험결과로볼때처리된미생물제는그기작은알수없으나잔디의생육을촉진하는효과가있을것으로생각된다. < 표 3.58> 시기별잔디밀도 (sampling area=2.54cm 2 (r=0.9cm)) 7th 8th 13th 15th Shoot number/cm 2 Hole number Sampling date 5월 10일 6월 7일 10월 9일 tee 3.81±0.45 4.30±0.82 2.5±0.6 Green 17.72±2.91 17.98±3.21 19.9±3.7 Fairway Low 2.36 1.71 1.84 Fairway High 2.28 2.56 2.24 tee 3.41±0.45 4.46±0.23 2.5±0.2 Green 17.59±0.99 16.01±1.64 16.1±0.4 Fairway Low 1.97 2.23 1.68 Fairway High 1.97 2.16 1.60 tee 3.67±0.82 2.89±0.23 2.5±0.2 Green 17.98±0.82 17.19±1.82 18.5±2.5 Fairway Low 1.89 1.97 2.32 Fairway High 2.05 2.32 1.28 tee 3.94±1.18 2.62±0.60 2.9±0.2 Green 18.37±1.20 17.82±1.52 20.1±1.8 Fairway Low 1.65 3.02 2.00 Fairway High 2.99 2.40 2.24 2007 년도 1년차, 2년차시험후잔디의생육과품질특성과관련된지표들을조사한결과는 < 표 3.59> 와같다. 1년차시험홀에서는대부분의지표들이구역에따라다소의편차를보이지만두홀이유사하게나타났으나, 특징적으로 7홀에서그린의벤트그라스잔디의뿌리길이가길었고, 8홀페어웨이에서평균이상으로탯취가축적되는곳이발견되었다. 탄력성은 7홀보다 8 홀이좋았는데이는 8홀은햇볕이잘들고통풍이양호한지역에위치하고있어서 7홀과비교할때원래지형이잔디의견실한생육에 8홀이더양호한조건이기때문에나타난결과로보인다. 2년째연속미생물을처리한 15홀과대조홀인 13홀의잔디품질특성을비교해볼때대부분의지표가 15홀에서높게나타났다. 특히뿌리길이는 15홀에서현저히길고, chlorophyll 함 - 102 -

량도상대적으로높았다. 탯취축적량의경우페어웨이위치에따라달랐는데평균이상의축적량을보인곳은 13홀관행대조홀이었다. 탄력성도 15홀에서현저히높게나타났다. 그러나엽폭은각잔디의품종별로큰차이가없었다. 조사한생육및품질특성지표를종합해볼때미생물제의 1년처리보다 2년연속처리에의해잔디가더양호한생육과품질을갖게되었다고판단된다. 특히탄력성이 15홀에서높게나타난이유로생각되는것은페어웨이잔디밀도가높고뿌리길이가길어단위면적당식물체가차지하는비율이높음에의한것이아닌가생각된다. < 표 3.59> 잔디의생육및품질특성 잔디품질특성 Hole number 뿌리길이 엽폭 탯취축적량 엽록소함량 ( μg /g f.w.) (cm) (mm) (g/cm 2 ) 엽록소a 엽록소b tee 1.6±0.2 7th Green 12.4±0.8 0.9±0.1 Fairway Low 3.4±0.1 0.57 1060 435 Fairway High 3.3±0.3 0.82 965 380 tee 1.7±0.1 8th Green 11.9±0.1 1.1±0.1 Fairway Low 3.3±0.2 0.31 1180 557 Fairway High 3.7±0.7 1.11 950 350 tee 1.8±0.1 13th Green 12.8±1.1 1.1±0.2 Fairway Low 2.7±0.6 0.97 1205 620 Fairway High 3.2±0.1 0.53 1020 410 tee 1.8±0.1 15th Green 16.1±1.8 0.9±0.1 Fairway Low 2.9±0.3 0.68 1245 785 Fairway High 2.7±0.4 0.75 1060 435 탄력성 (bounce height, cm) 5.5 6.0 5.3 6.5 ( 라 ) 농약사용량절감효과 2006 년에는양호한기상환경덕분으로미생물처리홀은살균제를전혀살포하지않아살균제만감안할때 100% 의농약사용량절감효과가있었고살균제와살충제총량을계산할때두종류의농약살포횟수가거의같으므로 (2007 년도전면살포횟수통계 : 살균제 ; 24회, 살충제 ; 25회 ) 50% 의농약사용이절감된것으로추산할수있다. 그러나병발생의위험도가높다고생각되는 2007 년도에는전면처리할경우미생물처리홀에도살균 - 103 -

제살포를관행의 1/10 수준으로실시하였고, 기상과잔디의생육상태에따라병발가능 성이있는부위 ( 주로페어웨이 ) 에부분살포를수행하였다. 이에따라살포된살균제별 처리량을산출한결과는 < 표 3.60> 과같다. < 표 3.60> 잔디의생육및품질특성 농약살포총량 Hole number 지오판 ( 수 ) 터브코나졸 ( 유 ) 아족시스트헥사코나졸베너 (g) (g) (ml) 로빈 (g) ( 액상 )(ml) Tee 94.2 78.5 102.1 14.1 0.0 Green 56.1 70.1 88.8 2.8 0.0 7th Fairway 542.0 0.0 234.9 0.0 0.0 Total 692.3 148.6 425.8 16.9 0.0 (%) (4.4) (11.1) (9.0) (12.5) (-) Tee 696.0 580.0 754.0 104.4 0.0 8th Green 607.8 759.8 962.4 30.4 0.0 Fairway 14,439.9 0.0 3,038.4 0.0 0.0 Total 15,747.7 1,339.8 4,754.8 134.8 0.0 Tee 654.0 545.0 708.5 98.1 0.0 13th Green 732.0 915.0 1,159.0 36.6 0.0 Fairway 9,628.6 0.0 81.8 0.0 0.0 Total 11,014.6 1,460.0 1,949.3 134.7 0.0 Tee 73.8 61.5 79.9 11.1 0.0 Green 77.6 97.1 122.9 3.9 0.0 15th Fairway 0.0 0.0 329.5 0.0 20.3 Total 154.4 158.6 532.4 15.0 20.3 (%) (1.4) (10.9) (27.4) (11.1) (-) 비고 8홀대비살포량 (%) 13홀대비살포량 (%) 위 < 표 3.60> 에서나타나있듯이가장많이사용된살균제는 2007 년도신규 합제인 베너였고가장적게사용된살균제는아족시스트로빈으로나타났다. 아족시스트로빈은한지형잔디의갈색잎마름병을대상으로사용되는농약으로주로티나그린에살포되고페어웨이에는사용되지않았기때문이라생각된다. 헥사코나졸의경우는네시험홀중에서는 9월초 15홀에한차례사용되었을뿐인데이는아마도갈색퍼짐병을대상으로예방차원에서살포한것이아닌가생각된다. 전체적으로미생물처리홀의농약살포량은살균제의종류에따라적게는 1.4% 에서많게는 27.4% 이지만총살포량이가장많은베너에서가장큰절감비율을보였으므로 2007 년도미생물처리홀의살균제총사용량은관행대조홀의 10% 미만이었다. 이는관행살균제사용량의 90% 이상절감하였음을의미하며, 유사한살충제사용빈도를고려할때 45% 농약절감을이루었다고판단된다. - 104 -

III. 적요한화그룹계열골프장의제이드팰리스의상용홀에서 2006 년과 2007 년 ( 주 )Green-biotech 에서개발된 4 가지미생물제를골프장의병해방제력에맞춰살포하고관행대조홀과비교하여병해발생, 토양미생물상의변화, 잔디의생육과품질특성등비교조사하여나타난결과는다음과같다. - 미생물처리홀에서는 2년간특별한병발생이관찰되지않았고오히려관행대조홀의페어웨이에서 2006 년 10월하순조사에서부분적인발생이관찰되었다. 따라서살균제대신해당미생물제로대체하여살균제사용을줄이더라도병해발생위험에유의적으로노출되지는않을것으로생각된다. - 2006 년도골프장페어웨이에서는초기미생물처리홀과관행대조홀간곰팡이와세균의밀도에유의적인차이는없었지만무처리관행홀에서세균의밀도가다소높은경향이었고총곰팡이밀도는미생물처리홀에서다소높은경향이었다. 특히유해세균인 Erwinia spp. 는대조홀인 13홀에서만검출되어토양환경이미생물처리홀인 15홀보다다소불량함을나타내었다. 2007 년도조사에서도 1년차시험홀의페어웨이에서의미생물상은전년도 1년차시험홀과유사한미생물상변이가관찰되었는데그린과티에서는달랐다. 이는곰팡이와세균의밀도변화가초종과토양의구조에따라달라질수있음을의미한다. 유해곰팡이의경우 1년차에는처리와대조홀간별차이가없었는데 2년차후반부에그밀도가관행대조홀의페어웨이가처리대조홀보다현저히높아졌음을알수있었다. 이로서미생물을이용한종합적방제 (IPM) 가미생물투여에의한현저한토양미생물의밀도상승에는기여하지않지만토양의전체적인미생물상의개선에기여할수있다고생각된다. - 2006 년에는페어웨이에서잔디생육과품질지표로잔디밀도와탯취축적량을조사에서는잔디밀도는미생물처리홀 (15홀 ) 과관행대조홀 (13홀 ) 사이에유의적인차이가없었으나탯취축적량은 15홀보다 13홀에서상대적으로높았다. 또한잔디의질감도처리홀이더좋았다. 2007 년에는 1년차시험홀인 7홀과 8홀을비교할때그린을제외하고모든구역에서잔디밀도의시기별변화추이가유사하였고, 그린에서는관행대조홀이잔디밀도가다소감소하는데비해미생물처리홀에서는그밀도가증가하였다. 2년째시험홀에있어서도처리홀의그린, 페어웨이, 티모든구역에서관행대조홀보다평균적으로높은밀도를보였다. 따라서미생물제처리는잔디의생육을촉진하는효과가있는것으로판단된다. - 잔디의생육과품질특성에있어서는 1년차시험홀에서는대부분의지표들이처리홀과관행대조홀과별차이가없었지만, 처리홀그린잔디의뿌리길이가길었고, 관행홀페어웨이에서평균이상으로탯취가축적되는곳이발견되었다. 2년째연속미생물처리홀과대조홀의잔디품질특성비교에있어서는대부분의지표가처리홀에서높게나타났으며그중그린잔디의뿌리길이는처리홀에서현저히길었고, chlorophyll 함량과탄력성도높았다. 탯취축적량 - 105 -

도페어웨이위치에따라다르지만평균이상의축적은관행홀에서만발견되었다. 이를종합해 볼때미생물제 1 년처리보다 2 년연속처리에의해골파장잔디가더양호한생육과품질을 갖게되었다고판단된다. - 2007 년도골프장에서살포된살균제의살균제별사용량을분석한결과, 미생물처리홀 의살균제총사용량를감안할때살균제사용량의 90% 이상절감한것으로판단되며농약 총사용량의 45% 정도를절감하였다고생각된다. 결론적으로잔디병해의종류와발병시기에맞춰상응하는미생물제를적기에살포하여농약사용을줄이는종합적방제법 (IPM) 은잔디병해발생위험도를높이지않을뿐아니라오히려그위험도를낮출가능성이있다. 또한미생물의처리로토양미생물상을개선하고잔디의생육을촉진하는부가적인효과로잔디의품질향상효과가예상되며농약사용량을크게절감할수있는잔디의병해관리방법으로생각된다. 5. IPM 모델의상업용골프장적용에대한고찰 (1) 화학농약의점감효과길항미생물을이용한 IPM 모델의상업용골프장 3곳과파3홀골프장의적용을통해연구과제의목표인화학농약 30% 이상저감모델을넘어선결과를얻을수있었다. 실험은 IPM 모델을해당골프장관리자와상의하여평년의병발생상황을근거로작성하였고, 병발생의위험혹은병발생시화학농약을처리함으로써발병을최소한으로유지하는형식으로진행되었다. 이런실험방법을통해연구과제의목표인화학농약의사용량을 30% 이상저감하는것보다더많은양의화학농약을저감하고도관행관리에비해훨씬높은방제효과를얻을수있었다. < 표3.61> 화학농약저감효과 골프장명 살균제저감량 ( 살충제포함 ) 비고 대명비발디파크 60.2%(30.1%) 1년적용 서서울 CC 77.8%(40.0%) 1년적용 춘천한화제이드팰리스 90%(45.0%) 2년적용 파주파3홀 63%(31.5%) 1년적용 이를통해미생물농약을이용한예방시약위주의방제는화학농약의저감을유도할수있 고, 춘천한화제이드팰리스의예에서처럼미생물의적용기간이길수록그효과는더욱커질 수있다. - 106 -

(2) 병방제효과실험이진행된모든골프장에서미생물을이용한 IPM 처리지역은화학농약의사용량을대폭저감하고도높은수준의병방제효과를얻을수있었다. 라지패취의경우는실험을진행한모든골프장의관행대조구페어웨이모두에서발병하였으나, IPM 처리구에서는한건의발병도보고되지않았다. 라지패취는대표적인난방제성병해로화학농약의처리에도방제가쉽지않지만, 길항미생물의예방시약만으로도방제가가능하므로특히그효과가탁월하다할수있겠다. 또한, 페어웨이는골프코스면적의절대적인비율을차지하는부분으로화학농약사용량의대부분을차지한다고할수있다. 이지역에서살균제의처리없이병을방제할수있었으므로연구과제의목표인화학농약사용량의저감을달성하는데매우큰역할을하였다. 비발디파크에서진행된라지패취의방제실험에서는 Rhizoctonia solani 의병원균밀도를확인할수있었는데, 이는라지패취방제용미생물농약인 B. subtilis CJ-9이병원균의밀도를감소시킴으로써방제효과를나타내는것을보여준다. 라지패취외에도피시움마름병, 달라스팟, 브라운패취도효과적으로방제되었고, 역시병원균의밀도감소를직접적으로확인할수있는바길항미생물을이용한병의방제는매우높은효과를기대할수있고, 이들미생물을이용한 IPM 모델은화학농약의사용을대폭줄이고도높은방제효과를갖는다는것을다시한번확인할수있었다. 특히 2007 년의경우강우일수와강수량의증가로병의발생이조장되기매우쉬운상황이었으나, 미생물을이용하여예방시약을한지역에서는전혀병이발생하지않았고, 오히려화학농약을처리한지역에서병의발생과정도가심각하였다. 이는앞으로도국내기후상황이이와같이장마철이길어지고, 집중호우와같은강우형태가빈번할것으로예상되는바그의미가더욱크다고할수있다. (3) 잔디품질의향상효과한화제이드팰리스의경우 2006 년실험의시작시점에서두홀은모두 2등급정도의잔디품질을지니고있었다. 코스관리자는 2006 년 1차실험이후미생물을이용한 IPM 처리구는 1등급수준의잔디품질을지니고, 관행처리구는여전히 2등급수준의잔디품질을지닌다고언급하였다. 2007 년말에최종적인잔디품질의평가에서는 IPM 처리구가잔디의밀도, 질감, 색감, 탄력성등모든부분에서관행처리구에비해높은상태임을알수있었다. 또한, 토양의분석결과 Erwinia spp. 과 Fusarium spp. 등같은대표적인토양품질의기준이되는미생물의밀도가관행처리구에서높게나타나고, 다른실험지역인대명비발디파크골프장에서의토양병원균밀도감소효과를종합하여보면, 미생물을이용하여살균제를대체한다면토양내건전성의향상과잔디의양분흡수, 병방제효과의증대로인해잔디품질의향상이라는부가적인효과도얻을수있다고생각된다. 이는미생물을이용한부가적인효과로골프장에서미생물농약의수요를더욱촉진할수있는미생물의한장점이라할수있다. - 107 -

제 5 절미생물농약품목등록시험 1. 미생물농약 미생물농약이란세균, 곰팡이, 바이러스및원생동물등의살아있는미생물을인워적인합성, 조작등을거치지않은상태로제품화하여농작물 ( 수목및농 임산물 ) 을해하는곤충 응애 선충 바이러스 잡초등기타농림부령이정하는동 식물의방제에사용하거나농작물의생리기능을증진 억제하는데사용하는약제를말한다. 이러한미생물농약은미생물농약등록법에따라약효, 약해시험과미생물농약의안정성을입증하기위한독성시험등을거쳐야한다. 2. 미생물농약등록진행현황본연구과제에서는 2 종의균주에 Bacillus subtilis CJ-9과 Bacillus subtilis EW42-1 대해미생물농약의등록을추진하였고, 현재 B. subtilis CJ-9은자체 공공약효약해시험과독성시험의전과정을성공적으로끝마친상태로 08년 3월등록신청하였고, B.subtilis EW42-1 은자체약효 약해시험은완료되었고, 독성시험은진행중이며, 공공약효 약해시험이 09년에예정중으로 08년 9월에등록신청을예정중이다. 두균주에대한원제와제품의독성시험은미생물농약등록공인시험기관인한국화학시험연구원에서진행하였다. 본최종보고서에미생물농약의등록을위해진행한약효 약해시험과독성시험결과를기재하고자한다. 3. 시험내용 ( 공공시험결과 ) < 외부의시험자료이므로별도의표와그림표시하지않음 > 가. B. subtilis CJ-9 (1) 약효 약해시험 ( 가 ) 약효시험 ( 최종약제처리 7일후피해면적율조사 ) 시험약제 피해면적율 (%) 유의차방제가 I 반복 II 반복 III 반복평균 (DMRT) (%) Bacillus subtilis CJ-9 SC 8.0 8.0 6.0 7.3 a 71.6 무처리 20.0 35.0 22.0 25.7 b ( 나 ) 약해시험 ( 약제처리후 3,5,7 일조사 ) - 108 -

시험약제 시험작물 기준량 약해정도 (0-5) 배량 비고 Bacillus subtilis CJ-9 SC 잔디 ( 한국잔디, 크리핑벤트그라스 ) 0 0 약해없음 ( 다 ) 결과요약 06년에실시한약효 약해시험에서는한국잔디의라이족토니아마름병 ( 라지패취 ) 에대한방제효과를검정하였고, 한국잔디와크리핑벤트그라스에대해약해를검정하였다. 방제결과는 B. subtilis CJ-9의액상수화제는무처리기준으로 71.6% 의방제가를나타내었고, 무처리구와비교하여통계적인유의차가인정되었다. 또한, 시험약제모두는시험작물잔디품종모두에서기준량및배량에서약해가관찰되지않았다. 이는미생물농약의등록기준을모두충족한결과이다. (2) 독성시험원제 9 항목, 품목 6항목등총 15개항목에대해한국화학시험연구원에의뢰하여독성시험을진행하여미생물농약등록기준에부합하는결과를얻었다. 세부항목의독성시험결과요약은다음과같다. ( 가 ) 원제인축독성단계시험항목투여방법 LD 50 시험기관보고년도비고한국화학시험 2007년급성경구 / 병원성경구투여 10 8 cfu 연구원 9월14일저독성한국화학시험 2007년급성경피경피투여 10 8 cfu 연구원 9월14일 1 급성호흡기투여 / 병원성비강내투여 2 10 7 cfu 한국화학시험 2007년 연구원 9월14일한국화학시험 2007년급성정맥내 / 병원성복강내투여 10 7 cfu 연구원 9월14일 - 109 -

( 나 ) 원제생태독성성적 1 1단계생태독성성적 시험항목시험원제함량 (cfu/ ml ) LC 50 /LD 50 /EC 50 시험기관 보고년도 비고 담수어영향 1.0 10 8 6.7 10 5 cfu/ml 한국화학시험 2007년연구원 9월21일 저독성 담수무척추동물한국화학시험 2007년 1.0 10 8 1.8 10 5 cfu/ml 영향연구원 10월4일 조류영향 1.0 10 8 1.0 10 8 cfu/ml 한국화학시험 2007년연구원 9월12일 꿀벌영향 1.0 10 8 1.0 10 7 cfu/ml 한국화학시험 2007년연구원 9월12일 토양미생물한국화학시험 2007년 1.0 10 8 영향없음영향연구원 9월18일 ( 나 ) 제품인ㆍ축독성 1 1 단계포유동물독성시험성적요약 시험종류 ( 기간 ) 급성경구독성 / 병원성 (21일 ) 급성경피독성 (14일 ) 피부감작성 (28일 ) 피부자극성 (72시간 ) 안점막자극성 (7일) 실험동물랫드랫드기니픽백색토끼백색토끼 투여방법경구투여경피투여피부패취피부도포결막낭내투여 투여량 LD 50 시험기관 ( 보고년도 ) 2.0 10 7 (cfu/2ml) 2.0 10 7 (cfu/2ml) 1.0 10 6 (cfu/0.1ml) 5 10 6 (cfu/0.5ml) 1.0 10 6 (cfu/0.1ml) >2.0 10 7 (cfu/2ml) >2.0 10 7 (cfu/2ml) 음성 (1.0 10 6 cfu/0.1ml) 비자극성 (5 10 6 cfu/0.5ml) 비자극성 (1.0 10 6 cfu/0.1ml) 한국화학시험 연구원 (2007) 한국화학시험 연구원 (2007) 한국화학시험 연구원 (2007) 한국화학시험 연구원 (2007) 한국화학시험 연구원 (2007) 비고저독성 2 2 단계포유동물독성시험성적요약 : 해당사항없음 - 110 -

3 3 단계포유동물독성시험성적요약 : 해당사항없음 ( 라 ) 제품환경생물독성 1 1 단계생태독성시험성적요약 가수생생물종에대한급성독성 시험기관구분시험생물종시험약제 LC 50 ( 시험년도 ) 한국화학시험담수잉어 2.81 10 5 1.0 10 7 cfu/ml 연구원어류 (Cyprinus carpio) cfu/ml (2007) 자료 번호 저독성 나조류 ( 鳥類 ) 에대한영향 : 해당사항없음 다꿀벌에대한영향 : 해당사항없음 라토양미생물에대한영향 : 해당사항없음 ( 다 ) 잔류성 1 작물잔류 : 해당사항없음. 2 토양잔류 : 해당사항없음. 3 수중잔류 : 해당사항없음. 나. B. subtilis EW42-1 (1) 약효 약해시험 ( 공공시험 2008 년시행예정, 자체시험결과 ) ( 가 ) 약효시험 ( 최종약제처리 7일후피해면적율조사 ) 시험약제 피해면적율 (%) 유의차방제가 I 반복 II 반복 III 반복평균 (DMRT) (%) Bacillus subtilis EW42-1 SC 6.9 6.4 6.5 6.6 a 60.7 무처리 15.7 17.4 17.3 16.8 b - 111 -

( 나 ) 약해시험 ( 약제처리후 3,5,7 일조사 ) 시험약제 시험작물 기준량 약해정도 (0-5) 배량 비고 Bacillus subtilis CJ-9 SC 잔디 ( 한국잔디, 크리핑벤트그라스 ) 0 0 약해없음 ( 다 ) 결과요약 06년에실시한약효 약해시험에서는한국잔디의라이족토니아마름병 ( 라지패취 ) 에대한방제효과를검정하였고, 한국잔디와크리핑벤트그라스에대해약해를검정하였다. 방제결과는 B. subtilis EW42-1 액상수화제는무처리기준으로 60.7% 의방제가를나타내었고, 무처리구와비교하여통계적인유의차가인정되었다. 또한, 시험약제모두는시험작물잔디품종모두에서기준량및배량에서약해가관찰되지않았다. 이는미생물농약의등록기준을모두충족한결과이다. (2) 독성시험 B. subtilis EW42-1 의독성시험은시험의진행에있어시험재료의수급과항목당소요되는시간상의문제로연구기간안에완료가불가하다. 독성시험기관에서보내온중간보고서를첨부함으로써대체하고자하며, 현재완료된품목의피부자극성시험과안점막자극성시험은미생물농약등록기준에부합한다. < 중간보고서 > 바실러스서브틸러스 (EW42-1) 의안전성시험 1. 목적 바실러스서브틸러스 (EW42-1) 의원제및제품에대한안전성시험을실시하여친환경농자 재및생물농약등록을위한기초자료로활용코져함. 2. 시험방법 토리 ( 팡 ) 의안전성시험은농촌진흥청고시제 2006-16 호 생물농약의등록시험방법및등 - 112 -

록신청서류검토기준 에준하여시험을실시하였다. 2.1 원제 2.1.1 급성경구독성 ( 병원성 ) 시험 1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16호 (2006. 10. 16.) 2) 사용동물 : SD 랫드 3) 투여방법및경로 : 단회경구투여 4) 시험항목 : 1 일반증상관찰 2 사망률 3 체중변화 4 육안소견 5 미생물체외배출현항 6 미생물체내잔존현황 2.1.2 급성경피독성시험 1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16호 (2006. 10. 16.) 2) 사용동물 : SD 랫드 3) 투여방법및경로 : 단회경피투여 4) 시험항목 : 1 일반증상관찰 2 사망률 3 체중변화 4 육안소견 2.1.3 급성호흡기 ( 병원성 ) 독성시험 1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16호 (2006. 10. 16.) 2) 사용동물 : SD 랫드 3) 투여방법및경로 : 비강내투여 4) 시험항목 : 1 일반증상관찰 2 사망률 3 체중변화 4 육안소견 5 미생물체내잔존현황 2.1.4 급성정맥 ( 병원성 ) 독성시험 - 113 -

1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16호 (2006. 10. 16.) 2) 사용동물 : SD 랫드 3) 투여방법및경로 : 단회정맥투여 4) 시험항목 : 1 일반증상관찰 2 사망률 3 체중변화 4 육안소견 5 미생물체내잔존현황 2.1.5 담수어영향시험 1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16호 (2006. 10. 16.) 2) 사용어종 : 잉어 3) 처리농도 : 실제사용량의 1,000배처리 4) 시험항목 : 1 시험용수의수질검사및수중미생물농도측정 2 체중변화 3 병리검사 2.2 제품 2.2.1 급성경구독성 ( 병원성 ) 시험 1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16호 (2006. 10. 16.) 2) 사용동물 : SD 랫드 3) 투여방법및경로 : 단회경구투여 4) 시험항목 : 1 일반증상관찰 2 사망률 3 체중변화 4 육안소견 5 미생물체외배출현항 6 미생물체내잔존현황 2.2.2 급성경피독성시험 1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16호 (2006. 10. 16.) 2) 사용동물 : SD 랫드 3) 투여방법및경로 : 단회경피투여 4) 시험항목 : - 114 -

1 일반증상관찰 2 사망률 3 체중변화 4 육안소견 2.2.3 피부자극성시험 1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16호 (2006. 10. 16.) 2) 사용동물 : 뉴질랜드화이트계백색토끼 3) 처리방법 : 고상또는 plaste상농약은중량으로 0.5g, 액상인경우용량으로 0.5ml를토끼피부에도포처리 4) 시험항목 : 1 노출후 30~60분, 24, 48 및 72시간에홍반과가피형성그리고부종정도관찰 2 특이한장애 3 중독증상 2.2.4 안점막자극성시험 1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16호 (2006. 10. 16.) 2) 사용동물 : 뉴질랜드화이트계백색토끼 3) 처리방법 : 시험농약을 0.1ml 또는 0.1g이초과하지않는범위에서토끼의결막낭내에처리 4) 시험기간 : 투여후 7일 5) 시험항목 : 1 자극증상및안손상의관찰은투여후 1시간, 1일, 2일, 3일, 4일및 7일후에관찰 2 7일째에자극증상이있는경우 21일간관찰연장 2.2.5 피부감작성시험 1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16호 (2006. 10. 16.) 2) 사용동물 : 백색기니픽 3) 처리방법 : 털제거후 1회투여시 0.05ml를그후 2일간격으로 0.1ml씩 3주간 9번피내주사하고 10회주사 2주후에야기주사실시 4) 시험기간 : 투여개시부터야기투여후 48시간 5) 시험항목 : 1 투여후 24시간, 48시간후홍반, 부종등의피부반응조사 2.2.6 담수어영향시험 1) 시험방법 : 농촌진흥청고시제 2006-16 호 (2006. 10. 16.) - 115 -

2) 사용어종 : 잉어 3) 처리농도 : 실제사용량의 1,000배처리 4) 시험항목 : 1 시험용수의수질검사및수중미생물농도측정 2 체중변화 3 병리검사 3. 시험결과 3.1 원제 3.1.1 급성경구독성 ( 병원성 ) 시험 시험진행중 3.1.2 급성경피독성시험 시험진행중 3.1.3 급성호흡기 ( 병원성 ) 독성시험 시험진행중 3.1.4 급성정맥 ( 병원성 ) 독성시험 시험진행중 3.1.5 담수어영향시험 시험진행중 3.2 제품 3.2.1 급성경구독성 ( 병원성 ) 시험 시험진행중 3.2.2 급성경피독성시험 시험진행중 3.2.3 피부자극성시험 1) 임상증상및사망률모든동물에있어서어떠한일반증상도관찰되지않았으며, 사망동물또한발견되지않았다. - 116 -

2) 체중변화 체중측정결과모든동물에서시험기간중정상적인체중증가가인정되었다. 3) 적용부의피부자극평가시험물질노출후 24, 72시간째에적용부의국소자극성을관찰한결과, 시험동물에서홍반, 및부종등이관찰되었고일차자극지수 (Primary Irritation Index) 는 "2.00" 으로산출되어약한자극성물질 (Mild irritant) 로판단된다. Skin after topical application at 24 hr. Skin after topical application at 72 hr. 3.2.4 안점막자극성시험 1) 일반증상및사망률 모든처치동물에있어서어떠한임상증상이나빈사및폐사동물은관찰되지않 - 117 -

았다. 2) 체중변화시험물질적용직전, 적용후 1일및 7일째에개체별체중을측정한결과, 투여후 7일동안정상적인체중증가가인정되었다. 3) 적용부위관찰시험물질적용후 1시간, 1, 2, 3, 4, 7일째에적용부의국소자극성을관찰한결과결막의발적, 부종및분비물등이관찰되지않았다. 평균안자극지수 (MOI) 는모든평가시간에 0.00으로판정되어급성안자극지수 (AOI) 는 0.00 으로평가되어 비자극물 (Non irritant) 로판단된다. - 118 -