ECL 프로토콜 화학발광 (ECL start, ECL, ECL prime, ECL select) 과형광 (ECL plex) GE Healthcare
Step 화학발광 (ECL start, ECL, ECL prime, ECL select) 형광 (ECL plex) 1) 실험계획 포인트 1.1. 전기영동과블로팅 (Blotting) 은한번에실험을진행하므로소요시간이나준비를확인합시다. 전기영동과블로팅은사용하는장비에따른 Protocol 를참고하십시오. 1.2. 항체희석률을검토해두면확실한결과를얻을수있습니다. 1.1. 전기영동과블로팅 (Blotting) 은한번에실험을진행하므로소요시간이나준비를확인합시다. 전기영동과블로팅은사용하는장비에따른 Protocol 를참고하십시오. 1.2. 항체희석률을검토해두면확실한결과를얻을수있습니다. 1.3. 기본조작은화학발광검출과같지만, 형광검출의경우에는다음과같은점을주의하십시오. 1.3.1. 형광검출성공의비결은백그라운드를낮게 억제하는것에있습니다. 1.3.2. 블로킹과워시시의버퍼양은막 1 cm 2 당 2.5 ml 이상을사용하는것을추천합니다. 1.3.3. 워시시에는막이충분히들어갈크기의용기를 준비합니다. 용기를사용하기전에물과에탄올로 워시합니다. 막이마르지않도록주의하십시오. 1.3.4. Powder-free 의글로브를사용합니다. 1.3.5. CBB, BPB, 볼펜의잉크, Triton X-100 등이섞여 들어가는것은백그라운드에영향을미치므로 주의하십시오. 1.3.6. 젤하단의 BPB 를포함하는부분도잘라냅니다. 2) 블로킹 (Blocking) 2.1. 검출까지한번에작업할수있도록미리준비해둡니다. 1 2 3 4 블로킹제 (5 % ECL Blocking Agent, 2 % ECL Prime Blocking Agent in PBS-T or TBS-T) 의조제 워시버퍼 (PBS-T or TBS-T) 의 조제 1 차항체, 2 차항체의희석 ( 희석액은 Suitable Blocking Agent in PBS-T or TBS-T 를 사용합니다.) 암실또는검출기기의예약 2.2. 블로팅 (Blotting) 한막을각 Blocking Solution 에담급니다. ( 검출후, 백그 라운드가높아졌을경우에는 PBS-T or TBS-T 의 Tween 20 농도및블로킹 시간, 온도를조절합니다.) 2.3. 실온에서 1 시간교반합니다. ( 막은 블로킹버퍼안에 4 의상태로오버 나이트로반응하는것도가능합니다.) 2.4. 새로운워시버퍼로바꾸어 2 분간 2 회 교반합니다. (1 cm 2 당 4 ml 이상의 2.1. 검출까지한번에작업할수있도록미리준비해둡니다. 1 블로킹제 (2% ECL prime Blocking Agent in PBS-T or TBS- T) 의조제, 2 워시버퍼 (PBS-T or TBS-T) 의조제 3 1 차항체, 2 차항체의희석 ( 희석액은 Suitable Blocking Agent in PBS-T or TBS-T 를사용합니다.) 4 암실또는검출기기의예약 2.2. 블로팅 (Blotting) 한막을각 Blocking Solution에담급니다. ( 검출후, 백그라운드가높아졌을경우에는 PBS-T or TBS-T 의 Tween 20 농도및블로킹시간, 온도를조절합니다.) 2.3. 실온에서 1 시간교반합니다. ( 막은블로킹버퍼안에 4 의상태로오버나이트로반응하는것도가능합니다.) 새로운워시버퍼로바꾸어 2분간 2회교반합니다. (1 cm 2 당 4 ml 이 상의버퍼를사용합니다. 8 10 cm 의막이라면 320 ml가적절합니다.)
버퍼를사용합니다. 8 10 cm 의막이라면 320 ml가적절합니다.) 3) 1차항체 3.1. PBS-T 또는 TBS-T 로희석한 1차항체에막을담급니다. (1차항체의희석배율은반응비교표를참고하시기바랍니다. 밴드가가늘거나, 엑스트라밴드가생기는등의문제점이발생한경우에는희석배율을검토할필요가있습니다.) 3.2. 실온에서 1 시간교반합니다. ( 최적반응시간, 온도는항체에따라다르므로경우에따라새롭게검토합니다 ) 3.3. 막을새로운워시버퍼에담근후교반하여워시합니다. 워시횟수는 2분간 2회, 15분간 1회, 5분간 3회입니다. (1 cm 2 당 4 ml 이상의버퍼를사용합니다. 8 10 cm 의막이라면 320 ml 가적절합니다.) 4) 2차항체 4.1. 블로킹제로희석한반응 HRP 표식 2 차항체에막을담급니다. ECL reagent 에따른 2 차항체의희석배율은비교표를참고하시기바랍니다. 4.2. HRP 표식 S-protein (ECL DualVue Western Blotting Markers) 또는 HRP 표식 Streptavidin (ECL Western Blotting Molecular Weight Markers) 를희석액에첨가합니다. 4.3. 실온에 1 시간교반합니다. ( 최적의반응시간, 온도는항체에따라다르므로경우에따라새롭게검토합니다.) 4.4. 막을새로운워시버퍼에담근후실온에서교반하여워시합니다. 워시횟수는 2 분간 2 회, 15 분간 1 회, 5 분간 3 회입니다. (1 cm 2 당 4 ml 이상의버퍼를사용합니다. 8 10 cm 의막이라면 320 ml 가적절합니다.) 5) 검출 5.1. CCD 카메라를이용한검출방법 5.1.1. 검출시약의조제 1 Solution A 와 Solution B 를실온에서평형화합니다. 2 Solution A : Solution B = 1 : 1 의비율로혼합합니다. 막 1 cm 2 당 0.1 ml 의검출시약이필요합니다. 8 10 cm 의막의경우는 8 ml Solution A, 200 μ l Solution B 를기준으로혼합합니다. 혼합시에검출용액이뿌옇게흐려지는현상은정상입니다. 검출시약은사용직전에혼합하십시오. 불가피하게잠깐동안 (2 시간이내 ) 혼합해두는경우호일로싸두거나, 어두운곳에보관합니다. 5.1.2. 랩위에블랏면이위로향하도록 3.1. 워시버퍼혹은블로킹제에희석한마우스혹은래빗유래의 1 차항체에막을담급니다. (1 차항체농도는 100, 500, 1000, 5000 배를기준으로실험을시작합니다. 적정항체양의기준은 0.3 ml/cm 2 이상입니다. 밴드가가늘거나, 엑스트라밴드가생기는등 의문제점이발생한경우에는희석배율을검토할필요가있습니 다.) 3.2. 다중검출을수행할경우는마우스유래와래빗유래의 1 차항 체를함께반응액에첨가합니다. 나누어서각각의반응액에반응시키십시오.) ( 항체액을재사용하는경우에는 3.3. 실온에서 1.5 시간교반합니다. ( 최적반응시간, 온도는항체 에따라다르므로경우에따라새롭게검토합니다.) 3.4. 막을새로운워시버퍼에담근후교반하여워시합니다. 워시 횟수는린스 x1 회, 5 분간 2 회입니다. (1 cm 2 당 4 ml 이상의버퍼 를사용합니다. 8 10 cm 의막이라면 320 ml 가적절합니다.) 4.1. 블로킹제로희석한 ECL Plex CyDye 표식 2 차항체에담급니다. 2 차항체의희석배율은 2,500 배희석이기준이며, 1,250~4,000 배 희석사이에서검토합니다. 4.2. 차광하여실온에 1 시간간교반합니다. (3) 차광하여막을새로운워시버퍼에담근후실온에서교반해서 워시합니다. 워시횟수는린스 3 회, 5 분간 4 회입니다. (1 cm 2 당 4 ml 이상의버퍼를사용합니다. 8 10 cm 의막이라면 320 ml 가 적절합니다.) 4.3. Tween 20 을포함하지않는워시버퍼로막을 3 회린스합니다. 5.3. 형광을이용한검출방법 5.3.1. 저형광글라스판 (3 mm 두께 ) 막을올려서사이에끼웁니다. 막과글라스판사이에기포가들어가지않도록주의하십시오. 기포의영향으로밴드가얇아질수있습니다. 5.3.2. Typhoon 의스테이지에먼지등이없는것을확인하고막면 쪽의글라스판에 Kapton tape 를붙입니다. 5.3.3. 샘플면이아래로향하게하여글라스판을설치합니다. 5.3.4. 스캔을시작합니다. 1 Focal Plane 3 mm ( 젖은막 ), 0 mm( 드라이막 ) 2 Pixel Size 100 μ m 3 Sensitivity Normal 4 PMT 볼티지추천 500~700 V( 젖은막 ), 300~500V( 드라이막 ) 5 사용하는형광의 excitation & emission 파장은아래와같습니다.
막을놓고, 막전체를덮도록검출시약을뿌립니다. 막에여분의워시버퍼가남아있으면백그라운드의원인이되므로물기를제거한후수행합니다. 5.1.3. 실온에서 5 분간방치합니다. 5.1.4. 막을핀셋으로조심스럽게집어올린후, 끝부분을킴와이프스에접촉하여여분의검출시약을제거합니다. 여분의검출시약이남아있으면백그라운드의원인이됩니다. 5.1.5. 단백질이있는부분을위로하여 CCD 카메라 sample tray 위에막을놓습니다. Figure Dye Ex. (nm) Em. (nm) A Cy2 489 506 B Cy3 550 570 C Cy5 649 670 5.1.6. CCD 이미징장비중 sample tray 놓는부분에 tray 를놓고 60 초간 CCD 카메라매뉴얼에따라서 60 초간노출시킵니다. 5.1.7. 현상한사진의신뢰성을평가합니다. 5.2. X- 선필름 Hyperfilm ECL 을이용한 검출방법 5.2.1. 검출시약의조제 1 2 Solution A 와 Solution B 를실온에서평형화합니다. Solution A : Solution B = 1:1 의비율로혼합합니다. 막 1 cm 2 당 0.1 ml 의검출시약이필요합니다. 8 10cm 의막의경우는 8 ml Solution A, 200 μ l Solution B 를기준으로혼합합니다. 혼합시에검출용액이뿌옇게흐려지는것은정상입니다. 검출시약은사용직전에혼합하십시오. 불가피하게잠깐동안 (2 시간이내 ) 혼합해두는경우호일로싸두거나, 어두운곳에보관합니다. 5.2.2. 랩위에블랏면이위로향하도록막을놓고, 전체를덮도록검출시약을뿌립니다. 막에여분의워시버퍼가남아있으면백그라운드의원인이되므로물기를제거
한후수행합니다. 5.2.3. 실온에서 5분간방치합니다. 5.2.4. 막을핀셋으로조심스럽게집어올린후, 끝부분을킴와이프스에접촉하여여분의검출시약을제거합니다. 여분의검출시약이남아있으면백그라운드의원인이됩니다. 5.2.5. 새로운랩위에블랏면이아래로향하도록막을놓고랩으로쌉니다. 기포가들어가지않도록주의하십시오. 기포의영향으로시그날이약해질가능성이있습니다. 막을강하게누르지않도록하십시오. 5.2.6. 필름카세트에막을블랏면이위 (x- 선필름쪽 ) 로향하도록놓습니다. 그위에 x-선필름을놓고카세트를덮습니다. 적색안전광아래서작업하십시오. 필름카세트안에검출시약이묻지않도록주의합니다. X-선필름의오른쪽끝을접는등상하, 앞뒤면을표시합니다. 5.2.7. 15초 ~ 수분간노출시킵니다. 타겟단백질의양이미량이거나시그날이약할경우에는노출시간을길게합니다. 1분 ~60 분이적절합니다. 5.2.8. X-선필름을현상합니다. 5.2.9. 현상한사진의신뢰성을평가합니다. ++++ = high performance +++ = good performance ++ = acceptable performance NA = not compatible NT = not tested