학술연구용역사업최종결과보고서 간흡충증고감도항체진단키트개발및유용성평가 간흡충증고감도항체진단키트개발및유용성 평가 주관연구기관 : 중앙대학교산학협력단 주의 ( 주의내용기재 ) ( 글 14 point 고딕체 ) 2 0 1 2 질병관리본부 질병관리본부
주의내용 주 의 1. 이보고서는질병관리본부에서시행한학술연구용역사업의최종결 과보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시질병관리본부에서시행한 학술연구용역사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개 하여서는아니됩니다.
질병관리본부학술연구용역사업최종결과보고서 과제명 간흡충증고감도항체진단키트개발및유용성평가 수행기관 / 연구책임자 중앙대학교산학협력단 / 홍성종 발주부서 말라리아기생충과 - 1 -
목 차 Ⅰ. 연구개발결과요약문 ( 한글 ) ---------------- 3 ( 영문 ) ---------------- 4 Ⅱ. 학술연구용역사업연구결과제1장최종연구개발목표 ------------------- 5 제2장최종연구개발내용및방법 ------------------- 11 제3장최종연구개발결과 ------------------- 17 제4장연구결과고찰및결론 ------------------- 56 제5장연구성과및활용계획 ------------------- 57 제6장기타중요변경사항 ------------------- 57 제7장연구비사용내역 ------------------- 58 제8장참고문헌 ------------------- 59 제9장첨부서류 ------------------- 60-2 -
과제명 중심단어 간흡충증고감도항체진단키트개발및유용성평가 신속진단키트, 항원단백질, 간흡충증진단, 항원성 주관연구기관중앙대학교산학협력단주관연구책임자홍성종 연구기간 2012. 3. 16. - 2012. 12. 15. 간흡충증은우리나라에서지금도여전히국민건강을위협하는장내기생충증중 1위를차지하고있다. 특히 4대강유역에서는주민들이민물고기를생식하여반복감염되고간흡충증이토착화되어있다. 현재간흡충증진단법은현미경대변충란검사, 혈청학적진단법으로 ELISA 검사법등이사용되고있다. 최근에는감염자의충체부하가낮아져서이들진단법은대단위집단관리사업에적용하기에상당한어려움이따르고있다. 이러한간흡충진단법을대치하기위해신뢰할수있는민감도와특이도를나타내고신속간편한신속진단키트개발이요구되고있다. 본연구에서는간흡충 EST 탐색과단백질칩으로항원성이확인된간흡충항원 17번을보완, 증강시킬수있는새로운항원을탐색하였다. 항원17번을포함한다수의간흡충단백질의 B-cell 항원기를예측하고부분단백질로발현, 정제하여항원성을분석하였으나항원17번보다높은민감도와특이도를보이는것이발견되지않았다. 항원으로서특이도가높다고보고된 Cs28GST 단백질을 tag로사용하고항원17번을융합시켜서항원성을검정하고신속진단키트 (RDT) 의항원 (test line) 으로사용하였다. ELISA에서는보통정도이던항원17번의 B-cell 항원결정기부분단백질 (17B-His) 이 RDT에서는항원성이우수한것으로평가되었다. 시제품 RDT 중에서, 17F-Cs28GST를 test line에놓고, 17B-His를 gold conjugate 로사용하여제작한 RDT가민감도와특이도가양호하여성능향상실험을실시하였다. 항원을 1.5 mg/ml로놓고 gold conjugate OD 9 농도의 RDT는민감도 68% 와득이도 100% 를보였으며, gold conjugate OD 9.5인 RDT는민감도 73% 에특이도 95% 를발휘하였다. Gold conjugate OD 10인 RDT는민감도가 80% 로증가하면서특이도는 95% 를유지하였다. 이 RDT는신속하고저렴한비용으로다량의혈청을검사할수있으며대변충란검출법보다간편하게현장에서사용할수있을것이다. - 3 -
Title of Project Key Words Institute Development of highly sensitive rapid diagnostic test kit for clonorchiasis and evaluation for usefulness Rapid diagnostic Test kit, Antigenic proteins, clonorchiasis diagnosis, antigenicity Chung-Ang University Industry Academic Cooperation Foundation Project Period 2012. 3. 16. - 2012. 12. 15. Project Leader Prof. Hong, Sung-Jong Clonorchiasis is the most prevalent disease among gastro-intestinal parasitic infections in Korea now. Clonorchiasis is an endemic disease in basins of four major rivers in Korea, where inhabitants eat fresh water fish in raw and repetitively infected by this fluke. Kato-katz stool examination and serological ELISA have been used to diagnose clonorchiasis, but thees methods have shortcomings such as taking long time and difficult for massive field works. So, now we need a rapid diagnostic test kit having high stability, sensitivity and specificity to replace the complicated methods. In this study, we have explored Clonorchis sinensis EST database and selected antigenic proteins to supplement antigen #17(Ag17), of which antigenicity was measured by protein chip and serologic tests. Even though we expressed and purified B-cell epitope region proteins derived from Clonorchis sinensis, all clones did not show good antigenicity. Cs28GST known of high specificity was employed as tag protein and Ag17 fused to this tag (17F-Cs28GST). This fusion protein was used as an antigen for RDT kits. B-cell epitope partial protein of Ag17 (17B-His) showed low sensitivity in the ELISA, but evaluated of a good antigen in RDT. Of the RDTs tested, a RDT with antigen 17F-Cs28GST in test line and 17B-histidine as gold conjugate appeared moderate sensitivity and specificity. In capacity enhancing experiments, one CsRDT using 1.5 mg/ml 17F-Cs28GST in test line and gold conjugate OD 9 revealed 68% sensitivity and 100% specificity, another CsRDT with conjugate OD 9.5 73% sensitivity and 95% specificity, the other CsRDT with conjugate OD 10 showed 80% sensitivity and 95% specificity. It is expected that this CsRDT is more cost-effective, speedy and versatile than stool examination for diagnosis of clonorchiasis in endemic areas. - 4 -
학술연구용역사업연구결과 제 1 장최종연구개발목표 1.1 목표 가. 연구목적및필요성 (1) 연구목적 간흡충에서높은민감도와특이도를나타내는재조합항원단백질을굴발하여항체검출신속진단키트 (Rapid Diagnostic Kit, CsRDT) 를제작한다. 간흡충증유행지현장에서간흡충감염에대하여이신속진단키트의간편성, 혈청학적민감도와특이도를분석하여현장적용도, 성능및유용성을평가하고자한다. 이진단키트를유행지주민의간흡충증검사 1차스크리닝에활용할수있도록한다. (2) 연구필요성 ( 가 ) 간흡충감염과국민건강 간흡충증은우리나라에서지금도여전히국민건강을위협하는장내기생충증중 1위를차지하고있는만성질환이다. 민물고기를생식하는지역, 특히우리나라 4대강유역에는간흡충증이토착화되어있으며주민들이반복감염되고있다. 일부지역에서는국지적으로전국평균감염률에비해 10배수준의높은감염률을나타내는지역도있다. 또한최근에는작은민물고기보다크기가큰민물고기고급어종으로소비형태가바뀌었다. 이큰민물고기는간흡충피낭유충감염율과부하가낮지만간흡충감염원이되고있다. 따라서민물고기양식과조리과정에대한관리대책이필요하다고본다. 간흡충은사람을비롯한포유동물의담도에기생하면서담도상피에물리적인손상을주고대사산물, 분비배설물의일부물질이독성작용을일으켜담관상피의과증식과담도둘레의섬유조직증식을유발시킨다. 간흡충에감염된사람은간염, 또는복부불쾌감, 소화불량, 폐쇄성황달, 담낭염, 담석증등의임상증상을호소하게된다. 간흡충감염이만성화되면간경변, 담관암까지유발할수있다. 세계보건기구 (WHO) 와국제암연구소 (IARC) 에서는간흡충을담관암유발생물학적원인체 Group 1으로공인하였다 (IARC working group, 2011). Group 1 발암체들은인체발암성에관한충분한근거자료가확보된생물체이다. 간흡충감염으로인하여발생된담관과간조직의병변은간흡충이구충된이후오랜기간동안잔존하는속발증 (sequela) 이다. 간흡충감염이진단이되면프라지콴텔로쉽게구충되므로간흡충으로인한만성질환으로의진행을막을수있다. 따라서간흡충감염을조기에정확하고빠르게진단하고치료하는간흡충증관리대책이매우중요하다. - 5 -
( 나 ) 간흡충감염의진단 - 현미경대변충란검사법 간흡충증진단법은현미경대변충란검사법이기준이되고있다. 간흡충감염은대변검사로간흡충충란을확인하여확진된다. 그러나, 간흡충피낭유충이감염자의담도에침입하여성충으로자라감염자분변에서간흡충의충란이검출되기까지는약 3~4주이상이걸리기때문에이기간사이에대변검사를통한조기감염이거의불가능하다. 현실적으로유행지주민이장내기생충진단용대변채취를번거로워하거나기피하여대단위집단관리사업에어려운요소가되고있다. 대변검사에서장내기생충들의충란을감별진단할수있는숙련된요원과검사장비들이필요하다. 또한대단위대상인원의대변을수거하기위하여수집직원동원과엄청난시간이필요하여대단위관리사업을전개하는데적용하기에어려운요인이되고있다. 대변검사법이외에혈청학적방법으로 ELISA법이보편적으로이용되고있다. 최근에영상진단법으로초음파검사법과내시경역행담도조영술등이소개되고있다 (Hong et al., 1998; 표1). 표 1. 간흡충증진단법비교 장점단점 대변충란검사법피내반응검사항체검출법 1) 영상진단법 2) - 민감도와특이도가우수함 - 정량검사법으로대변내충란수 (EPG) 측량하여충체부하추정할수있음 - 대규모집단검사에유리 - 주로초기감염진단에이용 - 간흡충감염자의 80-90% 가양성반응 - 유약충이나노쇠한충체감염기에항체를검출하여진단가능 - 잠정진단 : 간내담관의확장소견 - 합병증진단 : 담낭염, 담관염, 간염, 담관결석, 담관암등 - 경감염시충란검출율이낮음 - 혈청수집이불편함 - 치료후장기간양성반응 - 현증감염진단할수없음 - 민감도와특이성이낮음 - 현재감염여부를판정하는데한계가있음 - 고가검사비용 - 대단위집단진단에적용하기어려움 1) 효소면역측정법 (ELISA), 보체결합법, 면역형광법, 면역전기영동법, 면역한천확산법등 2) 초음파검사, 전산화단층촬영 (CT), 자기공명영상 (MRI), 내시경적역행담관조영술등 ( 다 ) 간흡충감염의진단 - 혈청학적진단법 다양한혈청학적진단법이있으나, 흡충류의감염에있어서커다란문제점중하나는민감도와특이도가모두우수한진단법이정립되어있지않은점이다. 이를보완하기위하여보체결합법, 면역형광법, 면역전기영동법, 면역한천확산법, 효소면역법등과 ELISA 방법등이개발되어사용되었다 ( 표1). 간흡충감염진단용 ELISA법에충체의조항원을사용하기때문에민감도와특이도를높이는문제에있어서한계가있었다. 특이도를향상시키기위하여조항원을대체할수있는항원성이높은재조합단백질항원을발굴하여사용해야한다. - 6 -
ELISA법에사용되는조항원을생산하기위해간흡충성충을대량확보해야하다. 성충을얻기위해많은수의실험동물이필요하며, 동물감염을위해다량의피낭유충이필요하다 ( 피낭유충을실험용토끼나쥐에경구감염시키고 2-3 개월후에담도에서성충을회수한다. 충체회수율은 30-40% 정도 ). 또한, 조항원은민감도는비교적높으나특이도가낮아다른흡충류에대해교차반응을보이는단점이있다. 안정적이고간흡충조항원보다높은특이도와민감도를나타내는단일항원단백질들을발굴하는것이 1차적인관건이되어왔다. 이재조합항원단백질들을조합, 배합하여다가복합항원을생산하여항원성을개선, 증강시키는것이 2차과업이될것이다. 복합항원단백질을사용하여간편하고, 빠르고정확하며현장적용성이뛰어난신속진단키트를제작, 생산하여보급하는것이 3차과업이라고생각한다. 신속진단키트의현장적용은적은양의혈청또는혈장으로도신뢰할수있는검사결과를낼수있어야한다. 신속진단키트는병의원이나개인이수월하게자가진단을할수있는것을의미한다. 신속진단키트는대단위집단관리사업에채택되어간흡충증의조기진단과만성감염으로진행되는것을예방하는데활용될수있을것이다. 그러므로기존혈청학적검사법의문제점으로제기된 1 조항원을대체할재조합항원단백질발굴, 2 민감도와특이도향상, 3 현증및과거감염감별기능등을향상시키기위하여간편하고경제적인간흡충신속진단키트개발이요구되고있다. ( 라 ) 간흡충증신속진단키트의국내및국외시장성 보건복지부주도아래 1971년제1차기생충감염현황조사사업 (Prevalence of Intestinal Parasitic Infections in Korea) 이시작된이후 1976년제2차, 1981년제3차, 1986년제4차, 1992년제5차및 1997 년제6차, 2004년제7차조사사업이 5-7년단위로실시되었다. 전국민의서기생충감염에관한통계자료가확보되어기생충퇴치정책자료로유용하게활용되었다. 최근에는과거에유행하던장내기생충감염률이 zero plateau에도달하였다. 2004년에실시된제7차조사 ( 질병관리본부 / 한국건강관리협회, 2004) 에따르면 1997년까지지속적으로감소하던간흡충양성률 (2.4%) 이 2004년에는 3.7% 로크게증가하였다. 이증가는감염율증가에기인하였다고보기어렵다. 표본집단에예년에비하여강유역주빈들이더많이포함되어나타난현상으로이해되어야할것이다. 또한국내에 4대강유역주민의간흡충감염율이 14.3% 로매우높은심각한상황으로간흡충증진단을국민건강검진기본항목에추가하여집중적으로관리를해야할것이다. 국내시장규모 : 약 100억원으로추정된다. ( 산출근거 : 추정감염자수 150만명 x 6500원 / 테스트 ) ( 보험수가참고 ) 해외시장규모 : 일본, 대만, 중국, 필리핀, 태국, 라오스등의감염자수가 2,000만명으로추정되어잠재시장규모는수백억원에이를것으로예상된다. 1.2 목표달성도및관련분야에대한기여도 - 7 -
구분월별추진일정목표달성도 연구내용 항원후보선별및 확보재조합항원단백질발현 정제 생산 를통한항원성 특이도 평가재조합항원단백질대량발현 정제 생산복합항원생산 검색 항원생산 를통한항원성 민감도 평가항원후보대량생산및정제시제품생산신속진단키트최적화 추진진도 (1) 기대효과 l l l l l l l l 간흡충증에대한혈청학적진단에새로운개념과기법제공특이도와민감도가우수한간흡충증혈청학적신속진단개발키트개발키트보급으로자가진단시대개막간흡충증진단비용절감및집단현장관리에빠르고손쉽게활용특이와민감도우수한간흡충증진단항원확보및항원의특성연구국내뿐아니라잠재적시장인중국, 베트남등에첨단진단키트와제조기술수출로고부가가치창출항원plate를냉장보관해야하는효소면역검사법에비하여신속진단키트는상온에보관하므로항원성이안정적이고유통, 보관, 판매에보다용이하다. 정책측면및연구 ü 간흡충유행지역주민을대상으로현장에서간편하게진단검사가가능하게된다. 이에따라국가기생충증진단표준품으로채택되어국가보건안정망구축에기여할것으로예상된다. ü 본연구에서개발될진단키트는기존의진단키트보다특이도와민감도가높으며, 사용법이원스텝 (one-step) 으로간편하고고가의장비없이신속하게현장검증 (point-of-care testing, POCT) 이가능한간흡충진단키트이다. ü 국내 외적으로최초로개발될것으로예상되어국제특허를포함한지적재산권확보, 수출등의경제적효과가예상된다. ü 개발될간흡충신속진단키트는 ELISA법에비하여생산단가가저렴하여간흡충증관리사업에경제적으로활용할수있다. - 8 -
(2) 활용방안 l l 대변검사법이민감도및특이도가높은보편적인진단방법이지만검사시간과인건비가많이소요되어대단위집단검진에적용하기에효율성이크게떨어짐. 따라서신속진단키트는대변검사법을대체할수있는고감도혈청학적진단법으로활용될것이다. 기존의대변검사법은숙련된전문검사인력이필요하므로일선보건기관및민간기관에서현실적으로자체수행하기에어려움이있다. 따라서본연구에서개발되는신속진단키트로 1차스크린하고양성자로판정된사람에대하여확진검사로대변검사를실시한후구충제를투여할수있다. 이방법은중앙과지자제간에업무를분장하고운영의효율성을극대화시키는데기여할것이다. 1.3 국내 외기술개발현황 가. 국내동향 - 기생충감염에대한혈청학적진단항원발굴에대한연구가지속되고있다. l l l l l 그동안여러연구진들에의해 cdna로부터전장단백질을발현시키고정제하여간흡충조항원에비해특이도와민감도가높은항원단백질을탐색하는연구가수행되어왔다. 최근간흡충 transcriptome DB가구축되어 EST정보를분석하고해당 cdna를분양받아서재조합단백질로생산하는연구가진행되고있다 (Yoo et al., 2011). Vacuolovirus system을이용하여진핵세포에서재조합단백질을생산하여민감도와특이도가향상된항원단백질을생산하는연구가시도되고있다 (Lee et al., 2006). In-fusion system과밀배아기반무세포단백질합성을통해삼일열원충의단백질을대단위로발현시키고, 아민단백질칩을제작하여열원충감염자혈청과정상인혈청을가지고항원성을검정하고선별된후보항원에대한 ELISA와단백질칩의상관관계등이연구되었다 (Chen et al., 2011 & 2010). 유구낭미충에서발견된 120 kda 및 150 kda 단백질에서서로다른 epitope subunit 4개를선택하여하나의 hybrid 항원단백질로생산하였을때단일항원보다더우수한민감도와특이도를나타내었다 (Bae et al., 2008). 톡소포자충에서분리된 4가지재조합단백질중 rsag1을이용하여고양이의혈청에서 rsag1 항체를검출하는높은특이도와민감도를나타내는신속진단키트가제작되었다. 이는이미상용되고있는 ELISA kit에견주어상당히높은연관성을보이는우수한진단시약이됨을보여주었다 (Chong et al., 2011). 나. 국외동향 - 9 -
- 기생충증에관련된항원단백질, 신속진단키트개발현황은다음과같다. l l l l l l l 약 20년전부터회선사상충의다양한항원단백질의항원성이평가되었다. 단일또는복합항원단백질을통한혈청학적진단연구가활발히이루어져각항원단백질은회선사상충의지역적유전자변이에따라반응이각각달랐다. 진단법개량을위해우수한항원들의 B cell epitope 부위를결합하여 hybrid 항원을생산하여연구하고있다 (Bradley et al., 1991; Andrews et al., 2010). 사상충증 (lymphatic filariasis) 을일으키는 Brugia malayi에서우수한항원 BmR1이분리정제되었고, 신속진단키트로 dipstick과 ELISA키트가개발되어상용되고있다. 정제단백질의수득을높이기위해 IMAC (immobilized metal affinity chromatography) 법과 IEX (ion exchange chromatography) 법을이용한연구가진행되었다 (Rahmah N et al., 1998; Arifin et al., 2010). 내장리슈만편모충증 (visceral leishmaniasis) 을진단하기위해재조합단백질 rk39을이용한 ELISA, 신속진단키트, 면역블롯, 직접응집검사 (direct agglutination test) 등이개발, 평가되어왔고진단과종감별을위해 PCR 방법도사용되고있다 (Srivastava et al., 2011). 유구낭미충증 (Cysticercosis) 진단을위해다양한종류의재조합단백질또는합성펩타이드를항원으로사용하여면역블롯이나 ELISA 방법으로평가하고있다. 단일항원으로는민감도와특이도를동시에만족하기어려워최근복합항원을 nitrocellulose membrane위에심어여러종류의항원으로환자의혈청으로한번에검사하는연구가진행되었다 (Wilkins et al., 2010a, 2010b). 주혈흡충의 genome project가완료되어 transcriptome, proteome, glycome 분석이진행되어새로운치료제, 백신, 진단항원개발에유용하게사용되고있다 (Hokke et al., 2007). 최근일본주혈흡충의수용성충란항원단백질을 dipstick으로개발하여실험실과현장에서 ELISA와 kato-katz 충란검사법과비교하였다 (Yu et al., 2011). 간질증 (Fasciolosis) 진단을위해다양한항원후보단백질을사용한진단법이시도되었으며최근재조합단백질 catheopsin L1으로 ELISA보다뛰어난면역검사법이개발되었다 (Ubeira et al., 2011). 세계적으로많은그룹이톡소포자충 (Toxoplasma) 에서분리된 SAG1, GRA5, GRA7 단백질을가지고항원성을연구중이며재조합단백질로 ELISA, immunochromatographic strip 등의신속진단법이개발되고있다 (Ma et al, 2009; Wang et al., 2011; Velmurugan et al., 2008; Holec-Gasior et al., 2009). - 10 -
제 2 장최종연구개발내용및방법 연구내용 가. 간흡충전사체분석 선행연구에서 protein chip을사용하여선별하여보유하고있는간흡충항원후보est의 B-cell epitope 을분석하였다. 박테리아시스템을이용하여후보클론의 cdna를 subcloning하고단백질을발현시켜항원후보단백질을정제하였다. 간흡충감염자, 다른흡충류나기생충증환자, 정상인대조군혈청에대하여 ELISA실시하고민감도와특이도를분석하여항원성을평가하고항원단백질을선택하였다. 나. 복합항원, chimeric 항원조제및신속진단키트제작 선택된단백질을다양한조합으로배합하여복합항원으로조제하였다. 항원성이우수하다고알려진 Cs28GST에선별된단백질의 B-cell epitope을분석하고항원기를연결하여 chimeric 단백질을생산하였다. ELISA를통해항원성을평가하고항원성이증강된복합항원단백질로신속진단키트를제작하여항원성을평가하였다. 연구방법 가. 항원후보클론선별 선행연구에서 protein chip 을사용하여선별하여보유하고있는간흡충항원후보 EST 중잔여클론에 대하여 B-cell epitope 을분석하고후보클론을선별하였다 (Table 2). 나. cdna 확보및재조합단백질합성 1 선별된후보클론의 cdna를확보하고시퀀싱을실시하여 ORP를결정하였다. 첫번째 methionine으로부터마지막 stop codon에이르는부분의 cdna를단백질발현용클로닝벡터 (pcs28gst-pet23 또는 pet23, pet44, pmal vector) 에 subcloning하였다. 2 플라스미드 DNA의염기서열을결정하고아미노산서열로연역한다음 ORF가올바르게연결된재조합발현벡터를선택하였다. 3 재조합 plasmid DNA로 E. coli BL21[DE3]pLysS를형질전환시키고 37 에서밤새배양시켜 single colony를얻었다. 4 새로운배양액에콜로니를접종하고 37 에서흡광도 A 600 이 0.6 정도되도록진탕배양하였다. 5 Isopropyl-β-thiogalacto-pyranoside (IPTG) 를최종농도가 0.1 또는 0.3 mm이되도록첨가하고배양하여재조합융합단백질을발현시켰다. 6 배양액을원심분리시켜대장균을모은후표적단백질의용해되는정도에따라 PBS나 2% sarcosyl - 11 -
을포함한 PBS 용액으로용균액을만들고 tag 단백질에따라 Ni-NTA resin, glutathione agarose 또는 amylose resin 을사용하여항원단백질을정제하였다. Table 2. Clonorchis sinensis EST clones encoding putative candidate antigenic proteins EST ID DNA Protein (bp) (aa) Description 1 CSA03055 711 236 tetraspanin family protein 16 invertebrate [Schistosoma mansoni] 2 CSA05948 702 233 hypothetical protein [Schistosoma mansoni] 3 CSA12898 858 285 growth hormone inducible transmembrane protein [Schistosoma mansoni] 4 CSA16074 516 171 Secretory carrier-associated membrane protein 2 [Schistosoma mansoni] 5 CSA17665 1030 345 wipi-2 [Schistosoma mansoni] 6 CSA17770 810 269 hypothetical protein, conserved [Trypanosoma brucei gambiense DAL972] 7 CSA18047 789 262 Vaculor amino acid transporter 6 [Ajellomyces capsulatus G186AR] 8 * 339 112 egg antigen [Paragonimus westermani] 9 CSM16820 1026 342 phosphatidylinositol glycan, class K [Schistosoma japonicum] 10 CSM19335 921 306 hyphthetical protein [Schistosoma japonicum] 11 * 393 130 30S ribosomal protein S8 [Schistosoma mansoni] 12 CSA04599_3 552 183 AGAP010490-PA [Anopheles gambiae str. PEST] 13 CSA13676_1 855 284 hypothetical protein [Schistosoma japonicum] 14 CSA16201_3 1176 391 (acyl-carrier-protein) S-malonyltransferase [Ruminococcus sp. 18P13] 15 CSA17308_3 324 107 hypothetical protein [Saccoglossus kowalevskii] 16 CSA19035_1 390 129 FAD-dependent pyridine nucleotide-disulphideoxido reductase [Sulfolobus islandicus] 17 CSA19133_3 420 139 predicted protein [Thalassiosira pseudonana CCMP1335] 18 CSA28266_3 825 274 lysosome-associated membrane glycoprotein [Schistosoma mansoni] 다. ELISA 를이용한후보재조합단백질의항원성평가 1 정제된단백질을 PBS에투석하고정량하여 2 ug/ml이되도록 carbonate buffer에희석하고 96 well plate에 200 ml씩분주하여 4 에밤새보관하였다. 2 각 well을 400 ul의 PBS/0.2% Tween-20 용액으로 3차례씻어주었다. 3 기생충증에감염된환자또는정상인대조군혈청을 PBS/T 용액에 1:200이되도록희석하여각 well 에 200 ul씩분주해주었다. 4 37 에서 1시간동안반응시켰다. 5 각 well을 400 ul의 PBS/0.2% Tween-20 용액으로 3차례씻어주었다. 6 HRP-conjugated human IgG를 1:3000이되도록 PBS/T용액에희석하여각 well에 200 ul씩분주하였다. 7 37 에서 1시간동안반응시켰다. 8 각 well을 400 ul의 PBS/0.2% Tween-20 용액으로 3차례씻어주었다. 9 OPD와 H 2 O 2 를증류수에섞고각 well에 200 ul씩분주하였다. 10 25 ul의 8 N HSO4용액으로반응을정지시켜주고 microplate reader로 490 nm에서흡광도를측정하였다 (Fig. 7). 11 각항원단백질의민감도와특이도를계산하였다. - 12 -
라. 복합항원 (cocktail antigen) 제작과항원성평가 서로다른민감도와특이도를보이는항원을다양한조합과배율로혼합하여최상의항원성을나타내는복합항원을찾아내어평가하였다 (Gimenez et al., 2009). 처음시도로우수한항원성을보이는여러종류의항원을 1:1의비율로배합하여각각의항원을사용했을때의항원성과비교하였다 (Neiman et al., 2009). 마. 항원후보단백질의 B cell epitope 검색 BepiPred (www.cbs.dtu.dk/services/bepipred/) 또는 linear epitope prediction database (http://140.121.196.30/lepd_antigenicity.php), Immune epitope database and analysis resource site (http://www.immuneepitope.org/) 를통해 Continuous (linear) epitope을예측하여공통적인부분을선택하였다 (Larsen et al., 2006). 사. 신속진단키트 (CsRDT) 시제품제작 항원성이가장뛰어난복합항원이나 chimeric 항원을선택하여 CsRDT시제품을생산하고항원성을평가하였다. 재조합단백질항원을사용한간흡충신속진단키트는아래그림과같이구성된반응판 (A) 을플라스틱하우징 (B) 에넣어서조립되었다 (Fig. 1). (A) (B) Fig. 1. Schematic diagram of CsRDT. Construct of reaction strip (A) and model of plastic housing containing reaction strip (B). 1 반응판 가축합패드 (conjugate pad) 를 0.5% PVA (polyvinylalcohol) 가함유된 Tris 완충액 (20mM, ph 8.0) 에 - 13 -
충분히적시고건조기에서완전히건조시킨후항원단백질분량규격대로절단하여사용하였다. 나콜로이드성금입자 (colloidal gold) 는일정량의금이온을증류수에녹인후, 100 에서강하게저어 주면서적절한환원제를첨가하여콜로이드성금입자를제조하였다 (Fig. 2). Fig. 2. Prepared colloidal gold conjugated with recombinant proteins. 다단백질A ( 특이항원 )-금입자축합체는콜로이드성금입자 ( 직경약 40 nm) 용액 (OD 540 =2.0) 을 100 ml 준비하여 37 에서교반하였다. 이용액에단백질A 또는간흡충항원단백질을첨가하여축합체를제조하였다. 금축합체를 1% BSA, 2 mm borate 용액으로세척하였다. 라준비된축합패드에단백질A 또는특이항원이결합된금축합체용액을분주하고, 완전히건조시킨후규격대로절단하였다. 2 혈청패드 (sample pad) 1 % Triton X-100 이함유된 0.1 M Tris (ph 8.0), 1% casein 또는 0.1 M carbonate 완충액에혈청 패드를충분히적시고건조기에서완전히건조시킨후규격대로절단하여사용하였다. 3 흡수패드 (absorbance pad) 흡수패드를완전히건조시킨후아무런처리없이규격대로절단하여사용하였다. 4 검사용멤브레인 Laminator를사용하여 nitrocellulose membrane을플라스틱카드에 lamination하였다. 검사선 (T) 부위에간흡충항원단백질을, 대조선 (C) 부위에산양항사람면역글로불린을자동분주기로분주하고 25~30 에서 48시간동안건조시켰다. 5 플라스틱하우징 ( 디바이스 ) 검사시험지를장착할하우징을아래와같은주안점을반영하여제작하였다. w w w w w 용액 을검사시험지혈청패드에넣었을때 가없어야한다 혈청를넣었을경우 항원 항체반응이최대한일어나도록유도해야한다 혈청주입후 용액이 초이내에대조선까지전개되어야한다 전혈 를사용할경우 혈구가잘분리되어야한다 대량제조시 검사시험지를조립할때흔들리지않아야한다 6 디바이스 검사시험지하단에축합패드가혈청패드와부분중첩되도록부착하고, 검사시험지상단에흡 - 14 -
수패드를부착하여검사시험지를완성시켰다. 검사시험지를 4 ± 1.0 mm 스트립으로절단하여플 라스틱하우징에넣어조립하였다 (Fig. 3). 1 2 3 4 5 6 7 Fig. 3. A lateral view of test strip. 1 혈청패드, 2 축합패드, 3 검사선, 4 대조선, 5 흡수패드, 6 plastic card, 7 nitrocellulose membrance. 7 혈청전개액 carbonate buffer (0.1 M carbonate, ph 9.5) 에 1% Triton X-100, 보존제 (0.02% NaN 3 ) 를혼합하여 제조하였다. Fig. 4. Flowchart of CsRDT manufacturing process. 아. CsRDT 성능최적화및유용성평가 1 민감도시험 : 간흡충감염혈청을 200 개이상사용하여신속진단키트의항체검출성능을평가하고, 민감도를 ELISA 법과비교하였다. 2 특이도시험 : 정상인의혈청을 200 건사용하여신속진단키트의특이도를평가하였다. - 15 -
제 3 장최종연구개발결과 1.1. Ag17F-Cs28GST 전장항원의 CsRDT 제작 무세포단백질생산시스템과대장균시스템을통해서항원후보단백질을생산하여간흡충혹은연충감염혈청에대하여 ELISA 검사로항원성을분석하였다. 그결과, 전장 Ag17-Cs28GST (17F-Cs28GST) 융합항원이민감도와특이도가높은항원으로선별되었다. 대장균에서응결되어수용성이낮은 Ag17F-Cs28GST융합항원을 sarcosyl을 detergent로사용하여용해시켜서정제하였다. 정제된 Ag17F-Cs28GST융합항원으로 CsRDT를제작하였다. RDT는산양항사람면역글로불린콘트롤라인과항원17번을 test 라인으로제작되었다. CsRDT는 ELISA를통해혈청학적으로간흡충양성판정받은간흡충감염자혈청에대하여 72% 이상의민감도를나타내었다. 그러나대변검사로간흡충충란양성이면서 EPG가 500이하인간흡충감염자혈청에대해서는 24% 미만의민감도를나타내었다 (Fig. 5 & Table 3). CsRDT를최적화시키기위해서혈청학적으로간흡충양성인환자혈청에대하여간흡충재조합융합단백질항원을평가하는것이가장적합하다고판단된다. Fig. 5. Serologic rapid diagnostic kits fabricated with Ag17F-Cs28GST show positive or negative signal for clonorchiasis. - 16 -
Table 3. Serologic detectability of Ag17F-Cs28GST rapid diagnostic kit compared with ELISA using C. sinensis crude antigen Group 1: C. sinensis infection serologically proven. Group 2: C. sinensis eggs detected from patient's feces, Sanchung-gun, Gyungnam Group 3: C. sinensis (+) sera collected in Heilungchiang province, China, endermic with clonorchiasis. 1.2. 각항원단백질의 B-cell epitope 와친수성부분예측 선행연구에서 protein chip 분석을통해선별하여보유하고있는간흡충항원후보EST 클론 (Table 2) 에대해 B-cell epitope와친수성부분을예측하였다. 역치값이 0.5이상되면서, 친수성예측점수 0.5점이상인것을수용성항원으로발현될가능성있는것으로선별되었다 (Fig. 6). 단백질발현벡터 pet-23 plasmid에 Cs28GST 항원단백질또는 6x-histidine tag가 fusion 되도록 construct를제작하였다 Fig. 6. (continued). - 17 -
Fig. 6. Putative antigenic part selected by B-cell epitope (upper panel) and hydrophilicity (lower panel) predictions. - 18 -
1.3. 항원단백질의 B-cell epitope 부분재조합단백질 가. 항원 17B 재조합단백질 선별된항원중가장우수한항원성을나타내는항원 17 번의 B-cell epitope 예측부분을 Cs28GST 에 fusion 시킨 construct (17B-Cs28GST) 를발현시켰다. 융합단백질은분자량이 35 kda 이었으며, thrombin 에 의하여 Cs28GST 와항원 17B 의 B-cell epitope 부분이절단되었다 (Fig. 7). Fig. 7. Ag 17B-Cs28GST fusion protein expression test. 이 construct 를박테리아에서대량발현시키고 Ni-NTA agarose 와 glutathione sepharose 4B 를이용하 여정제하였다. 양쪽모두에서목적단백질이외에 70kDa 와 28 kda 크기의단백질이함께정제되었다 (Fig. 8). Fig. 8. Purification of Ag17B-Cs28GST fusion protein using Ni-NTA agarose or glutathione sepharose 4B. - 19 -
이불순물제거를위하여다양한온도와 IPTG 농도조건에서발현, 정제하였다. 그러나모든조건에서불순물이제거또는감소하는효과를관찰할수없었다 (Fig. 9). 항원 17B 발현은기존의 IPTG 농도 0.1mM로 37 에서 3시간동안유도하고 GSH sepharose로정제하여분획을모았다. 4.5L 대장균배양을통해 30 mg이상의재조합단백질을정제하였다. 이정제된단백질을 size fractionation시키기위하여 gel filtration을실시하였다 (Fig. 9). Fig. 9. Ag17B -Cs28GSTcell epitope expression test with different concentration of IPTG and/or induction temperature. 나. 선별된다른항원 B-cell epitope 단백질 Cs28GST 또는 histidine tag 을 fusion 한재조합단백질은모두 0.1 mm IPTG 농도에서 3 시간발현되 었다. Coomassie 염색또는 western blot 을통하여재조합단백질의크기를확인하였다. 수용성으로발 현된단백질은대량박테리아배양하고 Ni-NTA agarose 또는 GSH sepharose 4B 로정제하였다. (1) Histidine C-terminus-tagged 융합단백질 142B-His, 174B-His, 228B-His, 372B-His, 551B-His는 IPTG induction으로과발현이되었으며정제시험에서표적단백질이잘정제되었다. 390B-His 단백질은과발현되지는않았으나정제되는것이확인되었다. 그러나 140B-His, 146B-His, 174B-His, 515B-His, 547B-His, 572B-His 단백질은과발현되지않거나과발현되어도불용성으로확인되었다 (Fig. 10). - 20 -
Fig. 10. Induction and purification test of 6x histidine-tagged B-cell epitope proteins. - 21 -
발현, 정제평가에서수용성분획으로용출되는재조합단백질은대장균 500 ml 에서발현시키고 Ni-NTA 를사용하여정제하였다. 목적단백질은 372B-His 을제외하고 100 mm 또는 200 mm 농도의 imidazole 을포함한 PBS 로용출되었다 (Fig. 11). Fig. 11. Histidine-tagged proteins purified by Ni-NTA agarose column chromatography. (2) Cs28GST 융합단백질 이미좋은민감도와특이도를보인다고보고된 Cs28GST 유전자를 expression vector 에삽입시키고표 적유전자와융합시킨후 0.1 mm IPTG 로발현시키고 GSH sepharose 를이용하여정제를테스트하였다. - 22 -
140-1B-Cs28GST, 140-2B-Cs28GST, 372B-Cs28GST, 390B-Cs28GST, 396B-Cs28GST, 142B-Cs28GST, 228B-Cs28GST, 551B-Cs28GST 단백질은과량발현되고정제되었다. 그러나 140-3B-Cs28GST, 146B-Cs28GST, 174B-Cs28GST, 515B-Cs28GST, 576B-Cs28GST, 547B-Cs28GST은과량발현되지않거나융합단백질이불용성이었다 (Fig. 12). Fig. 12. Induction and purification test of Cs28GST-tagged B-cell epitope antigenic protein. - 23 -
과발현되고정제가잘되는단백질을대량정제하기위하여대장균을 500 ml 배양하고 GSH sepharose 4B 를이용하여정제하였다. 표적단백질은 5 mm reduced glutathione 을포함한 PBS 용액에용출되었다 (Fig. 13). Fig. 13. Purification of Cs28GST tagged protein using GSH sepharose 4B. - 24 -
1.4. B-cell epitope 재조합단백질의항원성 -ELISA 그림 7과 9에서정제된단백질을 PBS 용액에밤새투석시키고정량하였다. 단백질항원의농도를 5 ug/ml이되도록조성하여 96-well microplate를밤새 coating 시키고간흡충, 타이간흡충, 폐흡충감염자혈청과정상인대조군혈청으로 ELISA를실시하여항원성을평가하였다. Cut-off value는정상인대조군혈청의 OD 490 평균값에 2x 표준편차를더한 0.15 또는 0.19로결정되었다 (Fig. 14). Fig. 14. (continued). - 25 -
Fig. 14. Antigenicity of C. sinensis antigenic protein B-cell epitopes and fusion to Cs28GST protein. - 26 -
각항원에대한민감도와특이도는표 4 에정리되어있다. 표적단백질과 Cs28GST 의융합이항원성을 향상시키는데도움이될거라고예상하였으나실제항원들의민감도는 6-38% 수준으로상당히낮았다. 타이간흡충감염혈청과교차반응하여특이도가낮은편이었다. Table 4. Antigenicity of B-cell epitopes or fusion to Cs28GST protein toward C. sinensis -infected human sera Antigen Cs crude Cs28GST-tagged 6xHis-tagged Cs Cs28GST-tagged 140-1 142 228 15 142 228 15 17 crude 140-2 372 390 396 cut off 0.15 0.19 sensitivity (%) 94 13 13 13 13 38 13 19 13 19 13 19 6 specificit y(%) Ov 0 75 50 50 50 13 75 50 38 75 75 75 75 Pw 50 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 (-) 94 100 100 100 100 100 100 100 100 88 100 100 100 100 1.5. Ag17B-Cs28GST 융합항원의 RDT 시제품 Ni-NTA 로정제된 Ag17B-Cs28GST 항원을 gel filtration 으로표적단백질을순수정제하고 RDT 시제품 을제작하여항원성을평가하였다. 가. RDT 의성능 정제된재조합 Ag17B-Cs28GST 항원으로 test line 을긋고 gold-conjugation 용으로사용하였다. 간흡충 양성자혈청 100 ul 를사용하였다. 반응이약하지만혈청 4 개가모두양성반응을나타내었다 (Fig. 15). Fig. 15. Reactivity of Ag17B-Cs28GST RDT against clonorchiasis patient sera. (+) reads positive reaction, even though weak in photos. 간흡충양성자혈청과정상인대조군사이에명확한결과의차이를관찰하기가어려웠다. 다시말해 - 27 -
Ag17B-Cs28GST 항원의특이성이떨어지는것으로생각된다. 양성환자혈청에서나타나는밴드가비특 이적반응일가능성도있다. 따라서 Ag17B-Cs28GST 단백질의항원성을확인하고, 비특이반응을일으키 는부분을제거해나가야할것이다. 나. CsRDT 의정상인혈청에대한반응성 축합패드에 Ag17B-Cs28GST에 conjugate로콜로이드성금입자를교반시켜만든항원-금입자축합체를분주하였다. 혈청패드에정상인혈청을 100 ul씩분주하여반응시키고 10-20분안에결과를판독하였다 (Fig. 16). 혈청 10개당 1-2개가위양성반응을나타내었다. 이 CsRDT의특이성을높여야한다. Fig.16. Reactivity of Ag17B-Cs28GST against normal control sera. 다. CsRDT 의민감도와특이도 ELISA 검사를통해혈청학적으로간흡충양성판정된환자의혈청또는정상인혈청을사용하여 Ag17B-Cs28GST RDT의성능을평가하였다 (Fig. 17). 7개의양성혈청중 1개가위음성으로판정되었으며 4개의정상인혈청에서는 1개가위양성으로판독되었다. 이후 Ag17B-Cs28GST 항원단백질의특이도와민감도를확인후농도별항원성을검사하고 RDT 에사용될항원으로서의최적조건을찾아낼것이다. Fig.17. Reactivity of Ag17B-Cs28GST RDT against clonorchiasis patient sera. - 28 -
1.6. Ag17B-Cs28GST 융합단백질의항원성 -ELISA 분석 전항의실험에서 17B-Cs28GST 항원의 RDT 성능이기대했던만큼크지않았다. Cs28GST-tag- 단백질의항원성증강효과를보기위해정제된 Cs28GST 와 GSH sepharose 로정제된 Ag17B-Cs28GST 단백질의항원성을 ELISA 로평가하였다 (Fig. 18). Fig. 18. Antigenicity of Cs28GST, Cs28GST-Ag17F and Cs28GST-Ag17B proteins by ELISA. 항원17의 B-cell epitope 부분을 Cs28GST과 fusion시킨융합단백질의항원성은같은 tag에전장단백질을 fusion 시킨항원과비교하여같은수준의항원성을유지하면서도더좋은 solubility를나타내어 native condition에서정제가되기를기대하였다. Cs28GST의민감도와특이도는각각 71%, 90% 이었다 (Fig. 18). Ag17F-Cs28GST 전장융합단백질은항원성의향상효과가있어각각 86%, 100% 를나타내었다. 그러나 Ag17B-Cs28GST 융합단백질은 solubility는현저하게증가하였으나민감도는 29% 로감소하였다 (Table 5). 이는선별된다른종류의항원성단백질에서도같은결과로나타난것으로해석되었다 (Table 4). 대장균에서발현시킨 Ag17단백질이불용성이되어서 detergent인 sarcosyl을사용하여정제하였다. Sarcosyl을이용하여정제된 Ag17F가항체인식과결합에영향을받지만전장단백질을정제하여사용한다는장점을가지고있다. Table 5. Antigenicity of modified or fused Ag17 antigens against C. sinensis-infected human sera Antigen Cs28GST-Ag17F Cs crude Cs28GST Cs28GST-Ag17B Cut-off 0.20 0.15 Sensitivity (%) 86 93 71 29 Specificity (%) 100 100 90 100-29 -
1.7. 제 2 후보항원군의전장단백질 결과 1.6. 항에서보여진바와같이 B-cell epitope를예측하여생산한항원단백질은 solubility 개선에는대단히효과적이었다. 그러나항원성개선효과는현저하지않았다. 그래서기발현시켰던항원후보단백질들과, 항원17의항원성을보완 / 개선할가능성이있는후보군을단백질칩분석결과를참고하여추가선별하였다. 이제2군후보단백질들을전장으로발현시키고정제하여항원성을평가하였다. 가. 제 2 군전장항원 -Cs28GST 융합단백질 각후보단백질의 EST sequence 중첫 methionine을포함시켜 stop codon까지가장긴 cdna를증폭시키도록 primer를제작하였다. 발현벡터는 Cs28GST 가 tag이되는 pet-23 개량 vector를사용하였다. Insert가삽입된클론들을선별하여 BL21(DE3)pLysS를 host cell로이용하여표적항원단백질을발현시켰다. 모든클론들은과발현되지않거나과발현되더라도불용성으로나타났다 (Fig. 19). 과발현된불용성 227F, 323-1F, 323-2F, 558F를 sarcosyl을사용하여용해시켜정제하였다. Fig. 19. Induction and test purification of full length antigenic proteins with Ni-NTA column. - 30 -
나. Cs28GST fusion 전장항원단백질정제 227F, 323-1F, 323-2F, 558F를 1 mm IPTG로 37 에서 4시간동안발현시키고 pellet을 3% sarcosyl/pbs용액에 resuspend 시켜서 sonication하였다. High speed centrifuge로원심분리시키고상층액을모아 Ni-NTA에 absorption 하고 PBS 용액으로수세하였다. 100 mm 와 200 mm imidazol/pbs 용액에표적단백질이용출되었다. 227F 단백질은고농도로단백질이깨끗하게정제되었으나 323-1, 323-2, 558 번은적은양의단백질이정제되었다 (Fig. 20). Fig. 20. Purification of antigen-cs28gst fusion proteins. SE, sarcosyl-extracted; SS, sarcosyl-extracted soluble, PT, pass thru; 1, 2, 3 & 4, elute. 1.8. ELISA 를이용한정제된전장재조합단백질의항원성평가 정제된전장재조합단백질을 PBS에밤새투석시키고정량하였다. 단백질항원의농도를 5 ug/ml가되도록조정하였다. 96-well microplate을밤새 coating 시키고간흡충양성자혈청과정상인대조군혈청을가지고 ELISA를실시하였다. Cut-off value는정상인대조군혈청의 OD 490 값평균에 2x 표준편차값을더하여 0.20이었다 (Fig. 21). 각항원에대한민감도와특이도는표 6에요약되어있다. Cs28GST의융합이항원단백질의항원성을향상시키는데도움이될것이라고예상하였으나 17F-Cs28GST (Table 6) 를능가하는민감도와특이도를보이는항원단백질이발견되지않았다. 그러나항원 323-2F-Cs28GST는 17F-Cs28GST이양성혈청을양성으로검출하지못하는것을양성으로잡아내었다. 그래서 17F-Cs28GST와 323-2F-Cs28GST로복합항원을조제하여항원성을검사하였다. - 31 -
Fig. 21. Antigenicity of full length antigenic candidates in the second group. Table 6. Antigenicity of fusion proteins against clonorchiasis and normal human sera Antigen Cs crude 227F-Cs28GST 323-1F-Cs28GST 323-2F-Cs28GST Cut-off 0.20 Cs(+) 4/5 =80% 30/40=75% 34/40=85% 33/40=82.5% Specificity 20/20= 100% 16/20=80% 10/20=50% 10/15=67% 1.9. 323-2F-Cs28GST 와 17F-Cs28GST 복합항원항원성 전장항원후보단백질중가장항원성이좋은 323-2F-Cs28GST을 17F-Cs28GST와각각 1:1 비율로혼합하여복합항원을제조하고간흡충양성자혈청에대하여 ELISA를실시하였다. 전체적으로 17F-Cs28GST항원에 323-2F-Cs28GST를넣어희석된값을보였으며, 17F-Cs28GST에의해위음성으로판독된것을양성으로판독하는데도움을주는경우는없었다 ( 표 7). 따라서 323-2F-Cs28GST의항원성증강효과가미미하였다. - 32 -
Table 7. Antigenicity of 17F-Cs28GST with 323-2F-Cs28GST comparing each antigen Conc. 2 ug/ml 2 ug/ml 2 ug/ml each OD490 Ag 17F-Cs28GST 323-2F-Cs28GST 17F-Cs28GST +323-2F-Cs28GST Cs (+) 1 0.495 0.334 0.488 2 (-) 0.173 0.123 0.169 3 0.879 0.320 0.644 4 0.495 0.259 0.472 5 1.575 0.370 1.424 6 1.545 0.376 1.279 7 1.424 0.552 1.454 8 0.510 0.272 0.460 9 0.240 0.136 0.219 10 0.498 0.263 0.557 11 0.778 0.300 0.754 12 0.594 0.290 0.574 13 1.234 0.421 1.189 14 0.755 0.265 0.660 15 0.397 0.228 0.422 16 0.572 0.312 0.557 17 0.896 0.403 0.860 18 1.348 0.267 1.373 19 1.390 0.455 1.401 20 0.298 0.197 0.253 21 0.489 0.316 0.552 22 0.652 0.269 0.579 23 0.616 0.188 0.563 24 0.537 0.285 0.527 25 1.309 0.468 1.423 26 1.437 0.890 1.555 27 0.885 1.270 1.414 28 0.821 0.311 0.816 29 0.112 0.122 0.154 30 0.427 0.165 0.414 31 1.432 0.221 1.386 32 1.417 0.445 1.495 33 0.836 0.305 0.687 34 0.587 0.244 0.546 35 1.852 0.256 1.631 36 1.066 0.236 0.919 37 1.358 0.309 1.277 38 1.583 0.198 1.237 39 0.423 0.130 0.305 40 1.362 0.546 1.363 41 1.175 0.232 1.067 42 0.687 0.254 0.728 43 1.321 0.326 1.416 44 0.264 0.155 0.311 45 1.674 0.567 1.645 46 0.904 0.994 1.286 47 1.382 1.239 1.493-33 -
1.10. 신속진단키트 (CsRDT) 시제품 항원성이뛰어난 Ag 17F-Cs28GST 또는 Ag 17B-histidine tag의융합단백질을가지고 CsRDT시제품을제작하고항원성을평가하였다. 축합패드 (conjugate pad) 는콜로이드성금입자용액을준비하고각항원과 37 에서교반하여특이항원-금입자축합체를제조하였다. 금축합체를 1% BSA, 2 mm borate 용액으로세척하였다. 준비된축합패드에금축합체용액을분주하고완전히건조시킨후규격대로절단하여사용하였다. Nitrocellose membrane의 control line (3.0 mg/ml goat anti mouse IgG) 과 test line ( 간흡충 17번항원 ) 에는각각의항원을자동분주기로분주하고 25-30 에서 48시간동안건조시킨후사용하였다. 준비된축합패드, 검사용 membrane 등을플라스틱하우징에넣어조립하였다. 혈청전개액은 0.1M Carbonate (ph9.5), 1% casein, 1% TX-100을혼합하여조제하였다. CsRDT 시제품을평가하기위해간흡충양성혈청은산청지역에서 ELISA 검사로 OD 490 가 0.5이상감염자의혈청을이용하였다. 정상인대조군은아산제약에서수집한혈청을간흡충조항원과 Ag17F-Cs28GST를이용하여각각 OD 490 0.16 이하인혈청을사용하였다. 가. 17 번항원을 test line, 17F-Cs28GST 를 gold conjugate 로사용하여민감도와특이도확인 Test line 에 17F-CsGST 또는 17B-His 항원을분주하고 17F-Cs28GST 를 gold conjugate 로사용하여반 응결과를살펴보았다. 민감도와특이도를알아보기위해각각간흡충양성자혈청과정상인대조군혈 청을사용하였다. (1) 저농도 17F-Cs28GST - gold conjugate 에서의민감도및특이도 Gold conjugate는 17F-Cs28GST를 OD 5 농도로사용하였다. Test line에는각각 0.5 mg/ml의 17F-Cs28GST, 0.46 mg/ml의 17B-His, 0.96 mg/ml의 17B-His의항원을사용하였다. Test line에 0.5 mg/ml의 17F-Cs28GST를사용했을때에는 100% 의민감도를나타내나음성혈청에서도거의 90% 에가까운 false positive 결과를나타내었다. 0.46 mg/ml의 17B-His 항원으로 capture할경우에특이도는상당히우수해졌으나민감도가매우낮았다. 0.96 mg/ml의고농도 17B-His 항원으로 capture할경우에는민감도가 50% 로증가되었으나반면에 70% 의위양성률을나타내었다 (Fig. 22). (A) - 34 -
(B) (C) Fig. 22. Test line 별저농도 17F-Cs28GST-gold conjugate 에서의민감도와특이도검겅. Test line 에 (A) 0.5 mg/ml 의 17F-Cs28GST, (B) 0.46 mg/ml 의 17B-His, (C) 0.96 mg/ml 의 17B-His 항원사용 (2) 고농도 17F-Cs28GST -gold conjugate 에서의민감도및특이도 Gold conjugate는 17F-Cs28GST를 OD 9.5 농도로사용하였다. 역시 test line에는각각 0.5 mg/ml의 17F-Cs28GST, 0.46 mg/ml의 17B-His, 0.96 mg/ml의 17B-His의항원을사용하였다. Test line에 0.5 mg/ml의 17F-Cs28GST 항원을사용했을때약 60% 의민감도를나타내나음성혈청에서는 100% false positive를나타내었다. 0.46 mg/ml의 17B-His 항원으로 capture할경우에는특이도는상당히우수해졌으나민감도가거의보이지않았다. 0.96 mg/ml의고농도 17B-His 항원으로 capture할경우에는민감도가 33% 로증가되었으나반면에 50% 의위양성률을나타내었다 (Fig. 23). (A) - 35 -
(B) (C) Fig. 23. Test line 별 17F-Cs28GST 의고농도 gold conjugate 에서의민감도와특이도측정. Test line 에 (A) 0.5 mg/ml 의 17F-Cs28GST, (B) 0.46 mg/ml 의 17B-His, (C) 0.96 mg/ml 의 17B-His 항원사용 (3) 민감도증강테스트 위양성율을낮추고민감도를향상시키기위해 test line 에 1.0 mg/ml 의 17F-Cs28GST 를, gold conjugate 로 17B-His 항원을 OD 9.5 농도로사용하였다. 간흡충양성혈청에대해 83% 의민감도를, 정상 대조군혈청에대해 100% 의민감도를나타내는우수한결과를얻었다 (Fig. 24). Fig. 24. 민감도증강테스트. Test line 에 17F-Cs28GST, 고농도 17B-His-gold conjugate 사용. - 36 -
나. Gold conjugate 를붙인항원 17 각각의민감도와특이도 (1) 혈청적하위치에따른민감도 Test line에 1.0 mg/ml 농도의 17F-Cs28GST를분주하고금입자축합체로는 17F-Cs28GST를 OD 5의농도로준비하였다. 혈청은간흡충양성자혈청을이용하였다. Control line과 test line 및 Sample Pad의조성, Buffer의조성을동일하게조성하였다. 혈청적하위치가다른 2 종의 RDT를이용하였다. Fig. 25(A) 와같이혈청을맴브레인위에적하하여혈청가우선진행하여민감도상승을기대하였다. 그결과혈청과 Buffer를같은곳에떨어뜨리는것이민감도면에서는우수하였다. 그러므로차후의실험은혈청을샘플패드에적하하기로결정하였다 (Fig. 25). (A) (B) Fig. 25. 혈청적하위치에따른민감도차이. (A) membrane 위에혈청적하. (B) 일반적인사용법대로패 드위에혈청적하 (2) 17F Cs28GST 항원을 test line 에심은 RDT 와여러 gold conjugate 의민감도와특이도 ( 가 ) 민감도 맴브레인에사용된 17F-Cs28GST와사용할적당한금입자 conjugate pad를선정하기위하여금축합체의종류별 Pairing Test를실시하였다금축합체는각각 17F-Cs28GST 항원에 OD 5의농도 (Fig. 26A), 17B-His 항원에 OD 9.5 (Fig. 26B), 17B-Cs28GST OD 7 (Fig. 26C) 농도가되도록조제하였다. Test Line 에는 1.0 mg/ml의 17F-Cs28GST를분주하였다. 간흡충양성자혈청을사용하였다. Fig. 26A의실험에서모든양성혈청이반응을보이므로 17F-Cs28GST의항원으로서의반응성이확인되었다. (B) 의경우에는 5개의양성혈청중 3가지의양성혈청만반응을나타내므로항원으로서의역활을하는 17F-Cs28GST중항원성은 Cs28GST보다는 17번이항원임이확인되었다. (C) 에서는 5가지모든양성혈청에서반응을보이지않으므로 17F-Cs28GST 중 Cs28GST 부위는항원으로서의반응성을보이지 - 37 -
않음을알수있었다 (Fig. 26). (A) (B) (C) Fig. 26. Test line 의 17F Cs28GST 항원에대한 gold conjugate 의민감도. (A) 17F-Cs28GST OD 5, (B) 17B-His OD 9.5, (C) 17B-Cs28GST OD 7. ( 나 ) 특이도 이 RDT의특이도를검정하기위해정상대조군혈청을사용하였다. Fig. 27A에서모든음성혈청에서반응을보이므로 17F-Cs28GST를 test line 및 Gold conjugate로함께사용경우항원의특이성이떨어져음성혈청이 false positive를나타내었다. Fig. 27B의경우, 음성혈청에서반응을보이지않으나민감도를증가시킬필요가있었다. (C) 의실험에서는 17F-Cs28GST를 test line으로 Gold conjugate로 17B-His를사용할때민감도는떨어지나특이성을보임을알수있었다. 민감도, 특이도반응실험결과를종합하여볼때, 17F-Cs28GST를 test line으로, 17B-His를 gold conjugate로사용하는 (C) 의경우 5 음성혈청에대해반응을보이지않았으며양성혈청에대해서도반응을보이지않았다 (Fig. 27). 17B-Cs28GST는특이도에서는당연히우수하나민감도가낮았다. 결론적으로, 17F-Cs28GST를 test line에심어 capture용으로, 17B-His를 gold conjugate로는사용하는조합이가장우수한성능을발휘것으로판단된다. - 38 -
(A) (B) (C) Fig. 27. 각 gold conjugate 에대한특이도확인 (A) 17F-Cs28GST OD 5, (B) 17B-His OD 9.5, (C) 17B-Cs28GST OD 7 (3) 17B-His 항원을 test line 에심고각 Gold conjugate 의민감도및특이도검정 ( 가 ) 민감도 이전의결과를볼때 17F-Cs28GST를 capture로, Gold conjugate로 17B-His 항원을사용하는조합이가장유리하여 capture와 Gold conjugate 항원을서로바꾸어다시한번반응성을비교하였다. 이상의실험을통해항원성이좋다고판명된 17B-His 항원을맴브레인의 test line에분주하고이와함께사용할적당한금입자 conjugate pad를선정하기위하여금축합체의종류별 Pairing Test를실시하였다. 금축합체는각각 17F-Cs28GST 항원에 OD 5의농도 (Fig. 28A), 17B-His 항원에 OD 9.5 (Fig. 28B), 그리고, 17B-Cs28GST OD 7 (Fig. 28C) 농도가되도록조제하였다. Test Line에는 17B-His를 1.0 mg/ml 농도가되도록분주하였다. 혈청은간흡충양성자혈청을사용하였다. Fig. 28A의경우 5개의양성혈청중에서한개만약한반응을보였다. 이는이전실험에서가장유리한조건으로판단된 17F-Cs28GST를 capture로 Gold conjugate로는 17B-His 항원을사용하는조건을뒤바꾸어 pairing을시도한것으로 20% 의양성률을보인이조합보다는 100% 의양성률을보인 17F-Cs28GST를 capture로 Gold conjugate로는 17B-His 항원사용하는조건의민감도가더우수하다. (B) - 39 -
는 17B-His 항원을 capture와 Gold conjugate로함께사용한조합으로 40% 의양성률을보였다. 항원17에의한반응성을보이고있으며 (A) 와비교시민감도는우수하나 17F-Cs28GST를 capture로, 17B-His Gold conjugate로사용하는조건보다는민감도가떨어진다. (C) 의경우에는 5개양성혈청에서반응을보이지않으며수회반복된실험결과를통해 17B-Cs28GST는항원성이없음을알수있었다 (Fig. 28). (A) (B) (C) Fig. 28. Test line 17B-His 항원에대한 gold conjugate 의민감도. (A) 17F-Cs28GST OD 5, (B) 17B-His OD 9.5, (C) 17B-Cs28GST OD 7. ( 나 ) 특이도 혈청은정상대조군혈청을사용하였다. 17B-His 항원을 capture로, 17F-Cs28GST를 gold conjugate로사용할때 Fig. 29A에서보이는바와같이 5개의음성혈청모두에서특이성을보였다. 17B-His를 gold conjugate로사용할때 5개의음성혈청이모두 false positive를보였다 (Fig 29B). 이는 17F-Cs28GST 항원중 17B-His 항원부위가민감도를보이는항원부위이기는하지만동시에 false positive의원인으로예측된다. 수차례의실험에서 17B-CsGST는항원성이없었으므로 17B-Cs28GST를항원으로사용하는경우 5가지모든양성혈청에서반응을보이지않았다 (Fig. 29C). - 40 -
(A) (B) (C) Fig. 29. Test line 17B-His 항원에대한 gold conjugate 의특이도. (A) 17F-Cs28GST OD 5, (B) 17B-His OD 9.5, (C) 17B-Cs28GST OD 7. 이상의결과를종합하면, 모든항원중항원성과위양성반응의원인은 Cs28GST이기보다 Ag17 예상된다. 17F-Cs28GST를 capture로 17B-His를 gold conjugate로사용하는 Pair에서상당한민감도와특이도를나타내었다. 이것은 17B가 17F와동일한항원부위를가지고있으면서 Cs28GST와융합된경우 3차구조가달라특이도이높아진것으로해석된다. 그러므로 17F-Cs28GST의 3차구조와 17B-His의 3차구조상의차이를보이는부위가특이도를높일수있는부위로예상된다. Ag17B의양단을잘라내는다양한길이의토막제조하여항원성을평가하고최적화시키는실험이요망된다. 다. conjugate gold 양과 test line 의항원단백질양에따른민감도와특이도최적화 상기실험결과, gold conjugate 로 17B-His 을사용하고, test line 에 17F-Cs28GGST 를사용하여최상의민 감도와특이도를보이는 gold conjugate 와 test line 단백질의농도를결정하였다. - 41 -
(1) Test line 의농도에따른반응선의강도 Control line에 3.0 mg/ml의 goat anti mouse IgG를사용하고, gold conjugate로는 17B-His 항원을 OD 10 농도로사용하였다. Test line에는 1.0 또는 1.5 mg/ml의 17F-Cs28GST 를사용하였다. 각각의신속진단키트를간흡충양성혈청과정상대조군혈청을사용하여민감도와특이도를비교하였다. Test line의농도차이에도불구하고민감도와특이도의차이가발견되지않았다. 그러나일반인의혈청을무작위로검사할때위양성률이증가할가능성이예상되므로민감도의범위를유지하는수준에서 test line의항원단백질과 gold conjugate의양을줄이도록설계하였다 (Fig. 30). (A) (B) (C) (D) Fig. 30. Test line의농도에따른반응선의강도실험. (A) 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST test with conorchiasis infected human serum. (B) 1.5 mg/ml 17F-Cs28GST test with conorchiasis infected human serum. (C) 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST test with normal human serum. (D) 1.5 mg/ml 17F-Cs28GST test with normal human serum. (2) Gold conjugate 와 test line 의농도에따른반응선의농후함 Control line에는 3.0 mg/ml의 goat anti mouse IgG를사용하고 gold conjugate로는 17B-His 항원을 OD 7.5 농도로사용하여앞서한실험에비해 gold의증감에따른민감도와특이도의변화를검사하였다. Test line에는각각 1 또는 1.5 mg/ml의 17F-Cs28GST를사용하였다. 각각의신속진단키트를간흡충양성자혈청과정상대조군혈청을사용하여민감도와특이도를비교하였다. 앞의실험보다 gold conjugate의농도를낮추고 test line의농도의증감에도불구하고민감도또는특이도의차이는발생하지않았다. 이경우에도일반인의혈청을무작위로검사할때위양성률의증가가예상되므로민감도의범위를유지하는정도에서가능한한 test line의항원단백질과 gold conjugate의양을줄이도록결정하였다 (Fig. 31). - 42 -
(A) (B) (C) (D) Fig. 31. Gold conjugate와 test line의농도에따른반응선의농후함. (A) 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST test with conorchiasis infected human serum. (B) 1.5 mg/ml 17F-Cs28GST test with conorchiasis infected human serum. (C) 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST test with normal human serum. (D) 1.5 mg/ml 17F-Cs28GST test with normal human serum. (3) 일반혈청에대한 CsRDT 의특이도 Test line은 17F-Cs28GST 을 1.0 또는 1.5 mg/ml으로사용하였고, gold conjugate는 17B-His 항원을 OD 10 또는 7.5의농도로사용하여 CsRDT를제작하였다. 일반인혈청혈청 200개를사용하여각각다른 test line 항원단백질의양과 gold conjugate의양의변화에따른반응을검사하였다. 일반인혈청 200개중 13개혈청이반응을나타내었다. 4종 CsRDT를사용한검사에서 3, 4번을제외한혈청 11개가더신속하게양성반응을나타내었다. 이혈청 2개는 test line 항원과 gold conjugate의농도변화에영향을받지않고음성반응을나타내었다 (Fig. 32). 이혈청 13개에대하여 ELISA로간흡충특이항체분석을실시하였다. (A) (B) - 43 -
(C) (D) Fig. 32. CsRDT 에대한일반인혈청의양성반응. (A) Test line, 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST, conjugate 17B-His OD 10. (B) 1.5 mg/ml 17F-Cs28GST, conjugate 17B-His OD 10. (C) 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST, conjugate 17B-His OD 7.5. (D) 1.5 mg/ml 17F-Cs28GST, conjugate 17B-His OD 7.5. CsRDT에대하여양성반응을나타낸혈청 13개에대해간흡충조항원과 17F-Cs28GST 를항원으로사용하여 ELISA를실시하였다. 혈청 13개중간흡충조항원에대해 4개의혈청이, 17F-Cs28GST 에대해서는 1개의혈청이양성반응을나타내었다 (Fig. 33). 이중혈청 1개는 CsRDT에음성반응을보였다. 종합적으로간흡충항체음성혈청 195개중위양성을나타내는혈청은 8개이었으므로, CsRDT의특이도는 96% 이었다. Fig. 33. ELISA results of common human sera positive to CsRDT. Antigens used were Clonorchis sinensis crude antigen and Cs Ag17F-Cs28GST fusion protein. (4) Test line 의농도와 sample pad 에따른민감도와특이도 - 44 -
Test line 항원으로는 17F-Cs28GST 의농도를달리하여사용하고 gold conjugate로는 17B-His를 OD 7.5 농도를유지하여사용하였다. 또한 sample pad에사용되는 buffer를 Tris나 carbonate를이용하고각 test line의농도와 sample pad에따른민감도와특이도를검사하였다. Test line 항원의농도를 1/2로줄였을때민감도가현저히낮아졌고 tris pad에비해 carbonate pad의민감도가떨어지는것이관찰되었다. 정상인대조군혈청에대해서모든조합의경우특이도가유지되었다 (Fig. 34). 같은조합의신속진단키트를가지고일반혈청 200개에대해검사를실시하였다. 이중 11개혈청은 test line에사용된 Cs28GST의농도의반감에도반응을나타내었다. 전체혈청중 ELISA를통해 5개는양성임이밝혀졌으므로기존의 80% 의민감도와 96% 의특이도를유지하였다 (Fig. 35) 그러나 sample pad에 carbonate를썼을때에는단한개의음성혈청에대해반응하므로 0% 의민감도와 99.5% 의특이도를나타내었다 (Fig. 35). (A) (B) Fig. 34. Test line 항원농도별및 sample pad에따른민감도 (A) 와특이도 (B). Top, test line 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST, conjugate 17B-His OD 7.5, sample pad 0.1 M Tris (ph 8.0), 1% casein, 1% Triton X-100. Middle, test line 0.5 mg/ml 17F-Cs28GST, conjugate 17B-His OD 7.5, sample pad 0.1 M Tris (ph 8.0), 1% casein, 1% Triton X-100. Bottom, test line, 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST, conjugate 17B-His OD 7.5, sample pad 0.1 M carbonate (ph 9.5), 1% casein, 1% Triton X-100. - 45 -
(A) (B) (C) Fig. 35. 일반인혈청에대한 test line 농도별및 sample pad에따른반응. (A) Test line, 17F-Cs28GST 1.0 mg/ml, conjugate 17B-His OD 7.5 sample pad, 0.1 M Tris (ph 8.0), 1% casein, 1% Triton X-100. (B) Testline 17F-Cs28GST 0.5 mg/ml, conjugate 17B-His OD 7.5, sample pad, 0.1 M Tris (ph 8.0), 1% casein, 1% Triton X-100. (C) Test line, 17F-Cs28GST 1.0 mg/ml, conjugate 17B-His OD 7.5, sample pad, 0.1 M carbonate (ph 9.5), 1% casein, 1% Triton X-100. - 46 -
1.11. Ag17 항원의항원성증강을위한재조합단백질생산 (1) 17F-nus, 17F-maltose binding protein fusion protein 현재 pet-44a와 pmal-cri 발현 vector를이용하여새로운 construct를제작하였다. 먼저 17번항원의전장길이를발현테스트하였는데, pet-44a에발현시킨것은 overexpression 이되지않았다. pmal vector를사용한것은 overexpression 은되었으나대부분 insoluble하였다. 지금까지전장 17번단백질은어떤발현벡터를써도재조합단백질이불용성을보이고있다 (Fig. 36). Fig. 36. Expression test of Ag17 full length polypeptide fused with nus or maltose tag protein. (2) 17B-maltose binding protein fusion protein CsRDT 에서 17B-his 가좋은항원성을가지고있음이확인되었으므로 17B 부분을상기의발현 vector 를 이용하여클로닝하였다. 그중 maltose binding protein fusion 단백질이발현, 정제됨을확인하였다 (Fig. 37). Fig. 37. Expression test of Ag17 B-cell epitope part fused with maltose binding protein. 이박테리아클론을 0.3 mm IPTG 농도로하여단백질발현을유도하고박테리아 pellet 을 20 mm Tris=HCl, 0.2 M NaCl, 1 mm EDTA 용액에녹이고 sonication 하여단백질수용성분획을모아 amylose resin 을 - 47 -
이용하여정제하였다. 10 mm maltose 를포함하는 elution buffer 로단백질을용출시켰다. 2 번째분획에가 장많은목적단백질이용출되었으며투석하고정량하여 RDT 제작에사용하였다 (Fig. 38). Fig. 38. Purification of 17B-MBP fusion protein. 1.12. 17B-MBP fusion protein 을이용한신속진단키트생산과평가 1.11에서정제된 17B-MBP protein을사용하여 RDT를제작하였다. 지금까지시험한다양한조합중가장높은민감도를보였던 17F-Cs28GST 를 test line에놓았다. 17B-MBP를 gold conjugate로사용하여간흡충항체양성혈청을가지고시제품 RDT의민감도를평가하였다. 기준이되는 test line에 17F-Cs28GST 와 gold conjugate로 17B-His OD7.5를사용한키트는양성혈청 5개중 4개를양성으로잡아내어 80% 의민감도를나타내었다. Gold conjugate를 17B-MBP OD 7.5로대체한것은 40% 의민감도를, test line을 1.25 mg/ml 17B-MBP로대체한것도 40% 의민감도를나타내었으나 17B-MBP를 test line과 gold conjugate로동시에사용한 RDT는간흡충양성혈청을한개도양성으로잡아내지못하였다 (Fig. 39). (A) (B) (C) (D) Fig. 39. 17B-MBP fusion protein을이용한 CsRDT의민감도측정. (A) Test line 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST, gold conjugate 17B-His OD 7.5. (B) Test line 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST, gold conjugate 17B-MBP OD 7.5. (C) Test line 1.25 mg/ml 17B-MBP, gold conjugate:17b-his OD 7.5. (D) Test line, 1.25 mg/ml 17B-MBP, gold conjugate 17B-His OD 7.5. - 48 -
이시점까지 RDT 로제작하여평가하였던항원 - 골드조합중 test line 에 17F-Cs28GST 와 gold conjugate 로 17B-His 가가장우수한민감도와특이도를보였다. 이조합으로최적화시험진행하기로하 였다. 1.13. 간흡충신속진단키트시제품의최적화 가. 시제품의민감도와특이도최적화 항원으로선정된 17F-Cs28GST 를 test line에, 17B-His를 gold conjugate로이용하여신속진단키트를제작하여민감도와특이도최적화시킨다. Gold conjugate 17B-His의 OD를각각 7.5와 9로조정하여각각의민감도와특이도를평가하였다. 저농도의 gold conjugate 항원을사용했을때간흡충양성자혈청 5개중 4개에반응하여 80% 의민감도를나타내었으며 100% 의특이도를나타내었다. 반면에고농도 gold conjugate를사용할경우에는간흡충양성자혈청 5개가모두반응하여민감도가 100% 로상승되었으나특이도는 75% 로떨졌다 (Fig. 40). (A) (B) (C) (D) Fig. 40. 시제품 RDT의민감도와특이도최적화. Test line 17F-Cs28GST 1.0 mg/ml. (A) Gold conjugate 17B-His OD 7.5. 간흡충양성자혈청에대한민감도. (B) Gold conjugate 17B-His OD 7.5. 정상인대조군혈청에대한특이도. (C) Gold conjugate 17B-His OD 9. 간흡충양성자혈청에대한민감도. (D) Gold conjugate 17B-His OD 9. 정상인대조군혈청에대한특이도. 나. 일반혈청에대한 CsRDT 의특이도평가 일반인혈청 100개를사용하여 CsRDT 시제품의특이도를평가하였다. Test line에 17F-Cs28GST 1.0 mg/ml을깔고, gold conjugate로 17B-His OD 7.5와 OD 9 농도를사용하였다. Gold conjugate를 17B-His OD 7.5 농도로사용한경우에모든일반검체에대해반응을보이지않았으나, 17B-His OD 9 농도를사용할때에는 100개검체중 2개가약한반응이보였다. 그러나 OD 10 농도 - 49 -
를사용한경우에는검체 51 개가양성반응을나타내었다 (Fig. 41). 다음단계로다수의간흡충양성자혈청을사용하여민감도가높은 RDT 를선정하기로한다. (A) (B) (C) Fig. 41. 일반인혈청에대한 CsRDT의반응. Test line 17F-Cs28GST 1.0 mg/ml, Gold conjugate 17B-His. (A) Gold conjugate OD 7.5. (B) Gold conjugate OD 9. (C) Gold conjugate OD 10. (20 RDTs are shown from each group). 다. CsRDT 의간흡충양성자혈청에대한민감도 CsRDT 는 test line 에 1.0 mg/ml 17F-Cs28GST 를사용하고 gold conjugate 로 17B-His 를 OD 7.5, 9 또는 10 농도로사용하여제작하였다. Sample pad 에는 0.1 M Tris (ph 8.0), 1% casein, 1% Tx-100 을 - 50 -
충진하고 buffer로 0.1M Tris (ph 8.5), 1% casein, 1% Tx-100을사용하였다. Control line으로 3.0 mg/ml anti-mouse IgG를사용하였다. 제작된 RDT의민감도를질병관리본부말라리아. 기생충과에서제공한간흡충양성자혈청 50개를사용하여검사하였다. 간흡충증은대변검사에서충란양성이고간흡충조항원을사용한 ELISA에서양성으로판정된것이다. 시험결과, gold conjugate 농도 OD 7.5에서는혈청 50개중 16개가양성반응하였으며, OD 9농도에서는 22개가, OD 10 농도에서는 40개가양성반응하였다 (Fig. 42). (A) (B) (C) Fig. 42. CsRDT의간흡충양성혈청에대한민감도. Test line Cs28GST 1.0 mg/ml, gold conjugate 17B-His. (A) old conjugate: 17B-His OD 7.5 (B) gold conjugate: 17B-His OD 9, (C) gold conjugate: 17B-His OD 10 (Some are shown) - 51 -
사용된간흡충양성판정받은환자의혈청의혈청학적항체가를평가하기위해 RDT에사용되어소진된 5개의혈청을제외한나머지혈청 45개에대해간흡충조항원을가지고 ELISA를실시하였다. 그결과정상인대조구의항체가로설정한 cutoff 값 (0.25) 보다낮은항체가를나타내는혈청은모두 10종이었다 ( 혈청학적위양성 ). 이를제외한 35개의항체가와 RDT에의한민감도검사결과는다음과같다 ( 표. 8) gold conjugate 농도 OD 7.5일때 35개혈청중 13개반응을하여 37% 의민감도를나타내었고, OD 9일때에는 17개가반응하여 49% 를, OD 10일때에는 29개가반응하여 83% 의민감도를나타내었다. 그러나, OD10농도일때에는일반검체에대한특이도가 49% 로현저하게떨어지므로 83% 의민감도는특이도상승에의한반응률이므로성적이휼륭한편은아니다. 표 8. ELISA 항체가에따른각 RDT 의민감도 - 52 -
라. 최종 RDT 조건설정 Gold conjugate 17B-His의농도를조절하여 RDT조건을최종적으로확정하기위하여, 대변검사로간흡충충란양성자중에서간흡충조항원을이용한 ELISA 검사를통해혈청학적으로도간흡충항체양성으로판정된혈청 45개, 폐흡충 (Paragonimus westermani) 항체양성혈청 20개, 간질 (Fasciola sp.) 항체양성혈청 5개, 일반인혈청 18개를사용하였다. RDT의 test line에 1.5 mg/ml 17F-Cs28GST 를사용하고 gold conjugate로 17B-His를 OD 7.5, 9 또는 10농도로사용하였다. Sample pad에는 0.1 M Tris (ph 8.0), 1% casein, 1% Tx-100을충진하고 buffer 로 0.1M Tris (ph 8.5), 1% casein, 1% Tx-100을사용하였다. Control line으로 3.0 mg/ml anti-mouse IgG를사용하였다. Gold conjugate 17B-His의 OD 9.0 농도일경우간흡충양성자혈청에대해 31개가양성반응하여민감도 68% 를나타내었으며, 폐흡충증혈청에대해 3개가양성반응을보여 85% 의특이도를, 간질증혈청에대해 2개가양성반응을보여특이도 60% 를, 18개의일반인혈청에대해반응을나타내지않아특이도 100% 를나타내었다. Gold conjugate OD 9.5 농도일때에는간흡충증혈청에대해 33개가양성반응하여 73% 의민감도를나타내었으며, 폐흡충증에대해 3개가양성반응하여특이도 85% 를, 간질증혈청에대해 2개가양성반응을보여특이도 60% 를유지하였다. 일반검체 18개중에 1개가양성반응하여특이도가 95% 로낮아졌다. Gold conjugate OD 10 농도일때에는간흡충증혈청에대해 36개가양성반응하여민감도가 80% 로상승하였다. 폐흡충증혈청에대해 4개가, 간질증혈청에대해 2개가, 일반인혈청에대해 1개가각각양성반응하여특이도 80% 와 60%, 95% 를나타내었다 (Fig. 43, 표 9). (A) - 53 -
(B) (C) Fig. 43. CsRDT의민감도와특이도. Test line 17F-Cs28GST 1.5 mg/ml, gold conjugate 17B-His. (A) Gold conjugate OD 9. (B) Gold conjugate OD 9.5. (C) Gold conjugate OD 10. Cs, clonorchiasis - 54 -
sera; Pw, paragonimiasis sera; Fg, fascioliasis sera; (-), normal human sera. Each panel shows some of RDTs tested. 표 9. Gold conjugate 17B-His의농도별 RDT의민감도와특이도 Gold conjugate 17B-His CsRDT Sera (No.) OD 9 OD 9.5 OD 10 Sensitivity Clonorchiasis (45) 68% 73% 80% Paragonimiasis (20) 85% 85% 80% Specificity Fascioliasis (5) 60% 60% 60% Normal human (18) 100% 95% 95% 이상의실험결과를총정리하면, 제작된 RDT중성능이가장우수한조합은 test line에 1.5 mg/ml 17F-Cs28GST 를사용하고 gold conjugate 17B-His OD 10 농도로사용하는것이었다. - 55 -
제 4 장연구결과고찰및결론 본연구에서는선행연구를통해우수한항원성을보이는 17번항원과더불어 17번항원을보완할항원들을탐색하고항원단백질을생산하여항원성을검사하고시제품을제작하여신속진단키트사용에대한가능성을연구하였다. 새로운 20여종의간흡충항원성단백질들을발현, 정제하여항원성을탐색하였다. B-cell epitope 부분발현시에는수용성이상당히개선되었으나 ELISA 검사를통해우수한단백질을찾는데는어려움이있었다. 항원단백질을전장으로발현시킬때에는많은경우과발현이되지않거나불용성단백질로발현되어정제에어려움이있었다. 어렵게불용성단백질을 denaturing condition으로정제하여도 Ag17항원을능가하거나보완할만큼우수한항원단백질을찾아내는데난항을겪었다. 항원성이우수한 Ag17 항원의전장또는 B-cell 항원기부분으로예측되는구역을발현, 정제시켜각각의항원성을평가하였다. ELISA 검사법에서는다소희망적이지않았던 17번항원 B-cell epitope 단백질이신속진단키트에서는항원성이우수한항원으로평가되었다. 항원성이좋다고생각된 Cs28GST와의융합단백질은 ELISA 검사에서는뛰어난항원성을나타내었으나신속진단키트에서는 test line 항원으로는전혀항원성을발휘하지못하였다. 그런데 17번항원 B-cell epitope 단백질은금축합체로만들어축합패드에장착하고 test line에 17번항원의 B-cell epitope 부분정제된단백질을쓸때민감도와특이도를모두만족시키는조합임을발견하였다. 현재까지제작된 RDT중성능이가장우수한조합은 test line에 1.5 mg/ml 17F-Cs28GST 를사용하고 gold conjugate 17B-His OD 10 농도로사용하는것이었다. 이 RDT는일반인혈청에대하여특이도 95%, 간흡충양성혈청에대해서는 80% 의민감도를나타내었다. 향후더많은수의간흡충항체양성혈청과여러종의기생충감염혈청, 더많은수의일반인혈청으로이 RDT의민감도, 교차반응, 특이도를평가하고성능을최적화시켜나가야할것이다. 이과제에서개발한 CsRDT는대변충란검사법보다사용이간편하다. 또한, 이 CsRDT는간흡충관리사업에서대량의대상주민혈청을현장에서일시에검사할수있을것이다. 따라서 1차스크리닝검사후항체양성자대변을현미경검사법으로간흡충감염여부를확인하면그유용성이우수할것으로예상된다. - 56 -
제 5 장연구성과및활용계획 5.1 활용성과과제명간흡충증고감도항체진단키트개발및유용성평가과제책임자홍성종 / 중앙대학교 / 기생충학가. 연구논문 번호논문제목저자명저널명집 ( 권 ) 페이지 Impact factor 1 해당사항없음 나. 학술발표 국내 / 국외 SCI여부 번호발표제목발표형태발표자학회명연월일발표지 1 해당사항없음 국내 / 국제 다. 지적재산권 번호 출원 / 등록 1 해당사항없음 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국출원 ( 등록 ) 번호 IPC 분류 라. 정책활용 해당사항없음 마. 타연구 / 차기연구에활용 해당사항없음 바. 언론홍보및대국민교육 해당사항없음 사. 기타 해당사항없음 5.2 활용계획 Ÿ 분자생물학적으로조합된간흡충항원17번재조합단백질을특허출원한다. Ÿ 간흡충대단위집단관리사업에활용한다. 이 RDT로대상지역주민을 screening하여간흡충항체양성자를대변검사대상자로추출하여진성감염을확인하는경제적접근에활용할수있다. 간흡충유행지에서대변검사대상자를대폭축소시킬수있다. Ÿ 간흡충유행지지자제의간흡충증관리사업시행과효과평가에횔용될것으로예상된다. Ÿ 간흡충유행지의국민건강검진항목에채택될수있다. Ÿ 이연구용역과제를통해생산된조합된간흡충항원17번재조합단백질을질병관리본부에이관한다. - 57 -
제 6 장기타중요변경사항 - 해당사항없음 제 7 장연구비사용내역및연구원분담표 7.1 연구비사용내역 단위 원 구 분 비 목 금액구성비비고 인건비소계 책 임 연 구 원 총 명 연 구 원 총 명 연 구 보 조 원 총 명 보 조 원 총 명 경비소계 국 내 여 비 국 외 여 비 유 인 물 비 전 산 처 리 비 시약및연구용재료비 회 의 비 임 차 료 교 통 통 신 비 감 가 상 각 비 위 탁 정 산 수 수 료 일 반 관 리 비 이 윤 합계 - 58 -
7.2 연구분담표 인건비 구분소속직위성명성분담내용지급여부별 단위 원 참여율 책임연구원 중앙대학교 교수 홍성종 남 연구결과분석 연구원 아산제약 주 부장 정점규 남 실험수행, 결과정리 연구원중앙대학교 김태임여 책임연구원보조, 문헌검색및결과분석 연구보조원중앙대학교연구원이지윤여실험수행 결과정리 연구보조원중앙대학교박사과정다이푸홍여유전자정보검색 재료수집 문헌검색 연구보조원중앙대학교박사과정백설련여유전자정보검색 재료수집 문헌검색 제 8 장참고문헌 Abdo J, Kristersson T, Seitzer U, Renneker S, Merza M, Ahmed J. (2010) Development and laboratory evaluation of a lateral flow device (LFD) for the serodiagnosis of Theileria annulata infection. Parasitol Res. 107(5):1241-8. Arifin N, Basuni M, Lan CA, Yahya AR, Noordin R. (2010) Purification of BmR1 recombinant protein. Protein J. 29(7):509-15. Bae YA, Jeong YT, Chung JY, Kim SH, Mahanta J, Feng Z, Chong CK, Kim TS, Kong Y. (2008) A recombinant chimeric antigen toward a standardized serodiagnosis of Taenia solium neurocysticercosis. Proteomics Clin Appl. 2(12):1596-610. Chen JH, Jung JW, Wang Y, Ha KS, Lu F, Lim CS, Takeo S, Tsuboi T, Han ET. (2010) Immunoproteomics profiling of blood stage Plasmodium vivax infection by high-throughput screening assays. J Proteome Res. 9(12):6479-89. Chen JH, Wang Y, Ha KS, Lu F, Suh IB, Lim CS, Park JH, Takeo S, Tsuboi T, Han ET. (2011) Measurement of naturally acquired humoral immune responses against the C-terminal region of the Plasmodium vivax MSP1 protein using protein arrays. Parasitol Res. 109(5):1259-66. Chong CK, Jeong W, Kim HY, An DJ, Jeoung HY, Ryu JE, Ko AR, Kim YJ, Hong SJ, Yang Z, Nam HW. Development and clinical evaluation of a rapid serodiagnostic test for toxoplasmosis of cats using recombinant SAG1 antigen. Korean J Parasitol. 2011 Sep;49(3):207-12. Giménez LG, Rojas J, Rojas A, Mendoza J, Camacho AG. (2009) Development of an enzyme-linked immunosorbent assay-based test with a cocktail of nucleocapsid and spike proteins for detection of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus-specific antibody. Clin - 59 -
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