2008 년대한간학회학술연구기금당선과제발표 가톨릭대학교의과대학내과학교실 윤승규 연구의배경 : 역학적, 병태생리적및임상적측면 간은지방산과중성지방 (triglyceride, 이하 TG) 대사를조절하는데중요한역할을한다. 비알코올지방간질환 (non-alcoholic fatty liver disease, 이하 NAFLD) 은음주와관계없이간내 TG가축적되는질환을의미하고, 여기에는단순지방간 (steatosis) 와비알코올지방간염 (non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 을포함한다. NASH는 1980년 Ludwig 등에의하여처음으로명명되었고지방간과함께염증혹은섬유화를동반하는것이특징으로되어있다. 단순지방간은임상적으로예후가양호한양성질환으로생각되고있으나 NASH는진행성간질환으로간경변이나간암을유발하는전구질환으로인지되고있다. 비알코올지방간의위험인자로크게비만, 당뇨병, 고지혈증이대표적이고이외에단백질-칼로리결핍, 몸무게를갑자기감량하는경우나정맥주사로전체영양을취하는경우에도올수있다. 이러한지방간은비알코올지방간염이나간경변으로진행될수있어앞으로점차심각한간질환으로생각되고있다. 국내의한보고에따르면최근 10대청소년에서비알코올성비만이급증하면서지방간도점차증가추세에있다. 예로 10대청소년비만율은 1988년 12.5% 에서 1998년 35.6% 로증가되고. 이들중 30% 이상이지방간을보였다고보고되고있어그심각성이점점심해지고있다. 미국의경우 NAFLD의유병률은약 20~30% 로보고되어있다. 1 NASH 환자의약 9~25% 에서간경변으로진행되고이들중 30~40% 는 10년이후간질환의합병증으로사망한다고보고되어있다. 2,3 Free fatty acid (FFA) 는 NAFLD나 NASH에서중요한역할을하고있지만아직기전적역할은확실하지않다. 사람에서혈청 FFA치는 NAFLD의정도와밀접한연관관계를갖고있다고보고되었다. 4,5 현재 WHO 추산에따르면약 200만명이지방간에의한간경변으로진행되고있다고보고하고있다. 일반적으로간은섭취된음식물, 지방조직및간내에서 de novo로생성된지방산에대하여반응하고이를처리하는데 FFA의 oxidation이공복시주요 gluconeogenesis의주요에너지원으로작용하고있다. TG는간에서말초조직으로이동되는동안 VLDL과결합하고지방산은주로지방조직에저장된다. 건강인에서공복시지방분해 (lipolysis) 는 TG를혈장내 nonesterified fatty acid (NEFA) pool로보내고반면지방세 - S72 -
윤승규 포는지방산을취한다. 식후췌장에서분비된인슐린은지방생성 (lipogenesis) 을증가시키고미토콘드리아에서지방분해와지방산의산화과정을감소시킨다. 2번째지방산의 source는 hepatic de novo lipogenesis (DNL) 이고 3번째는식사로섭취한지방의흡수이다. 1998년 Day 등은처음으로 NASH의병태생리에 two-hit theory 를도입하였다. 첫번째 hit인지방간의생성은간세포에서 3지방산과글리세롤 backbone으로구성되어있는 TG의축적이고, 많은동물연구와사람을대상으로한임상연구에서인슐린저항성이지방간의병태생리에핵심역할을하는것으로보고되고있다. NASH의병리기전은크게 2단계로진행이되는데, 이중에 TNF-α와 FFA가중요한역할을하는것으로알려지고있다. (Best Practice & Research Clinical Gastroenterology 2002;5:663-678) 혈청에서 FFA가증가하면간내에서 esterification이증가됨으로써 TG 증가된다. 6 그러나이러한 TG 자체가간손상을일으키는지여부에대한의문들은아직확실하게규명되어있지않았다. 하지만최근보고에따르면간내에서 TG가증가되면오히려 FFA에의한간손상이보호된다고하였는데, 7,8 향후이에대한규명연구가더진행되어야할것으로생각된다. 간세포에서 FFA의지방독성효과 (lipotoxic effects) 는 NASH의병리기전에서 apoptosis의중요한역할을한다고보고된바있는데, 9,10 이는 FFA가간세포내 mitochondria와 lysosome에서 Bax protein의활성화를유도하여 apoptosis를일으킨다는이론이다. 하지만이에대한연구는부분적으로보다연구가필요할것으로생각된다. 또한간세포내 FFA 축적은세포 sensor들을활성화시켜 apoptosis를유도한다고보고된바있는데, 이들 sensor중 CD36은지방세포에서 fatty acid binding protein (FABP) 및 fatty acid transport protein (FATP) 과상호작용하여 FFA uptake에관여하는것으로보고되고있다. 11 CD36의또다른기능으로 endothelial cell에서 apoptosis의 pathway의 receptor-mediated signal transducer로작용한다고알려져있다. 12,13 - S73 -
2008 년대한간학회추계학술대회 (Gastroenterology 2007;132:2191-2207) (J Clin Invest 2001;6:785-791) 하지만간내에서 CD36의역할은아직확실히규명되어있지않다. 말초조직에서 CD36의정상적인발현은여러연구에서관찰되고있지만, 정상간내에서의 CD36의발현은보고자마다달라 14,15 보다확실한규명이요구된다. 최근보고에따르면 16-18 다양한지방간동물모델에서 CD36의발현이증가됨을관찰하였고또한 LPS를처리한동물에서도 CD36의발현이증가됨으로써이는간의병적상태에서 CD36의발현이증가되는것을지지하는결과들이보고되고있지만이들의정확한기전은알려지고있지않다. 하지만 LPS receptor인 TLR4는 endotoxin에대한 receptor로작용할뿐아니라 FFA와결합, 작용하여말초 insulin 저항성을일으킨다는것이보고된바있다. 19 따라서세포내로 FFA의유입이증가되면 TLR4를통하여 CD36의발현이증가될가능성이있으리라고생각된다. 또한비만상태에서지방간에관여하는 PPARγ의과발현은 CD36의발현을증강시킨다는연구결과가보고되어 20 지방간의병태생리에 CD36이중요한역할을할것으로예측된다. CD36의또다른기능으로 TLR2/6 - S74 -
다. 24 지방간질환의증상은대부분없거나경한데그이유는간효소수치가약간증가되어우연히발견되기때 윤승규 Table 1. Possible causes for steatosis hepatitis Metabolic Abetalipoproteinemia Glycogen storage diseases Weber-Christian disease Wolmans disease Acute fatty liver of pregnancy Lipodystrophy Iron overload syndromes α-1-antitripsin deficiency Nutritional Malnutrition Total parenteral nutrition Severe weight loss Refeeding syndrome Jejuno-ileal bypass Gastric bypass Jejunal diverticulosis with bacterial overgrowth Inflammatory HIV Chronic Hepatitis C infection Drugs Methotrexate Diltiazem HAART2 Amiodarone Glucocorticoids Toxins Alcohol Environmental hepatotoxins (e.g. toxic mushroom) Wilsons disease Autoimmune Autoimmune hepatitis Celiac disease heterodimer complex를통해서기질인 diacylglycerol을인지하고전달하는역할을한다고보고된바있다. 21 이러한전달과정은 MyD88 경로를통해서염증신호를작동시키고근육세포에서 insulin 저항에영향을주며 apoptosis에관여한다고보고되었다. 22,23 따라서 TLR2는 CD36과상호작용하여 NASH에서 apoptosis의병리기전에중요한역할을할것으로예상된다. 최근 Science에발표한논문에따르면전사인자인 XBP1은간내 lipogenesis의조절에관여한다고보고하여지방간질환의병태생리에중요한역할을할것으로사료된 문이다. 일반적으로 ALT가상승하고영상학적으로지방간소견보일경우 NASH를진단하기위해서는다른질환들 ( 표 1) 을배제한후진단하는것이중요하다. 일반적으로 NASH에서 ALT가증가되지만정상상한치의 4배는넘지않고이러한수치는변동적으로나타나나정상으로돌아오는경우는드물다. 또한 r-gtp나 alkaline phosphatase도증가될수있으나이러한검사소견들로 NASH를진단하기에는예민도나특이도가너무낮다고생각된다. 지방간을진단하는영상학적도구로는초음파, CT, MRI가모두이용될수있으나불행하게도이러한영상학적도구는단순지방간으로부터 NASH를감별하는데한계를보이고있다. 이와같은임상적특성을가진 NASH의확진을위해서는간조직생검이요구되는데언제조직검사를해야하는가에대해서는아직논 - S75 -
2008 년대한간학회추계학술대회 란의여지가있다. 하지만일반적으로 ALT치가정상의 2배이상올라갈때조직검사가필요하다고인정하고있는실정이다. 그러나현재임상에서점차증가되고있는 NASH 환자들을모두조직검사를하는데에는한계가있어향후 NASH의진단을비침습적으로진단할수있는도구혹은방법의개발이시급한실정이다. 연구목적및계획 1. 연구목적 국내다기관에서비알코올지방간염 (NASH) 의빈도및원인인자를규명하고, 새로운병태생리를연구하며, 임상적특징을기반으로비침습성진단방법의개발을목적으로한다. 또한이러한임상과제와함께이행성연구로, 최근 Science지에발표된연구 (Science 2008, 320:13:1492) 에따르면 endoplasmic reticulum (ER) stress response를조절하는전사인자인 XBP1은간에서지방산의합성에이 hepatic lipogenesis를조절하여이유전자가결핍된생쥐에서는 hypocholesterolemia, hypotriglyceridmia가나타나는것을관찰하여보고하였다. 이러한기전이밝혀지므로 NASH의기전에도중요역할을할것으로예상되어본연구에서는 NASH의병태생리를다른측면에서연구하고자 NASH환자의조직을이용하여 XBP1의항체를이용한면역화학염색을통해임상및조직학적특성과 XBP1의발현을비교분석하여이러한전사인자가어떠한역할을하는지규명하고자한다. 2. 연구계획 연구개발의목표 2008-2009 다기관임상연구를통한국내 NASH 환자의역학과위험인자의분석 2009-2010 한국형 NASH 의병태생리와비침습성진단방법의확립 연구개발의내용 - NASH 진단을위한프로토콜확립 - 10 개병원에서조직학적으로확진된 NASH 환자의 data base 구축 - IRB 를획득후간조직생검시환자의혈청샘플확보 - NASH 환자의임상적조직학적특성규명 - 생검된간조직에서 CD36 의발현을조사하고최근보고된 lipogenesis 에관여하는전사인자인 XBP1 의간내발현여부를규명함으로 NASH 의병리기전을연구 - 조직학적으로확진된환자들의임상적및병리학적특징을분석하여조직검사없이 NASH 를진단할수있는 parameter 를규명 - 보관된혈청에서 TNF-alpha, IL-6, IL-8, CK-18 을분석하여조직학적특성과비교분석 -200 명이상의환자를분석하여 NASH 의새로운비침습성진단방법을확립 - S76 -
윤승규 3. 연구방법 본연구과제는다기관임상연구 (Multicenter Clinical Research) 로연구형식은 prospective observational cohort study이며, 참여기관은총 10개병원으로가톨릭의대강남성모병원, 가톨릭의대여의도성모병원, 가톨릭의대의정부성모병원, 가톨릭의대성빈센트병원, 가톨릭의대부천성가병원, 가톨릭의대성바오로병원, 가톨릭의대인천성모병원, 가톨릭의대대전성모병원, 순천향의대부천병원, 순천향의대서울병원이다. 4. 연구대상 < 선정기준 > non-viral, non-alcoholic, non-autoimmune chronic hepatitis 환자로 : 최근 3개월이상 ALT의 upper limit of normal (ULN) 이상인경우 < 제외기준 > a. alcohol consumption (20 g/day 이상 ) -- alcohol 20 g에해당하는양 : 맥주 500 ml, 와인 200 ml, 소주 120 ml, 양주 60 ml b. viral hepatitis B and C, HIV infection c. autoimmune hepatitis d. Wilson s disease e. hemochromatosis f. alpha-1 antitrypsin deficiency g. 간장약, 당뇨약, 혈압약, 고지혈증약외에다른약을 3개월이상복용하는경우 h. severe comorbid medical conditions (such as severe cardiac, pulmonary, renal or psychological problems) i. those not consenting for the study 관찰및임상검사항목 Screening Baseline 관찰기 기간 For 3 mos 0 time 6 mo 12 mo 검사종목 Blood pressure O O O Body weight O O O Height O O O Waist circumference O O O Hip circumference O O O CBC, CRP O O O O LFT, Lipid profile, O (2회이상 ) O O O HBs Ag/Ab Anti-HCV Ab, Anti-HIV Ab - S77 -
2008 년대한간학회추계학술대회 Iron, TIBC ferritin O O O Serum ceruloplasmin alpha1-antitrypsin ANA titer Anti-SM Ab Anti-LKM1 Ab AMA FBS O O O Fasting insulin O O O Liver Biopsy O Adiponectin, resistin O* TNF-alpha O* Total CK18 O* Caspase cleaved CK18 O* Fat abdominal CT O Informed consent O : LFT 항목 -- AST, ALT, TP, alb, TB, DB, alk-p, r-gtp, prothrombin time : Lipid profile 항목 -- TC, TG, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol i : screening 시작 1년이내또는 screening기의검사이어야함. *: biopsy 시보관된 serum으로시행. 간조직검사소견 a. NASH 진단소견 : steatosis (>5%) and lobular inflammation and ballooning degeneration : with or without Mallory bodies and/or fibrosis b. NASH의 grading 및 staging : by Brunt EM, et al. Nonalcoholic steatohepatitis: a proposal for grading and staging the histologic lesions. Am J Gastroenterol 1999;94:2467-2474. 임상용어의정의 a. metabolic syndrome (NCEP-ATP III criteria) : 다음 5가지항목중 3가지이상을만족하는경우 -- 허리둘레 >90 cm ( 남 ), >80 cm ( 여 ) -- 혈압 >130/85 mmhg -- 공복혈당 >110 mg/dl -- 중성지방 >150 mg/dl - S78 -
윤승규 -- 고밀도지단백콜레스테롤 <40 mg/dl ( 남 ), <50 mg/dl ( 여 ) b. homeostatic model assesement-insulin resistance (HOMA-IR) : fasting insulin (uu/ml) X fasting glucose (mmol/l)/22.5 본과제의 primary endpoints는대상군에서 simple steatosis 및 NASH의빈도와한국인에서 NASH와 simple steatosis 감별을위한 non-invasive parameters를규명하는것이고, secondary endpoints로는한국인 NASH와 metabolic syndrome의연관성, 한국인 NASH와 insulin resistance (HOMA-IR) 의연관성, 한국인 NASH와 BMI, diabetes와의연관성, 1년추적검사에서예후에영향을미치는예측인자분석하는것을목표로하고있다. 본과제의예상되는연구결과및발전방향은 NASH의국내유병률추정하고, 한국인 NASH의특징규명하고, 한국인 NASH의 natural course를관찰할수있는 prospective cohort 확립하며, 예후에영향을미치는인자를발굴함으로써임상에서환자관리에도움을줄수있으리라기대한다. 또한조직검사없이 NASH를진단할수있는 non-invasive parameters를규명할수있으리라기대된다. 참고문헌 1. Clark JM, Brancati FL, Diehl AM. Non-alcoholic fatty liver disease. Gastroenterology 2002;122:1649-1657 2. McCullough AJ, The epidemiology and risk factors of NASH. In: Farrell GC, George J, Hall P, McCullough AJ Eds In: Fatty Liver Disease: NASH and Related Disorders. Oxford: Blackwell, 2005:23-37. 3. Matteoni CA, Younossi ZM, Gramlich T, Boparai N, Liu YC, McCullough AJ. Nonalcoholic fatty liver disease: a spectrum of clinical and pathological severity. Gastroenterology 1999;116:1413-1419. 4.Angulo P, Keach JC, Batts KP, Lindor KD. Independent Predictors of Liver Fibrosis in Patients With Nonalcoholic Steatohepatitis. Hepatology 1999;30:1356-1362. 5. Bookman, ID, Pham J, Guindi M, Heathcote EJ. Distinguishing nonalcoholic steatohepatitis from fatty liver: serum-free fatty acids, insulin resistance, and serum lipoproteins. Liver Int 2006;26:566-571. 6. Anstee QM, Goldin RD. Mouse models in non-alcoholic fatty liver disease and steatohepatitis research. Int J Exp Pathol 2006;87:1-16. 7. Listenberger LL, Han X, Lewis SE, Cases S, Farese RV Jr, Ory DS, et al. Triglyceride accumulation protects against fatty acid-induced lipotoxicity. Proc Natl Acad Sci U S A 2003;100:3077-3082. 8. Yamaguchi K, Yang L, McCall S, Huang J, Yu XX, Pandey SK, et al. Inhibiting triglyceride synthesis improves hepatic steatosis but exacerbates liver damage and fibrosis in obese mice with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 2007;45:1366-1374. 9. Malhi H, Bronk SF, Werneburg NW, Gores GJ. Free Fatty Acids Induce JNK-dependent Hepatocyte Lipoapoptotis. J Biol Chem 2006;281:12093-12101. 10.Feldstein AE, Werneburg NW, Li Z, Bronk SF, Gores GJ. Bax inhibition protects against free fatty acidinduced lysosomal permeabilization. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2006;290:G1339-G1346. 11. Doege H, Stahl A. Protein-Mediated Fatty Acid Uptake: Novel Insights from In Vivo Models. Physiology (Bethesda) 2006;21:259-268. 12. Jiménez B, Volpert OV, Crawford SE, Febbraio M, Silverstein RL, Bouck N. Signals leading to apoptosisdependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. Nat Med 2000;6:41-48. 13. Susztak K, Ciccone E, McCue P, Sharma K, Böttinger EP. Multiple metabolic hits converge on CD36 as novel mediator of tubular epithelial apoptosis in diabetic nephropathy. PLoS Med 2005;2:e45. 14. Abumrad NA, el-maghrabi MR, Amri EZ, Lopez E, Grimaldi PA. Cloning of a rat adipocyte membrane protein - S79 -
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