Polymer(Korea), Vol. 35, No. 5, pp 378-384, 2011 실크피브로인 / 젤라틴하이브리드지지체의제조및특성분석 김혜린ㆍ홍민성ㆍ김수진ㆍ조한수ㆍ유일수ㆍ이동원 ㆍ강길선 전북대학교 BIN 융합공학과, 고분자나노공학과 (2010년 9월 30일접수, 2011년 3월 1일수정, 2011년 4월 12일채택 ) Preparation and Characterization of Silk Fibroin/Gelatin Hybrid Scaffolds Hye Lin Kim, Minsung Hong, Su Jin Kim, Hansu Jo, Il Sou Yoo, Dongwon Lee, and Gilson Khang Department of BIN Fusion Technology, Department of PolymerㆍNano Science Technology, Polymer Fusion Research Center, Chonbuk National University, 664-14, Dukjin, Jeonju 561-756, Korea (Received September 30, 2010; Revised March 1, 2011; Accepted April 12, 2011) 초록 : 실크피브로인은생체적합성과비독성및비면역특성을갖는생분해성천연고분자로서, 콜라겐의가수분해로부터유래되는천연물질인젤라틴을이용하여실크피브로인 / 젤라틴지지체를제조하였다. 지지체의최적화조건을찾기위하여실크피브로인의양과젤라틴및글루타알데히드의농도를다르게하여제조하였다. 실크피브로인 / 젤라틴지지체는 SEM 과 DSC 및수분흡수성평가를통해특성분석을하였으며세포생존율및증식률은 WST 방법을통해평가되었다. 이결과실크피브로인 지지체에 8% 젤라틴및 글루타알데히드를함유한지지체에서세포부착및증식을위해가장적합한특성을제공한다고제안되었다. 결과적으로, 실크피브로인 / 젤라틴지지체는잠재적인세포전달체및조직공학을위한구조기반역할을할수있을것으로사료된다. Abstract: Silk fibroin is a biocompatible and slowly biodegradable natural polymer. This natural polymer has excellent mechanical properties, non-toxicity, and non-immunogenic properties and has been demonstrated to support tissue regeneration. Also, gelatin is a natural material derived from collagen by hydrolysis and has an almost identical composition as that of collagen. Silk fibroin/gelatin scaffolds have been fabricated by using the freeze-drying method. To establish the scaffold manufacturing condition for silk fibroin and gelatin, we made scaffolds with various compositions of gelatin, glutaldehyde and silk fibroin. The silk fibroin/gelatin scaffolds were characterized using SEM, DSC, and water absorption ability tests. The cellular proliferation was evaluated by WST assay. These results suggested that a scaffold containing 8% of gelatin, of glutaldehyde and of silk fibroin provided suitable characterstics for cell adhesion and proliferation. In conclusion, the silk fibroin/gelatin scaffold may serve as a potential cell delivery vehicle and a structural basis for tissue engineering. Keywords: silk fibroin, gelatin, scaffold, tissue engineering. 서 생체조직공학이란생체에서완전히흡수되고세포와친화력이있는고분자지지체와세포를생체조직에이식함으로써새로운실질조직을복원, 재생, 대체하여정상적인기능을유도하는일련의기법이다. 1 이는세포배양학, 재료공학, 이식수술분야의다학제간조합이며, 이러한조직공학기법을이용하여원하는조직을얻을수있고지지체의모양에따라그모양을마음대로주조할수가있다. 조직공학분야에있어서세포및지지체의생물학적신호는매우중요한요소이며 2 사용되는생체재료지지체의역할은생체내에서세포가잘정착하여배양될수있도록도와줄수있어야하고고유의표현형을유지하면서생체재료지지 론 To whom correspondence should be addressed. E-mails: gskhang@jbnu.ac.kr, dlee@jbnu.ac.kr 체에골고루분포되어야하며분리된세포가생체내에서세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 을풍부하게분비함으로써분화된조직의재생을촉진시켜야한다. 3 또한체내에이식된후에도주변조직과융화가잘되고일정기간이지나면안전하게흡수, 분해하는생체적합성을가져야한다. 4 효과적인조직재생을위한이상적인지지체에는체내하중을견뎌내야할충분한기계적강도, 세포들의접착및성장이가능한표면화학적성질, 기공의마이크로와매크로적인구조, 크기및형태등이필수조건으로서요구된다. 특히세포의점착과분화가원활히이루어질수있는최대의공극률과상호연결성이우수한공극구조를지닌다공성의 3차원고분자지지체의공극률, 공극의크기, 공극의모양등은지지체가갖추어야할중요한매개변수이다. 지지체는다공성구조내에파종된세포와조직주변으로부터이동되는세포성장에중요한역할을수 378
실크피브로인 / 젤라틴하이브리드지지체의제조및특성분석 379 행한다. 인체내대부분의세포는부착세포로서만일부착할곳이없으면세포는성장되지못하고사멸한다. 5,6 이러한세포의특성으로인하여세포치료에많은어려움이있으며이를해결하기위해지지체가도입되어널리사용되고있다. 천연유래고분자에는콜라겐, 히알루론산, 키토산, 알긴산, 실크피브로인등이많이사용되고있는데 7 이는비교적우수한생체적합성, 상대적으로풍부함, 상업적유용성, 쉬운공정및식품의약품안전청에승인을비교적쉽게얻을수있다는장점을갖고있기때문이다. 8 이중에서도실크는피브로인과세리신으로이루어진삼각단면을가진장섬유로, 글리신, 알라닌, 세린과같은작은분자량을가진아미노산이전체아미노산의약 80 85% 의높은농도로피브로인을구성하고있다. 따라서실크피브로인은폴리펩티드분자들의배향과결정이잘발달하여, 실크에우수한기계적, 물리적, 화학적특성을부여한다. 9 이러한실크피브로인은산소및수분투과성이뛰어나고비독성, 비면역성및세포친화성의특성으로세포와조직성장을지지한다고보고된바있어서연골및인대의조직공학용지지체로서많은관심을받고있다. 10,11 젤라틴은동물의뼈, 연골, 가죽등결합조직의주요단백질성분인콜라겐의부분적인가수분해에의해얻어지는유도단백질로, 12 비교적낮은온도와농도에서도점성을부여하며, 냉각될때젤라틴용액은선명하고탄력성있는열가역적젤을형성하기시작한다. 13 최근의많은연구결과에따르면조직공학용지지체로서의젤라틴은다양한 ECM 고분자중에서도세포의부착, 뻗음및증식과같은세포와의상호작용을유도하는물질로평가되고있다. 14 또한생체내부로들어가는경우항원성이낮고, 생체흡수율이빠르기때문에안정성이높다. 이렇듯천연고분자를사용한지지체는생체적합성이우수한장점이있는반면, 약한기계적물성과수분이나체액에의하여고분자지지체가쉽게용해되는내구성의문제점을수반한다. 따라서대부분의천연고분자소재를사용한지지체는가교제와같은화학적처리를통해지지체의기계적물성을향상시키는것이일반적이다. 15,16 화학적처리에이용되는가교제의종류로는 3- 디메틸아미노프로핀 - N - 에틸카보다에미드하이드로클로라이드 (EDC), 글루타알데히드, β- 글레세롤포스페이트 (β-gp) 등이있다. 이중글루타알데히드를사용하여가교결합시킨젤라틴필름의기계적특성에대한보고에서는 17 글루타알데히드를사용하여고분자사슬간의가교결합을형성시켜수분과체액에의해지지체가용해되는것을억제하고기계적강도가증가되는것을확인하였다. 본연구에서는조직공학적방법으로조직적합성을향상시킬수있도록실크피브로인에젤라틴과가교제를이용하여물성을증가시켜서기계적물성평가, 물흡수성및안정성, NIH/3T3 세포를이식하여 WST 로세포독성평가를하였으며지지체구조및세포모폴로지는 SEM 을통해관찰하여조직공학적지지체로서의응용가능성을확인하였다. 실 시약및재료. 천연고분자인실크생사는동국대학교생명과학연구팀에서제공받았으며, 젤라틴 (Gelatin from porcine skin, Sigma- Aldrich Co. USA) 은 3차증류수를이용하여 40 이상에서녹여용액으로만들어서사용하였다. 글루타알데히드 (Grade I, 25%, Sigma- Aldrich Co) 는가교제로사용되었다. 모든화학약품과유기용매는 험 HPLC 등급을사용하였다. 실크피브로인 / 젤라틴지지체제조. 실크피브로인추출. 실크생사를 0.02 M 인산소다로 90 에서 1시간동안끓여세리신을제거한후, 0.3% 계면활성제를사용하고, 계면활성제를제거하기위하여 3차증류수로여러번세척하여세리신이제거된실크피브로인섬유만을추출하였다. 이후 -80 에서 24 시간동안보관후동결건조하였다. 실크피브로인 / 젤라틴지지체. 실크피브로인 / 젤라틴지지체의제조모식도를 Figure 1에나타내었다. 실크피브로인에젤라틴및가교제의첨가방법과각각의지지체를냉각시키는조건을달리하여세포가성장하기위하여최적의환경을제공할수있는조건을찾고자하였다. 실크피브로인섬유를 24 웰플레이트에넣고실크피브로인주변으로다공성스폰지형성을유도하기위하여실크피브로인섬유에 4% 젤라틴용액을함침시킨지지체, 4% 젤라틴용액과가교제인 글루타알데히드혼합수용액을함침시킨지지체를제조하였다. 각지지체는 4 와 -20 에서 8시간동안보관하고 -80 에서 24 시간동안냉각시키거나또는수용액을지지체에분주한뒤 -80 에서 24 시간동안냉각시키는조건으로제조하였다. 이후 4% 젤라틴만처리한지지체에는 글루타알데히드용액을처리하여가교시켜주었다. 그후모든지지체는 100% 글리신을사용하여가교를억제시켰고, 이를제거하기위하여 3차증류수로여러번세척하였다. 다시 -80 에서 24 시간동안냉각시킨후동결건조하여실크피브로인 / 젤라틴지지체를얻었다. 실크피브로인함량과젤라틴및글루타알데히드의농도를다르게처리한지지체도위와같은동결건조법으로제조되었다. 실크피브로인 0.1, 0.2 및 을 24 웰플레이트에넣고젤라틴용액 2, 4 및 8% 와가교제인글루타알데히드를 0.25, 1 및 를혼합한용액을함침시킨후, -80 에서 24 시간동안보관하여충분히수화시킨후동결건조시켰다. 그후 100% 글리신을사용하여가교를억제시켰고, 이를제거하기위하여 3차증류수로여러번세척하였다. 이지지체는 -80 에서 24 시간동안냉각시킨후동결건조하여실크피브로인 / 젤라틴지지체를완성하였다. 지지체의안정성과수분흡수도. 제조된지지체의수분에대한안정성을조사하기위하여실크피브로인함량과젤라틴및글루타알데히드농도가다른지지체를 0.5 cm 0.5 cm 의크기로절단하여인산염완충용액 (PBS, ph 7.4) 및배양액에침지하고 3 시간동안인큐베이션후형태를관찰하였다. 수분흡수도는시료의건조된무게를측정한 4%Gelatin Pour into 24 Well Plate in Silk Fibroin Mixing 4 to 80 /-80 freezer drying 4%Gelatin taldehyde 4%Gelatin/ taldehyde taldehyde Pour into 24 Well Plate in Silk Fibroin Added to 100 mm Glysine 4 to 80 /-80 freezer drying Distilles water and -80 freezer drying for 24 hrs Silk Fibroin/Gelatin scaffold Figure 1. Schematic diagram of the fabricating process of silk fibroin/gelatin scaffold. Polymer(Korea), Vol. 35, No. 5, 2011
380 김혜린 ᆞ 홍민성 ᆞ 김수진 ᆞ 조한수 ᆞ 유일수 ᆞ 이동원 ᆞ 강길선 후, 24 시간동안배양액에침지시킨뒤꺼낸시료의무게를측정하여다음식에의하여계산하였다. Water Uptake(%), WU=(W w -W d )/W d 100 이때, W w 는젖은지지체의무게이고, W d 는건조한지지체의무게이다. 지지체자체의압축강도측정분석. 실크피브로인함량과젤라틴및가교농도를달리한지지체의강도를측정하기위하여만능물성측정기 (TMS-Pro, Food Thechnology Coporation, Sterling, Virginia, USA) 를이용하였다. 만능물성측정기의설정값으로측정거리는, 측정속도는 /min, 측정힘은 0.5 N으로하였다. 시차주사열량계측정. 실크피브로인 지지체에서젤라틴및가교농도에따라서변하는열분해거동을관찰하기위해시차주사열량계 (TA Instrument, DSC 2910, USA) 를이용하였다. 시차주사열량계를이용하여 -30 에서부터 350 의범위에서실크피브로인 / 젤라틴지지체의열적성질변화를측정하였다. 분석조건으로승온속도는 10 /min 로하였으며질소기류하에서측정하였다. NIH/3T3 세포의배양. 쥐배아섬유아세포 (NIH/3T3 mouse embryo fibroblast, KCLB21658) 는한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, Korea) 에서제공받았다. 세포는 RPMI1640 에 10% 우태혈청 (FBS, Gibco), 항생제 (100 units/ml 페니실린과 100 μg/ml 스트렙토마이신 ) 가함유된배양액으로현탁액을만든후세포배양플라스크에분주하여 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 이때배양액은 3일에한번씩교체해주었다. 세포부착모폴로지 (SEM). 실크피브로인 / 젤라틴지지체에서쥐배아섬유아세포의부착양상및변화된모폴로지를확인하고자주사전자현미경 (SEM; S-2250N, Hitachi, Tokyo, Japan) 으로관찰하였다. 실크피브로인 / 젤라틴지지체는바닥면, 가로축으로잘라그단면을관찰하였다. 각샘플들은카본테이프를이용하여금속판에고정시키고플라즈마스퍼터 (Model SC 500 K, Emscope, UK) 로 200 A 두께의백금을코팅하였다. 각각의시료를가속전압 10 kv 에서관찰하였으며, 관찰된이미지는이미지분석프로그램인 P-SEM(Mirero, Korea) 를이용하여분석하였다. 세포증식률측정 (WST). 세포증식능력이나세포생존능력을발색측정으로정량하기위해 ELISA 플레이트리더 (E-max, Molecular Device, USA) 를이용하여 WST[2-(4- 요도페닐 )-3-(4- 나이트로페닐 )-5-(2,4- 다이설포페닐 )-2H- 테트라졸리움모노소디움 ] 분석법을 18 시행하였다. 부착세포인 NIH/3T3 를트립신을이용하여실크 / 젤라틴지지체에수확한후세포현탁액을지지체당 2 10 5 세포 / 지지체의농도로파종하여상기의배양액으로정적배양하였다 ( 각지지체당 n=4). 1, 2, 3일째에 WST 용액을 10 μl 씩넣고 4시간동안 37 인큐베이터에서배양하여 96 웰플레이트에시료를 100 μl씩분주하여 450 nm의흡광도로측정하였다. 통계. 각실험의통계학적분석은 Student's t-test 를시행하여 p 값이 0.05 미만일때통계적으로유의한것으로하였다. 19 결과및토론 실크피브로인 / 젤라틴지지체의제조조건설정. 실크피브로인섬 유에 4% 젤라틴용액을처리하여냉각시킨후가교제인 글루타알데히드를함유한지지체를제조한것과 4% 젤라틴에가교제인 글루타알데히드가교제의혼합용액을함침한지지체를제조하였고, 이들을 4 에서 -80 로 24 시간동안천천히냉각시키거나또는 24 시간동안 -80 에서바로냉각시키는조건으로제조하였다. 각각의제조방법을달리한지지체의조건중에서 4% 젤라틴에가교제인 글루타알데히드혼합지지체를 24 시간동안 -80 에서냉각시킨지지체의외형적형태가몰드의형태와똑같이얻어졌으며수축, 부풀림, 불규칙한크기및여타결함이없는것으로관찰되었다 (Figure 2(A)). 지지체의내부를관찰하였을때 4% 젤라틴과 글루타알데히드가교제를혼합한용액을함침시킨뒤냉각시킨조건을갖는지지체내부의공극구조는규칙적이며공극과공극사이의연결이양호하고대부분이열린셀구조를하고있는것으로나타났다. 20 그러나이외의조건을갖는지지체는다공의형태가뚜렷하지못하고형태가일그러지며 (a) (b) (c) (d) Lateral surface Horizontal surface 4 to 80-80 (a) (b) (c) (d) (A) Surface Horizontal section 30 100 30 100 (B) Figure 2. (A) Photographs of 4% gelatin and glutaldehyde mixed scaffolds; (a), (c): glutaldehyde was added to silk fibroin scaffold after freeze drying with 4% gelatin. (b), (d): silk fibroin scaffold was freeze-dried after adding mixed solution; 4% gelatin and glutaldehyde. (B) SEM micrographs of porous silk fibroin/gelatin scaffolds; (a), (c): glutaldehyde was added to silk fibroin scaffold after freeze drying with 4% gelatin. (b), (d): silk fibroin scaffold was freeze-dried after adding mixed solution; 4% gelatin and glutaldehyde(magnification; x30, x100). 4 to 80-80 폴리머, 제 35 권제 5 호, 2011 년
실크피브로인 / 젤라틴하이브리드지지체의제조및특성분석 381 (A) (B) 7 days 1 day 7 days 1 day 2% 4% 8% Gelatin taldehyde 변화된막힌다공이눈에띄게형성되었다 (Figure 2(B)). Figure 3. Morphology of silk fibroin/gelatin scaffolds (A) in PBS buffer solution; (B) in culture medium at 37. 함량을달리한실크피브로인과젤라틴및가교농도에따른지지체제조. 상기의결과에따라 -80 에서냉각시켜서동결건조후얻은지지체제조조건을바탕으로실크피브로인 0.1, 0.2 및 에젤라틴 2, 4 및 8% 로변화를주고물성을개량하기위하여글루타알데히드 0.25, 1 및 의가교농도로처리한지지체를육안으로관찰하였다. 실크피브로인함량과젤라틴및가교제의농도를달리한지지체의외관이수축되지않고몰드의형태와같은크기의지지체를제조할수있었다. 지지체의안정성. 지지체의수분에대한안정성을조사하기위하여각각의지지체를 37 에서인산염완충용액 (PBS, ph 7.4) 및배양액에침지하여 1일및 7일후의형태를관찰하였고그결과를 Figure 3 에나타내었다. 실크피브로인 및 지지체는인산염완충용액및배양액내에서고유형태를유지하지못하고풀어짐이관찰되었다. 반면실크피브로인 지지체는배양액내에서풀어지지않고약간의팽창된형태로유지하였다. 세포는지지체의내부벽면에부착한후증식하여일정한형태와기능을갖춘조직으로형성된다. 따라서지지체는조직이형성되면서생분해될수있어야하나세포가부착하고증식하는동안수분에의해급격히분해되지않고형태를유지하여야한다. 21 그러므로실크피브로인 지지체는수분에의해급격히분해되지않고세포가증식하는동안안정한형태를유지할수있을것으로사료된다. 수분흡수율측정. 수분흡수력은체내에이식된지지체가혈액속에포함된세포를수용할수있는능력을결정하는중요한요소로 22 상기의실험을바탕으로지지체의안정성을유지하는실크피브로인 을사용한지지체를이용하여수분흡수력을측정하였다. 본연구에서제조된실크피브로인 / 젤라틴지지체의수분흡수도를나타내었으며 (Figure Water uptake(%) 450 400 350 300 250 200 150 100 50 taldehyde taldehyde taldehyde Gelatin 2% Gelatin 4% Gelatin 8% Content of gelatin Figure 4. Water-uptake experiments using silk fibroin of scaffold depending on the gelatin and glutaldehyde concentrations. *, **, # denotes significant difference compared with each scaffolds. (p<0.05)(*: glutaldehyde vs glutaldehyde, **: glutaldehyde vs glutaldehyde 2.5 and #: glutaldehyde vs glutaldehyde ). Peak Load-Hardness(N) 70 60 50 40 30 20 10 0 taldehyde taldehyde taldehyde Gelatin 2% Gelatin 4% Gelatin 8% Content of gelatin Figure 5. Compressive stress of various scaffolds. *,**,# denotes significant difference compared with each scaffolds(p<0.05)(*: glutaldehyde vs glutaldehyde, **: glutaldehyde vs glutaldehyde and #: glutaldehyde vs glutaldehyde ). 4) 수분흡수도가높은실크피브로인에젤라틴농도가증가함에따라더높은수분흡수율을보였다. 젤라틴은팽화력이커서물을 5 10 배흡수하게되기때문에젤라틴의함유율이증가할수록더높은수분흡수율을보인것으로사료된다. 또한지지체첨가되는가교제의종류및농도는수분흡수율에미치는요인으로작용하는데실크피브로인 / 젤라틴지지체에서사용한가교제인글루타알데히드의농도를 로함유할때가장높은수분흡수율을보였다. 이러한결과로부터실크피브로인 / 젤라틴지지체에세포를파종하였을때세포의부착도등세포와의상호작용을증가시켜유리한환경을제공할것을예상할수있었다. 지지체자체의압축강도측정. 조직공학적응용가능한지지체로서사용되기위해서는배양시또는이식시에지속적이며기계적물리적특성을가진지지체이어야한다. 그러한의미에서기계적강도측정실험은매우중요한의미를갖는다. 제조한지지체의고유의압축강도를측정한결과는 Figure 5에나타냈으며젤라틴및가교농도가높아짐에따라 Polymer(Korea), Vol. 35, No. 5, 2011
382 김혜린 ᆞ 홍민성 ᆞ 김수진 ᆞ 조한수 ᆞ 유일수 ᆞ 이동원 ᆞ 강길선 0.14 0.12 taldehyde taldehyde taldehyde Optical density(450 nm) 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02 (a) Figure 8. Photographs of cell morphology: (a) NIH/3T3(magnification; x40); (b) NIH/3T3(magnification; 100). (b) 0.00 2% 4% 8% 2% 4% 8% 2% 4% 8% 1 day 2 days 3 days Content of gelatin Figure 6. Cell proliferation of NIH/3T3 in silk fibroin/gelatin scaffolds analyzed by WST assay after 1, 2 and 3 days(p<0.05 asterisk means different between *: 1 vs 2 day **: 2 vs 3 days #: 1 vs 3 days). 2% Gel 4% Gel 8% Gel Gel 8%/ Gel 8%/ Gel 8%/ Heat flow(mw) Gel 4%/ Gel 4%/ Gel 4%/ Gel 2%/ Gel 2%/ Gel 2%/ Silk Fibroin Figure 9. SEM micrographs of sericin-free silk fibers. Silk fibers modified with silk fibroin/gelatin scaffold(magnification; x1.0k). 0 50 100 150 200 250 300 Temperature( ) Figure 7. DSC thermograms of silk fibroin/gelatin scaffolds. 높은압축강도를나타내었으며젤라틴 2% 에비해 8% 에서전체적으로약 2 3 배정도높게나타나고가교제인글루타알데히드농도가높아질수록높게나타났다. 가교제의첨가량이증가할수록전반적으로기계적강도가증가함을볼수있는데이는 3차원공극구조의형성시가교제의투입량에따라공극구조를더욱치밀하게만들기때문이라사료된다. WST. 세포친화성을갖는실크피브로인 에젤라틴및가교농도를달리한지지체내에쥐배아섬유아세포를파종하여배양한후 WST 분석법을통하여세포성장률을관찰한결과를 Figure 6에나타내었다. 1, 2 및 3 일째에분석한결과, 시간의경과에따라서젤라틴의농도가높아질수록세포증식률이높아졌으며특히젤라틴 8% 를함유한지지체에서는다른실험군에비해월등히높은세포증식률을보였다. 이는젤라틴이친수성을증대시켜물흡수성이향상된것으로보이며실제세포를파종하였을때에증식률이향상된것으로사료된다. 또한 2, 4 및 8% 의젤라틴에 의글루타알데히드를함유한모든지지체에서시간의경과에따라유의성있는증식률을보였다. 이를통해세포의증식에있어서 8% 의젤라틴및 의글루타알데히드를함유한실크피브로인 / 젤라틴지지체가가장긍정적인영향을줄것으로생각된다. DSC. 실크피브로인 에젤라틴및글루타알데히드농도를달리한지지체의열특성을살펴보기위하여시차열분석을수행하고그결과를 Figure 7에나타내었다. 실크는분자가수소결합에의해결합된배향을가진폴리펩티드사슬로구성되어있고폴리펩티드사슬이완전히늘어난상태에서수소결합이동일평면내에존재하는 β 배향의파괴에의해흡열피크가나타난다. 23,24 일반적으로배향이잘된경우실크피브로인의열분해흡열피크는 320 이상의온도에서나타내는것으로알려져있는데 22 Figure 7에서순수한실크피브로인의흡열피크가 320 이상에서나타난것으로보아배향이잘된것으로여겨지며실크피브로인 지지체에농도를달리한젤라틴및글루타알데히드가함유된모든지지체의흡열피크또한거의유사하게나타났다. 실크의열적거동에서 100 부근의흡열피크는내부수분의증발에기인하는것으로알려져있고, 그이상의온도에서는 4% 젤라틴 / 글루타알데히드지지체가시프트된피크를보이는데이러한피크는시료의종류및가열속도에따라다소이동되는것으로알려져있기때문에 21 이러한요인들에기인하여이동한것으로보여진다. 실크피브로인지지체에서젤라틴및글루타알데히드혼합비의변화는본래의실크피브로인의흡열피크와유사하게나타나는것으로보아실크피브로인의열적거동에큰영향을끼치지않기때문에실크피브로인 / 젤라틴지지체를생체내이식하더라도열적으로안정할것으로사료된다. 실크피브로인 / 젤라틴지지체에서쥐배아섬유아세포부착도. 지 폴리머, 제 35 권제 5 호, 2011 년
383 실크 피브로인/젤라틴 하이브리드 지지체의 제조 및 특성분석 1 day 3 days 실크 피브로인에 젤라틴 및 가교농도를 달리한 지지체에서 섬유아세포 의 부착 및 증식률을 보기 위하여 SEM 분석을 실시하였다(Figure 8). 실크 피브로인/젤라틴 지지체에 아무것도 파종하지 않았을 때는 Figure 9에서처럼 매끈한 표면을 관찰할 수 있었다. 쥐 배아 섬유아세포를 파 종 후 1일째에서 실크 피브로인/젤라틴 지지체에서 둥근형태의 세포만 관찰되었으나 3일째에서는 세포외 기질이 나타나 지지체를 덮고 있는 모 습을 보였으며, 젤라틴의 농도가 가장 높은 8%의 젤라틴 및 의 글루 타알데히드 농도를 함유한 지지체에서 더 많은 세포외 기질이 나타나 지 지체를 덮고 있는 모습을 보였다(Figure 10). 이를 통해 실크피브로인 /젤라틴 지지체가 세포의 부착 및 증식에 있어서 긍정적인 효과를 주는 것으로 사료된다. 결 (A) 1 day 3 days (B) 1 day 3 days 론 (C) Figure 10. SEM micrographs of NIH/3T3 surfaces of silk fibroin/ gelatin of (A) 2%; (B) 4%; (C) 8% scaffolds for 1 and 3 days (magnification; x1.0k, x2.0k). 지체에 형성된 공극은 지지체 내부로 필요한 세포와 영양분을 이동시 키는 이동로 역할을 한다. 따라서 지지체 표면에 공극이 없을 경우에는 세포와 영양분의 이동이 용이하지 않아 세포증식이 원활하지 못한 문제 점이 야기된다.19,21 그러므로 지지체 내부로 세포와 영양분의 이동을 원 활하게 해주기 위해서는 지지체 표면에 많은 공극을 형성시켜야 한다. 본 연구에서는 생체적합성과 세포친화성이 우수한 실크 피브로인에 수분보유력이 뛰어난 젤라틴을 함유시킨 지지체를 제조 후 세포를 파종 하여 초기 부착률의 확인과 특성 분석을 하였다. 지지체 제조조건을 최 적화시키기 위해 실크 피브로인 섬유에 4% 젤라틴 및 가교제를 혼합시켜 만든 지지체를 -80 에서 24시간 냉각시킨 조건에서 몰드 형태와 같은 모양을 하며 여타의 결함이 없는 것을 확인하였고, 지지체 내부에서 열린 공극과 상호연결된 고른 공극구조를 보임을 확인하였다. 상기의 실험을 바탕으로 0.1, 0.2, 의 실크 피브로인과 2, 4, 8% 의 젤라틴 농도 및 0.25, 1, 의 글루타알데히드를 이용하여 함량 을 달리한 지지체를 제조하였다. SEM을 통하여 제조된 지지체 내부에서 상호 연결된 공극구조를 가짐을 확인하고 세포의 안정적인 부착을 지지 함을 확인하였다. 인산염완충액 및 배양액 내에서 지지체의 안정성 평가를 실시한 결과, 실크 피브로인 과 을 함유하는 지지체는 풀어짐 이 관찰되었으나 실크 피브로인 을 함유하는 지지체는 약간의 팽창 된 형태로 유지되었다. 세포가 부착하고 증식하는 동안 수분에 의해 급격 히 분해되지 않고 형태를 유지할 수 있는 실크 피브로인 에 젤라틴 및 가교농도를 달리한 지지체를 사용하여 수분흡수율 측정결과에서 젤라 틴 농도가 높아질수록 수분흡수율이 뛰어난 것을 보아 수분보유력이 뛰 어난 젤라틴의 특성에 영향을 받은 것으로 사료된다. 또한 실크 피브로인/젤라틴 지지체에서 사용한 가교제인 글루타알데히 드의 농도를 함유할 때 가장 높은 수분흡수율을 보였다. 이러한 결과 는 쥐 배아 섬유아세포를 이용한 WST 분석 결과에서 마찬가지로 실크 피브로인 에서 젤라틴 함유율이 높아질수록 세포의 성장에 긍정적 인 영향을 미침을 확인하였고 의 글루타알데히드를 함유한 모든 실험 군에서 유의성 있는 증식률을 나타내어 실크 피브로인/젤라틴 지지체에 세포를 파종하였을 때 세포의 부착도 등 세포와의 상호작용을 증가시켜 유리한 환경을 제공할 것을 예상할 수 있었다. 물을 많이 포함하는 기재는 압력에 대한 저항과 스트레스에 대항하는 보호기능 및 높은 탄성력을 제공 하며, 가교농도가 높아질수록 기계적 특성이 향상되는 성질은 압축강도의 결과에서 확인하였다. 또한 DSC 분석을 통해 실크 피브로인 지지 체에서 젤라틴 및 글루타알데히드 혼합비의 변화 또는 다른 가교농도 처 리 여부에 거의 영향을 받지 않는 것으로 생각되어 in vivo 적용시 지지 체를 생체 내 이식하더라도 열적으로 안정할 것으로 사료된다. 따라서 이상의 결과로부터 본 연구에서 제조한 실크 피브로인 지지체에 8%의 젤라틴 및 의 글루타알데히드를 혼합시킨 지지체에 Polymer(Korea), Vol. 35, No. 5, 2011
384 김혜린 ᆞ 홍민성 ᆞ 김수진 ᆞ 조한수 ᆞ 유일수 ᆞ 이동원 ᆞ 강길선 서적당한친수성을갖고세포의부착및성장에도움을주며조직공학지지체로응용하기에적절한조건이형성될가능성을확인하였다. 감사의글 : 본연구는세계수준의연구중심대학 (WCU R31-20029) 및세포응용사업단 (SCRC 4110) 의연구지원에의하여이루어졌으므로이에감사드립니다. 참고문헌 1. S. H. Kim, S. J. Yun, J. W Jang, M. S. Kim, G. Khang, and H. B. Lee, Polymer(Korea), 30, 14 (2006). 2. Y. K. Ko, S. H. Kim, J. S. Jeong, H. J. Ha, S. J. Yoon, J. M. Rhee, M. S. Kim, and H. B. Lee, Polymer(Korea), 31, 14 (2007). 3. G. Khang, S. J. Lee, M. S. Kim, and H. B. Lee, Tissue Engineering, in Webster s Biomedical Engineering Handbook, S. Webster, Editor, John & Wiley Press, NY, p 366 (2006). 4. J. H. Lee, S. J. Park, H. J. Chun, and C. H. Kim, Inter. J. Tissue Reg., 1, 1, (2010). 5. G. Khang, J. M Rhee, J. H. Lee, I. Lee, and H. B. Lee, Macromol. Res., 8, 276 (2000). 6. B. L. Seal, T. C. Pterom, and A. Panitch, Mater. Sci. Eng., 34, 147 (2001). 7. F. T. Moutos, L. E. Freed, and F. Guilak, Nature Materials, 6, 162 (2007). 8. W. H. Wong, D. J. Mooney, and A. Atala, Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds, Boston, MA, Birkhauser, Chap 4 (1996). 9. L. Meinel, O. Betz, R. Fajardo, S. Hofmann, A. Nazarian, E. Cory, M. Hilbe, J. M. Cool, R. Langer, G. Vunjak-Novakovic, H. P. Merkle, B. Rechenberg, D. L. Kaplan, and C. Kirker- Head, Bone, 39, 4 (2006). 10. L. Uebersaxa, M. Mattottia, M. Papaloïzosb, H. P. Merkle, B. Gander, and L. Meinel, Biomaterials, 28, 30 (2007). 11. M. Garcia-Fuentesa, A. J. Meinela, M. Hilbeb, L. Meinel, and H. P. Merkle, Biomaterials, 30, 28 (2009). 12. D. Ledward, P. Philips, and P. Williams, Gelatin, in Handbook of Hydrocolloid, Boca Raton, CRC Press, p 67 (2000). 13. V. Normand, S. Muller, J. C. Ravey, and A. Parker, Macromolecules, 33, 1063 (2000). 14. Y. J. Kim, Polymer(Korea), 32, 5 (2008). 15. L. Zhensheng, H. R. Ramay, K. D. Hauch, D. Xiao, and M. Zhang, Biomaterials, 26, 18 (2005). 16. J. S. Mao, H. F. Liu, Y. J. Yin, and K. D. Yao, Biomaterials, 24, 1621 (2003). 17. A. Bigi, S. Panzavolta, and N. Roveri, Biomaterials, 19, 739 (1998). 18. H. L. Kim, S. J. Kim, H. Yoo, M. Hong, D. Lee, and G. Khang, Inter. J. Tissue Reg., 1, 81 (2010). 19. H. L. Kim, H. Yoo, H. J. Park, Y. G. Kim, D. Lee, Y. S. Kang, and G. Khang, Polymer(Korea), 35, 7 (2011). 20. A. Bigi, B. Braccia, G. Cojazzib, S. Panzavolta, and N. Roveri, Biomaterials, 19, 24 (1998). 21. M. S. Choi, H. D. Han, H. Seong, E. S. Park, S. C. Chi, and B. C. Shin, J. Korean Chem. Soc., 50, 3 (2006). 22. Y. S. Choi, S. B. Lee, S. R. Hong, Y. M. Lee, K. W. Song, and M. H. Park, J. Mater. Sci., 12, 67 (2001). 23. H. K. Choi and J. H. Hahm, Korean J. Seric. Sci., 37, 142 (1995). 24. H. Y. Kweon, K. Lee, J. Yeo, S. O. Woo. S. M. Han, Y. W. Lee, J. H. Lee, and Y. H. Park, Korean J. Seric. Sci., 46, 28 (2004). 폴리머, 제 35 권제 5 호, 2011 년