(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2011-0106112 (43) 공개일자 2011년09월28일 (51) Int. Cl. G01N 21/35 (2006.01) G01N 21/25 (2006.01) G01N 33/02 (2006.01) G01J 3/28 (2006.01) (21) 출원번호 10-2010-0025345 (22) 출원일자 2010 년 03 월 22 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 6 항 2010 년 03 월 22 일 (71) 출원인 강원대학교산학협력단 강원도춘천시효자동 192-1 ( 강원대학로 42) 주식회사장원 제주특별자치도서귀포시안덕면서광리 1241 (72) 발명자 정명근 강원도삼척시중앙로 1 가강원대학교삼척캠퍼스 이민석 제주특별자치도제주시노형동부영아파트 1 차 102 동 704 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 김정현 (54) 근적외분광분석법을이용한녹차카페인과녹차카테친의개별함량동시측정방법 (57) 요약 본발명은카페인과녹차카테친의개별함량동시측정방법에관한것으로써, 더욱상세하게는임의량의녹차분말시료에근적외선을조사하여녹차카페인과개별녹차카테친성분과관련된근적외흡수스펙트럼을측정하는단계 ; 상기녹차카페인과녹차카테친관련개별근적외흡수스펙트럼을녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정보정용스펙트럼과검증용스펙트럼으로구분하는단계 ; 상기함량측정보정용으로구분된녹차카페인및개별녹차카테친관련근적외흡수스펙트럼의원시스펙트럼과이의도함수를얻고수학적처리와통계적분석을실시하여녹차카페인및개별녹차카테친각각의검량식을개발하는단계 ; 및, 상기녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정보정용스펙트럼으로상기검량식을보정및교차검증하고, 상기녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정검증용스펙트럼으로상기검증된검량식의적합도를검증하여최적의검량식을선발하는단계를포함하여이루어지는방법에관한것이다. 본발명에의하면, 녹차카페인과개별녹차카테친의함량을동시에단시간내에정확하게측정할수있으며, 이는특히차나무육종프로그램과녹차의품질표준화에더욱효과적인수단이될것을기대할수있다. 대표도 - 도 3-1 -
(72) 발명자 황영선 강원도삼척시남양동 16-12 번지한도맨션 301 호 이진호 제주특별자치도제주시노형동부영아파트 1 차 10 1 동 503 호 김영걸 제주특별자치도서귀포시서홍동 731-65 이수진 강원도동해시동회동현대아파트 18 동 901 호 이현진 서울특별시양천구신월 7 동신안파크아파트 3-506 최수산나 강원도춘천시조양동부영아파트 503 동 1308 호 김영학 부산광역시남구용호동오륙도롯데낙천대아파트 108 동 1001 호 홍승범 대구광역시서구내당 4 동 463-8 광장아파트 201 동 707 호 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 임의량의녹차분말시료에근적외선을조사하여녹차카페인과개별녹차카테친성분과관련된근적외흡수스펙트럼을측정하는단계 ; 상기녹차카페인과녹차카테친관련개별근적외흡수스펙트럼을녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정보정용스펙트럼과검증용스펙트럼으로구분하는단계 ; 상기함량측정보정용으로구분된녹차카페인과개별녹차카테친관련근적외흡수스펙트럼의원시스펙트럼과이의도함수를얻고수학적처리와통계적분석을실시하여녹차카페인과개별녹차카테친각각의검량식을개발하는단계 ; 및, 상기녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정보정용스펙트럼으로상기검량식을보정및교차검증하고, 상기녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정검증용스펙트럼으로상기검증된검량식의적합도를검증하여최적의검량식을선발하는단계 ; 를포함하여이루어지는것을특징으로하는녹차카페인과녹차카테친의개별함량동시측정방법. 청구항 2 청구항 1에있어서, 상기근적외흡수스펙트럼은 400 내지 2,500nm 범위파장대역의흡수스펙트럼을이용하는것을특징으로하는녹차카페인과녹차카테친의개별함량동시측정방법. 청구항 3 청구항 1에있어서, 상기녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정보정용스펙트럼과검증용스펙트럼으로구분은, 녹차카페인과개별녹차카테친의가시-근적외흡수스펙트럼반사율의역수의로그로기록된하나의데이터와이웃하는데이터간의거리를마할라노비스 (mahalanobis) 거리 (H 거리 ) 로측정하고이의절사점을기준으로하여이루어지는것을특징으로하는녹차카페인과녹차카테친의개별함량동시측정방법. 청구항 4 청구항 3 에있어서, 상기 H 거리가 0.6 미만이거나 3.0을초과하는범위의녹차카페인과개별녹차카테친의가시-근적외흡수스펙트럼에해당되는시료의데이터를제거하여흡수스펙트럼의경계를제공하는것을특징으로하는녹차카페인과녹차카테친의개별함량동시측정방법. 청구항 5 청구항 1에있어서, 상기근적외흡수스펙트럼외에적외선 (IR) 분광장치, 자외-가시광선 (UV-VIS.) 분광장치, 로만 (ROMAN) 분광장치, 및핵자기공명 (NMR) 분광장치중에서선택된어느하나를사용하여측정되는것을특징으로하는녹차카페인과 - 3 -
녹차카테친의개별함량동시측정방법. 청구항 6 청구항 1에있어서, 상기도함수의통계적분석은다중선형회귀분석법 (MLR: Multiple Linear Regression), 부분최소자승법 (PLS: Partial Least Squares), 변형부분최소자승법 (MPLS: Modified Partial Least Squares), 및주성분회귀분석법 (PCR: Principle Component Regression) 중에서선택된어느하나의방법에의하여수행되는것을특징으로하는녹차카페인과녹차카테친의개별함량동시측정방법. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은근적외선흡수스펙트럼을이용하여녹차잎에함유된카페인과다양한카테친의개별적함량을동시 에측정하는방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] 배경기술차 ( 茶 ) 는전세계적으로물다음으로많이소비되는음료로서, 여러대륙의열대및아열대지역에서성장한차나무의잎으로부터제조되는데, 차의주요생산국은인도, 중국, 일본, 한국, 스리랑카, 인도네시아, 베트남, 베네수엘라, 브라질, 조지아, 아제르바이잔및케냐를포함한다. 차는형태및화학적성분면에서서로상이한특성을나타내는중국차 (Camellia sinensis) 와아삼차 (Camellia assamica) 로식물학적으로구분하기도하고, 가공방법에따라녹차와홍차로구분하기도한다. 세계차생산의약 20 % 를차지하는녹차는차잎에함유된대부분의카테친을그대로보존하는방법인차잎건조에의하여제조되는반면, 세계차생산의약 80 % 를차지하는홍차는차잎에함유된카테친이테아플라빈 (TF), 테아루비긴등과같은다른올리고머로대부분산화되어 발효 된형태로제조되는차이가있다. 한편, 많은연구자들은폴리페놀이심혈관질환, 만성위염및몇몇의주요암에서중요한항산화제로서작용할수있음을시사한바있으며, 이와같은연구결과에힘입어녹차및홍차에함유된폴리페놀에대한관심이증대되고있는실정이다. 녹차잎을물에우려내면톡쏘는듯하고씁쓸한맛이나는데, 이맛의주요원천은카테친이다. 상기카테친은폴로보노이드계성분인폴리페놀로서, 녹차의총폴리페놀중약 93% 수준으로함유되어있다. 녹차에함유되어있는주요카테친은 (-)-에피갈로카테친 3-갈레이트 (EGCG), (-)-에피갈로카테친(EGC), (-)-에피카테친갈레이트 (ECG) 및 (-)-에피카테친(EC) 을포함하는에피카테친이성질체이다. 녹차의맛은상기카테친성분의함량에따라미묘하게달라지므로, 녹차의맛에주요한영향을주는카테친의개별적함량은녹차의품질개선이나차나무의육종에있어중요한인자라할수있다. 그러나, 상기한카테친은화학적으로불안정하여쉽게다른이성질체로에피머화되는등다소불안정한특성이있으므로, 녹차의품질을정확하게평가하기위해서는카테친을동시에빠르게분석할필요가있다. 또한, 상기카테친과함께녹차중에서는카페인성분도함유되어있는데, 이카페인은중추신경흥분작용을나타내기때문에이를과잉섭취할경우신경과민, 구역질, 불면등의유해작용을일으키는원인이된다고알려져있다. 이때문에, 녹차중에포함된카테친의함량과함께녹차카페인의함량도측정해야할필요가있다. 최근까지녹차에함유된카페인및카테친함량을측정하기위해고성능액체크로마토그래피나모세관전기영동과같은다수의분석방법이적용되었다. 그러나, 이들분석방법은높은정확성과정밀성을가짐에도불구하고, 분석에많은시간이소요되고, 분석장비의구입이나분석시료의추출과분석등에많은비용이소요되며, 아울러노동집약적분석방법이다. 상기한분석법은다수의카테친함량을동시에분석할수는있으나, 신속하 - 4 -
게분석하기에적합하다고보기에는무리가있다. [0011] [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] 따라서, 우수한차나무를육종하기위한육종프로그램에적용하기위해서나, 계통평가, 차잎의품질평가방법의확립등의다수의검체를분석하기위해서는보다더신속하고정확하며, 동시분석이가능한분석방법이필요하다. 최근, 개량된전자-광학장비의개발, 스펙트럼정보를효율적으로처리할수있는컴퓨터의개선, 강력한통계 -분석화학소프트웨어의개발로인해분광분석기술의확대가촉진되고있고, 분석시료로부터획득한화학데이터및스펙트럼의효율적인관리가가능해졌다. 그중에서특히근적외분광분석 (NIRS) 기술은크로마토그래피법과같은종래의함량평가를위해사용되어온분광적정량평가기술에비하여대단히유리한특성이있다. NIRS 분석은분석시간, 비용및노동력을현저히감소시키며, 유해한화학약품의사용없이정량분석이가능하다. 또한, 시료를파괴하는일없이그자연적인형태로분석할수있으며다수의형질을동시에분석할수도있다. 이러한특징을가진 NIRS 분석법은기존습식화학분석에서도출될수있는문제점을극복할수있는대안으로서신속, 정확하고비파괴적인방법의분석도구라고할수있다. 예컨대, Schulz 등은 NIRS를사용하여녹차잎에서알칼로이드와페놀계물질을동시에분석할수있는방법을검토한바있고, 또다른방법으로 FT-NIR 및다변량보정법 (multivariate calibration method) 을적용하여녹차에함유된주요 4종의카테친의함량을분석보고한바있다. 그러나이들선행연구는단지녹차잎에함유된카페인과 4종의주요카테친 (EC, EGC, ECG, EGCG) 함량의측정에만유용하다. 최근의연구에서, 상기주요카테친외에개별카테친이서로다른항산화특성을가지는것이밝혀지고있으며, 녹차중에비교적소량함유된것으로알려진 EGCG-3Me의경우에는항산화, 항암활성외에도항알러지특성을가지는등개별카테친이서로다른기능적특성을보유한다는것이공지되었다. 따라서, 기존알려진방법으로는주요카테친이외의다양한카테친의함량분석에어려움이있으며, 이는차잎중의다양한개별카테친을측정하기위한방법이개발되어야하는다른이유가될수있을것이다. 발명의내용 [0017] [0018] 해결하려는과제본발명은녹차함유카페인과다양한녹차카테친의함량을동시에예측할수있는방법을제공하는데그목적이있다. 또한, 차나무육종프로그램 (breeding program) 에효과적인녹차카페인과다양한개개의녹차카테친함량을동시에신속하게측정할수있는방법을제공하는데그목적이있다. [0019] [0020] [0021] 과제의해결수단상기한목적을달성하기위한일례로서본발명의녹차카페인과녹차카테친의개별함량동시측정방법은, 임의량의녹차분말시료에근적외선을조사하여녹차카페인과개별녹차카테친성분과관련된근적외흡수스펙트럼을측정하는단계 ; 상기녹차카페인과녹차카테친관련개별근적외흡수스펙트럼을녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정보정용스펙트럼과검증용스펙트럼으로구분하는단계 ; 상기함량측정보정용으로구분된녹차카페인과개별녹차카테친관련근적외흡수스펙트럼의원시스펙트럼과이의도함수를얻고수학적처리와통계적분석을실시하여녹차카페인과개별녹차카테친각각의검량식을개발하는단계 ; 및, 상기녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정보정용스펙트럼으로상기검량식을보정하여교차검증하고, 상기녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정검증용스펙트럼으로상기검증된검량식의적합도를검증하여최적의검량식을선발하는단계를포함하여이루어지는것을특징으로한다. 이하본발명의녹차카페인과녹차카테친의개별함량동시측정방법을각단계별로구체적으로설명한다. 먼저, 임의량의녹차분말시료에근적외선을조사하여녹차카페인과개별녹차카테친관련근적외흡수스펙트럼을측정하는단계이다. - 5 -
[0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] 근적외흡수스펙트럼의측정은통상적인근적외흡수스펙트럼의측정방법과동일한방법으로이루어질수있으며, 측정하고자하는녹차잎을분말화하여얻어진시료에근적외선을조사하여이루어진다. 바람직하기로는반사방식으로근적외흡수스펙트럼을얻는것이좋다. 녹차잎의분말시료는 400개내지 800 개로조절하는것이검량식의광범위화및유의적인검량식개발에적합하다. 본발명에있어서, 녹차카페인및개별녹차카테친의함량을확인하기위한근적외흡수스펙트럼측정은 400 내지 2,500nm 사이의흡수스펙트럼을측정하는것이바람직하다. 일반적으로근적외흡수스펙트럼은 800 내지 2,500nm 사이의흡수스펙트럼을이용하나, 본발명의실험결과가시광선영역인 400 내지 1,100nm 사이에서얻어진흡수스펙트럼에서도유의적인정보의제공이가능하여상기와같은파장대의근적외흡수스펙트럼을측정한다. 상기근적외흡수스펙트럼외에적외선 (IR) 분광장치, 자외-가시광선 (UV-VIS.) 분광장치, 로만 (ROMAN) 분광장치, 및핵자기공명 (NMR) 분광장치중에서선택된어느하나를사용하여스펙트럼을측정할수도있다. 두번째로, 상기녹차잎의근적외흡수스펙트럼을녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정보정용스펙트럼과검증용스펙트럼으로구분하는단계이다. 즉, 다양한통계적분석기법을적용하여최적의검량식을개발, 보정및검증하기위하여상기얻어진녹차카페인과녹차카테친관련근적외흡수스펙트럼을녹차카페인과녹차개별카테친의함량측정보정용스펙트럼과검증용스펙트럼으로구분한다. 상기구분은, 녹차카페인과녹차개별카테친의근적외흡수스펙트럼반사율의역수의로그로기록된하나의데이터와이웃하는데이터간의거리를마할라노비스 (mahalanobis H) 거리로측정하고, 이의절사점을기준으로무작위로선발한다. 바람직하기로, 본발명에서는상기 H 거리가평균스펙트럼으로부터 0.6 미만이거나 3.0을초과하는범위의녹차잎의근적외흡수스펙트럼에해당되는시료의데이터를제거하여흡수스펙트럼의경계를제공함으로써, 보다정확하고확실한검량식개발이가능하도록한다. 세번째로, 상기함량측정보정용으로구분된녹차카페인과개별녹차카테친관련녹차잎의근적외흡수스펙트럼의원시스펙트럼과이의도함수를얻고수학적처리와통계적분석을실시하여녹차카페인과개별녹차카테친각각의검량식을개발하는단계이다. 근적외흡수스펙트럼의측정시검체내, 외부의성분에의한영향, 기준선 (baseline) 의이동과시스템의잡음 (noise), 검체처리과정의분석오차가유발될수있는데, 이러한문제들은수학적처리및다양한통계적회귀분석을이용하여보정해주고, 검량선을안정하게하여정량및정성분석의필수적인도구로사용되고있다. 일반적으로스펙트럼의보정및분석을위해사용되는방법으로는도함수의수학적처리 ( 미분 ), 평활화 (smoothing) 및통계적회귀분석이사용된다. 스펙트럼의수학적처리인미분 (differential) 의목적은측정시의환경변화나, 측정장치의변화등에의해야기된기준선의이동을제거하고, 분석대상성분의스펙트럼정보가다른주성분의스펙트럼정보에의해보이지않을경우, 이를강조하기위해사용된다. 근적외흡수스펙트럼에사용되는수처리는 1차이상의미분을활용한다. 스펙트럼자료의미분은모든자료의기준선을 0 로한다음각스펙트럼의기울기를계산하는것으로, 스펙트럼의 1차미분은단순히모든파장에서접선의기울기를측정하는것이며, 접선의기울기는기준선의이동에영향을받지않으므로효과적으로기준선이동에따른영향을제거할수있다. 또한 2차미분은스펙트럼곡선에서의기울기변화의특성을나타내며기준선보정과함께시스템의잡음등으로나타나는오차를제거하는데효과적으로사용되기도한다. 또한평활화 (smoothing) 는스펙트럼신호의외란요인중, 측정센서자체의잡음을제거하기위한수치연산으로서신호값의단기적변이를완화시키는효과가있다. 중첩된피크를분리해내고기준선의이동을제거하는미분은잡음의영향을많이받는다. 따라서미분에앞서평활화를하는것이일반적이다. 한편근적외선에서는스펙트럼의변위가미약하기때문에검량식의개발을위해서는다양한통계적회귀분석이사용되고있다. 통계적회귀분석중, 다중선형법 (Multiple Linear Regression, MLR) 은보통시료의구성이단순할때적합하며측정성분이독특한흡수봉우리를가질때유용하다. 이때여러파장에서스펙트럼의변위가원하는측정성분의변위에비례하도록검량선을만든다. 주성분회귀분석법 (Principal Component Regression, PCR) 이나부분최소자승법 (Partial Least Squares, PLS) 은흡수봉우리의중첩으로스펙트럼이복잡하여분석이어려운경우많이사용되며, 교차검증 (Cross-validation) 을이용하는변형부분최소자승법 (Modified Partial Least Squares, MPLS) 은파장의전대역과실험치와의상관을유도하는과정에서각파장변수에따른상관도및교차검증결과의오차를얻을수있으므로, 과다적합 (overfitting) 화되지않는검량식을유도할수있기때문에많이이용되고있다. - 6 -
[0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] 본발명에서는녹차의카페인과다양한녹차카테친의함량을동시에측정하고자하는바, 녹차카페인과개별카테친각각의특성에맞도록최적화된검량식이필요하다. 이러한검량식의결정에의하여목적하는각성분의함량을수득함에있어편차가발생하게되므로, 검량식의최적화가중요하다. 기존방법에의하여, 주요 4종의카테친함량이측정된바있으나, 이러한경우에는얻어질수있는카테친의종류가적고, 다양한차나무의품종을개발하고자하는취지에적합하지않다. 본발명의경우, 상기근적외흡수스펙트럼의원시스펙트럼과이들의도함수를얻고수학적처리및통계적회귀분석을다양하게실시하여최적화된검량식을얻고, 미지의시료에서얻어진근적외흡수스펙트럼을상기최적화된검량식에대입하여목적하는녹차카페인및 9 종의개별적녹차카테친함량을단시간에동시에얻을수있게된것이다. 상기얻어진개별근적외흡수스펙트럼은각도함수 ( 원시, 1차혹은 2차미분 ) 를적용한수학적처리를수행하고, 또한다양한통계적분석을실시하여최적의검량식을개발한다. 상기수학적처리방법으로는다양한조건의평활화방법및원시혹은 1차및 2차미분방법이사용된다. 예를들어, 얻어진모든흡수스펙트럼결과들을 2nm 간격으로 400 내지 2,500nm 파장대에서근적외선을조사하여얻어진반사율의역수의로그로정리하여얻어지는데이터를정렬하여각시료간의유의성을확인할수있도록할수있다. 한편, 측정된원시흡수스펙트럼은여러요인에의해흡광도이동현상 (shift) 이발생되므로, 상기원시흡수스펙트럼의 1차또는 2차도함수를적용하는수학적처리를하면모든근적외흡수스펙트럼이동일기준선에정렬하게되어상기흡광도이동현상으로부터유래되는차이를배제할수있는이점이있다. 상기도함수의통계적분석은한정되는것은아니지만, 다중선형회귀분석법 (MLR: Multiple Linear Regression), 부분최소자승법 (PLS: Partial Least Squares), 변형부분최소자승법 (MPLS: Modified Partial Least Squares), 및주성분회귀분석법 (PCR: Principle Component Regression) 중에서선택된어느하나의방법에의하여수행될수있다. 상기와같이다양한통계적분석을실시하는것은근적외흡수스펙트럼에서발생되는흡수파장의중첩 (overlapping) 때문이다. 대부분의경우흡수파장이중첩되기때문에중첩되는파장의영향을배제하고, 보다정밀한예측을위해여러가지통계적스펙트럼분석기법을적용하여가장우수한검량식을개발하고자함이다. 네번째로, 상기녹차카페인과녹차개별카테친의함량측정보정용스펙트럼으로상기개발된검량식을보정및교차검증하고, 상기녹차카페인과개별녹차카테친의함량측정검증용스펙트럼으로상기검증된검량식의적합도를판별하여최적의검량식을선발하는단계이다. 상기한과정을거쳐최적화된검량식은본발명에서목적하는녹차카페인과녹차개별카테친의함량을보다정확하게측정할수있도록하며, 이러한측정은단시간에동시에이루어지는데, 목적하는결과를얻기위하여측정에소요되는시간은시료당 30초내지 1분미만이었다. 이는기존습식방법인화학적분석방법에의한분석시다양한분석시약, 숙련된기술, 분석을위한전처리등이소요되는것과비교할때, 분석시약이필요없고, 숙련된기술이요구되지않는이점과더불어기존화학습식분석시시료 1점분석에최소 5시간이상이소요되지만, 본발명에의한 NIRS 분석시단지 1분이내에정확한결과를얻을수있는것이본발명의장점이다. 한편, 동일한시료를사용하여기존의화학적분석에의하여녹차카페인과 9 종의개별녹차카테친의함량을측정하고, 이를상기한본발명에의하여얻어진녹차카페인및 9종의개별녹차카테친에대한보정검량식을적용하여얻어진결과와비교하였을경우, 카페인, 갈릭산 (GA), (-)-에피갈로카테친(EGC), (+)-카테친(C), (-)- 에피갈로카테친갈레이트 (EGCG), (-)-에피카테친(EC), (-)-갈로카테친갈레이트 (GCG), (-)-에피카테친갈레이트 (ECG) 및총카테친에대한검량식은현저하게높은정확도를가지는것으로확인되었으며, (-)-갈로카테친(GC) 및 (-)-에피갈로카테친 3-(3"-O-메틸 ) 갈레이트 (EGCG-3Me) 에대한검량식은상대적으로다소낮은정확도를나타내었으나, 상대적함량비교및선발을위한차나무육종프로그램에적용하기에는전혀무리가없는것으로보인다. 상기한결과는근적외분광분석법을적용하여고품질차나무품종개발을위한육종프로그램에서차잎에함유된카페인및개개의카테친을신속히측정할수있음을나타낸다. - 7 -
[0044] [0045] [0046] [0047] [0048] 발명의효과이상에서설명한바와같이, 본발명은근적외분광분석법의적용으로녹차카페인과개별녹차카테친의함량을간단한방법에의해측정할수있으며, 특히시료의근적외선흡수스펙트럼을측정, 분석하여시료 1점당 1 분미만의분석시간만으로도녹차카페인과 9 종에달하는다양한녹차카테친의개별함량을정확히측정할수있다. 또한, 본발명은, 기존의녹차카페인이나녹차카테친함량측정에이용된별도의분석장비가필요없고, 장시간소요되는분석시간을극히단축할수있으며, 인력, 경비및측정오차를개선할수있는효과를기대할수있다. 또한, 본발명은상기녹차카페인과개별녹차카테친이외에기타유용화합물, 단백질, 수분, 아미노산, 색도, 관능치와같은기타품질특성을동시에분석할수있으므로, 녹차의품질평가, 우수한육종계통의선발및새로운유전자원의동정 (identification) 이가능하여, 새로운품종의차나무육종에적용할수있다. 또한, 본발명은, 신속성, 정확성및실시간성이요구되는동시분석에활용가능하여이의결과를새로운품종의차나무육종에편리하게사용할수있다. 또한, 본발명은근적외분광분석기술의응용범위를확대할수있으며, 장치개발의중요한기초기술분야등관련산업에서과거에는상상할수없었던강력한장점들을제공할수있을것으로기대된다. [0049] 도면의간단한설명 도 1 은참고예에서얻은녹차추출물의 HPLC 크로마토그램이다. 도 2는녹차의원시스펙트럼에대한 1차도함수 (1,4,4,1 + Weighted MSC) 스펙트라와표준편차 (SD) 스펙트럼을나타낸것이다. 도 3 내지 5는녹차시료중카페인과, EGCG 및총카테친에대한측정보정용시료세트 (A) 와검증용시료세트 (B) 에서근적외분광분석에의하여예측되는값과, 참고예에서제시한녹차추출물의 HPLC 결과의상관성을비교한그래프이다. [0050] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하본발명을실시예등에의하여구체적으로설명하겠는바, 본발명이다음실시예등에의하여한정되는 것은아니다. [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] 참고예. 1) 시료및전처리국내자생차유전자원 (Camellia sinensis L.) 총 665개시료를 ( 주 ) 장원설록차연구소 ( 한국서귀포소재 ) 에서분양받아, 카페인및개개의카테친함량의측정을위한 NIRS 예측모델의개발에사용하였다. 녹차잎 (fresh green tea leaves) 을제1 수확기 (5월) 및제2 수확기 (7월) 에수확하고, 수확직후 40초동안 100 의스팀건조오븐 ( 일본시마다현소재 Kawasaki사 ) 으로스팀처리하여효소반응을억제시키고, 동일한스팀건조오븐을사용하여 1차건조 (100 에서 40분 ), 2차건조 (35 에서 40분 ) 및최종건조 (80 에서 70분 ) 하여건조된녹차잎을가공하였다. 상기건조된녹차잎을마이크로해머밀 ( 스위스취리히소재 Culatty AG사제품 ) 로분쇄하고 1.0mm 스크린을사용하여거른다음, 사용시까지 4 에서밀봉플라스틱백에보관하였다. [0056] 2) 시약 - 8 -
[0057] 메탄올, 에탄올및인산은 Merck Co.( 독일다름슈타트소재 ) 에서구입하였다. 카페인및카테친의분석표준품, 즉갈릭산 (GA), (-)-갈로카테친(GC), (-)-에피갈로카테친(EGC), (+)-카테친(C), (-)-에피갈로카테친갈레이트 (EGCG), (-)-에피카테친(EC), (-)-갈로카테친갈레이트 (GCG), (-)-에피갈로카테친 3-(3"-O-메틸 ) 갈레이트 (EGCG-3Me) 및 (-)-에피카테친갈레이트 (ECG) 는 Sigma-Aldrich Chemical Co.( 미국미주리주세인트루이스 ) 와 Indofine chemical Co.( 미국뉴저지주힐스보로소재 ) 로부터구입하였다. 초순수증류수 (ultra pure water) 는 Millipore사 ( 미국메사추세츠주베드포드소재 ) 의 Mili-Q 정수기 (water purifier system) 를이용하여가공하였다. 상기각카페인및카테친의표준품을 20% 메탄올 (v/v) 에용해하여표준보관용액 (stock solution) 으로조제한후 -20 에서보관하면서사용하였다. [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] 3) 녹차카페인및개별카테친함량의화학적분석 (reference analysis) 녹차잎에서카페인및카테친함량을분석하기위하여, 0.1g의녹차잎분말시료를상온 (25 ) 에서 2시간동안 2% 인산이함유된 50% 에탄올수용액 20mL를첨가하여교반하면서카페인과카테친을추출하였다. 추출물을일반여과지및 0.45μm의멤브레인필터 (Millex-HN, 미국메사추세츠주메드포드소재 Millipore사제품 ) 로여과하고, 여과액을다시물로희석하였다 ( 추출용액 1 ml : 물 4 ml). 최종여과및희석된용액의 20μL를 HPLC 에주입하여분석하였다. 280nm에서작동하는광다이오드어레이검출기가장착된 Agilent 1200 시리즈 HPLC 시스템 ( 미국델라웨어주윌밍톤 ) 을이용하여분석하였다. 분석용컬럼은 YMC ODS AM 303 칼럼 (5 μm ; 250 4.6 mm i.d., Waters사, 미국메사추세츠주밀포드소재 ) 을이용하였으며, 분석용컬럼을보호하기위해 Nova-Pak C18 가드컬럼 (Waters 사, 미국메사추세츠주밀포드소재 ) 을사용하였다. 칼럼온도는 30 를유지하였으며, 이동상은용매 A[0.1%(v/v) 인산함유증류수 ] 와용매 B( 메탄올 ) 를농도구배에의하여분석을실시하였다. 즉, 0 내지 25분까지는 20% B, 25 내지 50분까지는 30% B, 51분에는 20% B, 60 분에는 20% B로조절하였다. 용매 B의증가는선형적으로프로그래밍하였고, 유속은분당 1.0mL, 시료주입량은 20μL로하였다. 녹차카페인및개별카테친함량은농도별로작성된외부표준검량곡선에 HPLC 피크면적을대입하여계산하였다. 농도별로작성된외부표준검량곡선 (R 2 = 0.999 ** ) 은각카페인및개별카테친표준품 0.5ng/mL 내지 1,000 ng/ml의농도로 20% 메탄올에용해된표준용액 20μL를 HPLC에주입하여작성하였다. 2시간동안상온추출로부터얻어진녹차추출물의 HPLC 크로마토그램은 51분이내에차잎에함유된카페인및 9종의카테친화합물인, 갈릭산 (GA), (-)-갈로카테친(GC), (-)-에피갈로카테친(EGC), (+)-카테친(C), 카페인, (-)-에피갈로카테친갈레이트 (EGCG), (-)-에피카테친(EC), (-)-갈로카테친갈레이트 (GCG), (-)-에피갈로카테친 3-(3"-O-메틸 ) 갈레이트 (EGCG-3Me) 및 (-)-에피카테친갈레이트 (ECG) 가기준선으로부터완벽하게분리가되는양상을나타내었고, 상기방법에의해국내자생차유전자원총 665개시료의함량을분석하였다 [ 도 1]. [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] 실시예 1. 녹차카페인및개별카테친함량의동시측정용보정검량식의개발 1) 스펙트럼수집및전처리반사방식의근적외선스캐닝단색화장치인 NIRSystem 모델 6500 (Foss NIRSystems Inc사, 미국매릴랜드주실버스프링소재 ) 를사용하여 NIRS 분광분석을실시하였다. 상기분쇄된녹차분말시료 ( 약 2 g) 을표준링컵에넣고스캔하였다. 반사에너지의기준값보정은기기내부에장착된표준세라믹디스크로부터의측정값을이용하여보정하였고, 각시료별연속으로 32회스캔을수행하고, 이들의평균값을해당시료의스펙트럼으로사용하였다. 각시료별스펙트럼측정시, 반사에너지의기준값보정을위해시료의측정전, 후에각각표준세라믹디스크를 16회스캔하여기준값을보정하였다. 모든개별분석시료의스펙트럼데이터는 2nm 간격으로 400 내지 2,500nm 파장에서반사율의역수로그 ( 로그 1/R) 로측정하여시료당총 1,050개의파장별데이터를측정하였다. 가시광선영역과근적외선영역인 400 내지 2,500nm 영역에서의반사흡수스펙트럼의측정은 NIRS가충분히예열된후, 각분석시료의스캔절차는시료당 1분내에완료할수있었으며, 광도측정반복성 (photometric repeatability, 노이즈테스트 ) 및파장정확성테스트를통하여 NIRS의안정성을확인한후실시하였다. 분석 - 9 -
시료의스펙트럼측정을위한스캔작업, 수학적처리및통계분석을위한소프트웨어는 WinISI II ( 윈도우 1.50 버전, Foss and Infrasoft International LLC 사, 미국펜실베이니아주스테이트칼리지소재 ) 를사용하여 수행하였다. [0068] [0069] WinISI 소프트웨어에서, 스코어프로그램 (score program) 을사용하여보정및검증전에전체시료세트 (n = 665) 를대표하는시료들을선발하고, 일부스펙트럼범위밖의시료는제거하였다. 하나의시료와이웃하는시료사이의거리를마할라노비스 (Mahalanobis) 거리 (H 거리 ) 로서측정하고, 보정및검증세트를대표하는시료들을선택하는기준으로서사용하였다. 평균스펙트럼으로부터 H 거리에따라최근접이웃시료들로부터 H < 0.6인유사스펙트럼을갖는시료들을제거하고, 또한 H > 3.0인범위밖의시료들을제거하였다. 보정및검증을위한시료의최종수는 NIRS에사용되는군집 (population) 시료의스펙트럼변화및화학적변화에따라변화될수있으며, H 거리의절사점 (cutoff point) 을기준으로하여결정하였다. 상기총 665개시료중제거된스펙트럼을제외한나머지 640 개시료의스펙트럼을이용하여 WinISI 프로그램에서두세트로무작위로분할하였다. 함량측정보정용세트 (385개의시료 ) 를사용하여검량식을보정및교차검증을실시하였고, 나머지다른 255개의시료를외부검증용세트로사용하여개발된검량식의적합도를테스트하였다. [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] 2) 데이터처리 WinISI 소프트웨어의글로벌프로그램을사용하여, 2nm 간격으로얻어진전체가시광선 (400 내지 1,100nm) 및근적외선 (1,100 2,500 nm) 영역의스펙트럼에변형부분최소자승법 (MPLS), 부분최소자승법 (PLS), 주성분회귀분석법 (principal component regression) 및다중선형회귀분석법 (multiple linear regression) 과같은회귀방법을적용하여녹차잎함유카페인및카테친함량에대한검량식을개발하였다. 원시흡수스펙트럼 (raw spectrum) 에대한각종수학적처리 ( 로그 1/R 또는 1/R 데이터의 1차또는 2차도함수 (first- or second-derivative)) 를검량식개발에적용하였다. 예컨대, 1,4,4,1에서, 첫번째수는도함수의차수를나타내고 (1은로그 1/R의 1차도함수임 ), 두번째수는데이터점들의간격으로서이것에의하여도함수가계산되며, 세번째및네번째수는각각제1 및제2 평활화 (smoothing) 에사용되는데이터점들의수를나타낸다. 1차도함수및 2차도함수알고리즘을원시흡수스펙트럼 (raw spectrum) 에적용하면원시흡수스펙트럼에서중첩된피크들을명백하게분리할수있다. 또한, 다양한산란보정 (scatter correction) 방법 (none, SNVD, Weighted MSC, Detrend only) 이사용되었다. 원시흡수스펙트럼데이터에다양한산란보정변환 (scatter correction transformation) 을적용하면시료의경로길이및입자크기와같은물리적특성에관한스펙트럼차이가감소된다. 계산된검량식은검량식표준오차 (SEC), 결정계수 (R 2 ), 및교차검증의표준오차 (SECV) 로평가하였다. 다양한검량식개발조건에서얻어지는서로상이한검량식의상호평가는내부적검증방법과같은교차검증에의해판정하였다. 내부교차검증을이용하여각모델에서최소수의 PLS 조건을선택함으로써검량식의과다적합화 (overfitting) 을회피하였고, 각성분에대한최적검량식은 SECV가낮고, R 2 는높은것을기준으로선택하였다. 검량식에서벗어나는이상점 (outlier) 을제거하기위해 WinISI 소프트웨어에서두종류의방법, 즉 t 및 H 통계 ( 마할라노비스거리 ) 를사용하였다. RSC로표시되는, SECV에대한습식분석데이터 (reference data) 의표준편차 (SD) 비율 (SD/SECV) 을보정검량식의예측결과를비교평가하는기준으로도사용하였다. [0075] 검량식의작성후, 각검량식은미지시료의스펙트럼을기초로데이터를예측분석함으로써다른시료들의정확 한분석이가능한가를평가할수있다. 상기내부교차검층이외에, 검량식모델의외부적검증으로예측표준 오차 (SEP) 및예측시결정계수 (r 2 ) 를기초로한예측가능성을평가하였다. 또한예측된 SEP(RSP로표시 ) 에대한검증시료의 SD 비율을검량식의정확성을평가하기위한기준으로서사용하였다. 보정용시료세트에포함되지않은임의시료를사용하여, 검증용시료세트로작성한 NIRS 검량식의예측정확성을검증하였다. 녹차잎에함유된카페인및개별카테친에대하여선발된검량식을검증용세트 (n = 255) 에적용하여 WinISI 소프트웨어의모니터프로그램을이용하여모니터링하였다. [0076] [0077] 3) 분광분석 (Spectroscopic Analysis) 결과 녹차잎시료의 1 차도함수스펙트럼및평균표준편차 (SD) 스펙트럼은도 2 에나타내었다. 도 2 에나타낸바와 - 10 -
같이, 1 차도함수에산란보정 (scatter correction) 으로 Weight MSC 를이용하고, 1,4,4,1 의수처리에의한 1 차 미분스펙트럼으로부터계산하였다. [0078] 평균 SD 스펙트럼에서서로차이를나타내는상이한주요흡수밴드는근적외선영역 (1100 2500nm) 에서관측되 었는데, 페놀성 OH 와 COOH 에의한 C=O 의신축 2 차배음 (second overtone) 에관련해서는 1896nm 에서, 1390, 2310, 2320 및 2460nm 에서는 CH 2 에관련된흡수밴드가, 1418, 1958 및 2380 nm 에서는 ROH 에관련된흡수밴드 가, 1480 nm 에서는 NH 에관련된흡수밴드가, 1690 및 2256 nm 에서는 CH 3 에관련된흡수밴드가, 2026 nm 에서는 CONH 에관련된흡수밴드가, 그리고 2116 및 2150 nm 에서는 HC=CH 에관련된흡수밴드가관찰되었다. [0079] 평균 SD 스펙트럼에서, 몇몇높은표준편차를나타내는스펙트럼영역은화학적관능기 ( 페놀성 OH, CH 2, COOH, ROH, CH 3, CONH 및 HC=CH) 와밀접한관계가있으며, 이들영역은카페인및카테친의 NIRS 검량식작성에중요 한역할을하였으며, 스펙트럼에서관능기에대한정보는 WinISI 소프트웨어로측정하였다. [0080] NIRS 분광영역중 1690 (C-H 신축 1 차배음, -CH 3 ) nm, 2250 (C-H 신축과 C-H 변형, CH 3 ) nm, 2326 (C-H 신축과 C-H 변형, CH 2 ) nm, 2422 (C-H 신축과 C-C 신축, CH 2 ), 및 2050 (N-H 비대칭신축, CONH 2 ) 에서의흡수밴드는카페인과연관되어있고, 또한, 1410 (O-H 신축 1차배음, ROH) nm, 1900 1940 (O-H 신축 1차배음, 페놀성- OH) nm, 및 2130 2150 (=C-H 신축과 C=C 신축, HC=CH) nm에서상이한흡수밴드는폴리페놀성분인카테친성분과연관되는것으로평가할수있는데, 이것은도 2에나타난 1차미분평균 SD 스펙트럼과비슷한파장에서나타나는흡수밴드이다. [0081] 한편, 보정용및검증용세트에사용된녹차잎시료의카페인및개별카테친함량에대한평균, 표준편차 (SD) 및함량범위 (range) 를포함하는기술적통계자료 (descriptive statistics) 는비교적큰편차를보였고, 이것은향후광범위한함량범위의시료에적용될수있을것으로기대되었다 [ 표 1 및 2]. [0082] calibration set N Mean Range SD ---------mg/g------------ caffeine 375 15.844 4.57-35.92 8.618 GA 226 0.128 0.02-0.89 0.128 GC 309 1.205 0.32-2.88 0.753 EGC 380 24.428 1.03-59.75 15.068 C 310 1.145 0.09-2.77 0.826 EGCG 374 42.568 5.60-143.91 24.450 EC 374 6.784 1.95-15.17 3.575 GCG 376 0.913 0.08-3.28 0.548 EGCG-3Me 246 0.456 0.07-2.60 0.445 ECG 371 9.276 1.94-26.55 5.614 total catechins 377 86.786 22.10-206.80 48.111 표 1 [0083] Validation set N Mean Range SD ---------mg/g------------ caffeine 250 16.442 4.64-35.43 8.903 GA 158 0.125 0.02-0.75 0.110 GC 213 1.217 0.35-2.88 0.745 EGC 251 25.492 1.03-53.79 15.148 C 220 1.148 0.09-2.78 0.799 EGCG 234 42.835 11.47-124.62 23.783 EC 249 7.079 1.79-14.91 3.705 GCG 243 0.912 0.11-2.63 0.501 EGCG-3Me 167 0.448 0.17-1.80 0.348 ECG 249 9.680 1.87-25.72 5.748 total catechins 254 91.690 30.60-199.90 50.190 표 2-11 -
[0084] [0085] 상기표 1에나타난바와같이, 카페인및카테친의평균및 SD 값은보정용세트에서카페인은각각 15.844 및 8.618mg/g, GA는각각 0.128 및 0.128mg/g, GC는각각 1.205 및 0.753mg/g, EGC는각각 24.428 및 15.068mg/g, C는각각 1.145 및 0.826mg/g, EGCG는각각 42.568 및 24.450mg/g, EC는각각 6.784 및 3.575mg/g, GCG는각각 0.913 및 0.548mg/g, EGCG-3Me는각각 0.456 및 0.445mg/g, ECG는각각 9.276 및 5.614mg/g, 그리고총카테친은각각 86.786 및 48.111mg/g 이었다. 여기서총카테친은카페인및 GA 함량을제외한개별카테친함량의합을나타내었다. 한편, 상기표 2에나타난바와같이, 검증용시료세트 (validation sample set) 에서의녹차카페인및개별카테친의각통계치는보정용시료세트 (calibration sample set) 에서의카페인및카테친의각통계치와유사한양상을나타내고있음을확인할수있다. [0086] [0087] 4) 검량식모델 (calibration model) 개발 녹차카페인및개별녹차카테친함량에대한 NIRS 검량식모델의검량식작성통계는다음표 3 에 나타내었다. [0088] Contstituent Math treatment Scatter collection 표 3 N a Calibration Cross-validation SEC b R 2c 1-VR d SECV e RSC f caffeine 1,4,4,1 Weighted MSC 375 1.300 0.977 0.964 1.639 5.26 GA 1,4,4,1 Weighted MSC 226 0.042 0.891 0.780 0.063 2.03 GC 1,4,4,1 Detrend only 309 0.278 0.864 0.724 0.454 1.66 EGC 1,4,4,1 Weighted MSC 380 2.946 0.962 0.944 3.569 4.22 C 2,8,6,1 Standard MSC 310 0.239 0.917 0.876 0.295 2.80 EGCG 2,8,6,1 none 374 3.589 0.978 0.962 4.798 5.10 EC 1,4,4,1 SNV and detrend 374 0.769 0.954 0.933 0.929 3.85 GCG 1,4,4,1 none 376 0.163 0.911 0.849 0.125 2.55 EGCG-3Me 1,4,4,1 SNV only 246 0.239 0.710 0.503 0.515 0.86 ECG 1,4,4,1 SNV and detrend 371 1.103 0.961 0.936 1.422 3.95 total catechins 1,4,4,1 Weighted MSC 377 7.058 0.978 0.965 9.003 5.34 a Samples used to develop the model. b SEC, standard error of calibration. c R 2, coefficient of determination of calibration. d 1-VR, one minus the ratio of unexplained varianced ivided by variance. e SECV, standard error of cross-validation. f RSC,SD/SECV, the ratio of SD(standard deviation of reference data) to SECV in the calibration set. [0089] 각성분에따라차이는있으나, vis-nir 스펙트럼범위 (400-2500 nm) 의원시스펙트럼에 1 차혹은 2 차도함수 변형, MPLS 회귀모델 (regression model) 의적용및서로다른산란보정을하였을경우, 기타회귀모델의적용 보다최적의검량식을도출할수있었는데, 그결과로서 EGCG-3Me 제외한카페인및개개의카테친에대해 R 2 > 0.86 이상이고, 상당히낮은 SEC 를나타내었으며, 교차검증에있어서도높은 1-VR 및낮은 SECV 값을나타내었 다. [0090] 또한전체 vis-nir 영역 (400-2500 nm) 을사용할경우, 가시광선범위 (400 1100 nm) 혹은근적외선범위 (1100 2500 nm) 보다더욱양호한, 즉더높은 R 2 및더낮은 SEC 값이수득되었다. [0091] [0092] 녹차잎함유성분중카페인, GA, GC, EGC, EC, GCG, EGCG-3Me, ECG 및총카테친에대한검량식은다른기타수학적처리보다 1,4,4,1의수학적처리를적용하였을때모델의선택기준이되는 RSC (SD/SECV) 값이더욱향상되어지는것을확인할수있었다. 반면녹차의성분중 C 및 EGCG는수학적처리로 2,8,6,1을적용하였을경우, 기타상이한수학적처리보다더높은 RSC 값을갖는검량식을선발할수있었다. 녹차잎함유성분중카페인, EGC, C, EGCG, EC, GCG, ECG 및총카테친함량에대한신뢰성있는검량식은높 - 12 -
은 R 2 (> 0.911) 값및 RSC (> 2.55) 값을가지므로, 도 1에나타낸 HPLC에의해분석된표준분석함량과 NIRS 로추정된값사이에는고도로유의한상관관계가있음을알수있다. [0093] [0094] 녹차잎함유주요구성성분인카페인, EGC, EGCG, EC, ECG 및총카테친의검량식은 R 2 값이 0.954 이상이고, SEC 값이낮아매우우수한정확성을가졌다. 그러나, 소량함유된 GA, GC 및 EGCG-3Me에대한검량식모델은 R 2 < 0.900 로대량함유된구성성분에비해상대적으로다소낮은결과를나타내었는데, 이는보정용으로사용 된시료중에서의이들함량에대한표준편차가작고, 함량의범위가좁기때문일것이다. 본발명에서, 검량식작성에대한통계로서 1-VR은 R 2 과함께중요한평가인자로사용하였다. R 2 값이높은검량식모델이라도, 1-VR 값이낮을경우 NIRS로추정된함량은습식분석에의한함량과큰차이를나타낼수있다. [0095] [0096] 5) 외부검증 (External Validation) NIRS 분석에의하여개발된검량식모델의견고성 (robustness) 은보정용시료세트에포함되지않았던 225개의미지시료를가지고외부검증을통하여검증하였다. 차잎에함유된카페인및카테친에대한외부검증의통계는표 4에기재되어있다. [0097] Constituent 표 4 Mean a SD b Bias c r 2d SEP(C) e RSP f caffeine 16.442 8.903 0.010 0.971 1.538 5.79 GA 0.125 0.110-0.006 0.489 0.045 2.44 GC 1.217 0.745 0.023 0.777 0.374 1.99 EGC 25.492 15.148-0.135 0.952 3.333 4.54 C 1.148 0.799-0.025 0.909 0.250 3.20 EGCG 42.835 23.783-0.091 0.967 4.313 5.51 EC 7.079 3.705 0.030 0.948 0.848 4.37 GCG 0.912 0.501 0.008 0.846 0.200 2.51 EGCG-3Me 0.448 0.348-0.018 0.577 0.256 1.36 ECG 9.680 5.748-0.095 0.939 1.479 4.05 total catechins 91.690 20.190-0.975 0.965 9.463 5.30 a Samples used to monitor the model. b SD, standard deviation of mean. c Bias, average difference between reference and NIRS values. d r 2, coefficient of determination of cross-validation. e SEP(C), the corrected standard error of prediction. f RSP,SD/SEP(C), the ratio of SD of reference data to SEP(C) in the external validation set. [0098] 상기표 4 에나타낸바와같이, 검량식모델의신뢰성을평가하는데사용되는인자들인 r 2, SEP(C) [ 예측에서 의교정된표준오차 (corrected standard error)] 및 RSP [SD/SEP(C)] 이다. 낮은 SEP(C) 및높은 r 2 와 RSP 값을기초로하여, 확립된검량식모델의신뢰성및정확성을모니터링할수있다. 표 4의결과에의하면 GC 및 EGCG-3Me에대한 r 2 및 RSP 값은상대적으로낮은양상을나타내었는데, 이는 HPLC를이용하여습식으로분석한함량값과 NIRS로추정된함량값사이의상관관계가다소낮음을나타내는것이다. 반면카페인, EGC, EGCG, EC, ECG 및총카테친에대한예측은높은 r 2 ( 각각 0.971, 0.952, 0.967, 0.948, 0.939, 및 0.965) 및 RSP 값 ( 각각 5.79, 4.54, 5.51, 4.37, 4.05, 및 5.30) 으로확인되었는데, 이는 HPLC를이용하여습식으로분석한함량값과 NIRS로추정된함량값사이의매우우수한상관관계를나타내는것으로기존습식방법인 HPLC 분석법을대신하여 NIRS 분석법을사용함에아무런문제가없음을보여준다. [0099] [0100] 도 3 내지 5 는카페인, EGCG 및총카테친에대한보정용및검증용세트에서 NIRS 로예측되는값과상기참고 예에서녹차추출물의 HPLC 결과 ( 습식분석기준값 ) 의상관성을비교한그래프이다. 이들결과는, 녹차잎에서 NIRS 법을적용할경우카페인, GA, EGC, C, EGCG, EC, GCG, ECG 및총카테친에대 - 13 -
한본발명의검량식모델이정확한예측능을가지고있는것을입증하는것이며, 나아가검량식모델을일상적 분석에적용할경우차나무육종에적용하는데있어서전혀무리가없는높은신뢰성이있음을확인할수 있다. [0101] 결론적으로, 녹차에함유된카페인및카테친 (GA, EGC, C, EGCG, EC, GCG, ECG 및총카테친 ) 의함량분석은 NIRS 분석을이용함으로써신뢰성있고, 정확도가높게동시분석이가능하다. 한편, GC 및 EGCG-3Me에대한검량식은상대적으로다소낮은정확도를나타내었으나, 상대적함량비교및선발을위한차나무육종프로그램에적용하기에는무리가없을것이다. [0102] [0103] [0104] 이러한 NIRS법은유기용매를사용하는추출단계및시간소모적인크로마토그래피법이필요하지않으며분쇄단계를포함하거나포함하지않고 1분이내에용이하게분석되므로관심있는정량적인자의분석을간략화할수있다. NIR 스펙트럼으로부터의정보는다소복잡하고해석이곤란한경향이있으나, 각각의계량분석화학기술 (chemometric technique) 로각시료에대하여측정된파라미터및 NIR 스펙트럼에서의편차사이의수학적관계가확립된다. 따라서, 이러한관계는미지의시료에서파라미터값을예측하는데사용될수있다. 결과적으로, NIRS 분석은보정검량식작성에사용된시료와유사한시료에대해매우신뢰성있는시료예측분석방법이다. 또한 NIRS의주요이점은관능인자 (sensory factor), 기능성화합물, 단백질, 수분, 아미노산과같은품질성분을동시에측정할수있다는것이다. NIRS의분석적특징은식품의품질평가, 우수한육종계통의선택및새로운유전자원의동정 (identification) 을위한중요한수단으로사용될수있다. 다수의시료분석에있어서, NIRS법은 HPLC 및 GC와같은크로마토그래피분석방법을대체할수있다. [0105] 이상에서설명한본발명은전술한실시예및첨부된도면에의해한정되는것이아니고, 본발명의기술적사 상을벗어나지않는범위내에서여러가지치환, 변형및변경이가능함은본발명이속하는기술분야에서통 상의지식을가진자에게명백할것이다. [0106] 부호의설명. 도면 도면 1-14 -
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