한국어병학회지제26권제3호 (2013) www.ksfp.org J. Fish Pathol., 26(3) : 129~137 http://dx.doi.org/10.7847/jfp.2013.26.3.129 2012 년제주의양식넙치및자연산어류의 Kudoa septempunctata 감염조사 송준영 최준호 최혜승 정승희 박명애 *1) 국립수산과학원병리연구과 수산생물방역과 * Monitoring of Kudoa septempunctata in Cultured Olive Flounder and Wild Fish in Jeju Island during 2012 Jun-Young Song, Jun-Ho Choi, Hye-Sung Choi, Sung Hee Jung and Myoung Ae Park * Pathology Division, National Fisheries Research & Development Institute(NFRDI), Busan 619-705, Korea * Aquatic Life Disease Control Division, NFRDI, Busan, Korea The study surveyed infection rate of Kudoa septempunctata parasitized in the trunk muscle of olive flounder, Paralichthys olivaceus, cultured in Jeju Island and wild fish species caught in the coastal area around Jeju Island during 2012. Among 143 olive flounder that were randomly sampled from 26 different culture farms, K. septempunctata was detected in 7 fish samples (4.9%) from 4 different culture farms, showing no typical Kudoa infestation. However, K. septempunctata was not detected in olive flounder fry sampled from hatcheries and 8 species of wild fish. In addition, we compared 3 different sampling sites on trunk muscle of 7 Kudoa positive fish that included head part, tail part and entire muscle. Among 7 fish, K. septempunctata was detected in 3 fish that were sampled from head part; while 4 fish from tail part of trunk muscle. However, all 7 fish were positive when sampled from entire muscle. Thus, we suggest that it will be more efficient to use entire muscle sample than sampling partial muscle parts for detection of K. septempunctata. Key words : Kudoa septempunctata, Parasite, Paralichthys olivaceus, Trunk muscle 어류에서분리된쿠도아속점액포자충은전세계적으로수많은종류가보고되어왔으며 (Kent et al., 2001, Lom and Dyková 2006, Moran et al., 1999, Yokoyama 2003), 대부분의종이체근육, 뇌, 심장막, 소화관, 신장, 난소등의기관에육안으로보이는시스트를형성하는조직기생성이다 (Blaylock et al., 2004, Burger et al., 2007, Egusa and Shiomitsu 1983, Corresponding author: Jun-Young Song Tel: 051-720-2482, Fax: 051-720-2498, E-mail: jysong2012@korea.kr Maeno et al., 1993, Nakajima and Egusa 1978, Sitjà-Bobadilla 2009). 쿠도아충에의한감염은숙주의생리, 행동, 생존등에영향을미치지않지만 (Moran et al., 1999), 근섬유에기생하는 Kudoa thyrsites, Kudoa musculoliquefaciens, Kudoa paniformis, Kudoa clupeidae, Kudoa miniauriculata 등은어류가죽은후에기생충의단백질분해효소에의해근육을용해시켜 젤리화 를일으킴으로써상품가치를떨어뜨려경제적으로피해를일으킨다 (Kudo et al., 1987, Moran et al., 1999, Yokoyama et al., 2004). 이들
130 송준영 최준호 최혜승 정승희 박명애 쿠도아충가운데넙치에서는 4개의극낭을가진 K. thyrsites가근육용해를일으키는것으로최초로보고되었으며 (Yokoyama et al., 2004), 농어에기생하는것으로보고된 Kudoa lateolabracis가최근에넙치의근육에서발견되었고 (Grabner et al., 2012), 최근한국의양식넙치의근육에서신종쿠도아충인 Kudoa septempunctata의기생이보고되었다 (Matsukane et al., 2010). K. septempunctata는포자 1개당 7개 (6-7개) 의극낭을가지며숙주의염증반응을일으키거나근육내시스트를형성하지않아육안으로감염이확인되지않는특성을가진다 (Matsukane et al., 2010). 최근일본에서는 2003년부터회를섭취한이후 2-20시간이내에구토와설사를일으키는것을주증상으로하며증상이나타난후 24시간이내에자연치유되는것을특징으로하는원인불명의식중독이해마다 100건이상발생하여, 2010년에는 158건이발생되었다. 158건의식중독중 130건이넙치회를섭취한환자에서발생되어, 넙치회를중심으로역학조사와 metagenomic DNA 시컨싱을한결과, 넙치회에서 K. septempunctata의 DNA가검출이되었다. 또한, 실험동물을이용한식중독유발실험결과, K. septempunctata에의해설사와구토의식중독증상이유발되어, 이쿠도아충을새로운식중독의원인체로보고하였으며, 식중독발생시잔품조사결과대부분이넙치 1g 속에 10 6 이상의포자가확인되어, 이수치를식중독을일으키는양성기준으로하였다 (Kawai et al., 2012). 최근의한연구에의해 Kudoa에감염된어류가알러지성위장관증후군을보이는환자에게알러지원인이될수있다고보고된적이있으나 (Martínez de Velasco et al., 2008), Kawai 등 (2012) 에의해보고된 K. septempunctata에의한식중독의보고는인체에병원성을나타내는쿠도아에관한최초의보고이다. 이러한이유로일본정부에서는자국의 넙치는물론수입되는넙치로부터 K. septempunctata 기생여부검사를강화하고있다. 넙치는식품산업적으로중요한수산물이기때문에, 넙치에감염하는 K. septempunctata에의한식중독의발생은공중보건학적으로매우중요하여, 일본에서는 K. septempunctata를진단할수있는방법에대한여러가지연구가수행되어왔다. 넙치에감염하는 K. thyrsites, K. lateolabracis, K. septempunctata의 18S rdna를공통으로검출하는 primer의개발, 28S rdna를종특이적으로검출할수있는 primer가보고되어져있으며 (Grabner et al., 2012), 쿠도아유전자의 real-time PCR을사용한정량방법 (Harada et al., 2012a), 식중독환자의분변에서 K. septempunctata 유전자검출법 (Harada et al., 2012b) 등이보고되어졌다. 본연구에서는, 우리나라에서활넙치대일수출이활발한제주지역을중심으로, 양식넙치와자연산어류의 K. septempunctata의감염현황을파악하기위하여 18S rdna와 28S rdna를검출하는 PCR법과현미경검사를통해 K. septempunctata 감염률을조사하였으며, 넙치근육의채취부위에따른검출률을비교하였다. 재료및방법어류샘플채집양식넙치에서 K. septempunctata 감염현황조사를위해, 2012년 1년동안제주지역의총 26개소의넙치양식장으로부터성어 143마리 ( 출하사이즈, 500g 이상 ) 와종묘장 5개소로부터치어 67마리의샘플을채집하였다. 또한, 제주지역에서주로어획되는 8종의자연산어류 ( 넙치, 쥐치, 벵에돔, 능성어, 돌돔, 참돔, 부시리, 방어 ) 를제주서귀포시의수산물위판장에서구입하여조사에사용하였다 (Table. 1).
2012 년제주의양식넙치및자연산어류의 Kudoa septempunctata 감염조사 131 Table 1. Fish samples employed in the study Cultured fish Wild fish Fish species Sampling number size olive flounder ( 넙치성어 ) 143 >500g olive flounder (fry) ( 넙치치어 ) 67 <30g olive flounder ( 넙치성어 ) 3 41.5cm file fish ( 쥐치 ) 8 22.5cm largescale blackfish ( 벵에돔 ) 22 30.1cm seven-banded grouper ( 능성어 ) 2 27.0cm rock-bream ( 돌돔 ) 1 30.5cm red-sea bream ( 참돔 ) 11 33.5cm king amberjack ( 부시리 ) 8 62.5cm yellow tail ( 방어 ) 6 41.5cm 쿠도아검사모든실험어의 K. septempunctata 감염조사를위한현미경검사는일본의수산청 ( 일본수산청, 2012) 에서발표한자료를참고하여실험을수행하였으며, PCR 방법은일본수산청의방법과 Grabner 등 (2012) 의방법을참고하여실험을수행하였다. (1) 현미경검사현미경검사를위해넙치의두부쪽등근육, 미부쪽등근육, 등근육전체샘플을사용하였다 (Fig 1). 실험어의두부쪽등근육과미부쪽등근육부위를해부용칼로절개하여육안으로관찰후, 각부위를면봉을이용하여근육을채취한후슬라이드글라스에동전크기로문질러도말한후건조하였다. 등근육전체샘플채취는, 등근육전체부위를해부용칼로긁어모은후 TE buffer(promega, USA) 에 5배희석후완전히마쇄하여 10ul를슬라이드글라스위에떨어뜨린후건조하였다. 치어의경우, 등근육전체를칼로절개한후면봉으로근육을채취하여도말하였다. 건조후, 99.5% 에탄올 (Merck, Germany) 을슬라이드글라스에 1ml정도가하여 1분간고정하였다. 에탄올을제거하고슬라이드글라스위에남은에탄올이건조 된후, Loffler s methylene blue solution을 1ml가하여 1분간염색한후, 증류수를이용하여세척하였다. 광학현미경하에서 200 1000배배율로관찰하여 6-7개의극낭을가지는 K. septempunctata 포자를확인하였다. (2) PCR 검사실험어 ( 양식넙치성어, 자연산어류 ) 의두부쪽등근육과미부쪽등근육채취를위해, 각부위를해부용칼로절개하여 ( 약 0.3g) 샘플링하였으며, 등근육전체샘플채취를위해, 등근육전체를해부용칼로긁어모았다 (Fig. 1). 각샘플을튜브에넣어무게를잰후 TE버퍼에 5배희석하여근육조직을완전히마쇄하였다. 치어의경우, 등근육전체를긁어모아 1-5마리를 pool하여성어와같은방법으로근육을마쇄하였다. 피펫으로근육의 30mg에해당하는마쇄액 150μl를덜어 DNA 추출에사용하였다. DNA는시판되는 Accuprep DNA extraction kit (Bioneer, Korea) 를사용하여매뉴얼에따라추출하였다. PCR 에사용한 primer는일본의수산청에서제시하는 primer를사용하였으며 (Table. 2), 18S rdna를검출하는 primer set과 28S rdna를검출하는 primer set에대하여, 추출한3 μl template를 AccuPower PCR
132 송준영 최준호 최혜승 정승희 박명애 Figure. 1. Sampling sites in trunk muscle of olive flounder; (a) head part, (b) tail part, (c) entire muscle Table 2. Primer information and PCR reaction condition used in the study Target gene Primer name Sequence (5' to 3') Target size 18S rdna Ksept18S-436 agaaataccggagtggaccgtaaaatg Ksept18S-768 gttccatgctataacattcaagcgttcg 333bp 28S rdna KSf gtgtgtgatcagacttgatatg KSr aagccaaaactgctggccattt 357bp premix (Bioneer) 와혼합하여 20μl의반응액에서 PCR 을수행하였다. PCR 산물은 ethidium bromide가첨가된 1.5% agarose gel에전기영동한후 MultiImage Ⅱ (Alphainnotech, USA) 로 PCR 산물의증폭을확인하였다. PCR 양성반응을나타내는샘플은 Gel DNA extraction kit (Millipore, USA) 를사용하여정제한후, t-blunt vector (Solgent, Korea) 에클로닝하고 Cempetent cell DH5α (Biofact, Korea) 에 transformation 후 Accuprep plamid mini extraction kit (Bioneer) 를사용하여 plasmid를분리한후 Solgent사에시컨싱을의뢰하였다. 결과양식넙치에서의 K. septempunctata 감염현황제주지역에서양식되는넙치육성어를대상으로현미경검경법과 PCR을통해 K. septempunctata 감염 현황을조사하였다. 26개소양식장으로부터채집한 143마리넙치중 4개소의 7마리 (4.9%) 넙치에서 K. septempunctata 유전자가검출되었으며 (Fig. 2) 그중 3마리에서포자 (Fig. 3) 가확인되었다. 검출된모든넙치의근육을육안으로관찰한결과쿠도아불검출어와똑같은형태를하고있어육안으로는 K. septempunctata 감염의구분이불가능하였다. PCR은양성이나현미경으로포자가검출이되지않는샘플의경우, 28S rdna 357bp의 PCR product 시컨싱을통해분석하여, K. septempunctata 28S rdna(ab693040) 와 100% 일치함을확인하였다 (data not shown). 또한, 넙치종묘장 5개소로부터채집한치어 67마리 (39 samples) 에서는 K. septempunctata의유전자및포자가검출되지않았다.
2012 년제주의양식넙치및자연산어류의 Kudoa septempunctata 감염조사 133 Figure. 2. 18S rdna (a) and 28S rdna (b) PCR results of Kudoa septempunctata positive and negative samples. PCR was performed as duplicate and lane 1 to 5 show K. septempunctata negative results and lane 6 shows positive result. M, 100bp marker; N, negative control; P, positive control. 근육부위별쿠도아검출비교쿠도아가검출된어류의근육부위별쿠도아검출비율을조사한결과, 두부근육에서는 7마리중 3마리 (42.8%), 미병부근육은 7마리중 4마리 (57%), 등근육전체를사용한샘플은모든샘플 (100%) 에서쿠도아유전자가검출되었다 (Table 3). 또한, 7마리중 3마리에서현미경으로극낭 6-7개의포자가검출되었다. 검출된대부분의샘플에서 18S rdna 와 28S rdna 의검출결과가일치하였으나, 한마리에서 (Table 3, fish7) 두부, 미부, 전체근육모두에서 18S rdna 검출되지않았으나, 28S rdna는미부와전체근육에서검출이되어 K. septempunctata의감염임을추정하였으며, 28S rdna 증폭산물의시컨싱을통해 K. septempunctata임을확인하였다. 고찰 Figure 3. Microscopic observation (1000x) of Kudoa septempunctata spore with 6 to 7 valves, stained with Loffler s methylene blue solution. 자연산어류의쿠도아감염현황제주근해에서어획되어제주시서귀포지역위판장에서판매되는자연산넙치 3마리, 쥐치 8마리, 벵에돔 22마리, 능성어 2마리, 돌돔 1마리, 참돔 11마리, 부시리 8마리, 방어 6마리에서쿠도아감염을조사한결과, 쿠도아유전자와포자가모두검출되지않았다. K. septempunctata는한국에서일본으로수출한넙치의근육에서최초로보고되었으며 (Matsukane et al., 2010), 우리나라에서는제주지역이활넙치수출에가장높은비율을차지하므로, 본연구에서는 2012 년동안, 제주지역에서양식되는넙치육성어와치어, 그리고자연산넙치를포함한자연산어류 8종에서 K. septempunctata의감염현황을조사하였다. 그결과, 26개소조사양식장으로부터채집한 143마리중 4개소 7마리 (4.9%) 의넙치육성어에서 K. septempunctata의유전자가검출되었다. 검출된양식장의경우같은수조안에서샘플링한 3 5마리중 1 2마리에서검출양성을나타낸반면, 나머지어류는 K. septempunctata의유전자또는포자가전혀검출되지않는것으로보아개체에따른감염의차이가큰것으로생각된다. 유전자가검출된 7마리넙치중 3마리에서쿠도아포자가검출되었으며, 현미경하에서쿠도아포자검출최저한계가 10 4 spores/g 이라는보고에따라 (Iijima et al., 2012), 포자가검출되지
134 송준영 최준호 최혜승 정승희 박명애 Table 3. Comparison of sampling sites in trunk muscle of fish for detection of Kudoa septempunctata Fish Farm head part tail part entire muscle 18S rdna 28S rdna 18S rdna 28S rdna 18S rdna 28S rdna Kudoa spore 1 A P P P P P P P 2 A P P P P P P P 3 B n.d. n.d. n.d. n.d. P P n.d. 4 B n.d. n.d. n.d. n.d. P P P 5 C n.d. n.d. P P P P n.d. 6 C P P P P P P n.d. 7 D n.d. n.d. n.d. P n.d. P n.d. Detection rates (%) 3/7 (42.9%) P, positive; n.d., not detected 3/7 (42.9%) 4/7 (57.1%) 5/7 (71.4%) 6/7 (85.7%) 7/7 (100%) 3/7 (42.9%) 않은 4마리어류에기생하는쿠도아포자수가 10 4 spores/g보다적은것으로생각된다. 넙치를포함한 8종의자연산어류에서는쿠도아가검출되지않았다. 쿠도아와같은점액포자충에속하며송어에서 Whirling disease 를일으키는 Myxobolus cerebralis 의중간숙주로 Oligochaeta Tubifex tubifex가보고되어있으며 (Gilbert and Granath Jr 2001, Zendt and Bergersen 2000), 청어에서분리된 Ceratomyxa auerbachi의무척추중간숙주로다모류 Chone infundibuliformis가밝혀져있다 (Køie et al., 2008). 그러므로, K. septempunctata의감염또한환경에존재하는무척추동물이중간숙주로작용하고있을가능성을생각할수있어자연산넙치의쿠도아감염의가능성이큰것으로생각되나, 본연구에서자연산넙치에서쿠도아가검출되지않았다. 자연산넙치가어획되는적절한시기에많은수의샘플을채집하지못하여본연구의조사에 3마리만사용하였으므로, 차후자연산넙치의 K. septempunctata감염에대한더많은조사가필요할것으로생각된다. 현재까지어류에서보고되는쿠도아충에대한생활사가밝혀진종은없으며, K. septempunctata 또한 환경에존재하는중간숙주, 넙치에감염되는시기, 감염경로, 감수성어종등이밝혀지지않았다. 본연구의결과, 넙치종묘장 5개소로부터치어 67마리를조사하였으나, 쿠도아포자및유전자가검출되지않았다. 그러나, Iijima 등 (2012) 에의한보고에서넙치치어 300마리중 1마리에서 real-time PCR 결과쿠도아유전자가검출되어, 넙치의치어시기부터감염이시작되는것을제안하였다. 본연구에서는일반 PCR방법에의해조사를하였으므로, 검출민감도에의한결과의차이가있을수있다. 또한, 현재까지치어시기에서포자가확인된경우는없으므로, 감염초기에는포자형성이전단계로존재할가능성을생각할수있어, K. septempunctata의생활사나감염후숙주내에서의동태에관한연구가필요하다. 선행연구에서쿠도아를진단하는방법이여러가지제시되어있으며, 본연구에서는일본의수산청과 Grabner 등 (2012) 에의한방법으로현미경검경과유전자검사법을이용하여조사를하였다. 18S rdna primer 의경우 K. septempunctata 뿐아니라넙치에기생하는다른쿠도아충에교차반응하여검출할수있는 primer 이며, 28S rdna를검출하는 primer의경우 K.
2012 년제주의양식넙치및자연산어류의 Kudoa septempunctata 감염조사 135 septempunctata 에특이적으로고안된 primer 이다. 본연구에서조사결과, 28S rdna primer에서는검출이되나 18S rdna에서는검출이되지않는샘플이존재하여 28S rdna primer의효율이더높은것으로생각되었다. 근육에기생하는쿠도아감염을정확히진단하기위해서는, 근육의어느부위를채취하여실험에사용하느냐에따라검출결과가달라질수있으므로, 샘플링부위를결정하는것이중요하다. 본연구에서는, 넙치의두부쪽에서채취한등근육, 미부쪽에서채취한등근육, 그리고등근육전체를긁어모은샘플을사용하여쿠도아검출률을비교하였다 (Table 3). 그결과, 두부근육에서는 7마리중 3마리 (42.8%), 미병부근육은 7마리중 4마리 (57%), 등근육전체를사용한샘플은모든샘플 (100%) 에서쿠도아유전자가검출되어, 어느한부위의근육을샘플링하는것보다 (Fig. 1(a), (b)) 등근육전체 (Fig. 1(c)) 를긁어채취하는것이쿠도아검출에더효율적임을확인하였다. 7 마리중 3마리는모든부위에서유전자검출양성이었으며그중 2마리에서는포자가확인되었으나한마리에서는포자가확인되지않았다. Kawai 등 (2012) 이 real-time PCR을사용하여넙치의근육부위별쿠도아유전자의 Ct값을조사한결과, 넙치의근육에쿠도아의포자수 5.6 10 4 spores/g에서8.4 10 5 spores/g가존재할경우에는조사부위별로 Ct값이다르게나타났으나, 포자수 1.1 10 6 에서1.2 10 7 /g가존재할경우에는근육부위에상관없이 Ct값이차이가없음을밝혀, 근육 1g에 10 6 이상의포자가존재할경우쿠도아가근육전체에고르게분포하는것을제안하였다. 본연구에서쿠도아가검출된넙치의근육에서포자를계수하지않았지만, 부위별로 PCR 검출결과가다른개체의경우넙치근육 1g 당쿠도아가 10 6 이하로존재하는것으로생각할수있다. 그러므로, 쿠도아감염의효율적진단을위해서는, 어느한부위를샘플링하는것보다근육전체부위를고르게채취하여분석하는것이, 적은수의포자가존재하는샘플에 서도쿠도아감염에대한진단효율을높일수있음을제안한다. 요약 Kudoa septempunctata가한국의양식넙치의근육에기생하는것이보고되어, 본연구에서는 2012년동안제주지역의양식넙치및자연산어류에서 K. septempunctata의감염현황을조사하였다. 제주지역 26개소의넙치양식장으로부터 143마리를조사한결과, 4개소 7마리 (4.9%) 에서쿠도아감염이확인되었으며, 넙치치어 67마리에서는쿠도아가검출되지않았다. 또한, 제주지역에서어획된자연산어류 8종에서도쿠도아가검출되지않았다. 쿠도아가검출된 7마리어류에대하여등근육부위별쿠도아검출을비교하기위하여, 넙치의두부쪽에서채취한등근육, 미부쪽에서채취한등근육, 그리고등근육전체를긁어모은샘플을사용하여검출률을비교한결과, 전체를긁어모든샘플을사용할경우검출률이 100% 로가장높아, 어느한쪽에서근육을채취하는것보다등근육전체부위를골고루채취하는것이쿠도아검출에더효율적임을확인하였다. 감사의글본연구는국립수산과학원 ( 수산생물질병특성연구, RP-2013-AQ-206) 의지원에의해운영되었습니다. 참고문헌 Blaylock, R.B., Bullard, S.A., Whipps, C.M.: Kudoa Hypoepicardialis n. sp. (Myxozoa: Kudoidae) and associated lesions from the heart of seven perciform fishes in the northern gulf of Mexico. J. Parasitol., 90: 584-593, 2004.
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