(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 8/97 (2006.01) A61Q 19/08 (2006.01) A61Q 19/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2011-0006641 (22) 출원일자 2011 년 01 월 24 일 심사청구일자 2011 년 01 월 24 일 (65) 공개번호 10-2012-0099165 (43) 공개일자 2012 년 09 월 07 일 (56) 선행기술조사문헌 KR1020080094459 A* KR1020090132285 A KR1020080094457 A KR100371504 B1 * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2013년08월12일 (11) 등록번호 10-1293007 (24) 등록일자 2013년07월29일 (73) 특허권자 영동대학교산학협력단 충청북도영동군영동읍대학로 310 ( 영동대학교 ) 재단법인한국한방산업진흥원 경상북도경산시화랑로 94 ( 갑제동 ) (72) 발명자 손준호 대구광역시수성구달구벌대로 641 길 31, 매호화성 101 동 1108 호 ( 매호동 ) 박태순 대구광역시수성구범안로 8 길 35, 삼주타운 101 동 709 호 ( 범물동 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 신동인 전체청구항수 : 총 2 항심사관 : 이재영 (54) 발명의명칭대추의발효액을유효성분으로함유하는항산화및주름개선용조성물 (57) 요약 본발명은대추또는포도발효액을함유하는항산화, 항염증, 미백및주름억제효과를갖는조성물로서인체에대한부작용이나독성이없으며, 항산화, 항염증, 미백및주름억제효과를나타내, 항산화, 항염증, 미백및주름억제효과를나타내는화장료조성물로유용하게이용할수있다. 대표도 - 도 1-1 -
(72) 발명자 정미송 경상북도경산시압량면압독 2 로 8 길 17-8, 럭키하우스 301 호 이인철 대구광역시동구동부로 1, 103 동 705 호 ( 신천동, 신천주공아파트 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 경북-2010-03 부처명 경상북도 연구사업명 경북지역기반육성사업 연구과제명 대추발효초를활용한웰빙화장품개발 주관기관 대구경북한방산업진흥원 연구기간 2010.05.01 ~ 2010.12.31-2 -
특허청구의범위청구항 1 세척한대추원재료를착즙기로착즙하는제 1단계 ; 상기착즙물을 20 내지 40 온도범위의온도에서 1시간내지 7일동안수행하는전배양과 20 내지 40 온도범위의온도에서 1시간내지 7일동안수행하는본배양을거쳐활성화된사카로마이세스클루트베리 (Saccharomyces klutveri DJ97), 사카로마이세스코레아누스 (Saccharomyces coreanus), 사카로마이세스사케 (Saccharomyces sake), 사카로마이세스로욱시 (Saccharomyces rouxii), 또는사카로마이세스말리-두클라우스 (Saccharomyces mali-duclaus) 로부터선택된균주를 10 내지 30 브릭스 (brix) 범위의대추즙 (18brix) 에 1-30%(v/v) 용량이되도록접종하여 15 내지 50 온도범위의온도에서 1 일내지 2주일동안정치배양을수행하여알콜발효액의알콜도수가 1 내지 20% 및당도가 1 내지 20 브릭스 (18brix) 범위에이르도록발효를수행하여식물알콜발효액을수득하는제 2단계 ; 상기식물알콜발효액에 30 내지 100 온도범위의온도에서 1 분내지 1시간동안살균처리하여활성화된아세토박터파스테우리아누스 (Acetobacter pasteurianus KFC 819; KCTC 10173BP), 아세토박터아세티 (Acetobacter aceti), 아세토박터옥시단스 (Acetobacter oxidans), 아세토박터비니아세타티 (Acetobacter vini acetati) 또는아세토박터슈쳄바치 (Acetobacter schutzembachii) 로부터선택된균주를접종하여 15 내지 50 온도범위의온도에서 1 일내지 30일동안정치배양을수행하여초산발효액의초산함량이 1-10% 및당도가당도가 1 내지 20 브릭스 (brix) 범위에이르도록발효를수행하여수득된대추초산발효액을유효성분으로함유하는항노화및주름억제활성을갖는화장료조성물. 청구항 2 삭제청구항 3 삭제청구항 4 삭제청구항 5 제 1항에있어서상기화장료조성물은화장수, 스킨, 로션, 영양로션, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 팩의제형인것을특징으로하는화장료조성물. 명세서 [0001] 기술분야 본발명은대추의발효액을유효성분으로함유하는항산화및주름개선용조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] 배경기술 [ 문헌 1] (1.Voegeli, R. 1996. Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, 51-58.). [ 문헌 2] Aroca, P., et al. 1993. Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, 25650-25655.). [ 문헌 3] Chin, J. E., et al. 2005. Effects of Houttuynia cordata extracts on tyrosinse gene expression. J. Korean Soc Food Sci Nutr 34, 1284-1288.) - 3 -
[0005] [0006] [0007] [0008] [0009] [0010] [0011] [ 문헌 4] Oikarinen A, Karvonen J, Uitto J, Hannuksela M., Connective tissue alterations in skin exposed to natural and therapeutic UV-radiation. Photodermatol. 2(1), pp.15-26, Review, 1985. [ 문헌 5] Hirobe T., Role of keratinocyte-derived factors involved in regulating the proliferation and differentiation of mammalian epidermal melanocytes. Pigment Cell Res. 18(1), pp.2-12. Review, 2005. [ 문헌 6] McKay IA, Leigh IM., Epidermal cytokines and their roles in cutaneous wound healing. Br J Dermatol. 124(6), pp.513-8, Review, 1991. [ 문헌 7] Kim HH, Cho S, Lee S, Kim KH, Cho KH, Eun HC, Chung JH., Photoprotective and anti-skin-aging effects of eicosapentaenoic acid in human skin in vivo. J Lipid Res. 47(5),pp.921-30, 2006. [ 문헌 8] Medina A, Ghaffari A, Kilani RT, Ghahary A., The role of stratifin in fibroblastkeratinocyte interaction. Mol Cell Biochem. 305(1-2), pp.255-64, Review, 2007. [ 문헌 9] Wang XJ, Han G, Owens P, Siddiqui Y, Li AG., Role of TGF beta-mediated inflammation in cutaneous wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc. 11(1), pp.112-7, Review, 2006. [ 문헌 10] Traidl-Hoffmann C, MI, Ring J, Behrendt H., Impact of desloratadine and loratadine on the crosstalk between human keratinocytes and leukocytes: Implications for anti-inflammatory activity of antihistamines. Int Arch Allergy Immunol. 140(4), pp.315-20, 2006. 발명의내용 [0012] [0013] [0014] 해결하려는과제현대인들은자외선, 스트레스등의여러가지내외적인요인에의해각종피부트러블유발로기미, 주근깨, 피부색소침착등의피부노화현상을촉진한다 (1.Voegeli, R. 1996. Elastase and typtase determination on human skin surface. Cosmetic &Toiletries. 111, 51-58.). 피부의색소침착은멜라닌색소이생합성에서 tyrosinase 효소를비롯하여 DHICA oxidase(trp-1) 등의 L-tyrosine을 DOPA(3,4-dihydroxyphenyla-lanine) 으로 DOPA에서 DOPA quinone으로초기반응을조절하는것으로알려져있다 (2.Aroca, P., et al. 1993. Melanin biosynthesis patterns of following hormonal stimulation. J. Biol Chem 268, 25650-25655.). 이를바탕으로티로시나제 (tyrosinase) 효소의활성을저해하여멜라닌생합성의억제에영향을미칠수있는천연물탐색에대한연구가활발히진행되고있다. 그결과어성초추출물을이용하여티로시나제 (tyrosinase) 유전자발현억제효과 (3. Chin, J. E., et al. 2005. Effects of Houttuynia cordata extracts on tyrosinse gene expression. J. Korean Soc Food Sci Nutr 34, 1284-1288.) 등천연물을활용한연구가활발히이뤄지고있다. 그외현재알려져있는항산화및미백원료는아르부틴 (Arbutin), 코지산 (Kojic acid), 아스코르브산 (Ascorbic acid) 등의물질이대표적이고상백피, 닥나무, 감초등의식물추출물이널리알려져있다. 환경의파괴로인한자외선증가및각종산화성물질의증가는피부손상과단백질의합성능저하를유발할수있다. 이러한피부세포의손상이나기능저하는피부탄력의감소, 피부주름살의증가, 기미와주근깨생성등피부미용에치명적인현상들을유발한다. 피부탄력성은진피조직의콜라겐 (collagen), 엘라스틴 (elastin), 히알루론산 (hyaluronic acid) 등에의해유지되며, 콜라겐 (collagen) 을합성하는섬유아세포 (fibroblast) 는핵심적인역할을한다 (1). 섬유아세포기능은각종성장인자 (growth factor) 뿐만아니라케라티노사이트 (keratinocyte) 나멜라노사이트 (melanocyte) 와같은피부세포들에서분비되는싸이토카인 (cytokin e) 에의해서도조절된다 (2-3). 정상적인상태에서유리되는케라티노사이트의 TGF-β, TβRII, SGad3는피부섬유아세포 (dermal fibroblast) 로부터프로콜라겐 (procollagen), 피브릴린 (fibrillin-1), tropoelastin의발현을증가시켜콜라겐생성을증가시키며, MMPs의발현을억제하여콜라겐분해를억제하는것으로보고되었다 (4-5). UV에의해케라티노사이트가손상되면 TGF-β(transforming growth factor) 외에도 TNF-α(tumor necrosis factor), PGE 2 (prostaglandin E 2 ), α-msh(melanocyte stimulating hormone), GSF(granulocyte stimulating factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10 등의유리가유발한다 (6-7). 이중 α-msh와 PGE 2 는멜라노사이트를자극하여멜라닌생성을촉진하여, 이멜라닌은피부세포의항산화작용을증강시켜피부세포가자외선으로인해손상되는것을방어하게한다 (8). IL-1, TNF-α(tumor necrosis factor) 등은 fibroblast에작용하여 procollagen 발현을억제하며, MMP-1 (martrix metalloproteinase-1), MMP-2, MMP-3, - 4 -
히알루로니다아제 (hyaluronidase) 등의활성을증가시켜콜라겐분해를촉진하게된다 (9-10). 또한, UV에의해직접적으로섬유아세포 (fibroblast) 가상해를받는경우에도콜라겐관련유전자는억제되고분해에관련되는 MMPs류발현은촉진되어주름살은증가하게된다. 따라서, 진피섬유아세포 (dermal fibroblast) 의증식과콜라겐합성을증가시키거나, MMPs을억제하는것은주름살을생성을억제하는수단이될수있다. [0015] 화장품시장은이미성숙및포화수준에도달하고있어앞으로세계시장에서의경쟁력을향상시켜야할필요성이절실한상황이며, 우리나라고유의국산화장품브랜드의개발과수출전략마련의필요성이대두되고있다. 그러나우리나라화장품제조에사용되는원료의약 80% 이상은해외수입을통해이루어지고있는실정이다. 화장품원료수입품가운데수입실적이높은원료및제품들은각국이특허등의방법을통해산업차원에서보호하고있기때문에국내에서이를수입할경우완제품으로수입하거나고가의로열티를지불해야하는실정이다. 다양한식물추출물과전통한약효능을접목한한방화장품은국내시장에서좋은반응을얻고있다. 한방화장품은수입에만의존하던화장품원료를국산으로대체할수있고시대적트랜드인웰빙에부합하면서소비자의수요가지속적으로늘어나고있어국내화장품산업발전도모와국제시장에서의수출교두보를마련할수있을것으로기대된다. 하지만우리나라만의특색이있는한방화장품개발로서양의허브나다른천연추출물을이용한화장품과의차별화가되지않으면한방화장품이란의미도점점퇴색되어지리라생각된다. 오랜기간동안발효식품을사용하여온우리민족에게발효는매우친숙한단어이다. 그리고미생물을이용한국내발효산업은아미노산, 원료의약품생산을통하여세계최고의기술, 인프라, 전문가및경험을보유하고있어앞선발효기술과경험을활용하여새로운발효천연물화장품소재를개발한다면차별화된소재를사용하는새로운효능이추가된향장제품을만들수있는기회를제공할수있으며, 이것은한방화장품이시장에서고유브랜드로정착되어중국, 일본으로진출하여세계화로되는길을마련할수있다고판단된다. [0016] [0017] [ 대한약전 ] 에서는대추나무 Zizyphus jujuba Miller var. inermis Rehder 또는기타동속근연식물 ( 갈매나무과 Rhamnaceae) 의열매이다. 효능으로는비위 ( 脾胃 ) 를자양하고기혈을북돋우며, 간장을보호하고근력을강화하며, 얼굴색을좋아지게하고구규 ( 九竅 ) 를통하게하며십이경맥을돕고각종약들이조화를이루도록한다. 민간에서는 하루에대추를세개씩먹으면늙지않는다 는말이있을정도다. 대추는기를북돋우고비 ( 脾 ) 를튼튼하게하여기혈의생화를촉진하므로얼굴과피부가윤택해지는데, 특히야윈사람에게좋으며, 성분은단백질, 탄수화물, 지방, 각종비타민, 유기산및무기염을함유하고있으며, 비타민 C의함량이매우높아과일중에서도첫손가락에꼽히는데, 사과, 복숭아에비해 100배가량많으며, 비타민E와비타민P의함량또한과일중으뜸이다. 동의보감에는포도열매가배고픔을달래고기운이나게하며추위를타지않게하고, 기혈과근골을보강하고비위와폐신을보하여몸을든든하게하며태아를편안하게한다고한다. 포도에는포도당과과당등당분과비타민 A, B, C 등이풍부하고, 칼슘, 인, 철등무기질도다량으로함유되어있는것으로알려져있다. 특히레스베라트롤 (Resveratrol) 을포함한다양한폴리페놀성분을함유하고있는것으로보고되고있다. 포도의껍질과씨에많은폴리페놀약효성분은, 동맥경화와암, 노화와피로등을초래하는 ' 활성산소 ' 로부터우리몸을지켜주는항산화작용을한다. 그외, 철분이많아빈혈에좋고, 바이러스활동을억제하여충치를예방하며, 신경효소의활동을증진시켜알츠하이머병이나파킨슨병등의퇴행성질병을예방하는효과가알려져있다. [0018] [0019] 또한발효란미생물이어떤물질을분해하고변형시키는과정을말하며, 그과정을통해미생물이또다른물질을생산해내기도한다. 우유에발효균 ( 미생물 ) 을넣어두면요구르트가되고, 포도즙이자체발효되면서포도주가되듯이발효과정을거치면유효성분이분해되어, 그미생물의수가증가하고새로운물질이생겨난다. 이런과정을화장품에적용시킨것이바로발효화장품이며, 피부에좋은물질을미생물로발효시킨후얻은대사산물을화장품에이용하는것이다. 화장품중에는양을많이쓰면독성이생기거나, 혹은분자크기가피부세포의틈새보다커서피부에깊숙이침투되지못한채제기능을발휘하지못하는경우가있는데, 발효화장품은이러한문제점들을해결해준다. 발효를통해독성성분들을분해및변화시켜그독성을최소화하고, 피부에친숙한물질로변환시켜적은양으로도피부에큰효능을발휘할수있다. 발효는이제유망한 21세기바이오축이되고있다. 전통적인식품이외에도새로운분야에적용하려고하는연구가우리나라를필두로해서국제적으로활발해졌다. 기존의전통식품도더욱발전시키고있을뿐만아니라새로운분야까지적용을하 - 5 -
고있다. 화장품과다이어트제품, 의료, 공업, 농업, 축산, 수산분야까지적용범위가확대되고있다. 실제로 최근이러한자연발효기법을도입해화장품개발에나서는기업들이늘고있으며발효화장품의주요컨셉도 단순히 발효화장품 이아닌 자연발효화장품 으로변화되고있다. [0020] 이에본발명자들은대추또는포도를알콜발효또는초산발효를시켜항산화, 미백, 주름개선등의생리 활성을검증하여화장품조성물로서의가능성을검토한결과, 그생리활성을확인함으로써본발명을완성하였 다. [0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은대추또는포도발효액을유효성분으로함유하는항노화및주름억제효과를갖는화장료조성물을제공한다. 본원에서정의되는상기대추는 Zizyphus jujuba R. Zizyphus jujuba R. Zizyphus jujuba var. inermis MILL. 을포함하고 ; 상기포도로는 Vitis vinifera L. Vistis labrusca L., Vitis praecox Poit. &Turpin, Vitis moschata var. alba Poit. &Turpin, Vitis moschata var. rubra Poit. &Turpin, Vitis corinthiaca var. violacea Poit. &Turpin, Vitis alexandrina Poit. &Turpin, Vitis guilelmi Poit. &Turpin, Vitis bryoniaefolia Bunge, Vitis laxiflora A.Sav., Vitis densiflora A.Sav., 또는 Vitis promeryana T.Durand &B.D.Jacks를포함함을특징으로한다. 본원에서정의되는상기발효액은알콜발효, 초산발효또는이들의조합발효를포함한발효법을수행한발효액임을특징으로한다. 구체적으로, 본원에서정의되는상기알콜발효는 20 내지 40 온도, 바람직하게는 25 내지 35 온도범위의온도에서 1시간내지 7일, 바람직하게는 6시간내지 48시간동안수행하는전배양과 20 내지 40 온도, 바람직하게는 25 내지 35 온도범위의온도에서 1시간내지 7일, 바람직하게는 6시간내지 48시간동안수행하는본배양을거쳐활성화된유산균, 바람직하게는사카로마이세스 (Saccharomyces) 속균주, 보다바람직하게는, Saccharomyces klutveri DJ97, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycescoreanus, Saccharomycessake, Saccharomyces rouxii 또는 Saccharomyces mali-duclaus를약 10 내지 30 브릭스 (brix) 범위, 바람직하게는 15 내지 20 브릭스 (18brix) 범위의대추또는포도즙 (18brix) 에 1-30%(v/v), 바람직하게는 1-10%(v/v) 용량이되도록접종하여 15 내지 50, 바람직하게는, 20 내지 40 온도범위의온도에서 1 일내지 2주일, 바람직하게는 2일내지 6일, 보다바람직하게는 36시간내지 56시간동안정치배양을수행하여알콜발효액의알콜도수가 1 내지 20%, 바람직하게는 2 내지 5% 및당도가약 1 내지 20 브릭스 (18brix) 범위, 바람직하게는 5 내지 10 브릭스에이르도록발효를수행하여식물알콜발효액을수득함을특징으로한다. 또한, 구체적으로, 본원에서정의되는상기초산발효는식물알콜발효액에살균처리하여활성화된유산균, 바람직하게는아세토박터 (Acetobacter) 속균주, 보다바람직하게는, Acetobacter pasteurianus KFC 819(KCTC 10173BP, Acetobacter aceti, Acetobacter oxidans, Acetobacter vini acetati 또는 Acetobacter schutzembachii를접종하여 15 내지 50, 바람직하게는, 20 내지 40 온도범위의온도에서 1 일내지 30일, 바람직하게는 5일내지 15일, 보다바람직하게는 7시간내지 13시간동안정치배양을수행하여초산발효액의초산함량이 1-10%, 바람직하게는 2 내지 7%, 및당도가당도가약 1 내지 20 브릭스 (brix) 범위, 바람직하게는 5 내지 10 브릭스에이르도록발효를수행하여본발명의식물초산발효액을수득함을특징으로한다. 구체적으로, 본원에서정의되는상기포도또는대추원재료는착즙함한포도또는대추착즙물을사용함을특징으로한다. 구체적으로, 본발명의발효액을제조하는방법을설명한다. 예를들어본발명의발효액은세척한포도또는대추원재료를착즙기로착즙하는제 1단계 ; 상기착즙물을 20 내지 40 온도, 바람직하게는 25 내지 35 온도범위의온도에서 1시간내지 7일, 바람직하게는 6시간내지 48시간동안수행하는전배양과 20 내지 40 온도, 바람직하게는 25 내지 35 온도범위의온도에서 1시간내지 7일, 바람직하게는 6시간내지 48시간동안수행하는본배양을거쳐활성화된유산균, 바람직하게는사카로마이세스 (Saccharomyces) 속균주, 보다바람직하게는, Saccharomyces klutveri DJ97, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycescoreanus, Saccharomycessake, Saccharomyces rouxii, 또는 Saccharomyces maliduclaus를약 10 내지 30 브릭스 (brix) 범위, 바람직하게는 15 내지 20 브릭스 (18brix) 범위의대추또는포도 - 6 -
즙 (18brix) 에 1-30%(v/v), 바람직하게는 1-10%(v/v) 용량이되도록접종하여 15 내지 50, 바람직하게는, 20 내지 40 온도범위의온도에서 1 일내지 2주일, 바람직하게는 2일내지 6일, 보다바람직하게는 36시간내지 56시간동안정치배양을수행하여알콜발효액의알콜도수가 1 내지 20%, 바람직하게는 2 내지 5% 및당도가약 1 내지 20 브릭스 (18brix) 범위, 바람직하게는 5 내지 10 브릭스에이르도록발효를수행하여식물알콜발효액을수득하는제 2단계 ; 선택적으로, 상기식물알콜발효액에 30 내지 100, 바람직하게는, 70 내지 90 온도범위의온도에서 1 분내지 1시간, 바람직하게는 5분내지 30분간살균처리하여활성화된유산균, 바람직하게는아세토박터 (Acetobacter) 속균주, 보다바람직하게는, Acetobacter pasteurianus KFC 819(KCTC 10173BP, Acetobacter aceti, Acetobacter oxidans, Acetobacter vini acetati, 또는 Acetobacter schutzembachii를접종하여 15 내지 50, 바람직하게는, 20 내지 40 온도범위의온도에서 1 일내지 30일, 바람직하게는 5일내지 15일, 보다바람직하게는 7시간내지 13시간동안정치배양을수행하여초산발효액의초산함량이 1-10%, 바람직하게는 2 내지 7%, 및당도가당도가약 1 내지 20 브릭스 (brix) 범위, 바람직하게는 5 내지 10 브릭스에이르도록발효를수행하여본발명의식물초산발효액을수득하는단계를통하여본발명의대추또는포도발효액을수득할수있다. [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] 본발명은상기의제조방법으로수득한발효액을유효성분으로함유하는항산화항염증, 미백및주름억제효과를갖는화장료조성물을제공한다. 상기추출방법에의해얻어진발효액은강력한항산화, 항염증, 미백및주름억제효과를나타냈음을확인할수있었다. 상기화장료조성물은헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스또는헤어스프레이의제형을포함한다. 본발명의항산화, 항염증, 미백및주름억제효과를갖는조성물은, 조성물총중량에대하여상기발효액을 0.00001 내지 50% 중량 %(w/w), 바람직하게는, 0.0001 내지 20% 중량 %(w/w), 보다바람직하게는 0.1 내지 10% 중량 %(w/w) 으로포함한다. 그러나상기와같은조성은반드시이에한정되는것은아니고, 환자의상태및진행정도에따라변할수있다. 본발명의조성물은항산화, 항염증, 미백및주름억제효과를갖는화장품에다양하게이용될수있다. 본조성물을첨가할수있는제품으로는, 예를들어, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스또는헤어스프레이등과같은화장품류등이있다. 본발명의화장료는수용성비타민, 유용성비타민, 고분자펩티드, 고분자다당, 스핑고지질및해초엑기스로이루어진군에서선택된조성물을포함한다. 수용성비타민으로서는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을들수있으며, 그들의염 ( 티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염등 ) 이나유도체 ( 아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염등 ) 도본발명에서사용할수있는수용성비타민에포함된다. 수용성비타민은미생물변환법, 미생물의배양물로부터의정제법, 효소법또는화학합성법등의통상의방법에의해수득할수있다. 유용성비타민으로서는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(d1-알파토코페롤, d-알파토코페롤, d-알파토코페롤 ) 등을들수있으며, 그들의유도체 ( 팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파토코페롤, 니코틴산 dl-알파토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르등 ) 등도본발명에서사용되는유용성비타민에포함된다. 유용성비타민은미생물변환법, 미생물의배양물로부터의정제법, 효소또는화학합성법등의통상의방법에의해취득할수있다. - 7 -
[0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] 고분자펩티드로서는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는콜라겐, 가수분해콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수분해엘라스틴, 케라틴등을들수있다. 고분자펩티드는미생물의배양액으로부터의정제법, 효소법또는화학합성법등의통상의방법에의해정제취득할수있으며, 또는통상돼지나소등의진피, 누에의견섬유등의천연물로부터정제하여사용할수있다. 고분자다당으로서는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴황산또는그염 ( 나트륨염등 ) 등을들수있다. 예를들어, 콘드로이틴황산또는그염등은통상포유동물이나어류로부터정제하여사용할수있다. 스핑고지질로서는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질등을들수있다. 스핑고지질은통상포유류, 어류, 패류, 효모또는식물등으로부터통상의방법에의해정제하거나화학합성법에의해취득할수있다. 해초엑기스로는화장품에배합가능한것이라면어떠한것이라도되지만, 바람직하게는갈조엑기스, 홍조엑기스, 녹조엑기스등을들수있으며, 또, 이들의해초엑기스로부터정제된칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨등도본발명에서사용되는해초엑기스에포함된다. 해초엑기스는해초로부터통상의방법에의해정제하여취득할수있다. 본발명의화장료에는상기필수성분과더불어필요에따라통상화장료에배합되는다른성분을배합해도된다. 이외에첨가해도되는배합성분으로서는유지성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면활성제, 유기및무기안료, 유기분체, 자외선흡수제, 방부제, 살균제, 산화방지제, 식물추출물, ph 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행촉진제, 냉감제, 제한 ( 制汗 ) 제, 정제수등을들수있다. 유지성분으로서는에스테르계유지, 탄화수소계유지, 실리콘계유지, 불소계유지, 동물유지, 식물유지등을들수있다. 에스테르계유지로서는트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리 ( 카프릴, 카프린산 ) 글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디 ( 카프릴, 카프린산 ) 프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴등의에스테르계등을들수있다. 탄화수소계유지로서는스쿠알렌, 유동파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린등의탄화수소계유지등을들수있다. 실리콘계유지로서는폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테 - 8 -
알록시실록산공중합체, 알킬변성실리콘유, 아미노변성실리콘유등을들수있다. [0048] [0049] 불소계유지로서는퍼플루오로폴리에테르등을들수있다. 동물또는식물유지로서는아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인 ( 杏仁 ) 유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지 ( 牛脂 ), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상라놀린, 경화피마자유등의동물또는식물유지를들수있다. [0050] 있다. 보습제로서는수용성저분자보습제, 지용성분자보습제, 수용성고분자, 지용성고분자등을들수 [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] 수용성저분자보습제로서는세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B( 중합도 n = 2 이상 ), 폴리프로필렌글리콜 ( 중합도 n = 2 이상 ), 폴리글리세린B( 중합도 n = 2 이상 ), 락트산, 락트산염등을들수있다. 지용성저분자보습제로서는콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르등을들수있다. 수용성고분자로서는카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성키틴, 키토산, 덱스트린등을들수있다. 지용성고분자로서는폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자실리콘등을들수있다. 에몰리엔트제로서는장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르등을들수있다. 계면활성제로서는비이온성계면활성제, 음이온성계면활성제, 양이온성계면활성제, 양성계면활성제등을들수있다. 비이온성계면활성제로서는자기유화형모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE( 폴리옥시에틸렌 ) 솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP( 폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌 ) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질등을들수있다. 음이온성계면활성제로서는지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화가수분해콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르등을들수있다. 양이온성계면활성제로서는염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린유도체제 4급암모늄염등을들수있다. 양성계면활성제로서는카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린유도체형, 아미드아민형등의양성계면활성제등을들수있다. 유기및무기안료로서는규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민및이들의복합체등의무기안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지등의유기안료및이들의무기안료와유기안료의복합안료등을들수있다. - 9 -
[0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] [0074] [0075] 유기분체로서는스테아르산칼슘등의금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘등의알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘등의아실아미노산다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘등의아미드술폰산다가금속염 ; N- 엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파 -아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산등의알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌공중합체, 사불화에틸렌등을들수있다. 자외선흡수제로서는파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산및그염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-( 카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시 )-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐 ) 벤조트리아졸등을들수있다. 살균제로서는히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산등을들수있다. 산화방지제로서는부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산등을들수있다. ph 조정제로서는시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨등을들수있다. 알코올로서는세틸알코올등의고급알코올을들수있다. 또한, 이외에첨가해도되는배합성분은이에한정되는것은아니며, 상기어느성분도본발명의목적및효과를손상시키지않는범위내에서배합가능하지만, 총중량에대하여바람직하게는 0.01 내지 5 % 중량백분율, 보다바람직하게는 0.01 내지 3 % 중량백분율로배합된다. 본발명의화장료는용액, 유화물, 점성형혼합물등의형상을취할수있다. 본발명의화장료조성물에포함되는성분은유효성분으로서상기발효액이외에화장료조성물에통상적으로이용되는성분들을포함할수있으며, 예를들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료및향료와같은통상적인보조제및담체를포함한다. 본발명의화장료조성물은당업계에서통상적으로제조되는어떠한제형으로도제조될수있으며, 예를들어유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액, 모발화장료등을들수있다. 본발명의제형이페이스트, 크림또는겔인경우에는담체성분으로서동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크또는산화아연등이이용될수있다. 본발명의제형이파우더또는스프레이인경우에는담체성분으로서락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄히드록시드, 칼슘실리케이트또는폴리아미드파우더가이용될수있고, 특히스프레이인경우에는추가적으로클로로플루오로히드로카본, 프로판 / 부탄또는디메틸에테르와같은추진체를포함할수있다. 본발명의제형이용액또는유탁액의경우에는담체성분으로서용매, 용매화제또는유탁화제가이용되고, 예컨대물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸아세테이트, 벤질알코올, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜오일, 글리세롤지방족에스테르, 폴리에틸렌글리콜또는소르비탄의지방산에스테르가있다. 본발명의제형이현탁액인경우에는담체성분으로서물, 에탄올또는프로필렌글리콜과같은액상희석제, 에톡실화이소스테아릴알코올, 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르및폴리옥시에틸렌소르비탄에스테르와같은현탁제, 미소결정성셀룰로오스, 알루미늄메타히드록시드, 벤토나이트, 아가또는트라칸트등이이용될수있다. - 10 -
[0076] 본발명의제형이계면-활성제함유클린징인경우에는담체성분으로서지방족알코올설페이트, 지방족알코올에테르설페이트, 설포숙신산모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산아미드에테르설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족알코올, 지방산글리세리드, 지방산디에탄올아미드, 식물성유, 리놀린유도체또는에톡실화글리세롤지방산에스테르등이이용될수있다. [0077] 발명의효과본발명의대추또는포도발효액을함유하는항산화, 항염증, 미백및주름억제효과를갖는조성물은인체에대한부작용이나독성이없으며, 항산화, 항염증, 미백및주름억제효과를나타내, 항산화, 항염증, 미백및주름억제효과를나타내는화장료조성물로유용하게이용할수있다. 도면의간단한설명 [0078] 도 1 는알콜발효액시료들의전자공여능측정결과를나타낸도이며 ( JEF : 대추알콜발효액 ; GEF : 포도알콜발효액 ; Vit.C : 아스코르빈산을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를 기록함 ); 도 2 는초산발효액시료들의전자공여능측정결과를나타낸도이며 ( JAF : 대추초산발효액 ; GAF : 포도초산발효액 ; Vit.C : 아스코르빈산을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를 기록함 ); 도 3는알콜발효액시료들의 ABTS 소거활성측정결과를나타낸도이며 ( JEF : 대추알콜발효액 ; GEF : 포도알콜발효액 ; Vit.C : 아스코르빈산을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3중데이터를기록 함 ); 도 4는초산발효액시료들의 ABTS 소거활성측정결과를나타낸도이며 ( JAF : 대추초산발효액 ; GAF : 포도초산발효액 ; Vit.C : 아스코르빈산을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를 기록함 ); 도 5 는알콜발효액시료들의수퍼옥시드음이온소거활성측정결과를나타낸도이며 ( JEF : 대추알콜발 효액 ; GEF : 포도알콜발효액 ; Vit.C : 아스코르빈산을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를기록함 ); 도 6 는초산발효액시료들의수퍼옥시드음이온소거활성를나타낸도이며 ( JAF : 대추초산발효액 ; GAF : 포도초산발효액 ; Vit.C : 아스코르빈산을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이 터를기록함 ); 도 7 는알콜발효액시료들의수렴활성측정결과를나타낸도이며 ( JEF : 대추알콜발효액 ; GEF : 포도알콜발효액 ; TA : 탄닌산을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를기록함 ); 도 8 는초산발효액시료들의수렴활성를나타낸도이며 ( JAF : 대추초산발효액 ; GAF : 포도초 산발효액 ; TA : 탄닌산을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를기록함 ); 도 9 는알콜발효액시료들의엘라스타제저해활성측정결과를나타낸도이며 ( JEF : 대추알콜발효액 ; GEF : 포도알콜발효액 ; ADE : 아데노신 (adenosine) 을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중 데이터를기록함 ); 도 10 는초산발효액시료들의엘라스타제저해활성측정결과를나타낸도이며 ( JAF : 대추초산발효 액 ; GAF : 포도초산발효액 ; ADE : 아데노신 (adenosine) 을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를기록함 ); - 11 -
도 11 는대추알콜발효액시료들의세포독성비율결과를나타낸도이며 ( RAW : 대식세포 (RAW 264.7); HS-68 : 섬유아세포 (HS-68); B16F10 : 멜라노마세포 (B16F10) 을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를기록함 ); 도 12 는포도알콜발효액시료들의세포독성비율결과를나타낸도이며 ( RAW : 대식세포 (RAW 264.7); HS-68 : 섬유아세포 (HS-68); B16F10 : 멜라노마세포 (B16F10) 을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를기록함 ); 도 13 는대추초산발효액시료들의세포독성비율결과를나타낸도이며 ( RAW : 대식세포 (RAW 264.7); HS-68 : 섬유아세포 (HS-68); B16F10 : 멜라노마세포 (B16F10) 을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를기록함 ); 도 14 는포도초산발효액시료들의세포독성비율결과를나타낸도이다 ( RAW : 대식세포 (RAW 264.7); HS-68 : 섬유아세포 (HS-68); B16F10 : 멜라노마세포 (B16F10) 을의미하며, 결과는평균 (means) ± S.D. 3 중데이터를기록함 ). [0079] [0080] 발명을실시하기위한구체적인내용이하, 본발명을하기의실시예및실험예에의해상세히설명한다. 단, 하기실시예및실험예는본발명을예시하는것일뿐, 본발명의내용이하기실시예및실험예에의해한정되는것은아니다. [0081] [0082] [0083] 실시예 1. 식물발효액의제조 1-1. 식물액의제조경상북도경산시자인면에서생산되는대추및포도를각각 1kg을착즙기를이용하여착즙하여 18brix 당도의대추및포도착즙액 200ml를 ( 이하, 각각 JJ 및 GJ" 라함 ) 수득하여하기실험예의시료로사용하였다 [0084] [0085] 1-2. 식물알콜발효액의제조전배양 (30 에서 1일간 ) 과본배양 (30 에서 1일간 ) 을거쳐활성화된 Saccharomyces klutveri DJ97(KCTC 8842P) 를상기 1-1 단계에서얻은대추및포도착즙액 (18brix) 에 5% 용량 (S. klutveri DJ97 배양액 10ml) 이되도록접종하여 30 에서 4일간정치배양하면서알콜발효를하면서자연적으로생성된알콜의발효를수행하여알콜발효액이알콜도수가 3~4% 및 8~9brix에이르도록발효를수행하여대추및포도알콜발효액 ( 이하, 각각 JEF 및 GEF" 라함 ) 를수득하고이를하기실험예의시료로사용하였다. [0086] [0087] 1-3. 식물초산발효액의제조상기 1-2 단계에서수득한식물알콜발효액에살균처리하여 (70 내지 90 에서 5 내지 30분간살균 ) 활성화된 Acetobacter pasteurianus KFC 819(KCTC 10173BP, 배양액 10ml) 를접종하여 30 에서 10일간정치배양하여자연적으로생성된초산의함량이 3~4% 및 7~8brix에이르도록발효를수행하여대추및포도초산발효액 ( 이하, 각각 JAF 및 GAF" 라함 ) 를수득하고이를하기실험예의시료로사용하였다. [0088] [0089] [0090] 참고예 1. 시약및기기 1-1. 항산화능, 수렴효과및항염증측정시약항산화능과항염증측정실험에사용된시약인 1-1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl(DPPH), xanthine, xanthine oxidase, nitro blue tetrazolium(nbt) 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 에서구입하 - 12 -
여사용하였다. [0091] [0092] 1-2. 항균력측정에사용된균주및배지항균력검색실험에서사용한공시균주는피부상재균으로서 Staphylococcus aureus KCTC 1621, Staphylococcus epidermidis KCTC 1917, Escherichia coli KCTC 1039 및여드름유발균으로서 Propionibacterium acnes KCTC 3314를계대배양하여사용하였다. 전배양및본배양을위한액체배지는 nutrient broth (NB), tryptic soy broth (TSB) 를 Difco Lab. (Sparks, MD., U.S.A) 및 Gifu anaerobic medium(gam, Nissui Co. Japan) 를구입하여사용하였으며, 생육저해환측정을위한고체배지는상기액체배지에 agar를첨가하여본실험에사용하였다. [0093] [0094] 1-3. 미백및주름억제효과측정시약 미백및주름억제효과측정에사용된시약인 mushroom tyrosinase, L-3,4-dihydroxyphenyl-alanine(L- DOPA), porcine pancreas elastase(ppe), N- succinyl-(l-ala) 3 -p-nitroanilide, collagenase 및 4- phenylazobenzyloxycarbonyl- Pro-Leu-Gly-Pro-D-Arg 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 에서구 입하여사용하였으며, immunofluorecense 측정에사용된 c-fos, MMP-3, FGF-2, tyrosinase, MITF primary antibody 와 goat anti-mouse IgG secondary antibody 는 Santacruz(CA, USA) 에서구입하여사용하였다. [0095] [0096] [0097] [0098] 1-4. 세포생존율측정에사용된세포주및시약세포독성에측정에사용된세포주는 melanoma 세포인 B16F10과 fibroblast 세포인 HS-68, macrophage 세포인 RAW 264.7을 Korean Cell Line Bank(KCLB) 에서구입하여사용하였다. 세포독성측정시약은 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), fetal bovine serum(fbs), penicillin/streptomycin, trypsin 250, 0.4% trypan blue stain은 Gibco BRL Co.(Grand Island, USA) 및 Haemacytometer(Marienfeld, Germany) 에서구입하여사용하였으며, 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium -bromide(mtt) 는 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO, USA) 에서구입하여사용하였다. 1-5. 실험에사용된기기생리활성실험에사용된기기는 UV/VIS spectrophotometer(hitachi, Japan), rotary vacuum evaporator(tokyo, Rikakikai Co. Japan), centri- fuge(hitachi, Japan), freeze drier(ilsin, Korea), microscope(olympus, Japan), CO 2 incubator(hanbaek Scientific Co. Korea), BOD incubator (Hanbaek Co. Korea), autoclave(hanbaek Scientific Co. Korea), ELISA reader(bio Rad, Japan) 를사용하였다. [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] 실험예 1. 항산화효과실험상기실시예에서수득한시료들의항산화효과를확인하기위하여하기와같이실험을실시하였다. 1-1. 전자공여능측정상기실시예에서수득한시료들의전자공여능 (EDA: electron donating ability) 에대한효과를확인하기위하여하기와같이문헌에기재된방법을이용하여하기와같이실험을실시하였다 (Blois MS. Antioxidant determination by the use of a stable free radical.aster glehni. 1958;26:1199-1120). 각시료용액 2mL에 0.2mM의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 1mL 넣고교반한후 30분간방치한다음 517nm에서흡광도를측정하였다. 전자공여능은하기수학식 1을이용하여시료용액의첨가군과무첨가군의흡광도감소율로나타내었다. 수학식 1 [0104] [0105] 대추및포도의발효액들의전자공여능을측정한결과를도 1 및 2 에나타내었다. 대추의알콜발효는 5000ppm - 13 -
에서 58% 를나타내어발효액중가장높은전자공여능을나타내었으며, 대추의초산발효의경우 55%, 포도의 알콜발효액은 37%, 포도의초산발효액은 32% 의전자공여능을나타내었다. 따라서알콜발효액과초산발효액비 교시알콜발효액이높은전자공여능을나타내었다. [0106] [0107] 1-2. ABTS 측정 ABTS radical을이용한항산화력측정은 ABTS+ cation decolorization assay 방법에의하여측정하였다. (2. Roberta R., Nicoletta P., Anna P., Ananth P., Min Y and Catherine R.E. Antioxidant acitivity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free radical biology & Medicine, 1999. 26(9/10):1231-1237). [0108] 7mM 2,2-azino-bis (3-ethyl-benthiazoline-6-sulfonic acid) 와 2.4mM potassium persulfate 를혼합하여 실온에서 24 시간동안방치하여 ABTS+ 를형성시킨후 ethanol 로희석하여 ABTS+ 100uL 에시료 100μL 를가하여 1 분동안방치한후 732nm 에서흡광도를측정하고하기수학식 2 을이용하여소거능을계산하였다. 수학식 2 [0109] [0110] [0111] 이러한 ABTS 소거능을측정한결과도 3 및 4 과같이나타내었다. 포도의알콜및초산발효액의경우 1000ppm 에서 24%, 18% 의 ABTS 소거능을나타낸반면, 대추의발효액중초산발효의경우 1000ppm에서 39% 를나타내었으며, 알콜발효는 58% 의소거능을나타내어발효액중가장높은소거능을나타내었다. 이와같은항산화결과로미루어보아대추와포도의알콜발효와초산발효액을비교시알콜발효액이보다높은항산화활성을나타내었으며, 대추의발효액이포도의발효액보다높은활성을나타내었다. [0112] [0113] [0114] 1-3. Superoxide anion radical 소거능측정 Superoxide anion radical소거능은 nitrobule tetrazolium(nbt) 환원방법에의해측정하였다. (3. Marklund S, Marklund G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 1974;47(3):469-474.) 각시료용액 0.1mL와 0.1M potassium phosphate buffer(ph 7.5) 0.4mL에 xanthine(0.4mm) 을녹인기질액 0.4mL과 NBT(0.24mM) 를첨가하고 xanthine oxidase (0.2U/mL) 0.1mL를가하여 37 에서 15분간반응시킨후 1N HCl 1mL를가하여반응을종료시킨다음, 반응액중에생성된 Superoxide anion radical의양을 560nm에서흡광도를측정하고저해능을하기수학식 3을이용하여계산하였다. 수학식 3 [0115] [0116] NBT(Superoxide anion radical) 소거능측정은 xanthine oxidase 가 Xanthine 을기질로하여 uric acid 를생성 하는과정에서생성되는 Superoxide anion radical 을발효액과반응시켜소거능을확인하는방법이다. 이러한 피부노화방지와밀접한관련이있는 superoxide anion radical 소거능측정결과를도 5 및 6 와같이나타내었 다. 먼저대추의알콜발효액이 5000ppm 에서 76%, 초산발효액이 69% 로높은소거능을나타었으며, 포도의알콜 - 14 -
및초산발효액은각각 61%, 57% 의소거능을나타내어대추의알콜발효액이가장높은소거능을나타내었다. [0117] [0118] [0119] 실험예 2. 수렴효과실험상기실시예에서수득한시료들의수렴효과를확인하기위하여하기와같이실험을실시하였다 (JT Lee, YS Jeong, BJ An. Physiological activity of Salicornia herbacea and its application for cosmetic materials.aster glehni 2002;17(2):51-60.) 피부단백질과유사한혈액단백질 (hemoglobin) 을사용하여, 원심분리관용기에각각의시료용액과헤모글로빈용액을 1:1로넣어서진탕혼합한다음 1,500rpm에서 3분간원심분리후 576nm에서흡광도를측정하였다. Astringent 활성측정은시료용액의첨가군와무첨가군의흡광도감소율로나타내고하기수학식 4 을이용하여활성능을계산하였다. 수학식 4 [0120] [0121] 페놀성화합물과단백질과의상호작용은피부의단백질분해효소나히아루론산가수분해효소와도결합함으로서이들효소의작용을저해하고피부단백질손상을억제할수있다. 대추및포도발효액들의수렴효과측정인 astringent 활성측정결과도 7 및 8와같이나타내었다. 대추알콜발효액의경우 5,000ppm에서 20%, 초산발효액의경우 34% 로가장높은수렴효과를나타내었으며, 포도의알콜및초산발효액은각각 29% 이상의수렴효과를나타내었다. [0122] [0123] [0124] [0125] 실험예 3. 주름개선효과측정실험상기실시예에서수득한시료들의주름개선효과를확인하기위하여하기와같이실험을실시하였다. 3-1. Elastase 저해활성측정 Elastase 저해활성측정은 Cannell 등의방법에따라측정하였다. (Cannell RJP, Kellan SJ, Owsianks AM, Walker JM. Results of a large scale screen of microalgae for the production of protease inhibitors. Planta Med. 1988;54(1):10-14). [0126] 기질로서 N-succinyl-(L-Ala) 3 -p-nitroanilide 를사용하여 37 에서 20 분간기질로부터생성되는 p- nitroanilide의생성량을 445nm에서측정하였다. 즉, 각시험용액을일정농도가되도록조제하여 500μL씩시험관에취하고, 50mM tris-hcl buffer (ph8.6) 에녹인 porcine pancreas elastase(2.5u/ml) 용액 500μL을가한후기질로 50mM tris-hcl buffer(ph8.6) 에녹인 N-succinyl-(L-Ala) 3 -p-nitroanilide (500μg/mL) 을첨가하여 20분간반응시켜측정하였다. Elastase 저해활성은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내고저해율을하기수학식 5을이용하여계산하였다. 수학식 5 [0127] [0128] 대추및포도의발효액들의주름개선효과측정인 elastase 저해활성을측정한결과도 9 및 10 과같이나타 - 15 -
내었다. 대추및포도의알콜발효액은 1000ppm 에서 10% 이하의저해능을나타내었다. 포도의초산발효액은 5,000ppm 에서 13% 의저해능을나타내었으나, 대추의초산발효액의경우 5,000ppm 에서 37% 의 elastase 저해능을 나타내어같은농도에서의대조군인 adenosine( 제품번호, 제조사?) 보다높은효과를나타내었다. [0129] [0130] [0131] 3-2. Collagenase 저해활성측정 Collagenase 저해활성측정은 W등의방법에따라측정하였다.(WE, Heindrich HG. Zur quantitativen bestimmung der collagenase. Hoppe-Seyler's. Physiol. Chem. 1963;333:149-151.) 즉반응구는 0.1Mtris-HClbuffer(pH7.5) 에 4mMCaCl 2 를첨가하여,4-phenylazo-benzyloxy-carbonyl-Pro-Leu- Gly-Pro-D-Arg(300μg/mL) 를녹인기질액 250μL 및시료용액 100μL의혼합액에 collagenase (200μg /ml) 150μL를첨가하여실온에서 20분간방치한후 6%citric acid 500μL을넣어반응을정지시킨후, ethyl acetate 1.5mL을첨가하여 320nm에서흡광도를측정하였다. Collagenase 저해활성은시료용액의첨가구와무첨가구의흡광도감소율로나타내고저해율을하기수학식 6을이용하여계산하였다. 수학식 6 [0132] [0133] 대추및포도발효액들의 collagenase 저해활성을측정한결과를도 9 및 10 에나타냈다. 대추및포도의알 콜발효액의경우 5000ppm 에서 10% 이상의저해능을나타내었으며, 초산발효액의경우대추가 15%, 포도가 11% 의저해능을나타내었다. [0134] [0135] [0136] [0137] 실험예 4. MTT assay에의한세포생존율측정실험상기실시예에서수득한시료들의 MTT assay에의한세포생존율효과를확인하기위하여하기와같이실험을실시하였다. 4-1. 세포배양본실험에이용한세포의배양은 10% fetal bovine serum (FBS) 과 1% penicillin (100U/mL) 을첨가한 Dulbeco's modified eagle s medium (DMEM) 배지를사용하였으며, 37, 5% CO 2 incubator에적응시켜계대 배양하였다. [0138] [0139] [0140] 4-2. 세포의독성측정세포독성측정은 Carmichael 등의방법에따라측정하였다 (Carmichael J, DeGraff WG, Gazdar AF, Minna JD, Mitchell JB. Evaluation of a tetrazolium based semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Aster glehni. 1987; 47(4):936-942.). B16F10 melanoma 세포를 96 well plate에 0.6~0.8 10 3 cells/well이되게 180μL 분주하고, 시료를농도별로조제하여 20μL 첨가한후 37, 5% CO 2 incubator에서 24시간배양하였다. 대조군은시료와동량의증류 수를첨가하여동일한조건으로배양하였다. 여기에 5mg/mL 농도로제조한 MTT 용액 20μL를첨가하여 4시간배양한후배양액을제거하고각 well당 DMSO : EtOH (1:1) 150μL를가하여실온에서 30분간반응시킨뒤 ELISA reader로 550nm에서흡광도를측정하였다. 세포독성측정은시료용액의첨가군와무첨가군의흡광도감소율로나타내고세포생존율 (Cell viability) 을하기수학식 7을이용하여계산하였다. - 16 -
수학식 7 [0141] [0142] 세포의증식에미치는영향에대해알아보기하여 10 50, 100, 500, 1000, 5000ppm으로 48시간동안처리하였다. 세포의생존율을확인한결과발효액모두 1000ppm에서는 90% 이상의세포생존율을나타내었으며, 5000ppm에서는초산발효액이알콜발효액보다세포독성이적게나타남을확인하였다 ( 도 11-14). 이와같은결과로 Nitric oxide(no) 측정과 Immunofluorecence 측정은 1000ppm이하의농도에서실험하였다. [0143] [0144] 이하, 본발명의제형예로서크림, 맛사지크림, 로션, 스킨로션, 에센스, 팩, 클렌징폼의제형을예시하고 있으나, 본발명의화장품조성물을포함하는제형은이에한정되는것은아니다. [0145] [0146] 제형예 1. 크림조성물 유상과수상을각각 75 로가열혼합한후실온으로냉각한다. [0147] [0148] 제형예 2. 맛사지크림조성물 - 17 -
[0149] 유상과수상을각각 75 로가열용해혼합한후실온으로냉각한다. [0150] [0151] [0152] 제형예 3. 로션조성물 유상과수상을각각 75 로가열혼합유화한후실온으로냉각한다. [0153] [0154] [0155] 제형예 4. 스킨로션조성물 수상과에탄올상을각각제조혼합한후여과한다. [0156] [0157] 제형예 5. 에센스조성물 - 18 -
[0158] 수상과에탄올상을각각제조혼합한후여과한다. [0159] [0160] [0161] 제형예 6. 팩조성물 수상과에탄올상을각각분산용해하여혼합시킨후실온으로냉각한다. [0162] [0163] [0164] 제형예 7. 클렌징폼조성물 수상과오일상을각각분산용해하여혼합검화한후실온으로냉각한다. [0165] - 19 -
도면 도면 1 도면 2 도면 3-20 -
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