(51) Int. Cl. C12N 15/82 (2006.01) C12N 15/63 (2006.01) C12N 5/04 (2006.01) (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 10-2006-0023809 2006 년 03 월 15 일 (21) 출원번호 10-2004-0072687 (22) 출원일자 2004년09월10일 (71) 출원인재단법인서울대학교산학협력재단서울특별시관악구봉천동산 4-2 (72) 발명자김민균서울특별시관악구봉천 5 동 1712 관악드림타운아파트 130 동 1204 호이사미서울특별시영등포구양평동 2 가벽산아파트 102 동 1308 호정현섭서울특별시종로구연건동 296-16 강경수울산광역시울주군상북면향산리 487 유순희서울특별시관악구신림동서울대학교관악사가족생활동 934 동 405 호 (74) 대리인김석현 심사청구 : 있음 (54) 식물의색소체형질전환방법 요약 본발명은식물의색소체형질전환방법에관한것이다. 보다구체적으로, 본발명은식물로부터유도된캘러스를색소체형질전환용벡터로형질전환하는것을특징으로하는식물의색소체형질전환방법에관한것이다. 본발명에따른방법은형질전환체가성체로발달하여도형질전환된색소체가소멸되지않으며색소체에이식된유전자가다음세대로전달되는효과가있다. 대표도 도 9 색인어 색소체, 형질전환, 식물, 캘러스 명세서 도면의간단한설명 - 1 -
도 1a 는 sgfp 유전자포함되지않은본발명에따른색소체형질전환용벡터 pld-rctv 의제조과정을나타낸모식도이다. 도 1b 는본발명에따른색소체형질전환용벡터 pld-rctv-sgfp 의모식도이다. 도 1c 는본발명에따른색소체형질전환용벡터와천연의색소체게놈간의상동재조합과정을나타낸모식도이다. 도 2a 는벼의캘러스를스트렙토마이신이각각다른농도로첨가된 MS(Murachige and Skoog) 배지에치상하고광조건하에서배양한것이다. a: 스트렙토마이신 0mg/L 첨가 b: 스트렙토마이신 100mg/L 첨가 c: 스트렙토마이신 200mg/L 첨가 도 2b 는벼의캘러스를스트렙토마이신이각각다른농도로첨가된 MS 배지에치상하고암조건하에서배양한것이다. a: 스트렙토마이신 0mg/L 첨가 b: 스트렙토마이신 500mg/L 첨가 c: 스트렙토마이신 1000mg/L 첨가 도 3a 는본발명의방법에따라벼의캘러스를색소체형질전환용벡터로형질전환하고스트렙토마이신이첨가된선별배지에서배양한경우스트렙토마이신에저항성을나타내는캘러스에서신초 (shoot) 가유도된사진이다. 도 3b 는본발명의방법에따라벼의캘러스를색소체형질전환용벡터로형질전환하고스트렙토마이신이첨가된선별배지에서선별하고재분화함으로써수득한형질전환체를나타낸사진이다. 도 4 는본발명의방법에따라선별된형질전환체를토양에순화시키는경우스트렙토마이신의처리농도에따른영향을나타낸것이다. 도 5a 는본발명의상동재조합에사용된 trni 와 trna 유전자, 선별유전자인 aada 유전자, 목적유전자로사용된 sgfp 유전자의크기를나타낸모식도이다. 도 5b 는본발명의방법에따라형질전환된벼에서 sgfp 유전자가존재하는지를확인하기위하여형질전환된벼의게놈 DNA 를 PCR 증폭하여아가로스겔에서확인한결과이다. 도 6 은본발명의방법에따라형질전환된벼에서 aada 유전자가존재하는지를확인하기위하여형질전환된벼의게놈 DNA 를서던블롯법으로분석한결과이다. 도 7a 는본발명의방법에따라형질전환된벼에서상동재조합부위의왼쪽경계면단편이존재하는지를확인하기위하여벼의게놈 DNA 를 PCR 증폭하여아가로스겔에서확인한결과이다. 도 7b 는본발명의방법에따라형질전환된벼에서상동재조합부위의오른쪽경계면단편이존재하는지를확인하기위하여벼의게놈 DNA 를 PCR 증폭하여아가로스겔에서확인한결과이다. 도 8 은본발명의방법에따라형질전환된벼에서 sgfp 가발현되는지를웨스턴블롯분석법으로확인한결과이다. 도 9 는본발명의방법에따라형질전환된벼를자가수정하여수확한종자를배양함으로써획득한 T1 세대의벼에서 sgfp 가발현됨을공초점형광현미경으로확인한사진이다 ( 연녹색 : sgfp, 붉은색 : 엽록체, 노란색 : sgfp 가엽록체에서발현된부분 ). - 2 -
발명의상세한설명 발명의목적 발명이속하는기술및그분야의종래기술 본발명은식물의색소체형질전환방법에관한것이다. 보다구체적으로, 본발명은식물로부터유도된캘러스를색소체형질전환용벡터로형질전환하는것을특징으로하는식물의색소체형질전환방법에관한것이다. 일반적으로식물의형질전환에사용되는핵형질전환 (nuclear transformation) 기술은이식유전자의낮은발현수준, 유전자의삽입위치에따른발현양의차이 (position effect) 및발현의불안정성 (gene silencing) 등의문제점이있다. 또한, 핵형질전환기술에의해생산된유전자재조합식물체들은형질전환에사용된외래이입유전자가꽃가루를통하여다른유사야생식물종으로전이될수있기때문에심각한생태계문제를야기할수있다. 상기와같은문제점을해결하기위해최근에는색소체형질전환기술이핵형질전환기술의대안으로서주목받고있다. 색소체는광합성을담당하는엽록체 (chloroplast), 꽃및열매의색에관여하는유색체 (chromoplast), 전분저장기능을수행하는전분체 (amyloplast), 색소를포함하지않는백색체 (leucoplast) 및미분화된상태로서상술한색소체들의모체가되는전색소체 (proplastid) 로구분된다. 색소체는자체게놈 (genome) 을가지고있으며모계유전에의하여그유전정보가후대에전달된다. 따라서, 색소체형질전환을이용하면식물에이입된외래유전자가다른식물종으로전이되는것을방지할수있다. 또한, 멘델의유전분리에의한형질전환계통을선발하고유지할필요성이없으며균일한종자를대량으로생산할수있는장점이있다. 나아가, 식물세포에는대략적으로 100 여개의색소체가존재하며각색소체는 10-100 개의게놈을가지고있기때문에각세포당 1,000-10,000 개의카피유전자가존재한다. 따라서, 각세포당 1-2 개의게놈을가지고있는핵을형질전환하는기술에비해색소체를형질전환하는경우이식된유전자의발현수준이월등히높고유전자의안정적인발현을기대할수있다. 또한, 색소체는원핵생물의유전자발현시스템을가지고있어다중유전자의발현이가능한장점이있다. 식물의색소체형질전환은담배에서최초로보고된바있으며, 애기장대 (Sikdar, S. et al., Plant Cell Rep. 18, 20-25, 1998), 감자 (Sidorov. V. et al., Plant J. 19, 209-216, 1999), 토마토 (Ruf, S. et al., Nat. Biotechnol. 19, 870-875, 2001) 및레스쿠에렐라 (Lesquerella)(Skarjinskaia M. et al., Transgenic Res., 12, 115-122, 2003) 를포함하는식물종에서의색소체형질전환이보고된바있다. 한편, 지금까지보고된색소체형질전환에성공한식물들은모두쌍자엽식물에속하는것이며현재까지단자엽식물의색소체형질전환으로는벼의세포현탁을이용한사례가유일하게보고되어있을뿐이다 (Khan M. et al., Nat. Biotechnol, 17, 910-915, 1999). 그러나벼의세포현탁을형질전환대상으로설정하여색소체형질전환된벼는색소체의지극히일부만이형질전환되어형질전환체가성체로발달하는과정에서형질전환된색소체가점차소멸될수있는가능성이있었으며, 특히색소체에이식된유전자가다음세대로전달되지못한단점이있다. 이에본발명자들은효과적인식물의색소체형질전환방법을연구하던중, 식물로부터유도된캘러스를형질전환대상으로선정하여색소체형질전환용벡터로형질전환한결과형질전환체가성체로발달하더라도형질전환된색소체가소멸되지않으며색소체에이식된유전자가다음세대로전달됨을확인함으로써본발명을완성하였다. 발명이이루고자하는기술적과제 따라서, 본발명의목적은식물로부터유도된캘러스를색소체형질전환용벡터로형질전환하는것을특징으로하는식물의색소체형질전환방법을제공하는것이다. 발명의구성및작용 상기와같은목적을달성하기위하여, 본발명은식물로부터유도된캘러스를색소체형질전환용벡터로형질전환하는것을특징으로하는식물의색소체형질전환방법을제공한다. 이하, 본발명을상세히설명한다. - 3 -
본발명의식물의색소체형질전환방법은식물로부터유도된캘러스를색소체형질전환용벡터로형질전환하는것을특징으로한다. 지금까지성공한식물의색소체형질전환은식물의잎조직이나세포현탁을그대상으로하였으나, 본발명은식물로부터유도된캘러스를형질전환대상으로선정하였다는데에특징이있다. 식물의색소체를형질전환하는경우일차적으로색소체의엽육세포에존재하는약 10,000 개의색소체 DNA 카피중소수의색소체게놈카피만이형질전환이되게된다. 따라서, 일차적으로형질전환세포에는야생형과형질전환된색소체가혼합된상태로존재하게된다. 이러한세포, 조직및식물체를이형세포질상태 (heteroplasmy) 라한다. 상기이형세포질상태는일반적으로불안정해서야생형또는형질전환형의둘중하나의상태로게놈이전환되게되는동형세포질상태 (homoplasmy) 를요구하게된다. 따라서, 형질전환된식물의유전적안전성을높이고색소체의모든세포가완전히형질전환된동형세포질상태를유도할필요성이있다. 상기와같은동형세포질상태는높은선별압력하에서충분한세포분열의수에의하여획득될수있다. 이에본발명자들은식물로부터유도된캘러스를형질전환을위한대상으로선정하여색소체형질전환용벡터로형질전환다음선별배지에치상하여높은선별압력하에서재분화시켜충분한세포분열이일어나도록하여동형세포질상태를유도함으로써캘러스가성체로분화되었을때에도형질전환색소체가소멸되지않도록하였다. 구체적으로본발명에따른식물의색소체형질전환방법은 (a) 식물의종자, 조직및세포현탁액으로이루어진그룹중에서선택된어는하나를캘러스유도용배지에서배양하여캘러스를유도하는단계 ; (b) 상기 (a) 단계의식물의캘러스를색소체형질전환용벡터로형질전환하는단계 ; (c) 상기 (b) 단계에서형질전환된캘러스를선별배지에서배양하여형질전환된캘러스를선별하는단계 ; 및 (d) 상기 (c) 단계에서선별된캘러스를발근용배지에서배양하여뿌리를유도하고토양에옮겨순화시키는단계를포함하는것을특징으로한다. 상기 (a) 단계에서식물은특별히한정되지않으며모든종류의식물일수있다. 바람직하게는, 단자엽식물일수있다. 상기단자엽식물의예로는이에한정되지는않으나, 벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마및생강이있다. 바람직하게는, 상기단자엽식물로는벼를사용한다. 상기 (a) 단계에서캘러스를유도하는방법은당업계에공지된통상의방법을사용하여수행될수있다. 바람직하게는, 식물의종자, 조직및세포현탁액으로이루어진그룹중에서선택된어느하나를캘러스유도용배지에서배양한다. 상기식물의조직은잎, 줄기및뿌리의일부분일수있다. 바람직하게는, 식물이단자엽식물인경우에는식물의종자또는세포현탁액으로부터캘러스를유도하며식물이쌍자엽인경우에는조직의일부분으로부터캘러스를유도할수있다. 상기캘러스유도용배지로는 N6 배지, MS(Murashige & Skoog) 배지, WHITE 배지, B5 배지, R2 배지등을사용할수있다. 이때, 식물의종 (species), 식물의나이, 배양종자의숙도등을고려하여배양하고자하는식물에적합한배지를선택하는것이바람직하다. 또한, 상기배지에생장조절제를추가로첨가할수있다. 상기생장조절제로는이에한정되지는않으나, IAA(3-indoleacetic acid), IAld(3-indoleacet aldehyde), IPA(3-indolepyruvic acid), IAN(3-indoleacetonitrile), IAE (ethyl ester of indoleacetic acid) 와같은옥신 (auxin) 및 2,4-D(2,4-dichlorphenoxy acidic acid), NAA (naphthaleneacetic acid) 와같은상기옥신의유도체 ; 및키네틴 (kinetin), BA(benzoic acid), CPPU((N-2-chloro-4- pyridyl)-n'-phenylurea) 와같은사이토키닌 (cytokinin) 및그유도체를포함한다. 바람직한캘러스유도방법은다음과같다. 식물의종자를수득하여탄수화물이나아미노산과같은유기성분, 질소, 인산, 칼륨과같은무기양분및옥신과같은식물호르몬을함유한고체배지에서배양한다음식물종자로부터세포분열이일어나세포의덩어리인캘러스가생성되면배지로부터캘러스를분리하여신선한고체배지위에파종한다. 이후, 일정간격으로계대배양한다. 본발명의바람직한일실시예에서는화청벼종자를 N6 배지에파종한후 28 에서암조건으로 2-3 주간배양하여벼의캘러스를수득하였다 ( 실시예 2 참조 ). 한편, 본발명에서는총캘러스 (total callus) 또는배발생캘러스 (embryogenic callus) 를사용할수있으나바람직하게는배발생캘러스와함께재분화되지않은캘러스를모두포함하는총캘러스를사용한다. 이는본발명의예비실험에서배발생캘러스를사용하는경우에비해총캘러스를사용한경우보다높은재분화효율을나타냈기때문이다 ( 결과미도시 ). - 4 -
상기 (b) 단계에서색소체형질전환용벡터는구입하여사용하거나당업계에공지된방법에따라제조할수있다. 바람직하게는, 상기색소체형질전환용벡터는식물의색소체에존재하는상동재조합부위의왼쪽경계면영역, 선별마커, 목적유전자및상동재조합부위의오른쪽경계면영역을포함하고있는것을특징으로한다. 일반적으로색소체의형질전환은목적유전자를상동재조합 (homologous recombination) 방법에의해색소체게놈의목적부위에삽입함으로써수행된다. 따라서, 색소체형질전환용벡터는색소체게놈으로도입되는부위와동일한색소체게놈서열이목적유전자의양쪽측면에인접하여있다. 상기상동재조합부위의왼쪽경계면영역과오른쪽경계면영역은대상식물에따라달라질수있으며, 공지된식물의색소체게놈서열로부터제조될수있다. 예를들면, 벼, 담배, 옥수수와같은식물의색소체게놈의염기서열은모두공지되어있다. 한편, 상기식물의유전자배열구조는식물간에매우유사한것으로알려져있기때문에상기상동재조합부위는다른식물종간에교차되어사용될수있다. 바람직하게는상동재조합부위로는고등식물체간에높게보존되어있는서열인벼의 trni-trna 영역서열을사용할수있다. 상기선별마커는대상식물의색소체에외래의유전자가도입되었음을확인하는지표가되는유전자를말한다. 상기선별마커로는이에한정되는지는않으나항생제저항성유전자, 제초제저항성유전자, 대사관련유전자, 발광유전자, GFP (green fluorescence protein), GUS(β-glucuronidase) 유전자, GAL(β-galactosidase) 유전자등이사용될수있다. 바람직하게는, 항생제저항성유전자를사용한다. 상기항생제저항성유전자로는이에한정되지는않으나, 스트렙토마이신과스펙티노마이신저항성유전자인 aada(svab Z. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917, 1993), 가나마이신저항성유전자인 neo(kuroda H. et al., Plant Physiol. 125, 430-436, 2001; Kuroda H. et al., Nucleic Acids Res. 29, 970-975, 2001)) 및 apha-6(huang FC et al., Mol. Genet. Genom. 268, 19-27, 2002) 이있다. 상기목적유전자로는특별히한정되지않으며식물의색소체에도입하여식물이유용한형질을수득할수있도록하는것이라면모두사용할수있다. 상기목적유전자는공지된서열로부터당분야에공지된방법에의해재조합함으로써수득하거나상기유전자를포함하는플라스미드를상업적으로구입함으로써수득할수있다. 상기식물의색소체형질전환용벡터는상술한유전자외에유전자의발현을조절할수있는조절서열을추가로포함할수있다. 예를들면, 유전자의전사를개시하는프로모터및전사를종결하는터미네이터서열을추가로포함할수있다. 본발명의일실시예에서는상동재조합벼의게놈 DNA 로부터상동재조합부위의왼쪽경계면영역으로벼의 trni 유전자, 색소체 rrna 프로모터인 Prrn, 항생제저항성유전자인 aada 유전자, 목적유전자로사용한 sgfp 유전자, psba 터미네이터및상동재조합부위의오른쪽경계면영역으로벼의 trna 유전자가순차적으로연결되도록벼색소체형질전환용벡터를제조하였다 ( 실시예 1 및도 1 참조 ). 상기목적유전자로 sgfp(green fluorescent protein) 를사용한것은벼의색소체형질전환여부를시각적으로확인하기위한것이다. 상기 (b) 단계에서색소체형질전환용벡터를이용한캘러스의형질전환은당업계에공지된방법을사용하여수행될수있다. 예를들면, 이에한정되지는않으나입자충격법 (particle bombardment), PEG(polyethylene glycerol) 처리법, 전기천공법및미세주사법 (microinjection) 을사용할수있다. 바람직하게는, 입자충격법을사용할수있다. 한편, 본발명은상기 (b) 단계에서캘러스를형질전환한다음형질전환체의선별단계를거치기전에항생제가포함되지않은배지에서암조건으로일정기간배양하는단계를추가로포함할수있다. 상기단계는형질전환과정시손상된세포들이회복되도록하는단계이다. 바람직하게는, 본발명은상기 (b) 단계에서형질전환된캘러스를항생제가포함되지않고생장조절제가첨가된 MS 또는 N6 배지에서암조건으로 25 30 하에서 1 3 일간배양하는단계를추가로포함할수있다. 상기 (c) 단계에서형질전환된캘러스의선별은상기캘러스를선별배지에배양하여성장하는캘러스만을선택적으로선별함으로써수행될수있다. 상기선별배지는캘러스의선별마커에따라다양할수있다. 예를들어, 선별마커를항생제저항성유전자를사용한경우에는항생제가포함된배지를선별배지로서사용할수있다. 한편, 상기캘러스의선별단계를다단계로수행하여형질전환체의동형세포질 (homoplasmy) 형태를유도할수있다. 바람직하게는형질전환된캘러스의선별은상기 (b) 단계에서형질전환된캘러스를 100 500mg/L 의항생제가포함된배지에서광조건으로배양하여항생제저항성을나타내는캘러스를일차적으로선별한다음이를다시 300 500mg/L 의항생제가포함된배지에옮겨서배양하여항생제저항성을나타내는캘러스를이차적으로선별함으로써수행될수있다. 상기에서항생제로는당업계공지되어있는모든종류를사용할수있으며바람직하게는, 스트렙토마이신을사용한다. - 5 -
본발명의일실시예에서는색소체가형질전환된벼의선별에사용되는스트렙토마이신의최적농도를결정하기위하여발아후 2-3 주된캘러스를다양한농도의스트렙토마이신이포함된배지에치상하고광조건또는암조건하에서재분화시켰다. 실험결과, 광조건하에서는스트렙토마이신의첨가농도가증가할수록캘러스의성장이저해되었으나암조건하에서는스트렙토마이신의첨가농도가캘러스의성장에큰영향을주지않았다. 따라서, 본발명의색소체형질전환에있어서본발명자들은형질전환체를광조건하에서선별하였으며스트렙토마이신의최적농도는선별초기단계의경우 100 500mg/L 로하였으며그후의선별단계에서는 300-500mg/L 로하였다. 또한, 본발명의다른실시예에서상기에서결정한농도로항생제가포함된선별배지를이용하여형질전환된캘러스를선별하였다. 즉, 형질전환된캘러스를스트렙토마이신 200mg/L 가포함된배지에서배양하여재분화를유도하고항생제저항성을나타내는캘러스를일차적으로선별하였다. 그다음상기선별된캘러스를 300mg/L 의스트렙토마이신이포함된신선한선별배지로옮기고한달간배양하고스트렙토마이신저항성을나타내는신초를이차적으로선별하고 500mg/L 스트렙토마이신이포함된배지에서발근시켰다 ( 실시예 3 참조 ). 실험결과, 2 개의독립적인스트렙토마이신저항성계통을수득하고각각 sgfp-1 및 sgfp-2 로명명하였다 ( 도 3b 참조 ). 상기 (d) 단계에서는상기 (c) 단계에서선별된색소체형질전환캘러스를발근용배지에배양하여뿌리를유도하고토양에옮겨순화시켰다. 상기에서발근용배지는항생제가 300 1000mg/L 로포함되어있고호르몬이첨가되지않은 MS 배지를사용하는것이바람직하다. 상기에서배지에포함되는항생제는선별마커의종류에따라적합한항생제를선택하여사용할수있다. 본발명에서예시된것은스트렙토마이신이다. 상기에서뿌리가유도된식물체를토양에옮겨순화시킬때일주일간격으로토양 1L 당 500 1500mg 의항생제를상기식물체가종자를맺어수확할때까지처리함으로써색소체내의모든세포가형질전환된상태로전환되도록유도하는것이바람직하다. 보다바람직하게는, 항생제를토양 1L 당 500 1000mg 의농도로처리할수있다. 본발명의일실시예에서는형질전환된캘러스를발근용배지에서배양하여뿌리를유도한다음이를토양에치상하여유식물이충분한수로자랐을때, 상기유식물을각각별개의토양에치상하고스트렙토마이신을농도별로처리한다음유식물의성장정도를조사하여적합한처리농도를결정하였다 ( 실시예 4 참조 ). 그결과, 스트렙토마이신을토양 1L 당 500 1000mg 의범위로처리할수있음을확인하였다 ( 도 4 참조 ). 이에본발명자들은상기본발명의방법에따라제조되고선별된형질전환체의색소체가색소체형질전환용벡터에의해안정적으로형질전환되었는지여부를조사하였다. 본발명의일실시예에서는본발명의방법에따라선별된형질전환벼의게놈 DNA 를분석하여형질전환벼에목적유전자인 sgfp 유전자가존재하는지를조사하였다 ( 실시예 6 참조 ). 그결과, 선별된모든형질전환벼에서 sgfp 유전자가존재함을확인할수있었으며 ( 도 5a 및도 5b 참조 ) 본발명의다른실시예에서는형질전환벼에항생제저항성유전자인 aada 유전자가존재하는지를확인하기위하여 aada 유전자에특이적인프로브를사용하여서던블롯분석을수행하였다 ( 실시예 7 참조 ). 그결과, 형질전환벼에 aada 유전자가존재함을확인할수있었다 ( 도 6 참조 ) 또한, 본발명의다른실시예에서는형질전환벼의색소체게놈내에부위특이적으로목적유전자인 sgfp 유전자와항생제저항성유전자인 aada 유전자가인테그레이션되었는지를조사하였다 ( 실시예 8 참조 ). 실험결과, aada 유전자와 sgfp 유전자가벼의색소체게놈안의 trni 및 trna 유전자사이에존재함을확인할수있었다 ( 도 7). 또한, 본발명의다른실시예에서는형질전환벼에서 sgfp 가발현되는지여부를웨스턴블롯분석으로조사하였다 ( 실시예 9 참조 ). 그결과, 형질전환벼에 sgfp 가발현됨을확인할수있었다 ( 도 8 참조 ). 본발명자들은상기와같은실험결과로부터본발명의방법에따라형질전환된벼의색소체게놈내에목적으로하는유전자가도입되었음을확인할수있었으며형질전환체가성체로자랐을때에도형질전환된색소체가소멸되지않음을확인할수있었다. 나아가, 본발명자들은상기형질전환벼를자가수정하여종자를수득하고이를파종하여배양함으로써형질전환된벼의색소체에이식된유전자가다음세대 (T1 progeny) 까지전이되는지여부를조사하였다 ( 실시예 10 참조 ). 그결과, 본발명의방법에따라벼의색소체에이식된유전자가다음세대로전이됨을확인할수있었다 ( 도 9 참조 ) 이하, 본발명을하기실시예에의하여더욱상세히설명한다. - 6 -
하기실시예는본발명을예시하는것으로, 본발명의내용이이에한정되는것은아니다. < 실시예 1> 벼색소체형질전환용벡터의제조 벼색소체형질전환용벡터를제조하기위하여화청벼 ( 서울대학교육종학과고희종교수님으로부터제공받음 ) 의잎조직에서공지된방법에따라총게놈 DNA 를추출하였다 (Doyle J. et al. Phytochem. Bull. 19:11-15, 1987). 상기에서분리한게놈 DNA 를주형으로하여상동재조합사이트 (homologus recombination site) 로사용할 trni 유전자 ( 서열번호 1) 와 trna 유전자 ( 서열번호 2) 를하기의프라이머쌍 ( 서열번호 3 및서열번호 4) 을사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 증폭조건은 94 에서 30 초간변성, 60 에서 30 초간어닐링, 72 에서 2 분간신장하는단계로이루어진과정을 30 회반복하였다. 정방향프라이머 ( 서열번호 3) 5'- CGAGGCCTCCCAAAGGGAGGCCCGCGCGA-3' 역방향프라이머 ( 서열번호 4) 5'-GCTGATATCCAACTTTCATCGTACTGTGCTCT-3' 상기 PCR 증폭산물을 StuI 과 EcoRV 제한효소로처리한후 puc19 벡터 (strataene) 의 PvuII 제한효소부위에클로닝하였다. 그다음색소체형질전환벡터인 pzs197(svab, Z et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 913-917, 1993) 에서 16S rrna 프로모터인 Prrn, 항생제저항성유전자인 aada 유전자, psba 터미네이터를 NotI 제한효소로처리하여 NotI- NotI 단편으로분리하였다. 이를클리노우효소로처리한다음앞서제조한 puc19 벡터의 trni 과 trna 사이에존재하는 PvuII 제한효소부위에도입하여 pld-rctv 벡터를제조하였다 ( 도 1a). 시각적으로형질전환여부를구별할수있도록하기위해, 상기 pld-rctv 벡터에선별마커유전자로 GFP(green fluorescent protein) 유전자를도입하였다. 이를위해, 벼에서독성이없는것으로알려진 gfp 유전자의변형유전자인 sgfp 유전자를 PCR 방법으로증폭하였다. 이때, 상기 sgfp 유전자의앞부분에리보좀결합영역 (ribosome binding site) 을가지도록하였다. 상기 sgfp 유전자 ( 서열번호 5) 의 PCR 증폭은 psk-rg 플라스미드 (Jang E. et al., Plant Physiol, 129, 1-9, 2002) 를주형으로하고하기의프라이머쌍 ( 서열번호 6 및서열번호 7) 을사용하여수행하였다. 하기프라이머서열에서밑줄은 XbaI 부위를의미하며이탤릭체로표시된부분은리보좀결합영역을의미한다. 정방향프라이머 ( 서열번호 6) 5'- GCTCTAGAGTTGTAGGGAGGGACGTATGGCCAAGGGCGAGGAGCTGTT-3' 역방향프라이머 ( 서열번호 7) 5'-GCTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3' 상기 PCR 증폭산물을 pld-rctv 벡터의 aada 유전자와 psba 의 3'UTR 사이에존재하는 XbaI 부위에도입하여 pld- RCtV-sGFP 벡터를제조하였다 ( 도 1b 및도 1c). < 실시예 2> 형질전환된벼의선별을위한선별배지내스트렙토마이신함량및선별조건의최적화 형질전환된벼의선별에사용되는스트렙토마이신의최적농도를결정하기위하여, 발아후 2-3 주된캘러스를다양한농도의스트렙토마이신이포함된배지에치상하고재분화시켰다. 상기캘러스는화청벼종자를 2,4- 디클로로페녹시아세트산 (2,4-D) 2mg/L, 카제인가수분해물 (casein hydrolysate) 1g/L, 수크로오스 (sucrose) 30g/L 및젤라이트 (Gelrite) 2g/ L 로이루어진 N6 배지에파종하여 28, 암조건하에서 2 주내지 3 주간배양하여수득하였다. - 7 -
상기캘러스를스트렙토마이신이각각 0, 100, 200, 500 및 1000mg/L 의농도로첨가된 MS(Murachige and Skoog) 배지에치상하고광조건으로 2 달간배양하였다. 또한, 상기와동일한배지에캘러스를치상하고암조건으로 1 달간배양하였다. 실험결과, 광조건하에서스트렙토마이신을 100mg/L 로첨가한배지에서배양한경우캘러스의성장은부분적으로저해되는것으로나타났으며뿌리가유도되지않았다. 또한, 스트렙토마이신을 200mg/L 로첨가한경우에는성장이더욱저해되는것으로나타났다 ( 도 2a). 스트렙토마이신을 500mg/L 의농도로첨가한경우에도캘러스의성장이저해되는것으로나타났으며스트렙토마이신의농도가 1000mg/L 인경우에는모든캘러스가 3 주내에갈색으로변화되었다. 반면, 암조건하에서는스트렙토마이신을 1000mg/L 을첨가한경우에도캘러스의성장은큰저해를받지않았다 ( 도 2b) 상기실험결과로부터, 암조건하에서는캘러스가항생제에민감하지않음을알수있었으며이로인해형질전환체의선별시암조건하에서캘러스를배양하는것은적합하지않음을알수있었다. 따라서, 본발명의형질전환체는광조건하에서선별하는것이바람직하며, 배지에첨가하는스트렙토마이신의최적농도는부분적으로성장을저해하는것으로나타난 100mg/L 와캘러스가거의성장할수없는경우인 1000mg/L 를제외하고 200mg/L 내지 500mg/L 의농도범위가적합함을알수있었다. < 실시예 3> 입자충격법에의한벼색소체의형질전환및재분화 상기실시예 2 와동일한방법으로벼의종자로부터유도한캘러스를상기실시예 1 에서제조한벼색소체형질전환용벡터인 pld-rctv-sgfp DNA 를코팅한 0.6 μm지름의금입자 (gold particle) 와 PDH-1000/He 유전자전달시스템 (Bio- Rad) 을사용하여가속력 (acceleration power) 1,100psi, 표적거리 (target distance) 6cm 의조건으로형질전환하였다. 그다음상기캘러스를암조건하에서 28 로이틀간배양하고 NAA 2mg/L, 키네틴 2mg/L, 피트아가 (phytagar) 14g/L 및스트렙토마이신 200mg/L 가첨가된 MS(Murachige and Skoog) 배지에서 50 μe 의광조건으로배양하여재분화를유도하였다. 그결과, 스트렙토마이신 - 저항성캘러스는선별배지에서한달이지난후녹색스팟으로나타났고다음달에는캘러스에서신초가발생하였다 ( 도 3a). 상기스트렙토마이신에저항성을나타내는캘러스에서어린잎이생기면스트렙토마이신농도가 300mg/L 로증가된새로운배지에옮겨치상한후동일한광조건으로한달간배양하였다. 이후스트렙토마이신에저항성을나타내는신초 (shoot) 를발근용배지인스트렙토마이신 500mg/L 가첨가되어있고호르몬이첨가되지않은 MS 배지에치상하여배양함으로써뿌리형성을유도하였다. 약 4000 개의캘러스를사용하여상기와같은방법으로 10 번의독립적인실험을수행한결과, 2 개의독립적인계통이선별되었고재분화되었다 ( 도 3b). 상기 2 개의스트렙토마이신 - 저항성계통은각각 sgfp-1 및 sgfp-2 로명명하였다. < 실시예 4> 색소체형질전환벼의토양순화시스트렙토마이신의최적처리량결정 상기실시예 3 에서선별된 sgfp-1 및 sgfp-2 계통을토양이담긴화분에옮겨순화시키고토양 1L 당스트렙토마이신 500mg 을일주일간격으로처리하였다. 상기 sgfp-1 및 sgfp-2 의유식물이충분한수가되었을때, 상기유식물들을구분하여각각별개의토양이담긴 3 개의화분에치상하고토양 1L 당스트렙토마이신 500, 1000 및 1500mg 을일주일간격으로식물체가종자를맺어수확할때까지각각처리하였다. 이때, 대조군으로는형질전환하지않은벼의유식물을사용하였다. 실험결과, 토양 1L 당스트렙토마이신 500mg 을처리한경우형질전환하지않은벼는성장이저해된반면, sgfp-1 및 sgfp-2 의유식물의생장은영향을받지않았으며종자가생산되었다. 토양 1L 당스트렙토마이신 1000mg 를처리한경우에는형질전환하지않은벼의성장은크게저해되는것으로나타났으며, sgfp-1 및 sgfp-2 의유식물의영양성장은크게영향을받지않았으나종자가소량으로생산되었다. 토양 1L 당스트렙토마이신 1500mg 을처리한경우에는 sgfp- 1 및 sgfp-2 의유식물의생장이조금저해되는것으로나타났으며종자도생산되지않았다 ( 도 4). - 8 -
상기에서스트렙토마이신의농도를달리하여처리한각각에서항생제저항성을나타내는 sgfp-1 및 sgfp-2 의유식물체를선별하여 6 개의개체를수득하였다. < 실시예 6> 색소체형질전환벼의게놈 DNA 분석 상기실시예 5 에서선별된형질전환벼들에 sgfp 유전자가존재하는지를확인하기위하여벼의게놈 DNA 를 PCR 증폭하여분석하였다. 상기형질전환벼의입조직으로부터총게놈 DNA 를공지된방법에따라추출하였다 (Doyle J. et al., Phytochem. Bull. 19, 11-15, 1987). 또한, 대조군으로사용하기위해형질전환되지않은야생벼의입조직으로부터동일한방법으로총게놈 DNA 를추출하였다. 상기에서추출한게놈 DNA 100ng 을주형으로하고 DNA 중합효소 (Excel Taq DNA polymerase, Corebio, Seoul, South Korea) 를사용하여 sgfp 유전자를증폭할수있는하기의프라이머쌍 ( 서열번호 8 및서열번호 9) 을사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 증폭조건으로는 94 에서 30 초간변성, 63 에서 30 초간어닐링, 72 에서 40 초간신장하는단계로이루어진과정을 30 회반복하였다. 상기의 PCR 증폭산물을아가로스겔 (1%) 에서확인하였다. sgfp 의정방향프라이머 ( 서열번호 8) 5'-GACCCTGAAGTTCATCTGAC-3' sgfp 의역방향프라이머 ( 서열번호 9) 5'-ACTTGTACAGCT CGTCCATG-3' 실험결과, 상기실시예 5 에서선별된형질전환 6 개의개체모두 717bp 크기의 sgfp 유전자가존재함을확인할수있었다 ( 도 5a 및 5b). < 실시예 7> 색소체형질전환벼의서던블롯분석 상기실시예 5 에서선별된형질전환벼의색소체게놈내에 aada 유전자가존재하는지를확인하기위하여서던블롯분석을수행하였다. 이때상기실시예 5 에서선별한 6 개의형질전환된개체중토양에스트렙토마이신을 500mg/L 농도로처리하여선별한 2 개의개체를시료로사용하였다. 상기실시예 6 과동일한방법으로추출한총게놈 DNA 를 BamHI 으로소화시켜수득한 DNA 18μg 을시료로사용하였다. 상기시료를 0.7% 아가로스겔에서분리하고하이본드 -N+ 나일론막 (Amersham) 에옮기고 [α-32p]dctp 로표지된 aada 에특이적인프로브와혼성화하고 X- 레이필름으로감광하였다. aada 에특이적인프로브는 aada 유전자를포함하는상기실시예 1 의 pld-rctv 벡터를주형으로하여하기의프라이머 ( 서열번호 10 및서열번호 11) 로 PCR 증폭함으로써제조하였다. PCR 증폭조건으로는 94 에서 30 초간변성, 60 에서 30 초간어닐링, 72 에서 40 초간신장하는단계로이루어진과정을 30 회반복하였다. aada 프로브의정방향프라이머 ( 서열번호 10) 5'-GATCGCCGAAGTATCGACTC-3' aada 프로브의역방향프라이머 ( 서열번호 11) 5'-ATTTGCCGACTACCTTGGTG-3' - 9 -
실험결과, sgfp-1 및 sgfp-2 에서 3.3kb 크기의단편이검출되었다 ( 도 6). 이로부터상기 sgfp-1 및 sgfp-2 에 aada 유전자가존재하고발현됨을확인할수있었다. < 실시예 8> 형질전환벼의색소체게놈내에목적유전자가부위특이적으로도입되었는지여부조사 상기실시예 5 에서선별된형질전환벼의색소체게놈내에부위특이적으로 sgfp 및 aada 유전자가인테그레이션되었는지를확인하기위하여벼의게놈 DNA 를 PCR 증폭하여분석하였다. 형질전환벼의총게놈 DNA 는상기실시예 6 과동일한방법으로추출하고게놈 DNA 100-500ng 을주형으로하여벼색소체의왼쪽경계면및오른쪽경계면을각각증폭할수있는하기의프라이머쌍 ( 서열번호 12 내지서열번호 15) 을사용하여 PCR 증폭하였다. 왼쪽경계면정방향프라이머 ( 서열번호 12) 5'-TCAGCCATACGGCGGTGAATCCG-3' 왼쪽경계면역방향프라이머 ( 서열번호 13) 5'-CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACG-3' 오른쪽경계면정방향프라이머 ( 서열번호 14) 5'-CGGGATCACTCACGGCATGGACGAG-3' 오른쪽경계면역방향프라이머 ( 서열번호 15) 5'-TACCATAGAGGCCAACGATAGACAATAA-3' 왼쪽경계면의 PCR 증폭은 94 에서 30 초간변성, 63 에서 30 초간어닐링및 72 에서 2 분간신장하는단계로이루어진과정을 35 회반복하여수행하였다. 오른쪽경계면의 PCR 증폭은 94 에서 30 초간변성, 63 에서 30 초간어닐링, 72 에서 1 분 30 초간신장하는단계로이루어진과정을 10 회반복한다음 94 에서 30 초간변성, 60 에서 30 초간어닐링, 72 에서 1 분 30 초간신장하는단계로이루어진과정을 25 회반복하여수행하였다. 상기의 PCR 증폭산물을아가로스겔 (1%) 에서확인한후겔상의 DNA 만을순수분리하여 pgem-t Easy 벡터 (Promega, Madison, WI) 에클로닝하고서열분석회사인코아바이오사에의뢰하여서열을분석함으로써 aada 와 gfp 유전자의삽입된위치가벼의색소체게놈안의 trni 과 trna 사이부분임을확인하였다. 실험결과, 형질전환벼들에서각각 1.9kb 및 1.3kb 크기의벼색소체의왼쪽경계면단편 ( 도 7a) 및오른쪽경계면단편이검출되었다 ( 도 7b). 상기 PCR 증폭산물의서열을분석한결과, aada 유전자와 sgfp 유전자가벼의색소체게놈안의 trni 및 trna 유전자사이에존재함을확인할수있었다 ( 결과미도시 ). < 실시예 9> 색소체형질전환벼의웨스턴블롯분석 상기실시예 5 에서선별된형질전환벼에서 GFP 가발현되는지여부를웨스턴블롯분석법으로조사하였다. 상기형질전환벼의잎조직으로부터가용성단백질을단백질추출용완충액 (0.1M Tris-HCl, ph 8.3, 0.5M NaCl, 5mM 디티오트레이톨, 5mM EDTA, 2mM 페닐메틸설포닐플루오라이드 ) 을사용하여추출하였다. 대조군으로사용하기위해형 - 10 -
질전환되지않은벼의잎으로부터상기와동일한방법으로단백질을추출하였다. 상기에서추출한가용성단백질 2μg 을 12% SDS-PAGE 젤에서전기영동하고면역블롯팅을수행하기위해니트로셀룰로오스막 (Amersham) 으로옮겼다. 일차항체로는단클론항 -GFP(Sigma) 를 1:500 으로희석하여사용하였고, 이차항체로는알카라인포스파타아제결합염소 - 항마우스 IgG(Sigma) 를 1:10,000 으로희석하여사용하였다. GFP 의검출은 BCIP/NBP 콤보 (Gibco BRL) 를사용하여수행하였다. 실험결과, sgfp-1 및 sgfp-2 계통에서 27kDa 의밴드가생성되었고이로부터 sgfp 가생성되었음을확인하였다 ( 도 8). < 실시예 10> 색소체형질전환벼의자손획득및분석 상기실시예 5 에서선별된색소체형질전환된벼를자가수정하여종자를수득하고상기종자를스트렙토마이신농도가 100mg/L 이며호르몬이첨가되지않은 MS 배지에파종하여 28 에서광조건으로 2 주간배양하였다. 배양된벼를공초점형광현미경으로관찰하여 GFP 의발현여부를조사하였다. 또한, 상기 GFP 가형질전환된벼의엽록체 (chloroplast) 에위치해있는지를확인하였다. 즉, 상기색소체형질전환벼의자손에 488nm 여기파장과 510nm 의방출파장필터를사용하여레이저를조사하고녹색의 GFP 형광이발현되는지를공초점형광현미경 (Carl Zeiss 510 CLSM, Jena, Germany) 을사용하여확인하였다. 실험결과, 엽록체, 어린엽록체및잎표피에서 sgfp 형광이나타났다 ( 도 9). 따라서, 벼색소체에삽입된유전자가다음세대로전이됨을확인할수있었다. 발명의효과 본발명에따른식물의색소체형질방법은식물의캘러스를색소체형질전환용벡터로형질전환함으로써형질전환체가성체로발달하여도형질전환된색소체가소멸되지않으며색소체에이식된유전자가다음세대로전달되는효과가있다. (57) 청구의범위 청구항 1. (a) 식물의종자, 조직및세포현탁액으로이루어진그룹중에서선택된어느하나를캘러스유도용배지에서배양하여캘러스를유도하는단계 ; (b) 상기 (a) 단계의식물의캘러스를색소체형질전환용벡터로형질전환하는단계 ; (c) 상기 (b) 단계에서형질전환된캘러스를선별배지에서배양하여형질전환된캘러스를선별하는단계 ; (d) 상기 (c) 단계에서선발된캘러스를발근용배지에서배양하여뿌리를유도하고토양에옮겨순화시키는단계를포함하는것을특징으로하는식물의색소체형질전환방법. 청구항 2. 제 1 항에있어서, 상기 (a) 단계의식물은단자엽식물임을특징으로하는방법. 청구항 3. 제 2 항에있어서, 상기단자엽식물이벼, 밀, 보리, 죽순, 옥수수, 토란, 아스파라거스, 양파, 마늘, 파, 부추, 달래, 마및생강으로이루어진그룹중에서선택되는것을특징으로하는방법. - 11 -
청구항 4. 제 3 항에있어서, 상기단자엽식물이벼인것을특징으로하는방법. 청구항 5. 제 1 항에있어서, 상기 (b) 단계의색소체형질전환용벡터는상동재조합부위의왼쪽경계면영역, 선별마커, 목적유전자및상동재조합부위의오른쪽경계면영역을포함하고있는것임을특징으로하는방법. 청구항 6. 제 5 항에있어서, 상기선별마커는스트렙토마이신저항성유전자이고상동재조합부위의왼쪽경계면영역및오른쪽경계면영역이각각벼의 trni 및 trna 유전자임을특징으로하는방법. 청구항 7. 제 1 항에있어서, 상기 (b) 단계의형질전환은입자충격법 (particle bombardment) 에의해수행되는것을특징으로하는방법. 청구항 8. 제 1 항에있어서, 상기 (b) 단계에서캘러스를형질전환한다음항생제가포함되지않은 N6 또는 MS 배지에서암조건으로 25 30 로 1 3 일간배양하는단계를추가로포함하는것을특징으로하는방법. 청구항 9. 제 1 항에있어서, 상기 (c) 단계에서형질전환된캘러스의선별은상기 (b) 단계에서형질전환된캘러스를 100 500mg/L 의항생제가포함된 MS 배지에서광조건으로배양하여항생제에저항성을나타내는캘러스를일차적으로선발한다음이를다시 300 500mg/L 의항생제가포함된 MS 배지에옮겨치상한후배양하여항생제저항성캘러스를이차적으로선별함으로써수행되는것임을특징으로하는방법. 청구항 10. 제 1 항에있어서, 상기 (d) 단계의발근용배지는항생제가 300 1000mg/L 가포함되어있고호르몬이첨가되지않은 MS 배지임을특징으로하는방법. 청구항 11. 제 1 항에있어서, 상기 (d) 단계에서식물체를토양에옮겨순화시킬때일주일간격으로토양 1L 당 500 1500mg 의항생제를상기식물체가종자를맺어수확할때까지처리하는것을특징으로하는방법. 도면 - 12 -
도면 1a 도면 1b - 13 -
도면 1c 도면 2a 도면 2b 도면 3a - 14 -
도면 3b 도면 4 도면 5a - 15 -
도면 5b 도면 6 도면 7a - 16 -
도면 7b 도면 8 도면 9 서열목록 <110> Seoul National University Industry <120> Method for plastid transformation in the plant - 17 -
<130> NP04-0114 <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1045 <213> Oryza sativa <221> gene <222> (1)..(1045) <223> trni <400> 1 cctcccaaag ggaggcccgc gcgacgggct attagctcag tggtagagcg cgcccctgat 60 aattgcgtcg ttgtgcctgg gctgtgaggg ctctcagcca catggatagt tcaatgtgct 120 catcagcgcc tgacccgaag atgtggatca tccaaggcac attagcatgg cgtactcctc 180 ctgtttgaat cggagtttga aaccaaacaa acttctcctc aggaggatag atggggcgat 240 tcaggtgaga tcccatgtag atctaacttt ctattcactc gtgggatccg ggcggtccgg 300 ggggggcact acggctcctc tcttctcgag aatccataca tcccttatca gtgtatggag 360 agctatctct cgagcacagg ttgaggttcg tcctcaatgg gaaaatggag cacctaacaa 420 cgcatcttca cagaccaaga actacgagat caccctttca ttctggggtg acggagggat 480 cgtaccattc gagccttttt ttcatgcttt tcccggcggt ctggagaaag cagcaatcaa 540 taggacttcc ctaatcctcc cttcctgaaa ggaagaacgt gaaattcttt ttcctttccg 600 cagggaccag gaggttggat ctagccataa gaggaatgct tggtataaat aagccacttc 660 ttggtcttcg actccctaag tcactacgag cgccctcgat cagtgcaatg ggatgtggct 720 atttatctat ctcttgactc gaaatgggag cagagcaggt ttgaaaaagg atcttagagt 780 gtctagggtt gggccaggag ggtctcttaa cgccttcctt tttctgccca tcggagttat 840 ttcccaagga cttgccatgg taagggggag aaggggaaga agcacacttg aagagcgcag 900 tacaacggag agttgtatgc tgcgttcggg aaggatgaat cgctcccgaa aaggagtcta 960 ttgattctct cccaattggt tggatcgtag gggcgatgat ttacttcacg ggcgaggtct 1020 ctggttcaag tccaggatgg cccag 1045-18 -
<210> 2 <211> 823 <213> Oryza sativa <221> gene <222> (1)..(823) <223> trna <400> 2 ctgcgccagg gaaaagaata gaagaagcat ctgactcttt catgcatact ccacttggct 60 cggggggata tagctcagtt ggtagagctc cgctcttgca attgggtcgt tgcgattacg 120 ggttggctgt ctaattgtcc aggcggtaat ggtagtatct tgtacctgaa ccggtggctc 180 actttttcta agtaatgggg aagaggactg aaacatgcca ctgaaagact ctactgagac 240 aaaaagatgg gctgtcaaaa aggtagagga ggtaggatgg gcagttggtc agatctagta 300 tggatcgtac atggacgata gttggagtcg gcggctctcc taggcttccc tcatctggga 360 tccctgggga agaggatcaa gtgtggccct tgcgaatagc ttgatgcact atctcccttc 420 aaccctttga gcgaaatgtg gcaaaaggaa ggaaaatcca tggaccgacc ccattatctc 480 caccccgtag gaactacgag atcaccccaa ggacgccttc ggcgtccagg ggtcacggac 540 cgaccataga ccctgttcaa taagtggaac acattagccg tccgctctcc ggttgggcag 600 taagggtcgg agaagggcaa tcactcgttc ttaaaaccag cattcttaag tttaagatca 660 aagagtcggg cggaaaaagg ggagagctcc ccgttcctgg ttctcctgta gctggattcc 720 ccggaaccac aagaatcctt agaatgggat tccaactcag caccttttgt tttgagattt 780 tgagaagagt tgctctttgg agagcacagt acgatgaaag ttg 823 <210> 3 <211> 29 <223> primer <400> 3 cgaggcctcc caaagggagg cccgcgcga 29-19 -
<210> 4 <211> 32 <223> primer <400> 4 gctgatatcc aactttcatc gtactgtgct ct 32 <210> 5 <211> 717 <213> Jellyfish Aequorea victoria <221> gene <222> (1)..(717) <223> sgfp <400> 5 atggccaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60 gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120 aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180 gtgaccacct tcacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240 cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300 aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360 aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420 ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480 atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540 cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600 ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660 ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact cacggcatgg acgagctgta caagtaa 717-20 -
<210> 6 <211> 48 <223> primer <400> 6 gctctagagt tgtagggagg gacgtatggc caagggcgag gagctgtt 48 <210> 7 <211> 30 <223> Primer <400> 7 gctctagatt acttgtacag ctcgtccatg 30 <210> 8 <211> 20 <223> primer <400> 8 gaccctgaag ttcatctgac 20 <210> 9 <211> 20 <223> primer <400> 9 acttgtacag ctcgtccatg 20-21 -
<210> 10 <211> 20 <223> primer <400> 10 gatcgccgaa gtatcgactc 20 <210> 11 <211> 20 <223> primer <400> 11 atttgccgac taccttggtg 20 <210> 12 <211> 23 <223> primer <400> 12 tcagccatac ggcggtgaat ccg 23 <210> 13 <211> 25 <223> primer <400> 13 ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacg 25-22 -
<210> 14 <211> 25 <223> primer <400> 14 cgggatcact cacggcatgg acgag 25 <210> 15 <211> 28 <223> primer <400> 15 taccatagag gccaacgata gacaataa 28-23 -