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1 PJ 마커 - 프리형질전환시스템개발및활용 Development of marker-free transgenic crops 한국생명공학연구원 농촌진흥청

2 제출문 농촌진흥청장귀하 본보고서를 마커 - 프리형질전환시스템개발및활용 과제의보고서로제출합니다. 제1세부연구과제 : 선발마커제거용형질전환벡터제작및활용제1협동연구과제 : 마커프리형질전환벼개발제2협동연구과제 : 화본과작물에서의선발마커제거시스템확립및대량형질전환작물개발 주관연구기관명 : 한국생명공학연구원 주관연구책임자 : 권석윤 연 구 원 : 김현순, 임찬주, 김웅범, 이하연, 김태령, 김송, 황문주, 우성민, 라자아마드, 김형세, 김호방, 김태현, 심플쿠마리, 나지아압바시, 변지희김명수, 오승희, 고우리, 전수희 제1협동연구기관명 : 명지대학교 제1협동연구책임자 : 최상봉 제2협동연구기관명 : 동국대학교 제2협동연구책임자 : 조준형 - 1 -

3 요약문 Ⅰ. 제목 마커 - 프리형질전환시스템개발및활용 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성급속한산업화와인구증가에따른식량문제와환경문제는인류생존을위협하는가장중요한현안문제로대두되고있다. 최근유가상승과더불어국제곡물가격이급격히상승하고있으며우리나라주곡인벼의경우 2007년 12월시카고선물가격이 1년전에비해 33% (13.25$/100 파운드 ) 상승하여 1988년이래최고치를경싢하여애그플레이션 (agflation) 에대한우려가현실화될가능성이있다. 또한바이오에너지수요및세계인구증가에따라곡물가격이 2000년이후 7.5% 중대된반면생산증가율은 5.4% 에그쳐곡물재고량이감소하고있으며, 획기적인생산량증대방법이없는한국제곡물분쟁의소지가점차심화되고있다. 이는식물생명공학기술즉형질전환을이용한분자육종기술의적극적인활용으로기존육종기술의한계를극복하여농작물의생산성을증대시키기위한연구의필요성을제시한다. 형질전환작물에제작에사용되는항생제저항성유전자에대한일반소비자의우려가증대되고있어선발마커로사용되는항생제저항성유전자를사용하지않고도입되는외래유전물질을최소화하기위한노력이필요하다. 또한항생제저항성유전자를사용하지않는경우형질전환작물유래농산품의개발과마케팅가격을낮추며새로운생산품의산업화를가속시킬수있다. 따라서형질전환작물의조기산업화를위한마커-프리형질전환시스템및마커-프리형질전환체의개발로형질전환체에대한일반대중의인식을개선하고형질전환작물의안전성조사를위한비용과시간을단축시킬방안이필요하다. 현재까지 hpt 또는 bar 유전자등양성선발마커유전자들은형질전환체생산을위해필수적으로요구되어왔다. 그러나이들유전자들은환경및인체에미치는잠정적위해성으로인해기개발된형질전환작물의실용화에어려움이있으며, 따라서이들유전자를포함하지않거나제거할수있는방법의개발이필요하다. 선발마커 - 2 -

4 제거를위해서는동시형질전환법과위치특이적재조합법이주로이용되는데, 동시형질전환법의경우형질전환효율이낮을뿐만아니라마커프리형질전환체를얻는데상대적으로긴시간이필요하다. 반면위치특이적재조합번의경우마커프리 T0 형질전환체를직접얻을수있는점에서효율적이다. 따라서본과제에서는작물의생산성을증대시키기위한방안으로다양한스트레스에대한내성을부여하고농업적형질을개선할수있는유전자를마커-프리시스템으로개발하고자하였다. Ⅲ. 연구개발의내용및범위 본연구에서는마커 - 프리형질전환식물체를개발하기위해여다음과같은연구 를수행하였음. 1) 선발마커제거용형질전환벡터의개량및이를이용한형질전환체계확립 2) 확보된형질전환용유용유전자의이용및신규유전자발굴 3) 화본과식물에서마커-프리형질전환체제작을위한기반확보및형질전환체생산 Ⅳ. 연구개발결과 형질전환에흔히사용되는항생제저항성유전자는환경위해성또는동물위해성을초래할수있어이를이용하여제작된형질전환체의산업화를위한위해성및안전성평가에많은시간과비용이요구되는데, 본과제에서는원하는유전자 ( 농업형질개선용유전자 ) 만이도입된형질전환식물체를개발하기위한기술을확보하고이를활용한형질전환체를제작하여조기에품종화할수있는기반을마련하였다. 또한연구팀에서확보하고있는유용유전자를형질전환에활용하였으며, 신규유용유전자를다수확보하여형질전환에이용하고자하였다. 1) 마커-프리형질전환시스템확립선발마커제거용형질전환벡터 (psycan, psycah, ptsycan1, ptsycah1) 를제작하였으며, 이들형질전환벡터는특정물질 (tunicmycin) 의처리에의한선발마커제거또는특정발달시기 (tapetum specific 프로모터, TA29 프로모터 ) 를사용하여화분발달과정 - 3 -

5 중에선발마커 cassette가제거될수있도록제작하였다. 이와같은형질전환벡터는유용유전자의형질전환체제작에이용되었는데선발마커제거용벡터 psycan 및 psycah을활용하여 crtw 유전자를도입하기위한형질전환벡터를제작하였으며, 이를이용하여형질전환애기장대를제작한후선발마커를이용한선발, 선발마커의제거및역선발의과정을거쳐선발마커가제거된형질전환체를확보하였고이를통해선발마커제거시스템을확립하였다. 2) 유용유전자발굴 / 기능검정및형질전환벼제작 AtDof5.1, 벼 Dof5.1, APUM4, Os03g61560, OsRBP3 의기능을중점적으로확인하였다. AtDof5.1과벼 Dof5.1은애기장대와벼의잎발달과형태, 극성형성에관여하며, 과발현시리그닌이줄어드는현상을보였다. APUM4와 Os03g61560은애기장대와벼의 ortholog로각유전자의돌연변이체는수정후치사현상을보이며, rrna 프로세싱과전사체분해에관여하였다. OsRBP3는종자의크기를조절하는유전자로판단되었다. 또한제1세부과제에서제작한 HOB2 유전자 marker-free 벡터 (psycah-hob2) 의형질전환벼를 35개체얻었다. 3) 화본과작물에서의선발마커제거시스템확립및대량형질전환작물개발본연구에서는위치특이적재조합유전자 (site specific recombination) Cre/loxP와음성선발맠러로이용되는 arge 유전자를탑재한 psycah를이용하여마커프리형질전환체개발을위해수행되었다. 본 vector에탑재된 Cre 유전자는재분화단계에서 tunicamycine 처리에의해발현되어양성선발마커유전자이 hpt gene을제거하는기능을하며, Cre 유전자에의해 hpt gene이제거되지않는경우 arge gene에의해음성선발되도록하였다. arge 유전자를이용한음성선발을위해상용화되고있는 phophinotricin (PPT) 을 acetic acid anhydride와 tetrahydrofuran (THF) 를이용하여아세틸화함으로서 N-AcPt를생산한후이를기질로이용하였다. PPT가식물세포에독성을보이는반면아세틸화된 N-AcPt는비독성이었다. N-AcPt가벼종자발아에미치는영향을구명하기위해, wild type의벼종자와 arge-hpt gene 형질전환벼종자에 5~30 mg/l의 N-AcPt를처리하였다. N-AcPt가 wild type 벼종자에비독성을보인반면, 형질전환벼종자의경우배지에첨가된 N-AcPt 농도에따라 30~40% 의종자가발아하지못하였다. 또한 arge gene을갖는형질전환캘러스이선발과재분화단계에서 25~30 ppm을처리하여약 50여개체의형질전환체를획득하였으며, PCR 분석결과목적유전자인 HOB1은포함되어있으나 hpt gene, arge gene 및 Cre gene은확인되지않았다. Ⅴ. 연구개발결과의활용계획 본과제에서애기장대및벼를대상으로마커 - 프리형질전환시스템을활용하여 선발마커가제거된형질전환체를제작하기위한체계가확립되었고, 확립된시스템을 활용하여쌍자엽및단자엽작물의형질전환에활용할예정이다. 현재확인된 marker - 4 -

6 free 형질전환벼의고정및품종화를위해미질분석및형질전환벼의바이오안전성검증이필요한것이며, 이에따라형질전환작물의고부가가치의산업화가가능해질것으로보임. 또한이를농업적으로중요한타작물등에적용한다면 GM 작물에대한상업화가용이할것이며그가치가향상될것으로사료된다. 본연구를통해확보된벼 Dof5.1, APUM4 및 Os 에관한연구결과를논문으로발표할예정이며, 이들유전자를이용한형질전환체를제작에활용할예정이다. 본연구에서사용한선발마커제거용형질전환벡터를이용할경우 embryogenic callus로 large scale 벡터의안정적인도입을위한형질전환및재분화체계의추가적인개선이필요할것으로사료되어, 현재아그로박테리움감염및캘러스재분화의최적조건의재확립을위한연구가진행중이며, 따라서보다효율적인빠른형질전환작물개발시스템을구축하고자한다

7 S U M M A R Y I. Title Development of marker-free transgenic crops II. Purpose and necessities of the research project In the developing world 840 million people are chronically undernourished and surviving on the fewer amounts of calories needed per day. This less food supply is due to many factors including poor agricultural practices, biotic and abiotic stresses. Abiotic stresses alone can reduce the crop yield by more than 50 %. It is obvious that crop productivity can be increased substantially by decreasing the detrimental effects of abiotic stresses. However, the situation regarding abiotic stresses is getting worst by increasing temperature, salt affected areas and diminishing water resources. Plant molecular breeding stands to benefit huge number of people because of its tremendous potential to develop crop plants with desired characteristics in significantly less time span. However, the usage of antibiotic or herbicide resistant genes as selection marker has paved the way for environmentalist s and consumer s concerns over safety. It is therefore necessary to eliminate marker-genes to harvest maximum benefits of the advancements made in the field of agricultural biotechnology. Until now, utilization of the positive selectable marker genes such as hpt or bar gene have been prerequisite to produce transgenic plants. However, because of the potential biohazard of the genes to human health and environment, their minimization and excision are demanded for commercialization of the transgenic plants. Currently both co-transformation with negative selectable marker genes and site specific recombination methods are mainly used for the development of marker free transgenic plants. In co-transformation method, transformation efficiencies were critically low and comparably more longer periods were needed for producing marker free plants. However, site specific recombination method is more efficient to produce maker free plants in shorter periods in T0 generation. III. Contents and boundary of the research project To develop marker-free transgenic crops with enhanced agronomic traits, selection marker-gene removal vector system was used for generation of transgenic plants. The contents are follows

8 1) Improving selection marker-gene removal vector system, and its application in generation of marker-free transgenic crops 2) Isolation and characterization of novel genes from plants for development of transgenic plants 3) Development of marker-free transgenic Gramineae plants IV. Results of the research project 1) Transformation method for selection marker-gene removal The plant expression vectors (psycan, psycah, ptsycan and ptsycah) containing marekr-removal cassette were constructed. Treatment of tunicamycin could be used to induce the expression of Cre recombinase during transformation in psycan of psycah. Otherwise TA29 promoter derived from tobacco which had specific activity in tapetum tissue could induce the Cre recombinase during pollen development in ptsycan and ptsycah. Expression cassette containing crtw gene, which could synthesize keto-carotenoid from carotenoid, fused to psycan or psycah to establish marker-removal system in arabidopsis. The marker-free transgenic plants containing gene-of-interest without marker gene were generated through three steps of work, 1) selection of T0 plants using antibiotics, 2) marker-removal by tunicamycin treatment, and 3) negative selection of transgenic plants using acetylated phosphinotricin. 2) Isolation and characterization of novel genes from plants for development of transgenic plants The function of AtDOF5.1, rice Dof5.1, APUM4, Os3g61560 and OsRBP3 in plants were characterized. AtFDof5.1 and rice Dof5.1 have functions in leaf development and leaf morphology, and its overexpression resulted in reduced lignin contents of plants. The APUM4 from Arabidopsis and Os3g61560 from rice function in processing and degradation of transcripts of rrna, and its knock-out mutants were lethal after fertilization. It showed that OsRBP3 had function in control of seed size. 3) Development of marker-free transgenic Gramineae plants This research was conducted to produce selectable marker free transgenic rice by Agrobacterium-mediated transformation using psycah vector which constructed with Cre/loxP genes and arge gene. In regeneration stage of transgenic callus, hpt gene was removed by expression of Cre gene with tunicamycine treatment. If this positive selectable marker gene was not be successfully removed, this gene could be removed by negative selection with arge, ornithine deacetylase gene. For negative selection with arge - 7 -

9 gene, N-AcPt, which is a substrate of ornithine de acetylase, was organically acetylated with tetrahydrofuran (THF) and acetic acid (AcOH) anhydride from commercial L-Phosphinotricin. In toxicity test, L-PPT showed cyto-toxic but N-AcPt did not. In order to identify the toxic effect of N-AcPt to seed germination, non-transgenic and arge-hpt transgenic rice seeds were treated with various concentrations of N-AcPt from 5 mg/l to 30 mg/l. In germination test, toxic effect were not observed in WT seeds, however, in arge-hpt transgenic T1 seeds, 30~40% seeds could not be germinated depending on the medium. Furthermore, in selection and regeneration stages of arge-transgenic callus, calli were successfully selected with 25~30 ppm of N-AcPt. Treating with 0.1 mg/l of tunicamycine in regeneration stage, approximately 50 independent transgenic rice were obtained. In results of PCR analysis, HOB1, which is target gene, was identified in the plants, however, positive (hpt) and negative (arge) selectable marker genes and recombinase (Cre) gene were not. V. Application of the results from research project 1) The marker-removal systems developed in this project will be applicable to development of transgenic crops having good agronomic traits. 2) The agronomic traits of marker-free transgenic rice plants will be characterized. 3) The research results obtained about Dof5.1, APUM4 and Os gene will be published and these genes would be used for generation of transgenic crops

10 C O N T E N T S Chapter 1. Introduction 11 Chapter 2. State of the art 13 Chapter 3. Contents and result of the research 15 Section 1. Construction of selection marker-removal vector and its application 15 Section 2. Isolation and characterization of novel genes from plants for development of transgenic plants 22 Section 3. Development of marker-free transgenic Gramineae plants 29 Chapter 4. Achievement of plan and contributions 45 Chapter 5. Application plan of the results 50 Chapter 6. Changed contents 52 Chapter 7. References

11 목 차 제 1 장서론 11 제 2 장국내외기술개발현황 13 제 3 장연구개발수행내용및결과 15 제 1 절선발마커제거용형질전환벡터의개량및이를이용한형질전환체계확립 15 제 2 절확보된형질전환용유용유전자의이용및신규유전자발굴 22 제 3 절화본과식물에서마커-프리형질전환체제작을위한기반확보및형질전환체생산 29 제 4 장연구개발목표달성도및대외기여도 45 1 절 : 목표대비대외달성도 45 2 절 : 정량적성과 ( 논문게재, 특허출원, 기타 ) 를기술 46 제 5 장연구개발결과의활용계획 50 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 51 제 7 장기타중요변동사항 52 제 8 장국가과학기술종합정보시스템에등록한연구장비현황 53 제 9 장참고문헌

12 제 1 장서론 생명공학기술을활용한형질전환작물 (GMO) 의개발은인류가직면한식량문제및환경문제를해결할수있는핵심기술로부각되고있다. 1996년형질전환작물이상업적으로재배된이후, 년사이에생명공학작물의재배국수, 재배면적및농민의수익이두배로증가할것이라는 2005년 ISAAA의예측이실제로진행되고있다. 2008년현재유전자변형작물의재배면적은 1억2천5백만헥타르에달하는실정이다. 작물로는벼가주요대상작물이며, 형질로는가뭄저항성이주요형질로전망된다 (ISAAA Briefs, 2008). 국내에서도 1980년대부터유전자변형식물의개발에관한연구가시작되었고, 1990년대후반부터주요작물을대상으로하는연구가시작되었다. 2007년발간된바이오안정성백서 (2007 바이오안정성백서, 산업자원부 / 한국생명공학연구원 ) 에따르면국내에서는 20종이상의작물을대상으로 60건이상의개발에관한연구결과가발표되었으며, 일부품목의경우상업화를위한위해성평가가진행중에있다. 그러나국내에서개발된유전자변형작물의상업화된예가없는상황이며, 상업화를전제로한형질전환작물개발에대한치밀한계획하에연구가수행될필요가있다. 최근바이오에너지수요, 인구증가에따라곡물소비는 2000년이후 7.5% 늘어나고, 생산증가율은 5.4% 에그쳐세계쌀재고량이감소하고있으며, 획기적인생산량증대방법이없는한국제곡물분쟁의소지가점점심화되고있다. 식물생명공학의여러분야중형질전환기술은전통적인교잡등으로우수한형질을도입하기불가능한경우원하는새로운형질을유전공학적방법으로식물에도입하는기술이다. 식물생명공학기술의발전으로자연계에존재하지않았던새로운형질을갖는식물 ( 푸른장미, 황금쌀등 ) 을개발할수있었으며, 이들의개발과정에서발생한과학적발전및사회적경제적가치는막대하다. 원하는형질을도입하기위해필요로하는요소기술의개발과정을간과할수없으나최종적인생명공학제품 ( 형질전환식물체 ) 의개발이기술의완성이라는측면에서형질전환체의제작과정은형질전환식물체의개발에서가장중요하며기본적인것이다. 형질전환식물체의제작에서흔히사용되고있는항생제저항유전자의전이가능성등위험성을내재하고있고, 최근형질전환식물체에대한환경론자및소비자들의외면에따른외래유전물질의최소화가요구되어지고있다. GMO 작물에있어서저항성유전자의부재는유전자조작생산품의개발과마케팅의가격을낮추며새로운생산품의상업화를가속시킬수있다. 또한복수유전자또는전체대사계관련유전자군을도입하기위한유전자집적 (gene stacking) 은동일한선발마커를사용하는형질전환방법으로는불가능하다. 마커-프리형질전환체를제작하기위해다양한연구가수행되었는데, 1) 후대선발을과정을포함하는 co-transformation 방법, 2) specific recombinase를활용한마커제거법등에관한연구결과가보고되었다. 최근에는대상식물체에서유래한 DNA 서열을이용하여형질전환체를제작하기위한 P-DNA의이용등 intragenic modification or cisgenic modification' 에관한연구결과가발표되어이분야의관심이증대되고있는실정이다

13 따라서 GMO 작물의조기산업화를위한선발마커-프리형질전환체의개발로 GMO에대한일반대중의인식을개선하고, 형질전환작물의안정성조사를위한비용및시간을단축시킬방안이필요하다. 한편형질전환식물체의제작에흔히사용되는선발마커인 kanamycin 저항성유전자또는 basta 저항성유전자등은환경위해성및동물위해성을초래할가능성이있어, 이를이용하여제작된형질전환식물체의상업화를위한위해성및안정성평가에많은시간과비용이요구된다. 또한유럽연합은 2004년부터형질전환작물에 임상적으로사용되는 항생제대한저항성유전자의사용을금지하고있는실정이다. 또한복수유전자또는전체대사계관련유전자를도입하기위한유전자집적 (gene stacking) 은동일선발마커를사용하는형질전환으로는불가능하다. 따라서원하는유전자만이도입된형질전환작물의개발을위해서선발마커제거용형질전환벡터제작및이를이용한형질전환작물의개발은형질전환작물의조기품종화에매우중요하다. 마커-프리형질전환식물체를제작하기위한다양한방법이개발되어이용되고있다. 도입하고자하는유전자를가진벡터및선발마커를가진벡터로형질전환후후대에서도입유전자만이삽입된개체를선발하는 co-transformation 방법 (Dale and Ow, 1991; Ebinuma et al., 2001), 역선발마커를사용하는 co-tranforamtion 방법 (Park et al., 2004) 및 site-specific recombinase를이용하여선발마커를제거하는방법 (Zou et al., 2001) 등이보고되어마커-프리형질전환식물체의제작에관한관심이증대되고있다. 본연구에서는마커-프리형질전환시스템을활용하여유용형질에관련된유전자를도입한형질전환작물을제작하고자하였으며, 연구결과로개발된 마커-프리형질전환식물체 는조기에산업화가가능할것으로판단되며 선발마커제거용형질전환벡터 는다양한종류의마커-프리형질전환작물의개발에활용될것으로판단된다

14 제 2 장국내외연구개발현황 최근유가상승과더불어국제곡물가격이급격히상승하고있으며우리나라의주곡인벼의경우 2007년 12월시카고선물가격이 1년전에비해 33% (13.25$/100 파운드 ) 상승하여 1988년이래최고치를경신하여에그플레이션 (Agflation) 에대한우려가현실화될가능성이있다. 또한바이오에너지수요및세계인구증가에따라곡물소비가 2000년이후 7.5% 증대된반면생산증가율은 5.4% 에그쳐세계곡물재고량이감소하고있으며, 획기적인생산량증대방법이없는한국제곡물분쟁의소지가점차심화되고있다. 형질전환식물체의제작에흔히사용되는 kanamycin 등항생제의저항성유전자를사용하지않거나, 사용후항생제저항성유전자를제거하기위한연구가많이수행되어왔다. 서론에서언급된 co-transformation 방법및 site-specific recombinase를활용하는방법외에형질전환벡터에두개의 T-DNA를도입하여형질전환후세대를거쳐항생제저항성유전자는존재하지않고원하는유전자만이도입된형질전환체를선발하는기술이개발되었으며 (Komari et al., 1996; McCormac et al., 2001), 최근 loxp-frt를활용한 'GM-gene-deletor' 기술이개발되었다 (Luo et al., 2007). 또한형질전환시식물의염색체로도입되는 T-DNA의 border를대신하여식물체에서유래한 T-DNA와유사한서열인 P-DNA를사용한형질전환식물체의제작에관한연구결과 (Rommens et al., 2004 및 2005) 가발표되기도하였다. 식물체에서유래한 DNA 서열만을이용한소위 intragenic modification' 또는 cisgenic modification' 에관한관심이증대되고있는실정이다 (Romens et al., 2007). (1) 국내연구현황 선발마커를이용하지않고 T-DNA 내부에목적유전자를클로닝하여직접벼에도입하고 PCR에의하여형질전환체를확인하는방법이명지대김주곤교수, 국립식량과학원김율호박사에의하여시도되고있음 KAIST 정원일교수연구실에서는본과제와이전에 Cre/loxP 시스템을시도한바있음 한국생명공학연구원 (KRIBB) 의전재흥박사는식물유래유전자인 BiP 등을목적유전자와동일한벡터에클로닝하여형질전환하고스트레스를주어형질전환체를스크리닝하는방법을시도한바있음 (2) 국외연구현황 목적유전자를도입한마커-프리형질전환체를제작하기위해다양한방법에관한연구가지속적으로수행되어왔음. 이를위해마커만을포함하는벡터와목적유전자를포함하는벡터를동시에형질전환후선발을통해목적유전자만을가지는형질전환체를획득하는 co-transformation 방법, 하나의벡터에두개의 T-DNA ( 마커를포함하는것과목적유전자를포함하는것 ) 를

15 삽입하여형질전환후목적유전자만을가지는형질전환체를획득하는방법, 선발마커를사용하지않으며목적유전자만을가지는벡터로형질전환후형질전환체를 PCR 등의방법으로선발하는방법, site specific recombination 방법을도입하여선발마커를이용한선발후선발마커를제거하는방법등에관한연구가수행되었음. 또한대상작물의유전체정보를활용하여도입하고자하는유전자및 T-DNA를대상작물에서유래한 DNA로구성하여이른바 cis-genic 형질전환체를생산하고자하는연구가수행되고있음. 이러한노력에도불구하고항생제저항성유전자를활용하여목적유전자를도입한형질전환체의제작이일반적으로수행되고있음

16 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절선발마커제거용형질전환벡터제작및활용 1. 선발마커제거용형질전환벡터의제작 (1) 선발마커제거용형질전환벡터, psycan 및 psycah 기존의연구를통해연구팀에서확보하고있던선발마커제거용형질전환벡터 (psycan 및 psycah, 한국특허등록 ) 는항생제저항성유전자로카나마이신및하이그로마이신저항성유전자를가지고있어이를이용한형질전환체선발이가능하며, 특정화합물 (tunicamycin) 에발현이유도되는프로모터에 Cre recombinase가연결되어있어도입하고자하는유전자 (Gene of interest) 를제외한항생제저항성유전자를제거할수있으며역선발마커로미생물에서유래된 deacetylase 유전자 (arge) 를포함하고있어항생제저항성유전자의제거여부를확인할수있는구조를가지고있다 ( 그림 1). 그림 1. 선발마커제거용형질전환벡터, psycan 및 psycah 의구조 (2) 선발마커제거용형질전환벡터, ptsycan 및 ptsycah 식물의발달과정, 특이화분의발달과정에서특이적으로 Cre recombinase가발현되어항생제저항성유전자가제거될수있는벡터를제작하기위하여담배의 tapetum specific 프로모터인 TA29 프로모터 (Kriete et al., 1996) 을이용하였다. 해당프로모터를담배로부터 PCR 방법으로클로닝하고 psycan 및 psycah의제작에사용된 Bip-L 프로모터와치환하여 ptsycan 및 ptsycah를완성하였다 ( 그림 2). 두종류의프로모터는 tapetum에서특이적으로활성을나타내는 TA29 프로모터에 Cre

17 recombinase 가연결되어있으며, 항생제저항성유전자의제거여부를확인할수있는역선 발마커인 arge 유전자를포함하고있다. 또한 kanamycin 및 hygromycin 을활용하여선발 할수있도록각항생제저항성유전자를가지고있어형질전환이가능하도록제작되었다. 그림 2. 선발마커제거용형질전환벡터, psycan 및 psycah 의구조 (3) 형질전환용발현벡터의제작및형질전환해양미생물 (Flavobacterium sp.) 에서유래한 carotenoid 4,4' oxygenase (crtw) 유전자는 beta-carotene을기질로 astaxanthin을생합성할수있는유전자로알려져있으며 ( 그림 3), astaxanthin은토코페롤보다 100배이상의항산화능력을가지고있어항암및항노화활성을가지고있으며면역증강및항고혈압효과가있어의약품및화장품원료로사용되고있다 (Higuera-Ciapara et al., 2006). 식물의경우 ketocarotenoid 생합성경로는존재하고있지않아 kekocarotenoid 생합성경로를도입하기위한연구가진행되고있다 (Ralley et al., 2004). 본연구에서는 crtw 유전자를도입한형질전환체를제작하기위하여선발마커제거용형질전환벡터 (crtw-psycan) 를활용하였으며, 이를토마토의형질전환및애기장대의형질전환에사용하였다 ( 그림 4)

18 그림 3. Carotenoid 생합성경로및 crtw 에의한 astaxanthin 의합성 그림 4. 마커프리 crtw 형질전환체제작용형질전환벡터의구조 또한제1협동과제에서확보하고있는 HOB1 유전자가도입된형질전환애기장대는수분스트레스에대한내성이증가되며 ( 그림 5) 형질전환체의종자크기가증가되는특성을가지고있다 ( 한국특허등록 , 한국특허등록 ). 또한 HOB1 유전자도입형질전환벼는수분스트레스에대한내성이크게증가되는특성을나타내어 ( 그림 5), 선바마커제거용형질전환벡터의제작에활용하였으며 ( 그림 6) 제작된 HOB1-pSYCAH을형질전환에이용하였다

19 그림 5. 애기장대유래 HOB1 유전자도입형질전환체의특성 그림 6. 마커프리 HOB1 유전자도입용형질전환벡터의구조 2. 선발마커제거시스템의확립 (1) 형질전환애기장대의제작및선발마커제거본연구에서제작하여활용하는선발마커제거용형질전환벡터를활용한형질전환체제작에있어, 선발마커제거시스템을확립하고자 crtw-psycan 및 crtw-psycah를이용하여형질전환체를제작하고제작된형질전환체에서형질전환벡터의제작에활용된특성을

20 활용하여선발마커를제작하는방법을확립하고자하였다. 일반적인애기장대의형질전환방법 (floral dip) 을활용하여형질전환 T0 종자를제작하고, kanamycin 또는 hygromycin을이용하여형질전환체 (T3) 를확보하고이를선발마커의제거에이용하였다. 항생제저항성마커를제거하기위해 tunicamycin (0.01 μg/ml ~ 0.1 μg/ml, 4시간 ) 을처리하여 Cre recombunase의발현을유도하였다 ( 그림 7). 이들식물체에서선발마커의제거여부를확인하기위해, N-acetyl phophinotricin (1 μg/ml) 를두시간처리하였다. 그림 7. 선발마커제거를위한 tunicamycin 처리농도규명 최종적으로선발된 63개의개체에서도입하고자했던유전자 (crtw) 의존재및항생제저항성유전자 (NPT II), 역선발마커유전자 (arge) 및 Cre recombinase이형질전환체의 genome내에존재하는지를 PCR로분석하였다 ( 그림 8). crtw 유전자의경우거의모든식물체에서확인된반면, 선발마커유전자 (NPT II) 및선발마커제거를위해이용된유전자 (arge 및 Cre recombinase 유전자 ) 는일부식물체에서만 PCR 밴드를확인할수있었다. 이는본연구에서사용된선발마커제거용벡터가정상적으로작동하였음을나타내었으며약 10% 의효율 (63개체중 6개체 ) 로선발마커가제거되었음을나타낸다

21 그림 8. 선발마커제거여부확인을위한 PCR 분석 (2) 형질전환애기장대에서도입유전자의위치확인형질전환체의 genome내에도입유전자의위치를확인하는것은형질전환식물체안전성확보에중요한과정이다. 또한선발마커의제거과정에서제거부위의염기서열을확인할필요성이있다. 항생제저항성유전자, arge 유전자및 Cre recombinase 유전자가제거된것으로확인된개체의 genomic DNA를 template 및 < 그림 9> 에서표시된프라이머 (psycan-f 및 crtw-r) 를사용하여 PCR을수행하고확보한밴드의염기서열을확인한결과, T-DNA는애기장대의유전자 At4g47450의프로모터부위에삽입되었음을확인하였다. 또한 Cre recombinase의 target인 loxp를두개가지는것으로확인할수있었으며, PCR 분석으로확인되었던항생제저항성유전자 (NPT II), 역선발마커로사용된 arge 유전자및 Cre recombinase 유전자가해당애기장대의 genome 내에는존재하지않음을확인할수있었다

22 그림 9. 애기장대 genome 내도입유전자의위치확인

23 제 2 절마커프리형질전환벼개발 1. 유용유전자기능분석 (1) APUM24/OsPUM24와 OsRBP3의기능분석애기장대에서 PUF domain을포함하는 25종의 RNA결합단백질중한종인 APUM24(Nomenclature에따라 AtPUM4에서 APUM24로개명 ) T-DNA 돌연변이애기장대의종자크기가작아진점에착안하여 ( 그림 1, 그림 2), 35S::APUM4 과발현체를만들었다 ( 그림 3). 야생형애기장대에비하여 apum24 돌연변이체는발아지연과뿌리생장저해현상을나타냈고 ( 그림 2), 식물체의크기가작았으며종자의발달이억제되었다 ( 그림 1). 한편, 35S::APUM24 과발현체는야생형에비하여뿌리의길이가길었고유식물체의건물중량이증가하였다 ( 그림 4). 돌연변이체와과발현애기장대실험으로부터 APUM24는식물의생장발달과정에기여하는것으로판단되었고, 애기장대와는달리종자의대부분이배젖인벼에서 35S::APUM24 또는 APUM24의벼 ortholog의기능을조사할필요가있었다. 벼에는 20종의 PUF domain 단백질이있는것으로분석되었으며, 이들중 Os3g61560이 APUM24 와가장유사한것으로보고된바있다 (Abbasi et al., 2010). 그림 1. 애기장대의 PUF domain RNA 결합단백질인 APUM24 의돌연변이체의표현형. ( 왼쪽 ) 25 종의애기장대 PUF 단백질의 phylogeny. ( 오른쪽 ) Wild-type Col-0 와 apum24-2 돌연변이체표현형. 흰색삼각형은종자발달에문제가생겨함몰된부위를나타냄

24 그림 2. 애기장대 apum24-2 돌연변이체의초기생장. (A) 파종후 6 일간의발아율비교, (B) 파종 6 일후의뿌리길이, (C) 유식물체의뿌리길이 그림 3. APUM24 과발현체의초기생육. (A) 유식물체의뿌리길이, (B) 과발현형질전환체라 인의유전자발현을보기위한 RT-PCR 결과, (C) 파종 6 일후의식물체무게, (D) 파종 6 일 후에측정한 1 차근의길이 애기장대 APUM24 동일하게 OsPUM24는 5개의 Puf domain을포함하고단백질 1차구조가거의유사하였다 ( 그림 4A). Os03g61560 유전자의기능을규명하고자포항공대의 T-DNA mutant 라인 3종을분양받아 genotyping하였고, 변이체중에서 null mutation을보이는 heterozygote 식물체 (PFG_4A_01748) 를선별하였다 ( 그림 4B,C). Heterozygote에서수확한종자를파종하여 45개체를 genotyping하였지만 homozygote 라인을얻지못하였다

25 이는 OsPUM24가벼생장에필수적일가능성을시사한다. Heterozygote 돌연변이체를 2010년가을에파종하여겨울에표현형을관찰한결과모개체인동진과달리종자의등숙률이현저히낮아졌다 ( 그림 4D). 과제종료와관계없이 heterozygote로부터약배양을실시하고있으며, 배우체형성기또는 zygote 형성초기에문제가생겼는지확인할수있을것이다. OsPUM24 유전자의과발현체를만들기위하여옥수수 ubiquitin 프로모터와 RT-PCR 에의하여얻은 Os03g61560 cdna를결합하여 pcambia1301에클로닝한후동진벼에형질전환하였으며, ospum24 변이에체 APUM24, OsPUM24 cdna를과발현시켜표현형복구여부를조사중에있다. 그림 4. APUM4의벼 ortholog 유전자 (OsPUM24; Os3g61560) 에대한 POSTECH T-DNA 라인스크리닝및표현형. (A) OsPUM24 단백질에포함되어있는 Puf RNA 결합도메인, (B) T-DNA 삽입부위. (C) OsPUM24 변이체의 genotyping. (D) Heterozygote OsPUM24 변이체의종자표현형 OsPUM24의기능을추론하기위하여세포내위치를 35S::GFP-OsPUM24를옥수수원형질체에형질전환하여 confocal 현미경하에서관찰하였다 ( 그림 5). OsPUM24는인에존재하는존재하는것으로확인되었으며, 세포내위치로보아인에서일어나는 RNA 대사에관여할것으로예상되었다. 벼의 homozygote 돌연변이체를얻지못하여실험에이용할재료를확보하지못하였기때문에, 애기장대돌연변이체를이용하여인에서일어나는대표적인 RNA 대사인 rrna 프로세싱을조사해보았다 ( 그림 6). Total 및 poly(a) RNA를이용한 Northern blot 실험결과애기장대돌연변이체는 5.8S와 ITS2 지역에서프로세싱에문제가있는것으로확인되었다

26 그림 5. 35S::GFP-OsPUM24 를일시발현을통한옥수수원형질체에서 OsPUM23 의세포 내위치확인. mrfp-osabf1 은핵에존재하는것으로확인된마커 (Amir Hossain et al., 2010). 그림 6. apum24 변이체에서잘못된 rrna 프로세싱. (A) rrna Northern blot 분석에이용한탐침 ( 검은선 ). (B) total 및 poly(a) RNA Northern blot 결과. (C) 5.8S rrna와 ITS2의 misprocessing. (D) 5.8S와 ITS2의프로세싱부위를찾기위한 crt-pcr

27 애기장대 apum24 변이체에서나타난 rrna 프로세싱은 rrna 프로세싱에관여하는 snorna 생성에기인하는것으로나타났다 ( 그림 7). 또한, rrna 프로세싱결핍이리보솜 구성단백질인 40S 와 60S subunit 의단백질의 RNA 발현에영향을미쳤다 ( 그림 7). APUM24, OsPUM24와유사하게종자긔크기를조절할가능성이있는또다른유전자인 OsRBP3의기능을조사하고자하였다 ( 그림 8). OsRBP3 RNAi 형질전환체는종자의크기가컸으며, 과제종료시점에서아직도유전자의기능을확인하지못하였기때문에게속연구를수행할계획이다. 그림 8. OsRBP3 의 RNAi 형질전환식물의종자크기 (2) AtDof5.1 기능분석 AtDof5.1 유전자의기능을애기장대에서확인하고, 이유전자를동진벼에형질전환하여

28 표현형을관찰하였다. 유전자기능은 activation tagging mutant, complementation test, 35S::AtDof5.1과 dominant-negative 형질전환체를이용하여표현형과유전자의연관성을확인한연구와, GST fusion 단백질을이용한 target 유전자프로모터 EMSA 실험으로규명하였다 ( 그림 9). AtDof5.1은과발현시잎이말리는특징이있으며, 벼유도성프로모터를이용한과발현형질전환체에서도이러한표현형이관찰되었다 ( 그림 11). 특징적으로애기장대과발현체는리그닌양이줄어 endodremis를포함한 cortex층이 wild-type에비하여두꺼워졌고, 셀룰로스합성이현저히떨어졌다 ( 그림 9). 그림 9. 5 주된 wild-type 애기장대와 AtDof5.1 유전자의발현이증가된 Dof5.1-D 식물 체에서잎표면 (a), 잎횡단면 (b) 과줄기의 cortex 층 (c) 에서세포의형태적인차이. 막 대 =20 μm. 그림 10. AtDof5.1 단백질에의하여 REV 유전자의발현이증가하고 (a), REV 프로모터 에존재하는 TAAAGT 염기서열을제거할경우 (b) 프로모터에 AtDof5.1 이결합하지 못하는것을보여주는 EMSA 실험 (c)

29 AtDof5.1 단백질은 REV 유전자의프로모터에결합하여전사를활성화시키는것으로확인되었고 inverted repeat 형태로존재하는 "TAAAG...ACTTA" sequence를인식하였다 ( 그림 10). 한편, 벼 Dof5.1 유전자유도성과발현체의잎발달과정에서리그닌감소와잎이말리는현상을관찰하였으며 ( 그림 11), 따라서애기장대 Dof5.1 유전자와유사한기능을하는것으로판단되었다. 그림 11. Dexamethasone (DEX) 유도성프로모터하에서애기장대 Dof5.1 의발현. 2. 벼형질전환검정및마커프리벼의특성분석 (1) APUM24 및 HOB2의머커프리벡터제조 AtPUM4(APUM24로명칭변경 ) 와 HOB2 유전자를 psycah, psycan에클로닝하였다, 이때 CaMV 35S 및옥수수 ubiquitin 프로모터를이용하여쌍자엽작물과벼에서발현할수있는벡터를제작하였다 ( 그림 12). 우선 APUM24와 HOB2 유전자는 35S 프로모터조절하에 pcambia1301에클로닝하여기존에연구실에서쓰는 Agrobacterium AGL1을이용한형질전환을수행하였다. 제1세부과제에서제작한 HOB2 유전자 marker-free 벡터 (psycah-hob2) 의형질전환벼를 35개체확보하였다. 벡터제거여부를마커유전자와 HOB2 특이적유전자 primer를사용하여 PCR을수행하여마커가제거된효율을과제아직도검정중에있다. HindIII (8041) NotI (9779) RK2 oriv NPT II RB BiP-L CREi HindIII (7939) psycah TrfA 9967 bp HindIII (3338) LB EcoRI (3350) arge PstI (3360) XmaI (3362) HPH Sma I (3364) BamHI (3368) NotI (3387) XmaI (3437) NotI (9622) RK2 oriv NPT II RB BiP-L CREi psycan TrfA 9810 bp HindIII (3338) LB arge EcoRI (3350) PstI (3360) NPT II XmaI (3362) Sma I (3364) BamHI (3368) 그림 12. psycah-hob2와 psycah-atpum4(apum24) 마커프리벡터. 35S와옥수수 ubiquitin 프로모터하에서상시적으로발현되는벡터제작 Sma I (3439) Not I (3387)

30 제 3 절화본과작물에서의선발마커제거시스템확립및대량 형질전환작물개발 1. 재료및방법 가. 실험재료본연구는형질전환벼의실용화를목표로선발마커가제거된형질전환벼를생산하기위해수행되었다. 공시재료로는국내벼품종일미벼를이용하였으며, 2,4-D 2 ppm이포함된 N6 배지에서 embryogenic callus 를유도한후목적유전자인 HOB1 유전자와선발마커제거시스템으로제작된 CRE/loxP-argE 가탑재된 psycah vector 를이용하여 Agrobacterium 매개형질전환을수행하였다. 본연구를위한 psycah vector 는한국생명공학연구원 (1과제책임자권석윤박사 ) 으로부터분양받아사용하였는데, 이 psycah vector 에는 site-specific recombination system 인 CRE/loxP system 과선행연구에서음성선발마커유전자로사용된 arge 유전자를동시에포함하고있다. 또한선발마커유전자의제거와 marker-free 관련유전자의제거는 tunicamycin 에의한 CRE recombinase 의발현으로이루어지도록제작되었다. 재분화단계에서의형질전환식물체음성선발을위해 N-AcPt 를이용하였고, CRE/loxP 의발현을위해 tunicamycine 을이용하였다. 나. Agrobacterium을이용한효율적인벼형질전환시스템확립형질전환식물체생산을위한 MS기본배지의 phyto-hormone(kinetin 및 NAA), carbon source(sucrose, maltose, sorbitol) 의종류및비율을조절하여 callus 유도및재분화등조직배양시스템의효율을개선하고자하였다. 따라서 Agrobacterium 및 acetosyringone 농도와 Agrobacterium 의 callus cell 로의 infection 조건을조절하여효과적인형질전환이이루어지도록개선하였다. 다. 효율적인선발마커 - 프리형질전환시스템개발을위한 arge 음성선발마커유전자의 활용성확립 (1) arge 유전자의음성선발원리및 N-A cpt 의생산 음성선발마커유전자로사용되는 arge 유전자는오르니틴디아세틸레이즈 (Ornithine deacetylase) 로인코딩되며, 식물비독성 Acetyl-Phosphinothricin (N-AcPt) 는이 arge 유전자에의해탈아세틸화됨으로써독성을나타내는 Phosphinothricin (DL-PPT) 으로전환되어음성선발효과를보이게된다 ( 그림1-1). 따라서본연구에사용된 CRE/loxP-argE 시스템에서음성선발로이용되는 N-AcPt 의활용성을확립하기위하여기개발된 arge-hpt 형질전환식물체의잎과종자를대상으로음성선발방법개발및조건을구명코자하였다. 또한위시험에사용한 N-AcPt 는상용화되고있는 DL-PPT (250mg PPT/5ml ddh2o) 를

31 20ml 의 AcOH anhydride 와 Tetrahydrofuran (THF) 을이용한유기합성법으로아세틸화시 켜자체제작하여사용하였다. ( 그림 1-2) 그림 1-1. arge 유전자에의한 N-AcPt 의화학적변화 그림 1-2. 유기화학적방법에의한 N-AcPt 의생산 (2) 화학적으로변화된 N-AcPt의식물독성평가및음성선발효과 Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy 를통해유기합성법으로제작된 N-AcPt의화학적변화를확인하였다. L-PPT의 N-AcPt 전환시식물비독성변화를확인하기위해 wild-type 의벼종자의발아및캘러스재분화실험을수행하였다. 또한기개발된 arge-hpt 유전자가도입된형질전환벼종자를 N-AcPt 가포함된배지상에서발아시킴으로써 N-AcPt/argE 음성선발효과를확인하였다. 상용화되고있는 PPT와화학적으로아세틸화된 N-AcPt 를각각 5, 10, 15 mg/l 포함한

32 MS 기본배지로부터 wild type 벼종자를대상으로발아시험을수행하였다. 이론적으로식물독성을나타내는 PPT를포함한각배지에서는종자가발아되지않아야하며, 화학적으로변화된 N-AcPt 에서는식물비독성이나타나야하므로종자발아가이루어져야한다. 또한효과적인음성선발확립을위해 5-30 mg/l의다양한농도의 N-AcPt를포함하는배지에서 arge-hpt 형질전환벼종자 (T1) 의발아시험을수행하였다. 라. CRE/loxP-argE 시스템을이용한 Agrobacterium 매개형질전환벼획득 (1) CRE/loxP-argE 를이용하기위한효과적인재분화체계확립 본연구에서사용된 CRE/loxP-argE 시스템에서 CRE recombinase 의발현은 tunicamycin 에의해이루어지도록제작되어있다. Agrobacterium 에의해 Cre/loxP 가도입된 embryogenic 로부터재분화식물체를획득하는단계에서 plant cell 에영향을주지않는동시에유전자를발현시킬수있는적정농도의 tunicamycin 농도조건을구명해야한다. 따라서본연구에서는 mg/l의 tunicamycin 을각각포함한재분화배지에서 wild type 벼종자로부터유기된 callus 를대상으로재분화및녹체형성율을확인하였다. (2) Agrobacterium 적정농도및감염조건확립 실험에사용된 psycah 벡터는기존식물형질전환에사용된 kb 정도의벡터와비교했을때 10 kbp 정도의약 3배가량큰 size로형질전환및 callus 재분화에어려움이있어 Agrobacterium 의적정농도및벼형질전환켈러스의재분화체계재확립이필요하였다. 따라서다양한농도의 Agrobacterium 및 acetosyringone 처리와 Agrobacteirum 공동배양온도및처리기간을달리하여형질전환효율을증대하고자하였다. 마. CRE/loxP-argE 시스템을이용하여획득한형질전환벼의마커 - 프리여부확인 CRE/loxP-argE 시스템을이용하여획득한약 50여개의형질전환체로부터삽입유전자인 HOB1 유전자도입및선발마커유전자 ( 하이그로마이신저항성, hpt gene) 와선발마커제거관련유전자 (CRE, arge gene) 의제거여부를확인하기위해 CTAB 추출법을이용한 genomic DNA를추출후 PCR 분석을수행하였다

33 2. 연구결과및고찰 가. Agrobacterium 을이용한효율적벼형질전환시스템구축 Agrobacterium 매개형질전환의 target material 인 embryogenic callus 의생산및 callus 재분화를위한조직배양시스템을구축하였다. 벼배반유래 callus 의유도및재분화를위해 N6(Chu' ) 및 MS 기본배지를이용하였으며, phyto-hormone 은조직배양단계에따라 2,4-D 및 kinetin 과 NAA를이용하였다. 또한 carbon source 로는 sucrose 와 maltose 를이용하였다. Callus 유도및재분화등조직배양시스템의효율개선을위해배지상의 phyto-hormone, carbon source 의종류및비율을조절하여적정배지조건을구축하였다. 2 mg/l의 2,4-D phyto-hormone 을포함하는 N6(CHU) 를기본으로하는 2N6, NB3, NB4 배지에서의캘러스유도효과를확인한결과, NB3 배지에서의캘러스유도가가장좋은것으로확인되었다. NB3 배지에는 2N6 배지에서사용한 proline 의함량보다많은양이포함되어있는데, 이는캘러스가조직배양과정중스트레스에의해갈변화되는현상을감소시키는효과가있다. 또한 NB4 배지는 NB3의 sucrose 대신 maltose 를넣어캘러스증식을증가하고자하였으나, 캘러스가투명하게덩어리지는것으로보아효과적인단일캘러스선발에어려움이있을것으로보이며, 2N6 배지에서의캘러스는형태적으로좋았으나쉽게부서지는단점이있었다. 따라서본연구에서는 NB3 배지로부터유기된 embryogenic callus 를선발하여시험재료로사용하였다.( 표 2-1, 그림 2-1) 표 2-1. Embryogenic callus 유도를위한배지조성 2N6 NB3 NB4 N6 4 g 4 g 4 g Casamino acid 0.3 g 0.3 g 0.3 g proline 0.5 g 2.9 g 2.9 g Sucrose 30 g 30 g - Maltose g 2,4-D 2 ml 2 ml 2 ml Glutamine 0.5 g 0.5 g 0.5 g N-B vts. - 1 ml 1 ml N-B micro - 1 ml 1 ml myo-inositol g 0.1 g gelrite 2.5 g 2.5 g 2.5 g ph 나. CRE/loxP-argE 시스템의원리 CRE/loxP-argE 시스템은마커 - 프리형질전환작물을생산하기위한전략들중

34 site-specific recombination 시스템의하나인 CRE/loxP 시스템을적용한것으로본연구에사용된 psycah 벡터는두개의 loxp site 사이에양성선발마커유전자인하이그로마이신저항성을나타내는 hpt 유전자가포함되어선발마커유전자가 tunicamycin 에의한 CRE recombinase 발현에의해식물체재분화단계에서 auto-excision 되도록제작되었다. 또한음성선발마커유전자로서 arge 유전자를동시에사용하여선발마커유전자의제거가보다안정적이고정확하게이루어지도록하였다. ( 그림 2-2) 2N6 NB4 NB3 그림 2-1. 배지조성에따른 callus 의형태적차이 그림 2-2. site-specific recombination 시스템의선발마커제거원리

35 다. arge 유전자의기질로사용되는 N-AcPt 의제작 arge 유전자는오르니틴디아세틸레이즈로인코딩되며, 비독성인 N-AcPt 는이유전자에의해독성을나타내는 PPT로바뀌게된다. 이 arge 유전자를본연구에음성선발마커유전자로사용하기위해 N-AcPt 를유기합성법으로자체제작하였으며, 이의활용성을구명하였다. 상용화되고있는 L-PPT를 Acetic acid anhydride와 tetrahydrofuran 을이용하여아세틸레이션후 Evaporation 한 N-AcPt 를 Thin Layer Chormatography (TLC) 및 NMR spectroscopy 를통해화학적변화를확인하였다. NMR 분석을위한 solvent 로 D2O를사용하였으며 peak 의이동이다운된것으로보아 PPT의화학적변화가이루어진것을확인할수있었다. ( 그림 2-3) 그림 2-3. NMR spectroscopy 를통한 N-AcPt 의화학적변화확인 DL-PPT 의 NMR data ( 좌 ) 와유기합성법으로제작된 N-AcPt ( 우 ) 라. N-A cpt 의독성평가및음성선발효과확인 (1) N-A cpt 의독성평가 화학적변화가확인된 N-AcPt의독성평가를위해 wild type 벼종자를이용한종자발아시험을수행하였다. Phyto-hormone 이포함되지않은 MS 배지에 5-30 mg/l 농도범위의 N-AcPt 와 5-15 mg/l 농도범위의 L-PPT 를첨가한후종피를제거한 wild type 벼종자를파종하여발아시험을수행하였다. N-AcPt 를포함한배지에서는종자의발아가억제된 PPT 와확연한차이를보이며 30 mg/l 고농도의처리까지발아되어 N-AcPt 가효과적으로성분이변화했음을확인할수있었다. ( 그림 2-4) 또한 N-AcPt 의재분화단계에서의사용을위해 wild type 벼종자에서유기된배발생 callus 로부터재분화를관찰한결과종자발아시험결과와마찬가지로 30 mg/l 이상의고농도 N-AcPt 의사용이가능한것으로확인되었다. ( 그림 2-5)

36 (2) 형질전환체로부터 N-AcPt 의음성선발효과확인 식물비독성이확인된 N-AcPt 는기개발된 arge-hpt 형질전환체로부터 ( 그림 2-6) 음성선발효과를확인하기위해 5-30 mg/l의다양한농도를포함한 MS 기본배지를만들어사용하였다. 그결과저농도의 N-AcPt 를처리한배지에서는크게선발효과를관찰할수없었으나, mg/l 이상의고농도에서 N-AcPt 의음성선발효과를확인할수있었다 ( 그림 2-7). 5-6 mg/l의비교적낮은농도의 PPT 사용과의차이는 N-AcPt 가 PPT 로부터유기합성으로화학적변화를주는오랜과정의영향으로사료되며, 30mg/L 이상의고농도에이르기까지식물비독성을확인하였으므로고농도의 N-AcPt 의음성선발로의사용이문제가되지않을것으로판단된다. 그림 2-4. Wild type 벼종자로부터 N-AcPt 의식물독성평가 10 mg/l N-AcPt 15 mg/l N-AcPt 30 mg/l N-AcPt 그림 2-5. wild type 벼종자에서유기된배발생 callus 로부터 N-AcPt 의식물세포독성평가

37 그림 2-6. arge 유전자의기질로작용하는 N-AcPt 의음성선발효과를확인하기위해실험재료로사용된기개발된 arge-hpt 형질전환체의 T0 및 T1 plants의 PCR 분석 data. A; arge-hpt 형질전환 T0 plants 일부의 PCR 사진 B; A에서확인된 T0 라인의 T1 plants( 하이그로마이신무처리 ) C; B와동일라인에서하이그로마이신으로선발된 T1 plants ( 하이그로마이신처리 ) A B 그림 2-7. 형질전환체로부터 N-AcPt 의음성선발효과확인

38 식물비독성으로성분변화가확인된 N-AcPt 의형질전환체로부터의음성선발효과를확인한결과저농도의 N-AcPt 를처리한배지에서는크게선발효과를관찰할수없었으나, 30 mg/l의고농도에서는 B에서보이는것처럼종자가발아시작후성장이억제되는음성선발효과가확인되었다. 마. CRE/loxP-argE 시스템의사용을위한 tunicamycin 항생제의적정농도조건구명 CRE/loxP-argE 시스템에서마커유전자제거를위한 CRE recombinase 의발현은 tunicamycin 에의해이루어지도록제작되어있어적정농도의 tunicamycin 사용을위한재분화시스템확립이필요하다. 따라서 mg/l의다양한농도의 tunicamycin 을포함하는재분화배지에서의 callus 재분화효율을확인한결과, mg/l의 tunicamycin 을포함한배지에서의 callus 재분화효율이좋은것으로확인되었으며녹체형성율은 0.05 mg/l를사용한경우보다 0.1 mg/l를사용한경우더좋은것으로확인되었다 ( 그림 2-8). 0.1 mg/l tunicamycin 0.5 mg/l tunicamycin 그림 2-8. Tunicamycin 농도에따른 callus 재분화 바. CRE/loxP-argE 시스템을이용한 Agrobacterium 매개형질전환벼개발 (1) psy CA H 벡터 본연구에사용된 psycah 벡터는한국생명공학연구원 ( 권석윤박사 ) 으로부터분양받아 사용하였으며, 이 vector 에는 site-specific recombination system 인 CRE/loxP system 과음

39 성선발마커유전자로 arge 유전자를동시에포함하고있다. ( 그림 2-9) 그림 2-9. psycah vector (2) CRE/loxP-argE 시스템을이용한 Agrobacterium 감염및공동배양 CRE/loxP-argE 시스템을이용한형질전환벼생산을위한 Agrobacterium tumefaciens strain으로 AGL0를사용하였으며, 50 mg/l kanamycin을포함한 AB 배지에서약 3일간배양하여약 일간유기하여선발한 callus 에감염시켰다. callus 는노란색을띄고단단한 compact type의 callus 를선발하였으며, 한처리당약 개의 callus 를사용하였다. 선발된 callus 는멸균된 liquid AAM 배지약 25ml 에 3일간배양된 Agrobacterium 을넣어잘현탁되도록한후 spectrophotometer 를이용하여 Agrobacterium cell 농도를 OD 로맞추어사용하였다. 이때 200μM 의 acetosyringone (AS) 을 Agro-AAM 현탁액에넣어주는데이의사용은기존형질전환시 100μM 사용의 2배높은농도로공동배양시 callus 형질전환효율을보다높여준다. Agrobacterium 공동배양에는 2N6-AS (100μM) 배지를사용하여약 7-10 일간 25 암조건으로배양하였다. (3) Hygromycin 선발및식물체재분화 약 7-10 일간배양된형질전환 callus 는 cefotaxime 이포함된멸균수로세척후 50 mg/l hygromycin 이포함된 NB4-CH 배지에서약한달간 1차 callus 선발을수행하였다. 선발된 callus 는선행된재분화조건에서 27 광배양하는데, 이때 50 mg/l hygromycin 이포함된 MSRK5SS 배지에서약 4주간 1차재분화후 0.1 mg/l의 tunicamycin 을포함한배지에서계속적인재분화를유도하였다. 이는기존에 hygromycin 과 tunicamycin 을동시에포함하는배지에서재분화하였을경우보다약 2% 정도높은재분화율을확인할수있었으며 ( 그림

40 2-10), 이는여러개의항생제를동시에처리하여 callus 재분화를유도하는것보다식물세 포에덜무리를주는것으로판단되어진다. 위형질전환을수행하기위해사용된배지종류 및조성은표 2-2 와같다. ( 그림 2-11, 그림 2-12) 그림 기존재분화배지및개선된배지조건에서의재분화율비교그래프 (4) 획득한 psy CA H 형질전환벼의 PCR 분석 CRE/loxP-argE 시스템을이용한 Agrobacterium 매개형질전환방법으로총 50여개의형질전환체를획득하였으며, 이들중약 97% 의효과적인형질전환이이루어졌다. 또한본시스템으로개발된약 50여개의형질전환체에이용된 HOB1 유전자와선발마커유전자 (hpt gene) 및선발마커제거관련유전자 (CRE, arge gene) 의 PCR 분석을수행하였다. 형질전환유전자확인을위한 primer sequence 및 PCR 조건은표 2-3 와같다. 형질전환에이용된 plasmid vector 를 control 로한 PCR 분석에서각각 483 bp(hob1) 및 722 bp(hpt), 1158 bp(arge), 925 bp(cre) 의존재를확인할수있는 band를얻었다 ( 그림 2-13). 그러나동일 plasmid vector 를이용하여획득한형질전환벼각각의 line에서는양성선발마커로이용된 hpt gene을비롯한 arge gene과 Cre gene 등이확인되지않았다. 전체획득한형질전환체의약 60% 이상에서선발마커 ( 하이그로마이신저항성유전자, hpt gene) 및선발마커제거관련유전자들이검출되지않았으며, 현재 transgene의안정적도입및 copy 수확인을위해 RFLP 분석을수행하고있으며, transgene의유전양상을확인하기위해 T1 세대로전개시키고있다

41 표 2-2. CRE/loxP-argE 시스템을이용한 Agrobacterium 매개형질전환시사용되는 배지종류및배지조성 Medium Composition Cultural condition Temp ( ) Place Period Embryogenic callus induction Agrobacterium culture Agrobacterium suspension and infection Co-cultivation Transgenic callus selection 1st Regeneration 2nd Regeneration Root induction NB3 AB-K AAM 2N6-AS NB4-CH MSRK5SS -CH MSRK5SS -CT MS0 N6 (Chu et al., 1975) macro salts, B5 micro salts and vitamins (Gamborg et al., 1968), 2,4-D 2mg/L, casamino acid 0.3g/L, proline 2.9g/L, glutamine 0.5g/L, sucrose 30g/L, gelrite 2.5g/L, ph5.8 AB buffer and salt, glucose 5g/L, micro-agar 15g/L, kanamycin 50mg/L, ph7.0 AA macro and micro salt, Amino acid stock, MS vitamines, casamino acid 0.5g/L, sucrose 68.5g/L, glucose 36g/L, acetosyringone 200μM, ph 5.8 N6 medium, 2,4-D 2mg/L, casamino acid 0.3g/L, proline 0.5g/L, glutamine 0.5g/L, sucrose 30g/L, glucose 10g/L, gelrite 2.5g/L, acetosyringone 100μM, ph5.2 N6 medium, 2,4-D 2mg/L, casamino acid 0.3g/L, proline 2.9g/L, glutamine 0.5g/L, maltose 30g/L, gelrite 2.5g/L, Cefotaxime 250mg/L, Hygromycin 50mg/L, ph 5.8 MS basal medium (Murashige &Skoog, 1962) 4.4g/L, proline 0.5g/L, MES 0.5g/L, sorbitol 30g/L, sucrose 20g/L, gelrite 2.5g/L, cefotaxime 250mg/L, Hygromycin 50mg/L, ph 5.8 MS basal medium (Murashige &Skoog, 1962) 4.4g/L, proline 0.5g/L, MES 0.5g/L, sorbitol 30g/L, sucrose 20g/L, gelrite 2.5g/L, cefotaxime 250mg/L, tunicamycin 0.1mg/L, ph 5.8 MS basal medium 4.4 g/l, sucrose 30 g/l, gelrite 2.5 g/l, ph dark days 28 dark 3 days dark 7-10 days 28 dark 4 weeks 27 light 8 weeks 27 light subculture 2 weeks interval 27 light 15 days

42 그림 CRE/loxP-argE 시스템을이용한 Agrobacterium 매개형질전환과정 callus 유도 Agro-infection callus 재분화 녹체형성 식물체순화및 transplantation 그림 Embryogenic callus 로부터획득한형질전환체사진

43 표 2-3. 삽입유전자확인을위한 primer sequence 와 DNA 단편크기및 PCR 조건 Genes Primer sequences Size (bp) HOB1 F) 5' -TTT TAA CTG CTG TGG GCG AC-3' R) 5' -ACG GAT GCT CCA TCT CAC AA-3' 483 bp hpt F) 5' -TCT GCT GCT CCA TAC AAG GC-3' R) 5' -AAC CTC CTC GGA TTC CAT TG-3' 722 bp arge F) 5' -GGG ATC CAT GAA AAA CAA ATT ACC GCC ATT-3' R) 5' -GGA GCT CTT AAT GCC AGC AAA AAT GGT GA-3' 1158 bp CRE F) 5' -CAA CAT TTG GGC CAG CTA AA-3' R) 5' -TGC CCC TGT TTC ACT ATC CA-3' 925 bp Temp. ( ) Time Cycle 94 5 min min min m 30s min. 1 그림 선발마커제거및도입유전자확인을위한 PCR 분석 현재까지제초제저항성및항생제저항성유전자를형질전환체생산을위한양성선발마커로이용한경우이들유전자의발현에의한환경및인체에미치는잠재적위해성으로인해실용화가어려웠다. 특히화본과단자엽식물의경우대부분식량을목적으로재배되는경우가대부분이므로, 농업적으로유용한 target 유전자만을포함하고, 인체에위해성을줄수있는선발마커가포함되지않는형질전환체의개발은매우시급한과제이다. 이를위해기존에는 target gene과선발마커유전자를독립적인 plasmid vector에탑재하여형질전

44 환체를생산하는동시형질전환법 (co-transformation) 이이용되어왔다. 이방법은멘델의유전법칙에따라목적유전자만을포함하며선발마커유전자가포함되지않은개체를선발한다는점에서형질전환체의실용화에매우근접한방법으로평가되나, 다음과같은어려움이있다. 첫째, 동시형질전환효율이매우낮고, 둘째, 목적하는형질전환체를획득하는데걸리는기간이길다는점이다. 이방법은독립된 vector에탑재된목적유전자와선발마커유전자를이용하여동시형질전환법에의해형질전환체를생산해야하는데, 형질전환체획득을위해서는위두가지유전자가모두하나의식물세포에도입되어야한다. 두가지유전자가세포에도입되는경우의수를보면, (1) 목적유전자만도입되는경우, (2) 선발마커유전자만도입되는경우, (3) 목적유전자와선발마커유전자가동시에도입되는경우등세가지이다. 첫번째경우인목적유전자만이도입되는경우는정상적인식물체를얻을수없는경우이다. 양성선발마커유전자는 Agrobacterium 처리후유전자가도입된세포를선발하고재분화과정을거치는동안필수적으로요구되는유전자이므로, 두번째경우와세번째경우는모두형질전환체를획득할수있다. 그러나선발마커유전자만이도입된경우는목적유전자가포함되지않으므로무의미하다. 결론적으로우리가획득하고자하는형질전환체는목적유전자와선발마커유전자가그러나현실적으로위두가지유전자가동시에하나의식물세포에도입될가능성은확률적으로적으며, 또한세대진전에따라유전자분리가일어날수있도록염색체상의독립적인유전자좌에도입될가능성은더욱낮다. 동시형질전환법의두번째어려움은마커프리형질전환체를획득하는데걸리는기간이길다는점이다. 기획득된형질전환체 (T0) 의세대를진전시켜 T1 혹은그이후세대에서목적유전자와선발마커유전자의분리가일어난후의종자들을대상으로선발마커포함여부를확인한다음목적유전자만을갖는개체를선발해야하기때문이다. 특히마커프리개체를선발하는과정에서 PCR 방법으로각개체의도입유전자를확인하거나음성선발마커를사용하여선발하여야하는점도또다른어려움이다. 본연구결과확립된선발마커제거용 Agrobacterium vector system 및형질전환체생산을위한조직배양시스템은기존방법의어려움을해소하고빠른시간내에효과적으로실용화가능한형질전환체를획득할수있다는점에서획기적이다. 위치특이재조합 (site specific recombinase) 시스템방법중하나인 Cre/LoxP 유전자는 hygromycine 저항성유전자에의해형질전환 callus를선발하고, 재분화단계에서 tunicamycine에의해발현되어양성선발마커유전자인 hpt gene을제거하므로동시형질전환방법에비해형질전환체획득에필요한시간이짧다. 또한본시스템은음성선발마커유전자인 arge gene을동시에사용하므로 Cre/LoxP의발현이불완전한경우양성선발마커유전자를제거할수있는장점이있다. 따라서본연구결과확립된선발마커제거시스템은벼를포함한기타다양한화본과단자엽식물의형질전환체개발및실용화에유용하게활용될수있을뿐만아니라이를활용해획득한 HOB1 도입마커프리형질전환벼계통은최근급변하는환경변화에의한식

45 량작물의수량성감소를방지하고안정적식량확보에기여할것으로판단된다

46 제 4 장연구개발목표달성도및대외기여도 1 절 : 목표대비대외달성도 세부 협동연구과제추진목표달성내용 1 세부과제명 : 선발마커 제거용형질전환벡터 제작및활용 ( 권석윤 ) - 모델식물을이용한선발마커 - 마커-프리형질전환작물의제제거시스템확립및형질전환체작및특성분석분석중 - 선발마커제거용형질전환벡 - 선발마커제거용형질전환벡터제작터 4종제작 (2종특허등록 ) - 유용유전자기능분석제1협동과제 : 마커프리 - 벼형질전환체검정및형질전환벼개발 ( 최상봉 ) 마커프리벼의특성분석 - 5종유전자기능분석 (1종논문발표 ) - 마커프리형질전환벼 35 라인확보 제2협동연구과제 : 화본과작물에서의선발마커제거시스템확립및대량형질전환작물개발 ( 조준형 ) - 음성선발마커 arge 유전자기질 - PPT 로부터유기합성법에의한인 N-AcPt 의유기합성법에의 N-AcPt 제작및타세부과제로한생산및공동과제로의제공의제공 (100%) - 마커-프리형질전환벼생산에 - tunicamycin 의적정농도조 CRE/loxP-argE system 을이용건및형질전환과재분화체을위한형질전환및재분화조계의확립 (100%) 건의확립 - 아그로박테리움매개마커- - CRE/loxP-argE system 을이용프리형질전환벼획득한아그로박테리움매개형질전 (100%) 환벼획득

47 2 절 : 정량적성과 ( 논문게재, 특허출원, 기타 ) 성과물 논문 특허 품 년도 최초목표 계 1 년차 (2008 년 ) 2 년차 (2009 년 ) 3 년차 (2010 년 ) 국내 SCI 일반 국외 SCI 일반 학술발표 국내 출원등록 국외 출원등록 6 유용유전자 형질전환체 50 ( 이벤트 3) 50 종 등록육성 기능성물질 1 기술이전 1 시책건의 영농활용농자재등록생명정보등록 기탁생물자원등록 기탁홍보기타 ( 유전자원등록수등 ) 1 4 년차 (20 년 ) 5 년차 (20 년 ) [ 전문학술지논문게재 ] - 국외 SCI 논문 4 편발표 구분 저자명 논문제목 게재학술지명 1. R Ahmad, YH Kim, Development of Selection Marker-free MD Kim, MN Phung, 국내 (SCI) Transgenic Potato Plants with J Plant Biol WI Chung, HS Lee, Enhanced Tolerance to Oxidative Stress SS Kwak, SY Kwon Tobacco seeds simultaneously 국외 (SCI) overexpressing Cu/Zn-superoxide 1.YP Lee, KH Baek, dismutase and ascorbate peroxidase HS Lee, SS Kwak, JW display enhanced seed longevity and Bang, SY Kwon germination rates under stress J Exp Bot. conditions. 2.HB Kim, H Lee, CJ Oh, HY Lee, HL Eum, HS Kim, YP Hong, Y Lee, S Choe, CS An, SB Choi Postembryonic seedling lethality in the sterol-deficient Arabidopsis cyp51a2 mutant is mediated by ethylene and ROS Plant Physiol 권및쪽수 ( 년도 ) 51: (2008) 61(9): (2010) 152(1): (2010) Impact factor

48 3. HS Kim, SJ Kim, N The DOF transcription factor AtDof5.1 Abbasi, RA Bressan, regulates leaf axial patterning by DJ Yun, SY Kwon, promoting Revoluta transcription in SB Choi Arabidopsis. Silencing of SlFTR-c, the catalytic 4. CJ Lim, WB Kim, subunit of ferredoxin:thioredoxin BS Lee, HY Lee, TH reductase, induces pathogenesis-related Kwon, JM Park, genes and pathogen resistance in SY Kwon tomato plants Plant J. BBRC 64(3): (2010) 399: (2010) [ 학술대회논문발표 ] - 국내외학술대회 18 회연구성과발표 구분저자명발표제목학술대회명칭 국외 국외 국외 국내 국내 1. Young-Hwa Kim, Oh-Jung Kwon, Ji-Hee Byun, Joo-Hwa Lee, Joon Hyeong Cho Practical Utilization of arge, Ornithine Deacetylase, as Negative Selectable Marker in Agrobacterium-mediated Transformation of Rice 2. Oh-Jung Kwon, Agrobacterium-Mediated Young-Hwa Kim, Ji-Hee Co-Transformation with Negative Byun, Joo-Hwa Lee, Selection Marker Coda Joon Hyeong Cho 3. Young-Hwa Kim, Oh-Jung Kwon, Joo-Hwa Lee, Ji-Hee Byun, and Joon-Hyeong Cho 4. YoungHwa Kim, Ohjung Kwon, JooHwa Lee, JiHee Byun, JoonHyeong Cho 5. OhJung Kwon, JinHwa Chung, YoungHwa Kim, JiHee Byun, JooHwa Lee, JoonHyeong Cho. Efficient methods for producing N-AcPt from L-PPT and its practical use for removing selectable marker gene in rice transformation Selectable marker removing system via co-transformation for producing transgenic rice 개최기간및장소 발표형태 5th International Crop Science 제주국제컨벤션포스터 Congress & 센터 Exhibition 5th International Crop Science 제주국제컨벤션포스터 Congress & 센터 Exhibition 2008 Annual Meeting of KSPBT & The 20th Symposium on Plant Biotechnology of BOSK 2008 한국육종학회정기학술발표회 부산해운대그랜드호텔 대구인터불고호텔 Application of coda as negative 2008 한국육종학회대구인터불고 selection marker in transgenic rice. 정기학술발표회호텔 포스터 구두 포스터 국내 6. Ji-Hee Byun, Development of transformation Joo-Hwa Lee, Moung-su system for producing marker-free Kim, I-Jin Choi, transgenic rice. Joon-Hyeong Cho. 제3회식물과학협의회및한국배추과채소연구회공동심포지엄 용평리조트타워콘도 포스터 국제 The 6th 7. S Kumari, Y Han, HS A RNA binding protein OsPUM10 I n t e r n a t i o n a l Im, HB Kim, G An, SB regulates the flowering time in Symposium of Choi rice. Rice Functional Genomics ~12, 제주도 포스터

49 국내국내국내국내국내국내국내국내국외국내국내 8. Ji-Hui Byeon, Moung-Su Kim, Su-Hee Jeon, Woo-Li Go, Joon-Hyeong Cho 9. Ji-Hui Byeon, Moung-Su Kim and Joon-Hyeong Cho 10. Ji-Hui Byeon, Moung-Su Kim, Woo-Li Go, Joon-Hyeong Cho Strategy for selectable marker removing system using arge gene in combination with N-AcPt Utilization of N-AcPt used as substrate of arge gene for use of N-AcPt in CRE/loxP-argE system Cytotoxic effect of N-AcPt on arge transgenic plants in rice 2009 농업생명공학우수성과발표회 2009 한국작물학회춘계학술발표회 2009 한국식물학회 - 한국식물생명공학회 Joint Meeting 11. NY Song, BS Lee, 2009 한국식물학회 CJ Lim, WY Lee, MN Marker-removal system for -한국식물생명공학 Phung, T Kim, SY marker-free transgenic plants 회 Joint Meeting Kwon 12. Ji-Hui Byeon and Joon-Hyeong Cho Applied Condition of Organically Synthesized N-AcPt to arge-hpt Transgenic T1 rice Plant Science Conference, 제 4 회한국식물과학협의회정기학술대회 코엑스그랜드볼룸 강원대학교삼척캠퍼스 광주김대중컨벤션센터 포스터 포스터 포스터 포스터 서울교육문화회관 13. 송나영, 이복심, 임찬 주, 풍민넉, 이우용, 최상선발마커제거시스템을활용한마 2009 농업생명공학 코엑 봉, 조준형, 김태령, 권석커프리형질전환체제작윤 우수성과발표회 스그랜드볼룸 14. 권석윤, 최상봉, 조준선발마커제거시스템을활용한마형, 김태령커프리형질전환체제작 15. Ji-Hui Byeon, Su-Hee Jeon, Woo-Li Ko, Moung-Su Kim and Joon-Hyeong Cho 16. Ji-Hui Byeon, Su-Hee Jeon, Woo-Li Ko, Moung-Su Kim and Joon-Hyeong Cho 17. Ji-Hui Byeon, Su-Hee Jeon, Woo-Li Ko, Seung-Hee Oh and Joon-hyeong Cho 18. Ji-Hui Byeon, Woo-Li Ko, Su-Hee Jeon, Moung-Su Kim and Joon-Hyeong Cho Development of marker-free rice (Oryza Sativa L.) via Agrobacterium-mediated transformation with cre/loxp-arge system DEVELOPMENT OF MARKER-FREE TRANSGENIC RICE FROM USE CRE/LOXP-ARGE SYSTEM Development of the marker-free transgenic rice (Oryza sativa. L) via CRE/loxP system with negative selectable marker, arge gene Development of the marker-free transgenic rice via modified site-specific recombination system, CRE/loxP-argE ( 사 ) 한국육종학회 40 주년기념심포지엄및정기학술발표회 2010 한국작물학회춘계학술발표회 Crop Functional Genomics 한국자원식물학회정기총회및추계학술발표회 2010 Plant Science Conference, 제 5 회한국식물과학협의회공동심포지엄 대전컨벤션센터 대전베스트웨스턴레전드호텔 Ramada Plaza Hotel, Jeju 구두 / 포스터 포스터 포스터 포스터 포스터 제주라마다호텔포스터 서울교육문화회관 포스터

50 [ 국내특허출원및등록 ] - 특허등록 3 건 - 특허출원 2 건 국내외구분 국내 " " " " 출원인 ( 발명자 ) 제목 국가및출원 / 등록구분 출원 / 등록번호 ( 일자 ) 명지대산학협력단 1 식물의수분스트레스저항성을 ( 최상봉, 김호방 ) 증가시키는시토크롬 P450 유전자한국등록 ( ) 2종실의길이신장과종자생산성에명지대산학협력단 관여하는두개의시토크롬 P450 유한국등록 ( 최상봉, 김호방 ) ( ) 전자 KRIBB ( 권석윤, 이우 3선발표지유전자제거용형질전환한국등록용, 박정무 ) 벡터동국대산학협력단, KRIBB ( 조준형, 권석 4argE 유전자를음성선발마커로이한국출원윤, 김영화, 김명수, 용하는형질전환식물체제조방법 변지희 ) 동국대산학협력단, KRIBB ( 조준형, 권석 5선발마커가제거된형질전환벼의한국출원윤, 김영화, 김명수, 변제조방법 지희 ) ( ) ( ) ( )

51 제 5 장연구개발결과의활용계획 1) 애기장대를이용하여확립된선발마커제거시스템을이용하고대상작물의형질전환체를지속적으로제작하여마커프리형질전환체를확보할예정임 2) 벼 Dof5.1에관한연구논문 1편 (2011년후반기 ), APUM4와 Os 논문 1편 (2011년전반기 ) 발표할예정임 3) Embryogenic callus로 large scale 벡터의안정적인도입을위한형질전환및재분화체계의추가적인개선이필요할것으로사료됨. 현재아그로박테리움감염및캘러스재분화의최적조건의재확립을위한연구가진행중이며, 따라서보다효율적인빠른형질전환작물개발시스템을구축하고자함. 4) 현재확인된 marker free 형질전환벼의고정및품종화를위해미질분석및형질전환벼의바이오안전성검증이필요한것이며, 이에따라형질전환작물의고부가가치의산업화가가능해질것으로보임. 또한이를농업적으로중요한타작물등에적용한다면 GM 작물에대한상업화가용이할것이며그가치가향상될것으로사료됨

52 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 해당없음

53 제 7 장기타중요변동사항 해당없음

54 제 8 장국가과학기술종합정보시스템에등록한 연구장비현황 해당없음

55 제 9 장참고문헌 Abbasi N, Kim HB, Park NI, Kim HS, Kim YK, Park YI, Choi SB (2010) APUM23, a nucleolar Puf domain protein, is involved in pre-ribosomal RNA processing and normal growth patterning in Arabidopsis. Plant J 64: Amir Hossain M, Lee Y, Cho JI, Ahn CH, Lee SK, Jeon JS, Kang H, Lee CH, An G, Park PB (2010) The bzip transcription factor OsABF1 is an ABA responsive element binding factor that enhances abiotic stress signaling in rice. Plant Mol Biol 72: Aono M, Saji H, Sakamoto A, Tanaka K, Kondo N, Tanaka K (1995) Paraquat tolerance of transgenic Nicotiana tabacum with enhanced activities of glutathione reductase and superoxide dismutase. Plant Cell Physiol 36: Chen Z, Young TE, Ling J, Chang SC, Gallie DR (2003) Increasing vitamin C content of plants through enhanced ascorbate recycling. Proc Natl Acad Sci USA 100: Dale EC, Ow DW (1991) Gene transfer with subsequent removal of selection gene from the host genome. Proc Natl Acad Sci USA. 88: de Vetten N, Wolters A, Raemarkers K, Meer I, Stege R, Heeres E, Heeres P, Visser A (2003) A transformation method for obtaining marker free plants of cross-pollinating and vegetatively propagated crop. Nat Biotechnol 21: Ebinuma H, Sugita K, Matsunaga E, Yamada K, Komamine A (2001) System for the removal of selection marker and their combination with a positive marker. Plant Cell Rep 20: Higuera-Ciapara I, Felix-Valenzuela L, Goycoolea FM Asataxanthin: A review of its chemistry and application. Crit Rev Food Sci Nut 46: Komari T, Hiei Y, Saito Y, Murai N, Kumashiro T (1996) Vectors carrying two seperate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection markers. Plant J 10: Lee HL, Shin D, Park SR, Han SE, Jeing MJ, Kwon TR, Lee SK, Park SC, Yi BY, Kwon MO, Byun MO (2007) Ethylene responsive element binding protein1(sterebp1) from Solanum tuberosum increases tolerance to abiotic stress in transgenic potato plants. Biochem Biophysic Res Commun 353: Lee YP, Kim SH, Bang JW, Lee HS, Kwak SS, Kwon SY (2007) Enhanced tolerance to oxidative stress in transgenic tobacco plants expressing three antioxidant enzymes in chloroplasts. Plant Cell Rep 26: Luo K, Duan H, Zhao D, Zheng X, Deng W, Chen Y, Stewart Jr CN, McAvoy R, Jiang X, Wu Y, He A, Pei Y, Li Y (2007) GM-gene-deletor : fused loxp-frt recognition sequences dramatically improve the efficiency of FLP or CRE recombinase on transgene excision from pollen and seed of tobacco plants. Plant Biotech J 5:

56 McCormac AC, Fowler MR, Chen DF, Elliott MC (2001) Efficient co-transformation of Nicotiana tabacum by two independent T-DNAs, the effect of T-DNA size and implications for genetic separation. Transgenic Res 10: Park JM, Lee YK, Kang BK, Chung WI (2004) Co-transformation using a negative selectable marker gene for the production of selectable marker gene-free transgenic plants. Theor Appl Genet 109: Ralley L, Enfissi EMA, Misawa N, Schuch W, Bramley PM, Fraser PD Metabolic engineering of ketocarotenoid formation in higher plants. Plant J 39: Rommens CM, Bougri O, Yan H, Humara JM, Owen J, Swords K, Ye J (2005) Plant-derived transfer DNAs. Plant Physiol 139: Rommens CM, Haring MA, Swords K, Davies HV, Belknap WR (2007) The intragenic approach as a new extension to traditional plant breeding. Trends Plant Sci 12: Rommens CM, Humara JM, Ye J, Yan H, Richael C, Zhang L, Perry R, Swords K (2004) Crop improvement through modification of the plant' s own genome. Plant Physiol 135: Sen Gupta A, Heinen JL, Holaday AS, Burke JJ, Allen RD (1993) Increased resistance in transgenic plants that overexpress chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase. Proc Natl Acad Sci USA 90: Tang L, Kwon SY, Kim SH, Kim JS, Choi JS, Cho KY, Sung CK, Kwak SS, Lee SH (2006) Enhanced tolerance of transgenic potato plants expressing both superoxide dismutase and ascorbate peroxidase in chloroplasts against oxidative stress and high temperature. Plant Cell Rep 25: Zuo E, Nui QW, Moller SG, Chua NH (2001) Chemical-regulated, site-specific DNA excision in transgenic plants. Nat Biotechnol 19:

57 주 의 1. 이보고서는농촌진흥청에서시행한 바이오그린21사업 의연구보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시농촌진흥청에서시행한 바이오그린21 사업 의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개하여서는아니됩니다.