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Polymer(Korea), Vol. 41, No. 4, pp. 670-674 (2017) https://doi.org/10.7317/pk.2017.41.4.670 ISSN 0379-153X(Print) ISSN 2234-8077(Online) 헤스페리딘이첨가된젤란검지지체에서연골재생연구 전성현 이원택 송정은 박현 최일남 김초민 강길선 전북대학교 BIN 융합공학과, 고분자나노공학과, 고분자융합소재연구소, (2017 년 1 월 16 일접수, 2017 년 3 월 15 일수정, 2017 년 3 월 29 일채택 ) Cartilage Regeneration Using Hesperidin-Containing Gellan Gum Scaffolds Sung Hyun Jeon, Won Taek Lee, Jeong Eun Song, Hyun Park, Il Nam Choi, Cho Min Kim, and Gilson Khang Dept. of BIN Convergence Tech & Dept. of PolymerNanoSci Tech, Chonbuk National University, 567 Baekje-daero, Jeonju 54898, Korea (Received January 16, 2017; Revised March 15, 2017; Accepted March 29, 2017) 초록 : 젤란검은글루콘산, 람노오스, 포도당이 1:1:2 로구성된헤테로다당류로생체적합성과물리화학적특성이뛰어나조직공학분야에서다양하게응용되고있으며, 최근여러가지분야에서각광받는고분자로인정받고있다. 헤스페리딘은콜라겐재생과항염증효과의작용이있는데본실험은헤스페리딘이연골재생에미치는영향을관찰하기위해 0.7% 젤란검수용액에헤스페리딘을각각 0, 1, 2, 4 mg 씩첨가하여하이드로젤지지체를제조하였으며, 물리적특성평가를위해압축강도및 FTIR 를측정하였으며, 연골재생을평가하기위해 MTT, Bio-SEM, 및 RT- PCR 과같은실험을평가하였다. 그결과, 1 mg 헤스페리딘 / 젤란검지지체가연골재생효과가가장우수하다는것을확인하였다. 따라서연골재생을위해 1mg 헤스페리딘 / 젤란검지지체의다양한응용가능성을확인할수있었다. Abstract: Gellan gum is an FDA-approved heteropolysaccharide, composed of sodium gluconate, rhamnose, and glucose in molar ratios of 1:1:2. It has been widely utilized in tissue engineering because of its biocompatibility and outstanding physicochemical properties such as stability at high temperature transparency, and dynamic elastic modulus. In this study, we prepared 0.7% gellan gum hydrogel scaffolds with different amount (0, 1, 2, 4 mg) of hesperidin to incorporate collagen regeneration and anti-inflammatory effect for cartilage regeneration. The physiochemical and biological characteristics of the scaffolds were evaluated by compressive strength, FTIR, MTT, Bio-SEM, and RT-PCR. Interestingly, the gellan gum scaffold containing 1 mg hesperidin was found to be the most excellent scaffold for cartilage tissue regeneration in terms of compressive strength, cell differentiation, cell viability, and gene expression. Keywords: cartilage regeneration, gellan gum, hesperidin, chondrocyte cells, hydrogel. 서 퇴행성관절질병인골관절염은연골퇴보와뼈과성장의특성을나타낸다. 골관절염은임상실습에서보이는가장흔한퇴행성골절과노인장애의주된요인이다. 연골은연골세포와연골조직으로구성된조직으로충격을흡수하여관절을보호하는완충작용을하고관절면을뒤덮는초자연골의관절연골인윤활액이들어있는관절주머니를가지는윤활관절은뼈사이의마찰력을줄여움직임을부드럽게한다. 1 이러한관절을보호하는역할을하고있는연골이노화와비만, 무리한관절사용으로마모되거나퇴행성변화로인해파 론 To whom correspondence should be addressed. E-mail: gskhang@jbnu.ac.kr 2017 The Polymer Society of Korea. All rights reserved. 열되면골관절염질병의원인이된다. 골관절염은관절염증, 통증, 부기, 부종, 변형등의증상들이나타나는데이러한골관절염증상들은환자삶의질을저하시킨다. 하지만, 관절연골의낮은자가치료능력때문에골관절염은현재로서는정확한치료방법이없어, 도전적인질병분야이다. 2-4 궁극적으로골관절염의치료는환자의통증을줄이고관절의기능을개선시키는데목적이있다. 하지만, 기존의비스테로이드성소염제인진통해열제와합성진통마취제들은통증과부종을완화시키는데는효율적이지만근본적인문제인연골의손상을막을수없고장기적인복용이힘들며, 대부분심각한부작용을동반한다. 5 이에반해재생치료법은연골재생을증진시키고최종적으로건강한조직을복구하는치료법으로최근조직재생과치료의효율성이증대함에따라골관절염치료로생체적합성및생분해성이뛰어난고분자를이용한재생치료법의연구가많은관심을받고있다. 6 670

헤스페리딘이첨가된젤란검지지체에서연골재생연구 671 이중에식품첨가물, 의약품, 화장품등다양한분야에서응용되고있는젤란검 (gellan gum) 은생분해성물질로생체주입에적합하고내열성, 내산성, 내효소성의우수한물성뿐만아니라친수콜로이드 (hydrocolloid) 로신체에주입시젤을형성하여손상된부위를촉촉하게유지하고, 괴사조직의자연분해를도와생체조직공학에서의응용이광범위하다. 젤란검은 O- 글리코시드 (O-glycosidically) 가결합된에스터 (ester) 로아실기 (acyl group) 를함유하고있으며, 아실기의함유량에따라하이아실젤란검 (high acyl gellan gum), 로우아실젤란검 (low acyl gellan gum) 으로나뉘어진다. 7 하이아실젤란검은탄성, 신축성및유연성이높으며, 로우아실젤란검은기계적강도는높지만잘부서지는특성을갖는다. 8-13 젤란검하이드로젤지지체에첨가하는헤스페리딘은비타민 P 의일종으로콜라겐생성을돕고항염증작용, 노화에관련된질병에효과가있으며, 관절및연골에영향을준다고알려져있다. 14 이에본연구에서는로우아실젤란검에함량별헤스페리딘 (hesperidin) 을첨가한헤스페리딘 / 젤란검하이드로젤지지체를제작하여, 지지체특성평가및헤스페리딘의함량변화에따른젤란검하이드로젤지지체의연골재생효과를알아보고자하였다. 실 시약및재료. 로우아실젤란검 (Gelzan TM CM; Sigma-aldrich, USA, 평균분자량 1,000,000 g/mole, G1910), 헤스페리딘 ( 80%, Sigma-aldrich, 평균분자량 610.56 g/mole, G1910) 을사용하였고, 그외모든화학약품및유기용매는 HPLC 등급을사용하였다. 하이드로젤제조. 중탕시킨 90 o C 의 3 차증류수에젤란검을용해시켜, 0.7% 의젤란검수용액을제조한다. 이때, 가교제인 0.03% 염화칼슘 (CaCl 2 ) 을첨가하고교반하였다. 0.7% 젤란검수용액 50 ml 에 0, 1, 2, 4 mg 의헤스페리딘을각각첨가하고, 교반한뒤에, 페트리디쉬에넣어준다. 이를상온에서 30 분동안굳힌후직경 6.0 mm 의바이옵시펀치 (biopsy punch) 를사용하여 0, 1, 2, 4 mg 헤스페리딘 / 젤란검하이드로젤지지체 (H/G, 직경 6.0 mm 높이 5.0 mm) 를제조하였다. 세포배양. 연골세포를얻기위해생후 2 주된암컷뉴질랜드화이트토끼 (Hanil laboratory animal center, Korea) 를사용하였다. 토끼의무릎관절사이에서연골부위를절개한후 PBS(pH 7.4, Gibco, USA) 로여러번세척한다음연골세포를긁어내었다. 긁어낸연골세포는코니컬튜브에넣고 1200 rpm, 4 o C 에서 3 분동안 2 번원심분리하였다. 원심분리가끝난연골세포에 Dulbecco s modified eagle medium (DMEM/F-12, Gibco), 10% 우태아혈청 (FBS, Gibco) 그리고 1% 항생제 (100 units/ml 페니실린과 100 µg/ml 스트렙토마 험 이신 ) 을혼합한배양액 10 ml와 0.2 wt% 콜라게네이즈 A형 (Roche, USA) 200 μl를첨가하여 36 o C, 5% CO 2 조건하의인큐베이터안에서 1일동안콜라겐을분해하였다. 1일후 1200 rpm, 4 o C에서 3분동안원심분리후피펫팅하여세포배양접시 (cell culture dish) 에배양액과함께분주하였으며, 3 일에한번씩배양액을교체해주었다. 본실험에서사용된세포는 Passage 2의세포를지지체당 1 10 5 cell/scaffold로파종하여실험을진행하였다. 하이드로젤지지체압축강도측정. H/G의압축강도를측정하기위해실험실용프레스 (TMS-Pro, food technology corporation, sterling, USA) 를사용하였다. 이때측정거리는 1mm, 측정속도는 2 mm/sec, 측정힘은 0.5 N으로설정하여, 압축강도를측정하였다. FTIR 분석. H/G의결합구조확인 ( 작용기확인 ) 과분광학적성질을관찰하기위해적외선분광광도계 (FTIR, Spectrum GX, Perkin Elmer, USA) 를사용하여 4000~500 cm -1 파장에서분석하였다. SEM 분석. 주사전자현미경 (SN-3000 Hitachi, Hitachi, Japan) 을사용하여 20 KV, x1.0 K 조건하에서, 연골세포를파종후 2주동안배양한 H/G의표면을촬영하여관찰하였다. 세포증식능측정. 세포부착과세포증식률을발색측정으로관찰하기위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5,-diphenyltetrazolium bromide, Sigma-Aldrich) 분석을실행하였다. 제조된 H/G에연골세포 (1 10 5 cell/scaffold) 를파종하여배양 1, 4, 7, 14 및 21일째에 MTT 용액 (5 mg/ml stock in PBS) 을 100 µl씩넣고 4시간동안인큐베이터 (37 o C, 5% CO 2 ) 에배양하였다. 3시간후 H/G를 48 well plate에옮겨디메틸설폭사이드 (DMSO, Sigma-Aldrich) 용액을 1mL씩넣어각각 30 번씩피펫팅하였다. 그후, 96 well plate에시료를각각 100 μl씩분주하고 570 nm 흡광도에서측정하였다. 유전자발현도확인. 연골세포의특정유전자발현여부를알아보기위해역전사효소를사용하여 RNA를증폭시켜 RT- PCR 기기분석을실행하였다. 세포파종후 7, 14 및 21일째에회수된 H/G를 PBS 1X로세척후 300 µl의 RNAiso plus (Takara Bio Inc., Japan) 을첨가후피펫팅하여 1.5 ml의 EP 튜브에옮겨담고 180 µl 클로로포름 (Sigma-Aldrich) 을첨가한후 4 o C, 12000 rpm에서 15분동안원심분리하였다. 분리된 RNA는 Oligo(dT)12-18 프라이머 (Invitrogen TM, 5 first strand buffer(invitrogen TM ), dntp (dgtp, datp, dttp, dctp, Gibco), RNase inhibitor (Invitrogen TM, Superscript TM RNase H 역전사트랜스크립테이즈 (Invitrogen TM ), DNase/RNase free water(gibco) 를첨가하여 authorized thermal cycler (TP600, Takara Bio Inc.) 를통하여 cdna로역전사하였다. 역전사시킨 cdna는 beta-actin, aggrecan, Collagen-I 및 Collagen-II를신장시키기위해, PCR을수행하였다. PCR 과정후증폭된 cdna를 1%(w/v) 아가로스겔에전기영동을한 Polymer(Korea), Vol. 41, No. 4, 2017

672 전성현 이원택 송정은 박현 최일남 김초민 강길선 후, 상대적발현을 SYBR 녹색형광 (SYBRTM Green I Nucleic Acid Gel Stain, Cambrex, UK) 에의해시각화하였으며, 300 nm 자외선조사기로사진촬영을하여 Beta-actin, Aggrecan, Collagen-I 및 Collagen-II 밴드의발현정도를관찰하였다. 통계학적분석. Student s t-test 를시행하여각실험의통계학적분석을하였고 p 값이 0.05 미만일때통계적으로유의한것으로하였으며 (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001), 모든실험은 3 번이상에걸쳐진행하였다. 결과및토론 압축강도분석. 제조한 H/G 의기계적물성을관찰하기위해압축강도를실시하였다. Figure 1 은지지체의육안이미지와압축강도를나타나는그래프이다. 1 mm/sec 의속도로 0.5 N 의압력을가하여압축시켰을때 H/G 의균열파괴시의하중을지지체의단면적으로나누었다. 그결과 0mg H/G 에서 5N 이상의압축강도가관찰되었으며, 1, 2 및 4mg H/G 에서는헤스페리딘함량이증가할수록압축강도가점차감소하는경향성을나타냈다. 압축강도기기분석은총 5 번반복실험하여데이터값의재현성을높였다. FTIR 분석. 특징적인흡수스펙트럼을알아내어지지체의 구조변화를관찰하기위해 FTIR 을이용하여측정하였다. 분석결과, 젤란검의특이피크인 C-O(1000~1100 cm -1 ), 에스테르기 (ester groups) 의 C=O(1550~1650 cm -1 ) 및 O-H(3300~ 3400 cm -1 ) 의특징적피크를관찰할수있었다 (Figure 2). 15-20 0mg H/G 에서나타나는피크가 1, 2 및 4 mg H/G 에서도공통적으로나타나는것을확인할수있는데, 이는젤란검고유의구조적특성이모든군에서유지되고있다는것을알려준다. 특히, O-H 기는글리코스아미노글리칸분자의구성성분으로써, 세포의유동성을높여연골증식을유도하기때문에, 세포증식에우수한환경을제공해줄것으로사료된다. SEM 관찰. Figure 3 은세포파종후 2 주후에각각 0, 1, 2, 4 mg 의 H/G 의단면을 Bio-LV SEM 으로표면을촬영하여 Figure 2. FTIR spectra of 0, 1, 2, and 4 mg H/G scaffolds. Figure 1. (a) Gross image; (b) compressive strength of 0, 1, 2, and 4 mg H/G scaffolds. Figure 3. Bio-LV SEM photomicrographs of 0, 1, 2, and 4 mg H/ G scaffolds. (Magnification with 20.0 kv 1.0 k, scale bar=50 μm). 폴리머, 제 41 권제 4 호, 2017 년

헤스페리딘이 첨가된 젤란검 지지체에서 연골 재생 연구 673 관찰한 것이다. 관찰 결과 대조군인 0 mg H/G에서는 세포증 식 및 세포외기질(extracellular matrix)의 모습이 전반적으로 관찰되었고, 1, 2 및 4 mg의 H/G군 역시, 연골세포의 증식이 활발하게 이루어지고 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 세포외 기질이 응집되고 뻗어나간 것을 관찰할 수 있었다. 이는 헤 스피리딘은 플라보노이드계 화합물의 일종으로써 세포내의 염증을 일으키는 단백질을 제거하고 세포벽을 튼튼하게 하는 기능이 있어 세포의 결합조직 형성과 기능 유지에 긍정적인 영향을 미치기 때문으로 사료된다.15,21-23 MTT 분석. H/G에 1 105개의 연골세포를 파종 후 배양하 여 1, 4, 7, 14 및 21일에 연골세포 증식률을 관찰하기 위해 MTT 분석을 시행하였다. 실험 결과(Figure 4), 시간이 증가 할수록 세포 증식률이 모든 군에서 증가하는 것을 확인하였 다. 또한 모든 타임포인트에서 1 mg H/G에서 가장 우수한 세 포 증식률을 보였고, 14일 및 21일째에는 2, 0, 4 mg H/G 순 으로 증식률이 감소하였다. 특히, 4 mg H/G 군은 대조군인 0 mg H/G 보다 낮은 증식률을 보였는데, 이는 헤스페리딘 첨 가는 연골세포 증식에 긍정적인 역할을 하지만, 일정량 이상 의 용량이 초과하게되면 오히려 연골세포 증식을 방해했기 때문이라고 사료된다.3-25 MTT 분석은 총 3번 반복실험하여 데이터 값의 재현성을 높였다. RT-PCR 분석. 연골세포 유전자 발현을 관찰하여 연골세 포 증식과 확산 정도를 관찰하기 위해 H/G에 연골세포 파종 후, 1, 2, 및 3주째에 mrna를 분리하고 역전사효소를 사용 하여 상보적 DNA(cDNA)로 증폭시킨 후 연골기질의 주요 성분인 어그리칸(aggrecan), 연골조직의 세포간질 속에서 볼 수 있는 교원섬유(collagen fibers)를 구성하는 Collagen-I, 연 골세포의 표지 분자인 Collagen-II 프라이머들을 사용하여 전 기영동(electrophoresis)한 후 나타난 각각의 발현도를 확인하 였다. 이들 발현도는 항존유전자(housekeeping gene)인 beta- Figure 4. Cell viability of 0, 1, 2, and 4 mg H/G scaffolds was analyzed by MTT assay after 1, 7, 14 and 21 days post-seeding in vitro. Figure 5. RT-PCR of the BMSCs on 0, 1, 2, and 4 mg H/G scaffolds was analyzed after 1, 2, and 3 weeks. Quantitative analysis of (a) aggrecan; (b) collagen I; (c) collagen II by normalization of betaactin. Polymer(Korea), Vol. 41, No. 4, 2017

674 전성현 이원택 송정은 박현 최일남 김초민 강길선 actin 를대조군으로사용하여 normalization 하였다 (Figure 5). 25-30 그결과어그리칸, Collagen-I, II 의발현도가 1mg H/G 군에서모두가장높게나왔다. 이는연골세포증식분화의하이드로젤지지체로 1mg 의 H/G 가다른 H/G 보다이상적인연골세포지지체임을증명한다. Figure 5(a), (b), (c) 에서 1, 2mg H/G 은대조군인 0mg H/G 보다발현도가모두높거나비슷하게관찰되었으나, 4 mg H/G 는대조군인 0mg H/G 과발현도가비슷하거나더낮았다. 이로써헤스페리딘이연골세포에긍정적인역할을한다는사실을알수있지만첨가한양이일정량이상을초과하게되면, 오히려연골세포증식을저해한다는사실또한알수있다. 30-34 이는 MTT 분석결과와유사함을보인다. 결 본연구에서는 0, 1, 2, 4 mg 의 H/G 를제작한후, FTIR 분석을통해구조분석한결과헤스페리딘첨가한후에도젤란검의고유피크를가져구조가변화하지않은것을확인하였으며, Bio-LV SEM 분석을통해, 각 H/G 에서연골세포증식및세포외기질을이미지로확인하였다. 또한 MTT 분석을통해세포증식률을관찰하였고, RT-PCR 을통하여연골세포유전자발현도를측정하였다. 이모든 in vitro 결과에서 1mg H/G 이다른군보다뛰어난세포증식과세포외기질분비하기위한우수한환경을제공한다는것을확인하였다. 따라서일정량의헤스페리딘은연골재생에효과가있다는것을확인할수있었으며, 연골조직재생을위한지지체로 1mg H/G 가다양하게응용될수있을것이라사료된다. 감사의글 : 이논문은보건복지부의재원으로한국보건산업진흥원의보건의료기술연구개발사업지원 (HI15C2996) 을받아수행된연구입니다. 론 참고문헌 1. A. H. Gomoll, A. Phan, M. Mastrocola, L. F. Ambra, and N. Shah, Am J. Sports Med., 10, 1117 (2016). 2. S. Kumar, P. Kaur, M. Bernela, and R. Rani, Int. J. Biol. Macromol., 93, 988 (2016). 3. S. W. Ng, Inter. J. Tissue Regen., 4, 29 (2013). 4. S. R. Caliari, M. A. Ramirez, and B. A. C. Harely, Biomaterials, 32, 8990 (2011). 5. B. L. Farrugia, J. M. Whitelock, M. Jung, and B. McGrath, Biomaterials, 35, 1462 (2014). 6. J. S. Park, J. Y. Park, H. M. Kim, S. C. Oh, J. W. Yang, C. J. Lee, H. K. Jeong, and G. Khang, Inter. J. Tissue Regen., 5, 31 (2014). 7. B. Balakrishnan, N. Joshi, A. Jayakrishnan, and R. Bangerjee, Acta Biomater., 10, 3650 (2014). 8. S. Xu, L. Sang, Y. Zhang, X. Wang, and X. Li, Mater. Sci. Eng. C, 33, 648 (2013). 9. W. Lee, J. C. Debasitis, V. K. Lee, J. H. Lee, K. Fischer, K. Edminster, J. K. Park, and S. S. Yoo, Mater. Sci. Eng. C, 33, 2855 (2013). 10. F. Han, Y. Dong, Z. Su, R. Yin, A. H. Song, and S. M. Li, Int. J. Pharm., 476, 124 (2014.) 11. J. A. Gerstenhaber, R. Brodsky, R. B. Huneke, and P. I. Lelkes, Wound Medicine, 5, 9 (2014). 12. F. Wang, Y. Wen, and T. C. Bai, Mat. Sci. Eng. C, 69, 268 (2016). 13. E. Nakamachi, T. Noma, K. Nakahara, Y. Tomita, and Y. Morita, Int. J. Numer. Method Biomed. Eng., 10, 2864 (2017). 14. S. A. Cho, J. Biomater. Sci., Polym. Ed., 25, 625 (2014). 15. J. Brinckmann, Top. Curr. Chem., 247, 1 (2005). 16. R. M. Boehler, S. Shin, A. G. Fast, R. M. Gower, and L. D. Shea, Biomaterials, 34, 5431 (2013). 17. T. Natori, In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 10, 1007 (2016). 18. Y. Qian, L. Li, C. Jiang, W. Xu, Y. Lv, L. Zhong, K. Cai, and L. Yang, Int. J. Biol. Macromol., 79, 133 (2015). 19. J. E. Song, A. R. Kim, C. J. Lee, N. Tripathy, K. H. Yoon, D. Lee, and G. Khang, J. Biomater. Sci., Polym. Ed., 26, 181 (2015). 20. B. M. Moon, D. K. Kim, H. J. Park, H. W. Ju, O. J. Lee, J. H. Kim, J. M. Lee, J. S. Lee, and C. H. Park, Macromol. Res., 22, 1268 (2014). 21. S. R. Caliari, M. A. Ramirez, and B. A. C. Harely, Biomaterials, 32, 8990 (2011). 22. T. Song, J. Ma, L. Guo, and P. Yang, J. Cell. Physiol., 10, 1002 (2017). 23. J. E. Song, R. Kim, J. H. Lee, H. M. Kim, C. M. Kim, D. Lee, and G. Khang, Inter. J. Tissue Regen., 4, 17 (2013). 24. K. S. Han, H. Ko, N. Jang, J. Song, and G. Khang, Macromol. Res., 22, 1253 (2014). 25. D. Sakloetsakun, Drug Dev. Ind. Pharm., 14, 10 (2016). 26. B. B. Mandal and S. C. Kundu, Biomaterials, 30, 2956 (2009). 27. B. K. Gu, M. S. Kim, S. J. Park, and C. H. Kim, Inter. J. Tissue Regen., 2, 83 (2011). 28. S. Sahoo, S. L. Toh, and J. C. Goh, Biomaterials, 31, 2990 (2010). 29. M. Rutgers, D. B. Saris, L. A. Vonk, M. H. Van Rijen, and V. Akrum, Tissue Eng. Part A, 19, 59 (2013). 30. V. Perugini, A. L. Guildford, and J. Silva-Correia, J. Tissue. Eng. Regen. Med., 10, 1002 (2016). 31. M. H. Mahdi and B. R. Conway, Int. J. Pharm., 30, 515 (2016). 32. S. Mobini, B. Hoyer, M. Solati-Hashjin, A. Lode, N. Nosoudi, A. Samadikuchaksaraei, and M. Gelinsky, J. Biomed. Mater. Res. A, 101, 2392 (2013). 33. G. Khang, Inter. J. Tissue Regen., 9, 265 (2015). 34. H. W. Park, Polym. Korea, 39, 1 (2015). 폴리머, 제 41 권제 4 호, 2017 년