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진영 난
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1 Polymer(Korea), Vol. 38, No. 1, pp ISSN X(Print) ISSN (Online) 헤스페리딘 /PLGA 필름에서망막색소상피세포의부착과증식거동 이소진 강수지 김혜윤 이정환 김은영 권순용 * 정진화 *, 주천기 ** 강길선 전북대학교 BIN 융합공학과고분자나노공학과, * 가톨릭대학교의과대학여의도성모병원정형외과 ** 가톨릭대학교의과대학여의도성모병원안과 (2013년 7월 17일접수, 2013년 8월 22일수정, 2013년 8월 26일채택 ) Adhesion and Proliferation Behavior of Retinal Pigment Epithelial Cells on Hesperidin/PLGA Films So Jin Lee, Su Ji Kang, Hye Yun Kim, Jung Hwan Lee, Eun Young Kim, Soon Yong Kwon*, Jin Wha Chung*,, Choun-Ki Joo**, and Gilson Khang Dept. of BIN Fusion Tech., Polymer Fusion Res. Center & Dept. of PolymerNano Sci. Tech., Chonbuk National University, 567 Baekje-daero, Jeonju , Korea *Dept. of Orthopedic Surgery, Yeouido St. Mary's Hospital, Catholic University of Korea, 62 Yeouido-dong, Yeongdeungpo-gu, Seoul , Korea ***Dept. of Ophthalmology and Visual Science, Seoul St. Mary s Hospital, College of Medicine, Catholic University of Korea, 505 Banpo-dong, Seocho-gu, Seoul , Korea (Received July 17, 2013; Revised August 22, 2013; Accepted August 26, 2013) 초록 : 망막색소상피 (retinal pigment epithelium, RPE) 는시기능을유지하는데중요한역할을하여 RPE 의퇴화는여러망막변성질병을유발한다. 현재이에대한효과적인치료법이부족하여세포이식에적합한지지체를제작하기위해, 생분해성고분자인 PLGA 와항염증, 항산화작용등의기능이있는헤스페리딘을이용하여하이브리드필름을제조하였다. ARPE-19 를파종한후, MTT 분석법을이용하여세포증식률을확인하고, 세포의부착및세포형태를 SEM 을통하여확인하였다. 또한 RPE 세포의특이적유전자발현정도를확인하기위하여 RT-PCR 을수행하였고, RPE65 의발현을확인하기위해 AEC 면역화학적염색을실시하였다. 그결과, 헤스페리딘 /PLGA 필름은 PLGA 보다 RPE 세포의부착, 증식및표현형유지가우수함을확인하였고, 이를통해헤스페리딘 /PLGA 필름의망막재생을위한조직공학적담체로써응용가능성을확인할수있었다. Abstract: Retinal pigment epithelium (RPE) plays an important role in maintaining the visual function and the degeneration of the RPE causes several retinal degeneration disease. In order to fabricate the suitable carrier for RPE transplantation, the hybrid poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) film with hesperidin was prepared. Hesperidin has an antiinflammatory and antioxidant characteristics. ARPE-19 was seeded on hesperidin/plga film and then, cell proliferation was determined by the MTT assay, and cell adhesion and cell morphology were confirmed by SEM. Also, RT-PCR was performed to confirm the expression of the specific genes, and AEC immunohistochemical staining was performed to determine the expression of RPE65. As a result, we confirmed that attachment, proliferation and phenotype maintenance of RPE cells were more excellent on hesperidin/plga film than PLGA film, thereby we were able to confirm the potential applications of hesperidin/plga film as tissue engineering carrier for regeneration of retina. Keywords: retinal pigment epithelial cells, hesperidin, PLGA, hesperidin/plga hybrid film. 서 망막색소상피 (Retinal pigment epithelium, RPE) 는부르크막 (Bruch's membrane) 과맥락막사이에위치한육각형의단세 론 To whom correspondence should be addressed. gskhang@jbnu.ac.kr; koreafoot@gmail.com 포층이다. RPE 세포는나이가들면서쌓이게되는지방갈색소를포함한멜라닌과다른색소들때문에얼룩이있는갈색을띤다. 1-3 RPE 의크기는사람의나이와망막에서세포의위치에의존한다. RPE 는벗어나는빛흡수, 혈관 - 망막배리어형성, 시각색소의재생, 광수용체외부조직의식균작용같은생리학적으로중요한유지기능을한다. 4-6 또한주위조직인광수용체및맥락막모세혈관층과의상호작용으로시기 24

2 헤스페리딘 /PLGA 필름에서망막색소상피세포의부착과증식거동 25 능을수행하는데아주중요한역할을한다. 산업사회에서망막변성질병은실명의원인이된다. 7 전세계적으로안질환환자중 100 만명은연령관련황반변성 (age-related macular degeneration, AMD), 망막색소변성증 (retinitis pigmentosa, RP), 광수용체의변성을포함한망막변성으로인해질병이발생하였다. 8 또한당뇨망막병증 (diabetic retinopathy) 은젊은사람들의실명을유도하며당뇨와관련된심각한합병증으로나타난다. 9 이를치료하기위해서다양한지지체와함께 RPE 세포를이식하거나세포를부유시켜주입하는방법등의다양한방법이존재하고, 이중 RPE 세포이식법은망막재생에더욱효과적이다 따라서이식할때 RPE 의낮은안정성을보완하고단일상피층을유지하기위한재생의학적생분해성필름을제작하여 RPE 세포에적용시켜망막재생을위한조직공학적담체로써응용가능성을확인하고자하였다. 폴리글리콜산, 폴리락틴산과같은폴리알파 - 하이드록시산계와이것의공중합체인 PLGA 는합성고분자중미국식품의약품안전청 (FDA) 의승인을받고뛰어난생체적합성과조절가능한생분해성및편리한가공성을갖는다 그러나생체활성물질이부족하고소수성성질로인한세포부착및주변조직과의융합에어려움이있어세포의활성이낮은단점이있다. 16 이러한 PLGA 의단점을보완하고자사용한헤스페리딘 (3',5,7-trihydroxy-4-methoxyflavanone-7-rhamno-glucoside) 은감귤류에서풍부하게발견되는플라바논글리코사이드이다 (Figure 1). 헤스페리딘은항산화효과, 항염증효과, 항 - 고콜레스테롤혈증활성, 항 - 고혈압성활성, 이뇨특성을갖고있다 망막이상에대한헤스페리딘의효과는혈관생성, 항산화성, 항염증성의직접적인영향뿐만아니라망막의노화에대해억제효과가뛰어나다고보고된바있다. 20 이를이용하여본연구에서는망막재생을위한생체적합성고분자 PLGA 와항염증, 항산화작용등의효과가있는감귤류플라바논중하나인헤스페리딘을이용한헤스페리딘 / PLGA 하이브리드지지체를만들어세포에적용시키는 in vitro 연구를진행하여어떤함량의필름이 RPE 세포의안정성과부착, 성장에가장좋은영향을미치는지확인하였다. 실 시약및재료. 생분해성고분자인 PLGA( 락타이드 / 글리콜라이드몰비 75/25, Resomer RG756, Boehringer Ingelheim Chem. Co. Ltd., Germany) 는평균분자량이 g/mol 인것을사용하였다. 헤스페리딘 (Sigma, USA) 은평균분자량 g/mol 인것을사용하였다. 메틸렌클로라이드 (MC, Tedia Co. Inc., USA) 및이외의모든화학약품과유기용매는 HPLC 등급을사용하였다. 헤스페리딘 /PLGA 필름의제조. 용매증발법을이용하여 PLGA 와헤스페리딘을포함한 PLGA 하이브리드필름을제조하였다 (Figure 2). PLGA 0.3 g 을 MC 6 ml 에용해시켜 5w/v% 의 PLGA 용액을준비한후, PLGA 중량 0.3 g 의 0, 5, 10 및 15 wt% 에해당하는 0, 0.015, 0.03 및 g 의헤스페리딘을첨가하였다. 균일하게분산된필름을제조하기위해볼텍싱하였고, 디쉬에부은후교반시켰다. 유기용매를제거하기위하여실온의평평한장소에서 3 일건조시킨후, 세포파종을위한적절한크기로잘라실험에사용하였다. 접촉각측정. 헤스페리딘의함량이다른각헤스페리딘 / PLGA 필름에물방울을떨어뜨려접촉각을측정함으로써친수성을평가하였다. 일반적으로시료와물방울이이루는각도가작을수록친수성을나타낸다 cm 2 크기의각각의필름에증류수 10 µl 를떨어뜨리고 5 분간격으로물접촉각측정기 (Tantec TM, CAM-PLUSmicro, USA) 를이용하여필름의표면과물방울이이루는각도를측정하였다. 접촉각을측정하는것을 3 회실시하였고평균값을취하여평가하였다. 세포및배양. 실험에사용한 ARPE-19 세포 (Cell Line, ATCC catalog NO. CRL-2302) 는 ATCC(American type culture collection) 에서구입하였다. 세포는 Dulbecco's modified eagle medium(dmem, Gibco, USA) 과 F-12 영양배지혼합액 (Ham's F-12, Gibco, USA), 10% 우태아혈청 (FBS, Gibco, USA) 및 1% 의페니실린 - 스트렙토마이신 (PS, 100 units/ml 페니실린과 100 g/ml 스트렙토마이신 ) 이함유된배양액으로 37 o C, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 험 Figure 1. Chemical structure of hesperidin. Figure 2. Schematic diagram for illustrating the fabrication process of hesperidin/plga films by solvent evaporation method. Polymer(Korea), Vol. 38, No. 1, 2014

3 26 이소진 강수지 김혜윤 이정환 김은영 권순용 정진화 주천기 강길선 Table 1. Primers and Protocol for Thermal Cycling Species Gene Primer sequence Protocol Cycles Human GAPDH RPE65 CRALBP F : 5'-acc aca gtc cat gcc atc a-3' R : 5'-tcc acc acc ctg ttg ctg ta-3' F : 5'-gcc ctc ctg cac aag ttt gac ttt-3' R : 5'-agt tgg tct ctg tgc aag cgt agt-3' F : 5'-ttc cgc atg gta cct gaa gag gaa-3' R : 5'-act gca gcc gga aat tca cat agc-3' D=94 o C; 30 sec A=60 o C; 30 sec E=72 o C; 1 min D=95 o C; 15 sec A=60 o C; 30 sec E=72 o C; 1 min D=94 o C; 30 sec A=55 o C; 40 sec E=72 o C; 40 sec 헤스페리딘 /PLGA 필름에세포를배양하기위해서 70% 에탄올에필름을담군후, PBS 로 3 번이상세척하였다. 필름에새포배양액을넣어줌으로써세포가헤스페리딘 /PLGA 필름에서잘자랄수있는환경을만들어주었다. 세포를필름에파종하였고세포에사용한배양액은 2 일에한번씩교체하였다. MTT. 제조한헤스페리딘 /PLGA 필름에서세포의생존율을 MTT(3-(4,5- 디메틸티아졸 -2- 일 )-2,5- 디페닐테트라졸리움브로마이드, Sigma, USA) 분석법으로확인하였다 well 크기로제작한필름에 RPE( cells/ 필름 ) 를파종하였고, RPE 를배양한지 1, 2 및 3 일째에기존의배양액을제거하고새로운배양액 1mL 을넣어준후, MTT 시약을 100 µl 씩넣고 4 시간동안 37 o C 인큐베이터에서배양하였다, 4 시간후, 디메틸설폭사이드 (DMSO, Sigma, USA) 를 1mL 씩넣어결정을완전히녹인다. 96 well 에샘플을 100 ml 씩분주하고마이크로플레이트리더기 (E-max, Molecular Device, USA) 를이용하여흡광도 570 nm 에서측정하였다. SEM 관찰. 헤스페리딘 /PLGA 필름에서헤스페리딘함량에따른 RPE 세포의부착및모폴로지를알아보기위해 SEM 측정을실시하였다. 24 well 크기로제조한필름에 RPE( cells/ 필름 ) 를파종하고, 1, 2 및 3 일동안배양한후배양액을제거하고 PBS 로세척하였다. 이를 2.5% 글루타알데하이드 (Sigma) 로 24 시간동안고정하고, 알코올구배용액 (50, 60, 70, 80, 90 및 100%) 을이용하여각 30 분씩탈수과정을진행하였다. 지지체를잘라시료홀더에고정시킨후, 아르곤가스하에서플라즈마스퍼터 (Emscope, Model SC500K, UK) 를이용하여약 200 µm 의두께로백금코팅하고이를주사전자현미경 (Hitachi Co, Model S-2250N, Japan) 을이용하여각각세포의부착및모폴로지변화를관찰하였다. 23 mrna 분리및 RT-PCR. 헤스페리딘의함량을조절한헤스페리딘 /PLGA 필름에서 RPE 세포의유전자발현정도를확인하기위하여 RT-PCR 을실시하였다. 세포는 cells/ 필름의농도로계산하여파종하였다. 세포의배양액을제거하고 1mL 의 Trizol(Invitrogen, USA) 과 0.2 ml 의클로로포름을처리하여세포에서 RNA 층을분리하였고상층액을취하여이소프로판올 (Sigma, USA) 0.5 ml 을넣고, Polyacryl Carrier TM (Molecules Res) 5 µl을넣어 RNA를침전시켰다. RNA는 SuperScript TM II Reverse Transcriptase(Intvirogen, USA) 를이용하여 cdna로역전사하였다. cdna는 2유니트 Taq DNA 폴리머라아제를포함한 PCR 마스터키트 (Roche, Germany) 를이용하여원하는 DNA의특정영역을증폭시켰다. 프라이머는 GAPDH, RPE65, CRALBP를사용하였다. PCR후증폭된 DNA를 ethidium bromide solution(etbr, Sigma, USA) 이포함된 1.2%(w/v) 아가로스겔 (Sigma, USA) 에전기영동을수행한후상대적발현을시각화하여 300 nm 자외선투과조사기 (Vilber Lourmat ETX-20.M, France) 로촬영하여밴드의발현정도를관찰하였다. 프라이머의염기서열은 Table 1에나타내었다. 면역화학적평가. RPE 세포에서특이적으로발현하는단백질을확인하고각각의필름에서배양한세포의증식을비교하기위해 RPE 특정단백질인 RPE65를이용하여면역세포화학염색을수행하였다. 세포배양 1, 2 및 3일째에 PBS로세척하고 10% 포르말린용액으로고정하여 4 o C에서하루동안보관하였다. AEC 방법으로면역세포화학적염색을수행하였고 1:200으로희석한 Rabbit anti-rpe65 항체 (sc , Santa Cruz Biotechnology, INC., Europe) 를 1시간 30 분동안처리한후, anti-rabbit 면역글로블린항체 (Immunotech, France) 를상온에서 20분동안처리했다. PBS로세번세척한후 streptavidin peroxidase reagent(immunotech, France) 를첨가하여다시 30분방치하였다. PBS로세번세척하고 Chromogen substrate(ultra tech AEC kit AEC substrate:ultra tech AEC kit AEC chromogen, 1:50) 발색을확인하였다. 발색을확인하기위해현미경을통하여 200배율에서관찰하였다. 16 통계학적분석. 각실험의통계학적분석은 Student's t-test 를시행하여 p 값이 0.05 미만일때통계적으로유의한것으로하였다. 결과및토론 헤스페리딘 /PLGA 필름의친수성평가. PLGA 필름과헤스페리딘함량을달리하여제조한헤스페리딘 /PLGA 필름은 폴리머, 제 38 권제 1 호, 2014 년

Water contact angle of hesperidin/plga film surfaces: PLGA only, 5, 10 and 15 wt% hesperidin/plga. 육안관찰결과, 함량이증가할수록불투명해지는것을알수있었다 (Figure 3).

4 헤스페리딘 /PLGA 필름에서망막색소상피세포의부착과증식거동 27 Figure 3. Photographs of surface of PLGA and hesperidin/plga films. Figure 5. RPEs viability in hesperidin/plga film analyzed by MTT assay after 1, 2 and 3 days post-seeding (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001). Figure 4. Water contact angle of hesperidin/plga film surfaces: PLGA only, 5, 10 and 15 wt% hesperidin/plga. 육안관찰결과, 함량이증가할수록불투명해지는것을알수있었다 (Figure 3). 이는헤스페리딘이아세톤, 클로로포름, MC 등의용매에용해되지않기때문에 24 분산된형태로존재하였고, 따라서함량이증가할수록헤스페리딘 /PLGA 필름이헤스페리딘특유의주황색을띠는것을확인할수있었다. 헤스페리딘 /PLGA 필름의접촉각을측정하여친수성을평가하였다 (Figure 4). 친수성이헤스페리딘의함량과비례하게증가하지는않았지만, 소수성인 PLGA 에 5, 10 wt% 함량의헤스페리딘첨가는수분흡수를도와필름의친수성이증가하는결과를가져왔다. 반면에, 15 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름은 PLGA 필름보다높은접촉각결과를보였다. 이는헤스페리딘이헤스페리딘의아글리콘형태인헤스페리틴으로구성되어있고, 헤스페리딘은헤스페리틴보다친수성이나, 헤스페리틴은소수성을띠기때문에 25 함량이증가하면서소수성 이증가한것으로사료된다. 친수성을갖는표면은세포부착과증식을돕는다고보고된바있다. 26 따라서친수성이증가한헤스페리딘 /PLGA 필름은세포성장과증식에더나은환경을제공할것으로사료된다. 헤스페리딘 /PLGA 필름에서 RPE 세포의부착및증식거동확인. 헤스페리딘함량에따른헤스페리딘 /PLGA 필름에서 RPE 의부착및증식정도를측정하기위하여필름에 RPE 를파종한후 1, 2 및 3 일째에 MTT 분석을실시하였다 (Figure 5). 분석결과, PLGA 필름에파종한세포는다른군에비해초기에가장낮은성장을나타냈고, PLGA 필름에비해다양한함량별헤스페리딘 /PLGA 필름에서높은증식률을나타냈다. 시간이지남에따라 5 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서배양한세포가꾸준히가장높은증식을한것을관찰할수있었고, 10 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서는 2 일째까지는 PLGA 필름에서보다높은증식을보이다가 3 일째에는비슷한수준을증식을한것으로측정되었고, 15 wt% 헤스페리딘을함유한헤스페리딘 /PLGA 필름에서는 3 일째에가장낮은증식을보였다. 15 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서배양한세포가낮은증식률을보인것은접촉각측정결과가장친수성이낮았던것과일치함을알수있었다. 헤스페리딘은세포의노화와관련된일산화질소 (NO) 의합성을 10-30% 감소시켜준다고보고된바있다. 27 이러한헤스페리딘의효과로인해 RPE 가손상되지않고잘부착할수있는환경을만들어주고, 헤스페리딘의영향으로 NO 의합성도감소하여세포의괴사가덜일어나게되어세포의증식이잘유지되었을것으로사료된다. 28 헤스페리딘 /PLGA 필름에서 RPE 세포의부착및모폴로지확인. 헤스페리딘함량에따른헤스페리딘 /PLGA 필름에서 RPE 의부착과세포의형태및증식을육안으로관찰하기 Polymer(Korea), Vol. 38, No. 1, 2014

28 이소진 강수지 김혜윤 이정환 김은영 권순용 정진화 주천기 강길선 Figure 6. SEM micrographs of PLGA and hesperidin/plga scaffolds following hesperidin contents by means of the solvent-evaporation method (magnification; 500).

3 일째에는모든군에서시간이지남에따라세포가안정화됨은물론세포가잘증식하였지만, 특히 5 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서의세포부착과증식이다른군들에비해좋음을관찰할수있었다. PLGA 에서증식한세포의모폴로지는헤스페리딘이첨가된필름들보다는좋지않음을확인하였다. 이결과또한앞의 MTT 결과와일치함을보인다.

5 28 이소진 강수지 김혜윤 이정환 김은영 권순용 정진화 주천기 강길선 Figure 6. SEM micrographs of PLGA and hesperidin/plga scaffolds following hesperidin contents by means of the solvent-evaporation method (magnification; 500). 위해 SEM 분석을실시하였다 (Figure 6). RPE 세포가필름에부착한것을관찰한결과, 세포부착 1 일째에 PLGA 필름과함량별헤스페리딘 /PLGA 필름군에서세포가고르게부착한것을확인할수있었다. 그러나 2 일째에는 15 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서세포의증식이잘일어나지않음을확인할수있었다. 이결과는앞서측정한 MTT 분석결과와도일치함을보인다. 3 일째에는모든군에서시간이지남에따라세포가안정화됨은물론세포가잘증식하였지만, 특히 5 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서의세포부착과증식이다른군들에비해좋음을관찰할수있었다. PLGA 에서증식한세포의모폴로지는헤스페리딘이첨가된필름들보다는좋지않음을확인하였다. 이결과또한앞의 MTT 결과와일치함을보인다. PLGA 필름에서는소수성성질에의해부착에도움을주지못했지만헤스페리딘 /PLGA 필름에서는 PLGA 의소수성을보완하고헤스페리딘이세포와친화력이있는재료로써세포의부착을돕고, 헤스페리딘의특징인항산화기능에의해세포가빠르게안정화되고세포의모폴로지를유지하도록도움을준것으로사료된다. 27 헤스페리딘 /PLGA 필름에서 RPE 세포의특정 mrna 발현정도확인. PLGA 필름과헤스페리딘 /PLGA 필름에서배양한 RPE 에서헤스페리딘의함량에따라 RPE 의특성및기능에어떠한영향을주는지확인하기위해 RT-PCR 을실시하였다. mrna 발현정도를알아보기위해 RPE 세포의프라이머인 RPE65 와 CRALBP 를사용하여 mrna 발현정도를 Figure 7. Gene expression profiles of GAPDH, RPE65, CRALBP as analyzed by RT-PCR after 3 days: (a) results of agarose gel electrophoresis; (b) normalization of GAPDH expression by RPE65 and CRALBP (***p<0.001). 폴리머, 제 38 권제 1 호, 2014 년

6 헤스페리딘 /PLGA 필름에서망막색소상피세포의부착과증식거동 29 Figure 8. Microphotographs of anti-rpe65 staining with AEC method of films of PLGA, 5 wt% hesperidin/plga, 10 wt% hesperidin/plga, and 15 wt% hesperidin/plga at 1, 2 and 3 days after cell seeding (magnification; 200). 표준화시켜그래프화하였다. 모든군에서 house keeping gene 인 GAPDH 가일정하게발현하였고, RPE 에특이적으로존재하는 RPE65, CRALBP 가나타난것을확인할수있었다 (Figure 7(a)). 발현세기를정확히확인하기위하여그래프로나타내었다 (Figure 7(b)). Figure 7(b) 에서확인할수있듯이, 3 일째에헤스페리딘을함유한모든헤스페리딘 /PLGA 필름에서 PLGA 필름보다발현이강하게나타났다. RPE65 의경우, 5, 10 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서더욱강한발현이나타났고, CRALBP 의발현은 5wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서가장높은발현이나타났음을확인하였다. 이러한결과는앞에서기술하고있는결과와부합하므로헤스페리딘이세포의표현형유지에더좋은영향을주는것으로사료된다. 헤스페리딘 /PLGA 필름에서 RPE 세포의특정단백질발현확인. RPE 세포에서발현되는특이단백질발현을확인하고각각의필름에서배양한세포의형태와분포양상을평가하기위해 RPE 세포를배양한 PLGA 및헤스페리딘함량에따른헤스페리딘 /PLGA 에 AEC 방법을통하여면역세포화학적염색을실시하였다. RPE 세포에서만발현하는특정단백질인 RPE65 를 1 차항체로사용하여 1, 2 및 3 일째에관찰하였다 (Figure 8). 1 일째의결과를관찰하였을때, PLGA 필름과함량별헤스페리딘 /PLGA 필름을비교한결과 PLGA 필름과다른함량의필름에서는고른부착이나타났지만 15 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서는다른함량에비해세포의부착이적게나타나는것을확인할수있었다. 또한 2 일과 3 일이지나면서세포가증식하는것을발색한분포를통해육안으로확인할수있었고 2 일째에 PLGA 와 5 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서는좋은모폴로지와증식을확인할수있었지만, 상대적으로 10, 15 wt% 헤스페리딘 /PLGA 필름에서는발현된색이약했으며, 모폴로지또한좋지않음을확인할수있었다. 특히 15 wt% 에서그증식이약했으며, 이결과는앞서측정한 MTT 의 2 일째결과와일치한다. 3 일째에는 PLGA 필름군에서세포의증식은많이이루어졌지만, 그에따른세포의모폴로지변형이나타났다. 이는소수성인 PLGA 필름이세포의표현형유지에영향을미친것으로사료된다. 이러한세포의단백질발현의경향성은앞서측정된 MTT 와 SEM 의결과와유사한경향성을나타냈으며, 이결과로헤스페리딘 /PLGA 필름이 RPE 세포가증식하고표현형을유지하는데에더도움을준것이라고사료된다. 결 PLGA 는뛰어난생체적합성, 생분해성그리고편리한가공성을갖고있어임상에널리적용되고있지만생체활성물질의결여와소수성성질로인해세포활성이낮은단점을가지고있다. 헤스페리딘을이용하여 PLGA 의소수성을개선시켜제조한헤스페리딘 /PLGA 필름에서 RPE 세포의안정성과부착, 세포증식률및표현형유지에긍정적인영향을미치는지확인하였다. 론 Polymer(Korea), Vol. 38, No. 1, 2014

7 30 이소진 강수지 김혜윤 이정환 김은영 권순용 정진화 주천기 강길선 MTT 분석을통하여세포생존율과증식률을관찰하였고, SEM 을통하여세포의안정성과부착정도를확인하였다. 그리고 AEC 염색을실시하여 RPE 세포의성장과기능유지에대하여알아보았다. 그결과증식에서 5 wt% 헤스페리딘 / PLGA 필름에서초기부착률과증식, 특이단백질의발현이우수한것을확인할수있었으며시간이경과함에따라서 5wt% 의헤스페리딘 /PLGA 필름이 RPE 의생존에유용함을확인하였다. RT-PCR 결과에서는 PLGA 필름보다 RPE65, CRALBP 의 mrna 발현이다양한함량의헤스페리딘 /PLGA 필름에서높게나타나헤스페리딘 /PLGA 필름이 RPE 의성장과표현형유지에긍정적인영향을미침을확인하였다. 따라서본실험은적절한양의헤스페리딘을함유한헤스페리딘 /PLGA 필름은 RPE 세포에긍정적인영향을미치므로망막재생에있어유용한지지체로사용될수있다는정보를제공할것이다. 감사의글 : 본연구는 2012 년도정부 ( 미래부 ) 의재원으로한국연구재단바이오의료기술개발사업의지원을받아수행된연구로 (2012M3A9C ) 이에감사드립니다. 참고문헌 1. S. Beatty, H. Koh, M. Phil, D. Henson, and M. Boulton, Surv. Ophthalmol., 45, 115 (2000). 2. J. Ambati, B. K. Ambati, S. H. Yoo, S. Ianchulev, and A. P. Adamis, Surv. Ophthalmol., 48, 257 (2003). 3. D. T. Organisciak and D. K. Vaughan, Prog. Retin. Eye Res., 29, 113 (2010). 4. S. Aisenbrey, B. A. Lafaut, P. Szurman, S. Grisanti, C. Luke, R. Krott, G. Thumann, J. Fricke, A. Neugebauer, R. D. Hilgers, P. Esser, P. Walter, and K. U. Bartz-Schmidt, Arch. Ophthalmol., 120, 451 (2002). 5. O. Strauss, Physiol. Rev., 85, 845 (2005). 6. S. Binder, B. V. Stanzel, I. Krebs, and C. Glittenberg, Prog. Retin. Eye Res., 26, 516 (2007). 7. R. van Leeuwen, C. C. Klaver, J. R. Vingerling, A. Hofman, and P. T. de Jong, Eur. J. Epidemiol., 18, 845 (2003). 8. R. Klein, C. F. Chou, B. E. Klein, X. Zhang, S. M. Meuer, and J. B. Saaddine, Arch. Ophthalmol., 129, 75 (2011). 9. C. A. Shah, Indian. J. Med. Sci., 62, 500 (2008). 10. A. Kubota, K. Nishida, M. Yamato, J. Yang, A. Kikuchi, T. Okano, and Y. Tano, Biomaterials, 27, 3639 (2006). 11. N. Yaji, M. Yamato, J. Yang, T. Okano, and S. Hori, Biomaterials, 30, 797 (2009). 12. J. H. Lee, S. J. Park, H. J. Chun, and C. H. Kim, Inter. J. Tissue Regen., 1, 1 (2010). 13. C. T. Lee, C. P. Huang, and Y. D. Lee, Biomol. Eng., 24, 131 (2007). 14. T. Yoshioka, N. Kawazoe, T. Tateishi, and G. Chen, Biomaterials, 29(24-25), 3438 (2008). 15. B. K. Gu, M. S. Kim, S. J. Park, and C.-H. Kim, Inter. J. Tissue Regen., 2, 83 (2011). 16. E. H. Jo, S. J. Kim, S. J. Cho, G. Y. Lee, O. Y. Kim, E. Y. Lee, W. H. Cho, D. W. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 35, 289 (2011). 17. A. Garg, S. Garg, L. J. Zaneveld, and A. K. Singla, Phytother. Res., 15, 655 (2001). 18. A. Gil-Izquierdo, M. I. Gil, F. Ferreres, and F. A. Tomas- Barberan, J. Agric. Food Chem., 49, 1035 (2001). 19. S. T. Ahmad, W. Arjumand, S. Nafees, A. Seth, N. Ali, S. Rashid, and S. Sultana, Toxicol. Lett., 208, 149 (2012). 20. X. Shi, S. Liao, H. Mi, C. Guo, D. Qi, F. Li, C. Zhang, and Z. Yang, Molecules, 17, (2012). 21. G. Thumann, A. Viethen, A. Gaebler, P. Walter, S. Kaempf, S. Johnen, and A. K. Salz, Biomaterials, 30, 287 (2009). 22. T. Udono, K. Takahashi, M. Nakayama, O. Murakami, Y. K. Durlu, M. Tamai, and S. Shibahara, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 41, 1962 (2000). 23. A. Y. Oh, S. H. Kim, S. J. Lee, J. J. Yoo, M. van Dyke, J. M. Rhee, and G. Khang, Polymer(Korea), 32, 403 (2008). 24. N. Tirkey, S. Pilkhwal, A. Kuhad, and K. Chopra, BMC Pharmacol., 5, 2 (2005). 25. V. Kuntic, I. Filipovic, and Z. Vujic, Molecules, 16, 1378 (2011). 26. Y. S. Song, J. I. Kwon, B. K. Kim, Y. Y. Jeon, G. Khang, and D. W. Lee, J. Biomed. Mater. Res. A, 98, 517 (2011). 27. Y. K. Rao, S. H. Fang, and Y. M. Tzeng, Phytother. Res., 22, 957 (2008). 28. L. Xiaoting, Z. Xiangyun, L. Shumei, D. Minghua, and X. Liang, Adv. Exp. Med. Biol., 664, 193 (2010). 폴리머, 제 38 권제 1 호, 2014 년

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