운동과학, 2012 년, 제 21 권제 3 호 Exercise Science, 2012, Vol.21, No.3 노인과성인의단일근섬유아형에따른수축특성과형태의비교 최승준 1) 임재영 2) 1) 경성대학교스포츠건강학부, 2) 분당서울대학교병원재활의학과 Abstract Choi, S. J., Lim, J. Y. Age-related changes in contractile properties and morphology on chemically skinned single fibers from young and old human skeletal muscles. Exercise Science. 21(3): 309-318, 2012. Studies using human model reported inconsistent results on the intrinsic contractile properties of single muscle fiber. To extensively test aging effect on the innate myofilament characteristics and morphology, functional assay of chemically skinned vastus lateralis muscle fiber(15 C) were investigated from young(25±2 yrs) and old(78±2 yrs) healthy human subjects(n=10 and 8 for young, and old respectively). Fiber cross sectional area(csa) was measured by 3 dimensional microscopy, peak Ca 2+ -activated force and maximal shortening velocity(v o ) were measured by slack test procedure. Fiber myosin heavy chain(mhc) isoform was determined by gel electrophoresis and silver staining. Single muscle fiber assays showed fiber CSA and maximal Ca 2+ -activated force(mn) in old adults type I fiber were 15 % bigger and 18 % greater compared to the corresponding MHC isoform fibers from young adults(p<.05). However, specific force(maximal Ca 2+ -activated force normalized by fiber CSA, kn/m 2 ) of type I fiber was identical between age group, which suggested that the greater Ca 2+ -activated force(mn) of type I fiber is resulted from the bigger fiber CSA. Otherwise, type IIa and IIa/IIx fibers showed no difference on fiber CSA and P o between age groups. There is no difference on shortening velocity in type I and IIa fibers between young and old, type IIa/IIx fiber in old adults showed substantially slower V o than young adults type IIa/IIx fibers(33 %, p<.05). Linear regression modeling to identify relationship between fiber CSA and force generating ability showed strong direct relationship(p<.001) with no aging effect. Therefore, our result indicated maintained contractile properties of myofilament lattice regardless of age. Collectively, the declines of the muscular strength with aging appeared to be due to the quantitative reduction rather than qualitative impairment of single muscle fiber. Key words:aging, Single muscle fiber, MHC isoform, Maximal isometric force 초록 최승준, 임재영. 노인과성인의단일근섬유아형에따른수축특성과형태의비교. 운동과학, 제 21 권제 3 호. 309-318, 2012. 일반적으로노화로인한근기능의저하는근육량감소와더불어근신경계의기능부전등으로인식되고있지만, 단일근섬유의본질적수축력에대한노화의효과는여전히논란이되고있다. 노화로인한단일근섬유의질적변화를규명하기위해, 본연구에서는건강한노인의골격근을단일근섬유로분리한뒤, 수축특성과횡단면적을 MHC 의발현유형에따라일반성인의골격근과비교하였다. 근생검법을이용하여성인 10 명 (25±2 세 ) 과노인 8 명 (78±2 세 ) 의외측광근으로부터근육표본을추출한뒤, 이완용액에서손상되지않게종단면으로분리한후, 분리용액에서 24 시간배양 (4 C) 하였다. 배양후근막구조가제거된근다발로부터단일근섬유를분리하여실험장치 ( 등척성근력측정기와고속모터 ) 에고정하고일정한근절길이 (2.6 µm) 를유지하여, 근섬유길이와횡단면적을측정하였다. 활성용액 (pca 4.5) 을사용하여근섬유를최대수축시킨후 slack 검사를통하여최대수축력과최대수축속도를측정하였다. 측정이완료된단일근섬유절편은 SDS-PAGE 를이용하여 MHC 의아형을확인하였다. 실험결과에따르면, 노인의 type I 근섬유는일반성인의동일아형근섬유와비교하였을때횡단면적과최대수축력 (mn) 에서유의한증가가나타났다 (p<.05). 하지만횡단면적으로표준화된수축력 (kn/m 2 ) 에서이러한차이는나타나지않았다. Type IIa 그리고 type IIa/IIx 근섬유에서는연령에따른횡단면적과최대수축력 (mn), 그리고표준화된수축력 (kn/m 2 ) 에서연령간통계적차이가없는것으로나타났다. 근섬유의횡단면적과근력생성능력간의관계를분석하기위한선형회귀분석결과에서도, 두연령그룹모두유의한선형관계를나타내었고 (p<.001), 그룹간유의한차이가없었다. 이러한결과들은흥분 - 수축결합을배제한단일세포수준에서의수축력은, type I 근섬유의형태학적보상효과와더불어노화와관계없이유지됨을증명한다. 따라서노화에따른근기능저하는근육세포의질적퇴화보다는, 주로근육세포수감소와같은양적요인에의한것으로사료된다. 주요어 노화, 단일근섬유, MHC 아형, 최대수축력 * 본논문은 2012 학년도경성대학교학술연구비지원에의하여연구되었습니다.
310 노인과성인의단일근섬유아형에따른수축특성과형태의비교 Ⅰ. 서론 노화에따른근신경계의기능감퇴는노인의신체활동장애와독립적활동능력감소의원인으로인식되고있다. 이러한변화는유병율 (prevalence rate), 장애, 사망률등의위험성을증가시키는것으로역학적연구에서나타났다 (Manton & Gu, 2001). 또한향후 20년간의인구학적변화추이와임상적, 경제적중요성등으로인해, 노화에따른근기능장애에대한증상과기전을규명하는데상당한관심들이집중되고있다. 일부선행연구에서인간의노화에따른근력감소가근위축증 (muscle atropy) 과직접적인관련이있는것으로나타났지만 (Kent-Braun & Ng, 1999), 다른대부분의연구결과는노화로인한근력감소가근질량감소수준보다높게나타났다 (Lynch et al., 1999). 다시말해, 등척성 (isometric) 이나단축성 (concentric) 근수축을통해근력을생성하는능력은나이가듦에따라감소하게되고, 그원인으로는단일근섬유수 (number) 의감소와더불어, 속근섬유 (fast contracting fiber types) 의감소 (Larsson et al., 1979; Lexell et al.,1988; Sato et al.,1984 ), 흥분-수축결합 (excitation-contraction coupling) 과정의손상 (Delbono et al.,1995; Wang et al.,2002), 십자형교 (cross-bridge) 기능의약화 (Ansved & Larsson, 1990; D'Antona et al.,2003; Lowe et al.,2001) 등이제시되었다. 즉노화에따른근력 (strength) 저하는단일근섬유수감소에따른양적요인과단일근섬유의수축력저하에의한질적저하등에서원인을찾을수있다. 노화에따른단일근섬유의질적저하를증명하기위해서는, 단일근섬유자체의본질적수축력에대한연구가이루어져야한다. 왜냐하면단일근섬유에서의본질적수축력은노화에따라근섬유의횡단면적과비례하여감소하지않을수있기때문에, 이두가지요소를함께고려하여근섬유의특성을제시하여야한다 (Frontera et al., 2008). 따라서단일근섬유의횡단면적과근력의상대적인관계를표준수축력 (P o /CSA, 근육의횡단면적으로표준화된수축력 ) 으로제시하여근섬유의고유기능이노화에의해어떻게변하는지를규명하는것이필요하다. 본연구에서는단일근섬유의본질적수축특성에대한노화의영향을알아보기위해화학적처리로근막구조를벗겨낸단일근섬유를사용하였다. 본연구에서사용된화학적처리는근섬유내부의근세사 (myofilament) 조직을손상시키지않고근절과근형질세망, T-세관등근막에결합 하는구조물과세포소기관들을제거시켜서, 실험자가원하는농도의 Ca 2+ 으로근섬유를수축시킬수있다. 미토콘드리아또한기능을하지않기때문에근피로에의한장애도방지할수있다. 이러한특징들을바탕으로, 화학적으로분리된단일근섬유는세포내부의십자형교 (cross-bridge) 의특성을직접평가할수있는모델로활용돼오고있다. 단일근섬유로분리하여분석한선행연구들에따르면, 근기능척도인최대수축력 (maximal Ca 2+ -activated isometric force, P o ) 의감소와함께근섬유횡단면적 (fiber cross sectional area; CSA) 으로표준화된수축력 (P o /CSA) 감소, 그리고최대근수축속도 (unloaded shortening velocity, V o ) 등이노화에따라유의하게감소하는것으로나타났다 (D'Antona et al., 2003; Frontera et al., 2000; Krivickas et al., 2001; Larsson et al., 1997; Ochala et al., 2007). 이렇게본질적인근수축력이감소하는원인을설명하기위해, 최대수축시강력하게결합한십자형교의숫자가감소하고각각의십자형교에서생성되는힘이감소되었다는연구결과들이제시되었다 (D'Antona et al., 2003; Ochala et al., 2007). 하지만다른연구들에서단일근섬유의수축특성은노화가진행되어도여전히유지되는것으로발견되었고 (Frontera et al., 2003; Korhonen et al., 2006; Slivka et al., 2008; Trappe et al., 2003), 심지어 type I과 type IIa 근섬유에서는근섬유의최대수축력이미세하게증가하는것으로나타났다 (Frontera et al., 2008; Raue et al., 2009). 이러한결과는십자형교기전의본질적수축력은나이가들어도유지되는것을의미하고 (Trappe et al.,2003), 다시말해단일근섬유의고유능력이노화로인해변하지는않음을의미한다. 이처럼, 근력 (strength) 은일반적으로나이에따라감소하는것으로받아들여지지만, 근육세포즉, 단일근섬유에서의본질적인수축력에대한노화의효과는여전히논란이되고있다. 따라서본연구에서는노인의골격근을근육세포외의요인들이배제된단일근섬유로분리한상태에서, 근섬유의수축특성과횡단면적을 MHC 아형의발현유형에따라일반성인의골격근과비교하였다. 이러한실험방법은근육수축과정의부수적인요인들을배제한상태에서보다명확한단일근섬유의본질적수축력에대한정보를제시할수있으므로, 노화에따른골격근의질적변화에대한근거를제시할수있을것으로예상된다.
최승준 임재영 311 Ⅱ. 연구방법 1. 연구대상자 본연구는 Harvard Medical School and Spaulding Rehabilitation Hospital 의 Institutional Review Board 의승인을받아진행되었다. 모든피험자는실험목적, 절차, 위험성등에대한정보를제공받고서면으로동의서를제출하였다. 피험자는재활의학전문의로부터임상병력질문지와신체검사를마친후선정되었다. 근신경계나심혈관계질환, 고혈압, 6개월이내의사지골절, 기타의학적조건이불안정한사람과급성혹은만성질환이나상해가있는피험자는제외되었다. 또한피험자를선정하는데있어, 최근 6개월동안규칙적인유산소운동과저항성운동에참가하지않은피험자들을선택하였다. 이실험에는성인 10명 ( 남자 5명, 여자 5명, 25 ± 2 세 ) 과노인 8명 ( 남자 5명, 여자 3명, 78 ± 2 세 ) 으로총 18명의피험자가참여하였다. 모든피험자는근골격계기능과관련된약물이나여성호르몬대체약물의사용을금했다. 근생검을실시하기직전에는극심한신체활동을제한하였다. 2. 실험용액이완및활성용액의조성은 Fabiato 프로그램을사용하여계산되었고 (Fabiato, 1988), 이온화강도 (ionic strength), 온도, ph는모두동일하게조절되었다.(fabiato, 1985). 이완및활성용액은 7.0 mm EGTA(ethylene glycolbis-(aminoethylether) -N,N tetraacetate), 14.5 mm creatine phosphate, 20.0 mm imidazole, 4 mm Mg 2+ -ATP, 1mMfreeMg 2+ 로구성되어있으며, 이용액의 free Ca 2+ 농도는 CaCl 2 를이용하여이완용액은 10~9 M(pCa 9.0), 활성용액은 10~4.5 M(pCa 4.5) 로보정하였다. 수소이온농도는 KOH을이용하여 ph 7.0 로조절하였고, 총이온화강도 (total ionic strength) 는 KCl을이용하여 180 mmol로조절하였다. 3. 근생검및단일섬유분리근육표본은외측광근 (vastus lateralis) 을국소마취시킨후외과적절개 (incision) 를한뒤, 경피적침생검 (percutaneous needle biopsy) 기법으로추출되었다. 근생검직후, 근육표본은즉시이완용액 (relaxing solution) 으로옮겨져 (4 C), 종단면으로주의깊게손상없이분리되었다. 분리된근섬유다 발 (muscle fiber bundle) 은약 50-100여개의단일근섬유를 (single muscle fiber) 포함하였다. 근섬유다발은약10-20 % 정도늘어난길이로의료용봉합사를사용하여유리모세관에묶고분리용액 (50 % glycerol, 50 % 이완용액 ) 에넣어 4 C에서 24시간배양하였다. 배양후, 근막구조가제거된근다발 (permeabilized single fiber) 은 3주이내에차후분석할때까지 20 C에서보관되었다. 근막구조의제거를최종확인하기위해실험시작전, 분리된근다발을 0.5 % Brij-58 (polyoxyethylene 20 cetyl ether; Sigma Chemical) 이함유된 15 C 이완용액에서 30분동안배양하였다. 4. 실험장치실험당일에는, 근다발을이완용액이들어있는특수실험장치의챔버에옮겨서, 단일근섬유를손상되지않게분리하였다. 단일근섬유는의료용 10-0 봉합사로티타늄와이어에견고하게고정되었다. 근섬유는평균길이 1.37 ± 0.02 mm로, 한쪽은등척성근력변환기 (Model 400, Aurora Scientific, Aurora, Ontario) 에연결하고, 다른한쪽은고속모터 (Model 308B, Aurora Scientific) 에고정되었다. 고정된근섬유절편은이완용액을함유하는챔버에서활성용액을담고있는챔버로고속이동시킬수있도록, 특수하게고안된실험장치에연결되었다. 특수실험장치는현미경위에설치되어, 근섬유절편을 450 또는 600 배율 (Olympus IX70) 로실험과정동안관찰하였고, 근섬유이미지는 CDC 카메라와 graphic acquisition board를이용하여획득하였다.( 그림 1 D) 5. 실험프로토콜모든실험과정동안근절길이 (sarcomere length; SL) 는 2.6 µm로유지되었다. 근절길이는단일근섬유를따라각기다른 3곳의근절길이를측정하여확인하였다. 근섬유길이 (fiber length; FL) 는현미경에설치된마이크로미터 (micrometer) 를이용하여측정했다. 근섬유횡단면적은근섬유길이를따라타원형으로 3쌍의폭과깊이를측정하여계산하였다. 근섬유폭은광학면에서측정했고, 근섬유깊이는근섬유로향해있는프리즘으로부터반사된이미지를이용하여측정하였다. 근섬유폭과깊이는접안 (eyepiece) 마이크로미터로측정했다. 모든측정은 15 C에서실시하였다. 데이터는데이터수집기판 (data acquisition board, Model AT-MIO16E-10;
312 노인과성인의단일근섬유아형에따른수축특성과형태의비교 National Instruments, Austin, TX) 와 LabVIEW 프로그램 (Ver. 7.1, National Instruments) 을통해얻었다. Ca 2+ -활성화최대수축력 (P o ) 과최대수축속도 (V o ) 는선행연구에서와같이 slack 검사절차를통해서측정하였다 (Choi & Widrick, 2010). 간단히요약하면, 근섬유는활성용액 (pca 4.5) 으로옮겨진후, 최대수축력 (peak force) 에도달하게되면, 근섬유한쪽에빠른 (1-2 ms 이내 ) 단축성길이변화 ( 근섬유길이의약 8-18 % 범위 ) 를유발하였다.( 그림 1 A와 B). 단축성길이변화가가해진후, 장력이재발생되기까지의시간을측정하였고, 이러한과정을각각다른단축성길이변화로최소 5회이상실시하였다. 이렇게얻은결과들은최소자승회귀법 (least-squares regression) 을이용해 시간 vs. 단축성길이 로전개했을때회귀직선의기울기는 V o 로기록되었다 ( 그림 1 C). 단회귀식의설명력 (r 2 ) 이 0.95 이상일때에만유효한실험수치로기록되었다. 실험이실시되는동안, 외부요인에의한기준선변화 (baseline drift) 로인한근력측정의오류를제거하기위해, 최대근섬유의수축력은활성용액내에서의최대근력과이어지는기저근력 (baseline force) 사이의차이로계산되었다. sample buffer(62.5 mm Tris ph 6.8, 2 % SDS, 10 % glycerol, 5 % beta-mercaptoethanol, and 0.001 % bromophenol blue) 로변성시켰다. 근섬유의 MHC조성은 SDS-PAGE(6 % separating gel, 4 % stacking gel, acrylamide:bisacrylamide = 37:1) 을이용하여분석하였다. 특히 MHC 아형의전개를향상시키기위해젤에 30 % glycerol 을함유하였다. 전기영동시, 기존의시료에서얻은 Human MHC의세가지아형에대한 standard 를같이전개하여시료의아형을확인하였다. 7. 통계분석자료의통계분석은 Sigma Stat 11.0(Systat Software, San Jose, CA) 프로그램을사용하였고, 모든자료는평균 ± 표준오차로표시되었다. 모든실험된단일근섬유에서의 SL, FL, V o 에서성별에의한차이는없는것을확인하였다. 또한남녀피험자로부터얻어낸근섬유의수축특성이근섬유형태에따라다르지않았다. 이는사전연구결과와일치하는것으로 (Choi & Widrick, 2010) 차후분석에서는성별에따른차이를배제하였다. 변수에대해이원분산분석 (MHC 아형과나이의주효과및상호작용효과 ) 을실시했다. F ratio 가유의한경우, 사후검증으로서 Bonferroni post hoc test를사용하여차이를검증하였다. 선형회귀분석을이용하여횡단면적과근력사이의상관관계를분석하였고, 유의수준은 p <.05으로설정하였다. Ⅲ. 연구결과 1. 근섬유길이, 수축속도, 탄성 (compliance) Fig 1. Experimental Protocol. A. 5 superimposed length steps B. corresponding superimposed force responses. C. the time for redevelopment was plotted against the slack length step and fit by linear regression to yield maximal shortening velocity(normalized by fiber length), D. a representative image for single muscle fiber in relaxing solution. 6. MHC 아형분석 측정이완료된근섬유절편은티타늄선에서제거하여 80 C 에보관하였다. 근섬유절편은이후에 20 µl 의 SDS 젊은성인과노인의외측광근근육으로부터분리된 333 개의단일근섬유들의특성은표1과같이나타났다. 나이와근섬유형태로분류한집단들사이에서근섬유의길이 (FL), 근절의길이 (SL), 그리고탄성 (slk cmpl, 선형회귀분석의 y-intercept) 은통계적으로유의한차이가나타나지않았다. 따라서, 젊은성인과노인집단간에나타난근수축특성의차이는근섬유의물리적차이에의한것은아닌것으로나타났다. 예상했던바와같이, slack 검사를통해얻은최대수축속도 (V o ) 는나이에상관없이 type I 섬유에서가장느리게나타났고, type IIa 섬유는 type I 섬유보다빨랐으며 (p<.05), type IIa/IIx 섬유가가장빠르게나타났다 (p<.05, 그림
최승준 임재영 313 3B). 하지만나이에따라분류된집단에서, type I과 IIa 섬유의근수축속도는집단간차이를나타내지않았지만, type IIa/IIx hybrid 섬유는노인집단이젊은성인집단에비해 33 % 까지느리게나타났다.(p<.05, 표 1, 그림 3B) Table 1. The properties of single muscle fibers group young old MHC isoform (number of fibers) I (n=76) IIa (n=66) IIa/IIx (n=23) I (n=70) IIa (n=79) IIa/IIx (n=21) SL, µm Mean±SE, *p<.05(young vs. old) 2. MHC 아형분포 FL, mm Vo, FL/s slk cmpl, %FL 2.62±0.01 1.44±0.03 0.84±0.04 2.9±0.2 2.64±0.01 1.31±0.03 2.55±0.11 3.5±0.2 2.61±0.01 1.34±0.04 4.14±0.47* 3.1±0.4 2.62±0.00 1.39±0.03 0.76±0.03 3.4±0.2 2.59±0.03 1.37±0.02 2.66±0.15 3.4±0.2 2.60±0.12 1.31±0.04 2.75±0.30 3.9±0.5 그림 2 에서보여지듯이, type I MHC 의경우젊은성인집 단보다약 5 % 높은분포를, type IIa MHC 의경우노인집단에 서약 6 % 의높은분포를나타내었다. 단일근섬유내에서 두가지 MHC 를발현하는 type IIa/IIx MHC 의경우는성인집 단 (13 %), 노인집단 (12 %) 간의차이가없었다. 하지만, 젊은 성인과노인집단간의 MHC 아형분포를카이제곱검정으로 검증한결과두집단간유의한차이가없는것으로나타났 다 (chi-square= 1.429, p= 0.49). 3. 근섬유횡단면적 젊은성인의근섬유에서는 MHC 아형과무관하게횡단면 적에서통계적인차이가없는것으로나타났다 ( 그림 3A). 반 면에, type I 이나 IIa/IIx 형의노인근섬유는동일한아형의 젊은성인으로부터얻어진근섬유보다통계적으로횡단면 적이크게나타났다.(p<.05). 정량적으로분석한결과에따 르면, 노인의 MHC I 아형근섬유는젊은성인의 I 형근섬유 보다횡단면적이약 15 % 정도큰것으로나타났다. 이와유 사하게, 두개의 MHC 아형이공동발현되는 type IIa/IIx Fig 2. Distribution of MHC isoform. Top image is the silver -stained polyacrylamide gel to idetify three different human myosin heavy chain isoforms. hybrid 근섬유에서도노인의근섬유횡단면적이젊은성인 의근섬유에비해약 30 % 큰것으로나타났다 (p<.05). 따라 서, type I 와 IIa/IIx 근섬유의평균횡단면적은나이에따라 증가하지만, 반면 IIa MHC 아형이발현되는근섬유에서는 횡단면적에대한나이의영향이없었다. 근섬유횡단면적의 보다세밀한분포를규명하기위해, 그림 4 와같이산포도 (scatter plot) 로자료를변환하였다. 그결과 10,000 µm 2 이상 의횡단면적을갖는근섬유비율이젊은성인의경우약 6 % 로나타난반면, 노인의경우에서는약 11 % 로나타났다. 4. 최대근력 (Maximal Ca 2+ -activated force) 본연구에서, 단일근섬유의표준화된최대수축력은평 균 110~138 kn/m 2 의범위로선행연구결과들과일치하였다 (Frontera et al., 2003; Trappe et al., 2003). 젊은성인근섬유 에서, type I 근섬유는 type IIa, 혹은 IIa/IIx 근섬유에비해 낮은근력 (P o /CSA) 을생성하였고 (p<.05), type IIa 근섬유는 type IIa/IIx 보다낮은근력을생성하였다 (p<.05, 그림 3D). 하지만, 노인근섬유에서는, type I 근섬유와 type IIa 근섬유 에서생성된근력은차이가나타나지않았고, type IIa/IIx 근 섬유만이 type I 에비해유의하게높은근력을나타냈다 (p<.05). 최대절대근력 (mn) 의연령그룹간의비교에서, 노인의 type I 근섬유가성인의 type I 근섬유보다약 18 % 정도높은 근력을생성하는것으로나타났다 (p<.001). 하지만, 젊은성 인과노인의이러한절대적인근력 (mn) 의차이는횡단면적
314 노인과성인의단일근섬유아형에따른수축특성과형태의비교 Fig 3. The morphological and functional characteristics based on different MHC isoforms. * indicate a significantly difference between age groups(p<.05). Values are mean±se 섬유는 type IIa 근섬유만큼강한근력을생성하였고, 이는비대해진근섬유의횡단면적에비례하는것으로나타났다. 이러한결과는, 최소한건강한노인들에게서단일근섬유에서의근력생성능력이노화가진행되어도유지된다는선행연구결과들과일치한다 (Frontera et al., 2003; Korhonen et al., 2006; Slivka et al.,2008; Trappe et al., 2003). 평균화된근력은단일근섬유의보편적특성만을의미하기때문에, 각각의근섬유로부터얻은결과들을선형회귀분석법 (linear regression analysis) 을이용하여근섬유횡단면적과근력생성능력과의관계를분석하였다.( 그림4). 선형회귀분석결과에따르면젊은성인 (r 2 = 0.84, p<.001) 과노인 (r 2 = 0.82, p<.001) 의근섬유에서모두강한선형관계를나타냈다. 최근일부연구결과에따르면젊은동물의근섬유에비해나이든동물의근섬유는횡단면적이증가할수록근력이감소하는경향이보고되기도하였다. 하지만, 본연구를통해서는지금까지의선행연구들을통해잘알려진바와같이. 근섬유단면적과근력은직접적인상관관계를갖는다는결과들과일치하여나타났다 (Hellam & Podolsky, 1969). 따라서본연구의결과는흥분-수축결합을배제한단일세포수준에서의근육수축력은노화와관계없이유지된다는것을명확하게뒷받침한다. Ⅳ. 논의 Fig 4. Linear regression analysis of maximal fiber force and fiber CSA. The analysis shows identical relationship between force generating capacity and fiber CSA in young and old human muscle fibers. 으로표준화 (kn/m 2 ) 했을때차이가없어지는것으로나타났 다. 흥미로운사실은노인의 type IIa/IIx 근섬유의근력 (mn) 은약 19 % 정도낮게나타났지만, 통계적유의성은나타나 지않았다.(p=.063). 따라서노인으로부터분리된 type I 근 본연구에서는근섬유의 MHC 발현에따른단일근섬유의수축특성이노화에의해변화하는양상을알아보기위해젊은성인과노인의외측광근으로부터근육을채취하여비교분석하였다. 실험결과에따르면노인의 type I 섬유에서근섬유의횡단면적과절대근력이유의하게높게나타났다. 하지만높아진절대근력은근섬유의횡단면적으로표준화되었을때, 젊의성인의 type I 근섬유와차이가없는것으로나타났다. type II 근섬유와두개의 MHC 아형이공동발현되는 type IIa/IIx hybrid 근섬유에서도연령에따른근섬유의횡단면적, 절대근력그리고표준근력이차이가없는것으로나타났다. 최대근수축속도또한 type I과 IIa 근섬유에서노화로인한유의한변화가없는것으로나타났다. 따라서노화에따른신체기능의감소는근육세포수의질적퇴화보다는양적감소와함께, 흥분-수축분리 (EC uncoupling) 에따른근형질세망에서칼슘을분비하는체계의퇴화등의기전으로생각된다.
최승준 임재영 315 노화에따른근감소증 (sarcopenia) 은일반적으로골격근의질량손실과함께근력손실, 근수축속도감소와같은기능적특성들의점차적인감퇴를유발하는것이특징으로여겨진다.(Doherty, 2003; Goodpaster et al., 2006; Lynch et al., 2007; Thomas, 2007). 즉, 나이에따른근위축은근육의양적 ( 근질량 ) 및질적 ( 횡단면적당근력, 근섬유형태의비율과대사적특성 ) 감소모두관련있는것으로여겨진다 (Lynch et al., 2007). 근육의양적감소는주로수축력에관여하는단백질의감소에서비롯되는것으로생각되며, 다시말해서근섬유수의감소와남은근섬유크기의감소모두로부터기인하는것으로생각된다. 예를들면, 65~75 세에서근육의횡단면적이약 25~30 %, 근력은 30~40 % 감소하는것으로보고되었다 (Porter et al., 1995). 이러한노화에의한근수축단백질함량의감소는단백질의분해와합성비율의차이로설명될수있고 (Yarasheski, 2003), 저하된단백질합성보다는높아진단백질분해가주요요인으로여겨지고있다 (Kimball et al., 2004). 나이에따른근육의질적감소는노화된근육에서최고수축장력 (peak twitch tension) 도달시간과근육이완반응시간이증가하는것을의미한다 (Schertzer et al., 2005). 이러한원인으로는근육내콜라겐과지방수준의증가, 단일근섬유의표준화된최대수축력 (kn/m 2 ) 감소, 흥분-수축결합의퇴화, 신경생성인자, 운동단위재형성 ( 신경제거와신경재분포 ) 등의여러다른기전들의가능성들이있다 (Delbono, 2003; Hook et al., 2001; Plant & Lynch, 2002). 이처럼전체근육에서의수축특성은일반적으로노화에따라감소하는것으로받아들여지지만, 단일근섬유의본질적특성에대한노화의효과는여전히논란의여지가있다. 즉젊은성인과노인의단일근섬유수준에서의최대수축력 (P o ), 최대근수축속도 (V o ) 에대한선행연구결과들은일정하지않다. 본연구에서는노인의 type I 근섬유에서의횡단면적증가와함께젊은성인의 type I 근섬유보다높은절대근력이나타났지만, 절대근력이근섬유의횡단면적으로표준화되면이러한차이는사라지는것으로나타났다. 이러한근섬유의횡단면적증가의현상은노화에따른형태학적의보상효과 (compensation effect) 로선행연구에서제안되었다 (Raue et al., 2009). 구체적으로, 노화가진행됨에따라나타나는근섬유의위축은 type I 근섬유보다는 type II 근섬유에서주로일어나기때문에 (Lexell et al., 1988; Sato et al., 1984), 이를회복하기위한보상효과로서, type I 섬유에서의비대가나타나는것으로보고되었다. 이는근육내에서의지형변화에따른물리적특성에기인하는것으로생각된다. 다시 말해, 노화에따라근섬유의수가감소하게되면서, 근육내의근섬유밀도저하로, 남아있는근섬유에서의상대적인근비대 (hypertrophy) 가나타나는것으로생각된다. 이는최근연구에서확인되었는데 (Raue et al., 2009), 본연구에서도, 건강한노인의 type I 근섬유에서이러한보상효과가나타남으로써이러한현상을뒷받침하였다. 한편노인의 type I 단일근섬유의절대근력이증가 (18 %) 한이유는근섬유의단면적증가 (15 %) 에따른것으로사료된다. 즉단면적증가에따라단일근섬유내의수축단백질 (myofilament) 의증가가함께나타난것이다. 본연구의결과와는반대로일부연구에서는, 노화에의해단일근섬유의크기와수축특성모두유의하게감소하는것으로보고되었다 (D'Antona et al., 2003; Frontera et al., 2000; Krivickas et al., 2001; Larsson et al., 1997; Ochala et al., 2007). 앞서기술한바와같이, 근섬유의최대수축력 (P o ), 횡단면적으로표준화된수축력 (P o /CSA), 최대근수축속도 (V o ) 모두유의하게감소하는것으로보고되었고, 이는노화로인한본질적인근력생성능력의감소, 즉근육세포의질적저하를의미한다. 단일근섬유의질적감소에대한 Lowe 와동료들의연구에따르면 (Lowe et al., 2001), 근섬유가최대로수축할때, 약 32 % 의마이오신머리 (head) 가강한-결합상태 (strong-binding state) 에있게되지만, 나이가든뒤에서는단지 22 % 의마이오신머리가강한-결합상태에있게된다. 따라서, 노화된근육의 P o 감소는횡단면적당강한결합상태의십자형교수가감소하는것이원인으로제안되었다. 또다른기전으로는노화에따른마이오신함량의감소와마이오신아형발현의변화에따른근섬유형태전이 (fiber type shift) 또한주목할만한기전으로제시되고있다 (Canepari et al., 2010; D'Antona et al., 2003). 노화로인한수축속도의감소는액틴-마이오신십자형교의분리속도와같은십자형교주기내의단계들이느려지는것에기인하다 (Larsson et al., 1997). 이러한현상은아형의변화없이도일어나는것으로주장되고있으며 (Bottinelli, 2001), 이는마이오신의당화 (glycation) 와관련된것으로생각된다 (Ramamurthy et al., 2001). 이렇듯노화에따른본질적인십자형교의수축력에대한모순된결과들은피험자의생활환경, 식이, 지난수십년간의신체활동이력등과같은단일근섬유의특성에기여하는중요인자들을적절하게통제할수없기때문일것이다 (D'Antona et al., 2007). 더욱이, 피험자의교육, 직업이력, 사회경제적지위, 성격등의차이는신체활동수준에도영향
316 노인과성인의단일근섬유아형에따른수축특성과형태의비교 을미치고 (Seefeldt et al., 2002), 이는결과적으로단일근섬유의수축특성에도영향을미치게된다. 즉, 사람을대상으로한연구는생활습관의다양성에만국한되는게아니고, 개인이력의이질성 (heterogeneity) 도고려해야한다. 그러므로추후연구에서도이러한다양한변인들을통제하는것에지속적으로유의해야할것으로사료된다. Ⅴ. 결론 노화에따른단일근섬유의본질적수축특성의변화를분석하기위해, 노인의골격근을단일근섬유로분리한상태에서, 근섬유의수축특성과횡단면적을 MHC 아형의발현유형에따라일반성인의골격근과비교한결과다음과같은결론을얻어냈다. 1. 노화가진행됨에따라 type I 섬유에서근섬유의횡단면적과절대근력 (mn) 의유의한증가가나타났다. 하지만증가된절대근력은근섬유의횡단면적으로표준화했을때 (kn/m 2 ) 이러한차이가사라지는것으로나타났다. 2. type IIa와 type IIa/IIx hybrid 근섬유에는연령에따른근섬유의횡단면적, 절대근력그리고표준근력에차이가없는것으로나타났다. 3. 단일근섬유의최대근력과횡단면적사이의선형회귀분석결과, 직접적인상관성이나타나, 흥분-수축결합을배제한단일세포수준에서의근섬유수축력은노화와관계없이유지됨을나타내었다. 4. 따라서, 노화에따른근력 (muscular strength) 저하는단일근섬유의본질적수축력저하에의한질적퇴화보다는주로근육단일근섬유수의양적감소에기인하는것으로사료된다. 참고문헌 Ansved T & Larsson L. (1990). Effects of denervation on enzyme-histochemical and morphometrical properties of the rat soleus muscle in relation to age. Acta Physiol Scand 139., 297-304. Bottinelli, R. (2001). Functional heterogeneity of mammalian single muscle fibres:do myosin isoforms tell the whole story? Pflugers Arch., 443, 6-17. Canepari, M, Pellegrino, M. A., D'Antona, G., & Bottinelli, R. (2010). Single muscle fiber properties in aging and disuse. Scand J Med Sci Sports., 20, 10-19. Choi, S. J., & Widrick, J. J. (2010). Calcium-activated force of human muscle fibers following a standardized eccentric contraction. Am J Physiol Cell Physiol., 299, C1409-1417. D'Antona, G., Pellegrino, M. A., Adami, R., Rossi, R., Carlizzi, C. N., Canepari, M., Saltin, B., & Bottinelli, R. (2003). The effect of ageing and immobilization on structure and function of human skeletal muscle fibres. J Physiol., 552, 499-511. D'Antona G, Pellegrino MA, Carlizzi CN & Bottinelli R. (2007). Deterioration of contractile properties of muscle fibres in elderly subjects is modulated by the level of physical activity. Eur J Appl Physiol., 100, 603-611. Delbono, O. (2003). Neural control of aging skeletal muscle. Aging Cell2, 21-29. Delbono, O., O'Rourke, K. S., & Ettinger, W. H. (1995). Excitation-calcium release uncoupling in aged single human skeletal muscle fibers. J Membr Biol., 148, 211-222. Doherty, T. J. (2003). Invited review:aging and sarcopenia. J Appl Physiol., 95, 1717-1727. Fabiato, A. (1985). Time and calcium dependence of activation and inactivation of calcium-induced release of calcium from the sarcoplasmic reticulum of a skinned canine cardiac Purkinje cell. J Gen Physiol., 85, 247-289. Fabiato A. (1988). Computer programs for calculating total from specified free or free from specified total ionic concentrations in aqueous solutions containing multiple metals and ligands. Methods Enzymol 157, 378-417. Frontera, W. R., Hughes, V. A., Krivickas, L. S., Kim, S. K., Foldvari, M., & Roubenoff, R. (2003). Strength training in older women:early and late changes in whole muscle and single cells. Muscle Nerve, 28, 601-608. Frontera, W. R., Reid, K. F., Phillips, E. M., Krivickas, L. S., Hughes, V. A., Roubenoff, R., & Fielding, R. A. (2008). Muscle fiber size and function in elderly humans:a
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