TEM 시료제작 박창현 ( 고려대학교의과대학 ) I. 조직채취 (Sampling) 1. TEM 조직이든 SEM 조직이든가급적작게체취하는것이좋다. 특히 TEM 에서는 1x1x1mm 정도로작게하는것이좋다. 2. 방향성이요구되는경우에는 1x1x2mm 정도로한쪽방향을약간길게하여야후에 embedding 과정에서포매하기가용이하여진다. (skin, nerve등 ) 3. 조직을채취하는데시간이오래걸리거나, 고정이잘안되는조직은 perfusion 한후채취한다. 4. 실험동물을사용시에는마취후살아있는상태하에서필요부분을잘라낸다. 5. 신속히고정액에담아야한다. II. 고정 (Fixation) 1) 고정의목적 1. 고정이란세포의 autolysis를방지하고세포성분의응고및경화시키는것이다. 2. 세포의구조가살아있는상태에서의변화를최소화시켜서잘보존시킨다. 3. 탈수과정및후에전자 beam 에노출되었을때조직을보존하기위함이다. 2) 고정액 (fixative) 의선택 1. 이상적인고정액은조직의수축또는팽창등의변화를최소화하며빨리조직내에침투하는고정액이다. 2. 전고정에는 aldehyde 계통은 2% 정도의 paraformaldehyde fixative나 2% 정도의 glutaraldehyde fixative가많이사용된다. 3. TEM 조직고정에는 glutar. fixative 단독으로사용하거나 paraform. 과 glutar. 혼합 fixative를많이사용한다. 4. SEM 조직고정시는 glutar. fixative 만을사용하는경향이많다. 5. 후고정에는중금속인 1% OsO4를사용하여조직을더욱안정시키고전자밀도 (contrast) 를증가시킨다. 3) 완충액 (buffer) 의사용 1. 고정액의 ph와삼투압을조절하기위하여완충액을사용함. (ph 7.2-7.4) 2. 전고정과후고정사이에서이들고정액들간의화학적반응을방지하기위하여고정액에사용된같은 buffer 로세척을한다. 3. 후고정후에도과도한 fixative 의제거및고정액과탈수제사이의반응을방지하기위하여세척을한다. 4. Buffer 에는 phosphate, cacodylate, veronal acetate buffer외많은종류가사용되나통상 phosphate 나 cacodylate buffer가많이사용된다.
4) 고정액의온도및시간 1. Autolysis 나 extraction 을최소화하기위해서 0-4 의저온에서실시한다. 2. 전고정액에는 2-4시간고정한다. 3. 후고정액 (OsO4) 에는 1-2시간정도고정하며 2시간을절대로넘기지않는다. 4. Microtuble과같은 Cytoskelatone이주된관심분야인경우에는오히려 extraction을촉진하여관찰이용이하게되도록하고자실온에서실시하기도한다. 5) 고정액사용시주의사항 1. OsO4는 1gm 으로시판되는데용해가잘안되므로최소한사용하기 1일전증류수에 2% 용액으로만들어갈색병에담아서냉장고에보관한다. 2. 고정액은눈, 코의점막, 기도등에손상을주므로작업시에는반드시 hood에서다룬다. III. 탈수 (Dehydration) 1) 탈수의목적 1. TEM 관찰을위해서는초박절편을제작하여야하므로조직을포매하여야한다. 2. 이러한포매제는일반적으로물과잘혼합되지않으므로물과포매제에잘섞이는용제로써조직내의 free water를제거하여야한다. 3. 또한조직내의수분은높은표면장력으로써구조적역할을하고있으므로물보다표면장력이낮은유기용매로서서히대체시킨다즉 50% 부터 100% 까지점차로실시한다. 2) 탈수방법및시간 1. 조직의성질과크기등에따라서탈수시간이달라지나가능한한짧은시간내에실시한다. 2. 탈수시간이너무길면조직으로부터물질의유출 (extration) 의우려와조직의수축등이일어날수있다. 3. 탈수시간이너무짧으면불완전한탈수로인하여후에표매과정도불완전하여절편제작 (sectioning) 시많은어려움이발생하게된다. 3) 탈수용매의종류 1. Acetone: 포매제와잘섞이므로탈수후치환제가필요없으나, 흡습성이강하여불완전한탈수가우려된다. 그러나 ethanol보다값이싸므로이용하는경우도많다. 2. Ethanol: 가장일반적으로많이사용되는우수한탈수제이나, 지질유출능력이비교적강하고 epoxyresin과같은포매제에잘섞이지않으므로 ethanol 탈수후치환제를필요로한다. 3. Propylene oxide: 주로치환제로사용되는탈수제이다. 4) 탈수의실제 50% Ethanol 5-20 min 1-2회 60% " " " 70% " " "
90% " " " 100% " " 3 회 Propylene oxide " 2 회 IV. 포매 (Embedding) 1) 포매의목적및과정 1. 고정및탈수가끝난조직에포매제를완전하고균일하게침투시켜야후에초박절편 (thin section) 제작이용이하게된다. 2. 조직내의탈수용매를포매제와대체시켜주고 (infiltration), 조직내의모든틈새를포매제로채워 (embedding) 넣는과정이다. 2) 침투 (infiltration) 1. 침투는탈수후포매제로점진적대체시키는방법이다. 2. 이때 shaker를이용하면침투가쉽게된다. 3. 침투의실제 Propylene oxide: epon = 2 : 1 ( 또는 3 : 1) 30-60 min 1 : 1 30-60 min 1 : 2 3hr.-over night 0 : 1 2hr. 3) 포매제의구비조건 1. 세포성분의유출능이거의없어야한다. 2. 탈수제, 치환제등에쉽게녹아야한다. 3. 점도가낮아조직내의침누가용이하여야한다. 4. 중합 (polymerization) 과정시부피의변화가거의없어야한다. 5. 관찰시전자 beam에안전하여야한다. 6. 절편제작이쉽고, 균일하여야한다. 7. 절편이얇게되고, 염색성이좋아야한다. 4) 포매제의종류 1. 불수용성포매제 (water-immiscible media) Methacrylate : 현재거의사용하지않음 Polyester resin : epoxy resin 과비숫한성질 Epoxy resin : 현재가장널리사용되는우수한포매제염색성우수, 전자선에도잘견딤. 2. 수용성포매제 (water-miscible media) Durcupan, Glycol methacrylate, Gelatin, Poly ethylene glycol 등이있음. 5) 포매제의구성 (Epoxy resin 을기준으로함 ) 1. 포매제 : Epon 812 2. 경화제 (hardner) : DDSA (Dodecenyl scuccinio anhydride)
NMA (Nadic methyl anhydride) 3. 가속제 (accelerator) : 포매제와경화제의반응을촉진시킨다. DMP-30 (Tridimethyl amino-methyl phenol) 이사용 6) 포매제의혼합 (Epon mixture) A 액 B 액 Epon 812-100gm Epon 812-100gm DDSA - 112gm NMA - 75gm 1. A, B 액을만들어서보관하여두었다가포매시혼합하여사용한다. 2. A 액은연 (soft) 하며, B 액은경 (hard) 하므로이들혼합비를조절하여온도조건에따라사용한다. 3. 일반적으로여름철에는경한편으로, 겨울철에는연한편을사용하나각실험실마다온도조건에따라서혼합비가달라진다. 4. A : B 액의혼합액에가속제 (DMP-30) 를 1.5-2% 비율로섞어서사용한다. 5. 특히 DMP-30 혼합시불균일하게혼합되면침투도불균일해지며 block 의질도떨어지고, 초박절편제작이어렵게된다. 6. 가급적온도는 20-25, 습도 50% 이하에서포매하는것이좋고, 사람에따라서allergy 가일어나는사람도있으니포매시비닐장갑을착용한다. 7) 중합 (Polymerization) 1. Gelatin capsule, polypropylene capsule, silicon plate 등에포매한다. 2. 60 에서 24-48 시간중합하는경우가있다. 3. 다음과같이온도를조절하여중합하는경우도있다. 35 : 12hr. 45 : 12hr. 60 : 24-48hr. 4. 요즘 cytochemistry 에서열의영향을배제하고자 UV-lamp를이용하여중합시키는방법도있다. 8) Block 보관 중합이끝난 block 를 silicagel 이들어있는 desicator 에보관하여두면좋다. V. 절편제작 (Sectioning) 1) 절편제작과정 1. TEM 관찰시매우얇은절편 (500A 정도 ) 이요구되므로조직이포매된 block 을 trimming 한다. 2. Ultramicrotome 을사용하며절편을제작한다. 3. 물위에뜬절편을 grid에올려놓는과정이다. 2) 유리칼 (Glass knife)
1. 날면이매우 sharp 하여초박절편을만들때효과적이므로가장널리사용된다. 2. Plier 만을갖고손으로만드는방법도있으나대부분 5-10mm 두께의유리를 knife make 에넣어제작한다. (LKB 사, Sorvall 사, Sunkay 사등 ) 3) Diamond Knife 1. Glass knife 보다훨씬우수하여, 균질한 thin section을만드는데좋다. 2. 잘못다루어서날이손상되면재생하는데고가의경비가요구된다. 3. 사용시세심한주의가필요하며, 초심자는가급적사용을금해야한다. 4) Grid 1. LM 에서는 slide glass를사용하듯, EM 에서는 grid 로절편을지지한다. 2. 즉절편을지지하는얇은망으로써직경 3mm 정도의원형으로구멍수에따라구분된다. 3. One hole (single), one slot, 100 mesh, 200 mesh, 300 mesh 등이있으며실험내용과조직에따라알맞는것을사용한다. 4. 널리쓰이는일반적인 grid 는구리 (copper) 로만들어져있으며, 실험내용에따라 nickel 이나백금 (platinum) 제품도이용된다. 5. 구멍이큰 grid (one role grid, 100 mesh grid 등 ) 는얇은지지막 (suppot film) 을 grid 에씌워서사용한다. 5) 절편제작시구비조건 1. 온도 (20 정도 ) 와습도 (50% 정도 ) 가일정하다. 2. Ultramicrotome이진동을받지않는곳. 3. 공기의유통이적고, 분진이적은곳. 6) Block의삭정 (Trimming) 1. 절편을제작하기에앞서서먼저 block의불필요한부분을제저한다. 2. Stereo microscope 아래서면도칼을이용하여실시한다. 3. Knife와 block face 사이에서 block이균등한힘을받아서 section이용이하게되며연속된절편을얻을수있도록 block의윗면 (block face) 을사다리꼴로 trimming 한다. 4. 또한광학현미경하에서 thin section을위한부위선정시용이하도록사다리꼴로실시한다. 7) 후절편 (Semithin Section) 의제작 1. Ultramicrotome을이용하여일반적으로두께 0.5-1um 정도로자른다. 2. 유리봉이나루프를이용하여 slide glass위에절편을옮긴다. 3. Slide glass를 hot plate (60-80 ) 위에서건조시킨다. 4. 건조된절편을염색액 toluidine blue 나 methylene blue 로염색한다. (hot plate 이용 ) 5. 광학현미경 (LM) 하에서관찰하여전자현미경에서관찰하고자하는부위를선정한다. 6. 염색액제조방법 Toluidine blue Methylene blue Toluidine blue - 1gm Methylene blue - 1gm
Sodium borate - 1gm Sodium hydroxide 소량 D. W. - 100ml D. W. 100ml 에먼저 sod. borate 를넣어 60-70 에서녹인후, toluidine blue 를넣어잘 용해한다음 filter paper 에여과하여사용한다. 8) 박절편 (Thin Section) 의제작 1. 광학현미경에서선정된부위만을남기고다시한번 block을 trimming하여나머지부분을제거한다. 2. 이때 trimming한부위 (block face) 가너무넓을경우에는박절편을제작하기에어려우므로가급적작게 trimming한다. 3. 만들어진절편을모으기 (collecting) 와전자현미경하에서의관찰을용이하게하기위하여가급적 ribbon 모양으로절편을만든다 ( 그림 8 참조 ) 4. D. W. 위에만들어진 thin section의 ribbon을 grid 로뜬다 ( 그림 8 참조 ) 5. Grid와 forceps 사이의수분을 filter paper로제거한후 petridish 또는 grid box에보관한다. VI. 전자염색 (Staining) 1) 전자염색의목적 1. 완성된 section을전자현미경으로관찰하기위해서는염색을하여야한다. 2. 전자현미경으로관찰시세포나조직의미세구조의관찰을위해서중금속을이용하여 contrast (electron density) 를부여한다. 2) 염색액의제조 1. 여러가지염색액이있으나현재일반적으로 uranyl acetate와 lead citrate를이용한다. 2. Uranyl acetate 염색액의제조가. D. W., ethanol 및 acetone등에 3-7% 로녹여서여러시간방치한후사용한다. 나. 빛에분해되기쉬우므로갈색병에넣어서보관한다. 3. Lead citrate 염색액의제조가. Reynold's method I 액 II 액 Lead nitrate - 1.33gm 1N NaOH - 8ml Sod. citrate - 1.76gm D. W. - 30ml 나. I액을 30분정도완전용해하면 lead citrate가된다 ( 젖빛색깔 ). 다. 이때 II액을가한후 D. W. 를가하여 total volume이 50ml가되도록한다. 라. 주사기나 flask에넣에냉장고속에보관한다. 3) 염색방법 1. 탈수전에실시하는 block stain은 1-2% uranyl acetate를이용하여 1내지 2시간한다. 2. 보통의염색방법으로는 uranyl acetate 를먼저염색한후 lead citrate를염색하는 double stain 법을많이사용한다. 3. 작은 petri dish속에염색액을한방울떨어뜨린후 grid를완전히담그거나, 염색액에위에
띄워서염색을한다. 4. 염색시간은보통 uranyl acetate에는 5-30분, lead citrate에는 5-20분염색하나각실험실마다시간이매우다르다. 5. 시간이길어질수록 contamination이증가하므로알맞는시간을정해서실시한다. 6. 염색이매우손쉬운 automatic stainer를사용하는실험실도있다. ( 카톨릭대 EM실 ) 7. 염색이끝난 grid는 D.W. 를담은작은 beaker을 3개정도준비하여차례대로담그어서 washing하거나, wash bottle을이용하여 grid위에물을떨어뜨려서 washing하는방법이있다. 사진작업 (Photography) - 요즘은 CCD 카메라를이용하기때문에이내용은삭제한다.