LMO승인제도설명집

간행물발간등록번호 (ISBN) 978-89-93016-17-8 93510 시험 연구단계유전자변형생물체수입및개발 실험승인심사설명집 2008

목 차 I. 들어가는말 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 4 7 1. 법률소개 / 8 2. 용어의정의 / 9 3. 수입승인대상 / 10 4. 제출서류및승인심사절차 / 13 5. LMO의명칭 특성및용도작성시고려사항 / 17 6. 표시및안전취급관리 / 34 부록 I 37 1. LMO 통합고시제3장 / 38 2. 별표 3-2 승인제외대상약제내성유전자 / 50 3. 별표 3-3 LMO 명칭 특성및용도정보목록 / 55 4. 별지제10호서식 LMO 수입승인신청서 / 58 5. 별지제3-1호서식시험 연구개요서 / 59 6. 별지제3-3호서식자료보완기간연장요청서 / 60 7. 별지제3-4호서식승인사항변경승인신청서 / 61 8. 별지제27호서식 LMO 수입관리대장 / 62 9. 별지제28호서식 LMO 운반관리대장 / 63 10. 별지제29호서식 LMO 보관관리대장 / 64 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 65

1. 법률소개 / 66 2. 용어의정의 / 67 3. 개발및실험승인대상 / 68 4. 제출서류및승인심사절차 / 71 5. 개발 실험의위해성평가자료작성시고려사항 / 75 6. 생물학적위해성평가 / 127 부록 II 131 1. LMO 통합고시제9장 / 132 2. 별표 3-2 승인제외대상약제내성유전자 / 139 3. 별표 9-5 개발 실험위해성평가자료목록 / 144 4. 별지제25호서식 LMO 개발실험승인신청서 / 148 5. 별지제3-1호서식시험 연구개요서 / 149 6. 별지제9-2호서식개발 실험평가자료제출표 / 150 7. 별지제3-3호서식자료보완기간연장요청서 / 151 8. 별지제9-3호서식승인사항변경승인신청서 / 152 9. 별지제9-5호서식연구시설설치 운영신고확인서 / 153 10. 별지제23호서식연구시설설치 운영허가서 / 154 11. 별지제27호서식 LMO 개발관리대장 / 155 12. 별지제28호서식 LMO 운반관리대장 / 156 13. 별지제29호서식 LMO 보관관리대장 / 157 14. 기관생물안전위원회생물안전심의결과서양식 / 158 15. 미생물의위험군분류 / 159 Ⅳ. 참고문헌 175

Ⅰ. 들어가는말 21세기들어아시아지역을중심으로중증급성호흡기증후군과고병원성조류인플루엔자감염증이발생하여많은인명손실과함께사회 경제학적피해및혼란이야기되었다. 이들감염증의원인바이러스는병원성관련유전자의변형으로인하여숙주의범위가다양해진경우로신변종전염병에대한적극적인대응방안의필요성이대두되고있고, 큐열, 결핵, 치쿤구니아, 보툴리눔독소증등다양한병원체에의한자연적감염질환이전세계에서지속적으로발생함에따라다양한감염병의치료및예방, 신속한진단을위한진단법, 백신및치료제개발, 병인및항생제내성기전규명등관련연구가활발하게수행되고있다. 질병을초래하는병원성미생물은불특정다수의인명살상및피해를목적으로하는생물테러용생물무기제조에이용될수있기때문에인체병원체의이중적사용 (dual-use) 으로인한위해가능성이제기되고있다. 또한, 유전자변형생물체를이용한새로운치료제및백신개발은인류의건강유지를위해유용하게활용될수있지만생물다양성보존의파괴, 지속적인이용으로인한악영향발생등위해가능성을배제할수없다. 이러한이유등으로병원체및유전자변형생물체의개발및실험, 취급관리, 국가간이동등에대하여생물안전및생물보안체계의구축및이행, 현대생명공학기술남용방지를위한인식제고,

위해관리등이국가적차원에서마련되어야함이더욱강조되고있다. 이와관련하여 유전자변형생물체의국가간이동등에관한법률 이 2008년시행됨에따라특히위해가능성이큰유전자변형생물체를개발하거나이용하는실험을실시하고자하는경우에는사전에국가의승인을받도록동법률에명시되어있는데이러한법적, 행정적조치는인체위해가능성이큰병원성미생물를이용한유전자변형생물체개발및실험에대한효과적인위해성평가및관리시스템의확립과발생할수있는위해의사전방지의필요성에근거하고있다. 질병관리본부는연구시설의신고및허가등록제와연계하여해당연구시설에서수행되는유전자변형생물체개발및실험의생물안전확보등연구의건전성을확보하고자위해가능성이큰시험 연구용유전자변형생물체를수입하거나유전자변형생물체개발또는이용하는실험에대한승인심사업무를이행하고있다. 본설명집은 유전자변형생물체의국가간이동등에관한법률 에의거한시험 연구용유전자변형생물체수입승인과위해가능성이큰유전자변형생물체개발및실험의승인에대한심사대상및절차, 제출서류목록, 위해성평가, 제출자료작성시고려사항등을소개하는내용으로구성하여신청인의이해를도모하고자하였다.

II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 1. 법률소개 / 8 2. 용어의정의 / 9 3. 수입승인대상 / 10 4. 제출서류및승인심사절차 / 13 5. LMO의명칭 특성및용도작성시고려사항 / 17 6. 표시및안전취급관리 / 34 부록Ⅰ / 37

II. 시험 연구용유전자변형생물체수입승인심사 1. 법률소개 수입승인 유전자변형생물체의국가간이동등에관한법률 ( 이하 법 ) 제9조제1항및동법시행령제12조제1항및제2항에의거하여위해가능성이큰시험 연구용유전자변형생물체를수입하고자하는자는질병관리본부장의승인을얻어야한다. 승인, 조건부승인또는불승인통지동법시행규칙제7조와관련하여질병관리본부장은승인신청서를접수한날부터 270일이내에승인, 조건부승인또는불승인여부를결정하여관련서식에따라신청인에게통지한다. 다만, 수입승인을받은유전자변형생물체와동일한유전자변형생물체를계속수입하는경우에는 10일이내에승인여부를결정하여신청자에게통보한다. 8 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

2. 용어의정의 유전자변형생물체유전자변형생물체 (Living Modified Organisms, LMO) 는다음의현대생명공학기술을이용하여얻어진새롭게조합된유전물질을포함하고있는생물체를말한다. 가. 인위적으로유전자를재조합하거나유전자를구성하는핵산을세포또는세포내소기관으로직접주입하는기술나. 분류학에의한과의범위를넘는세포융합으로서자연상태의생리적증식이나재조합이아니고전통적인교배나선발에서사용되지아니하는기술 시험 연구용유전자변형생물체시험 연구용으로사용하기위하여밀폐사용조건 ( 안전등급에따라관계중앙행정기관의장의허가를받거나신고한연구시설 ) 에서이용되는유전자변형생물체를말한다. 취급자 유전자변형생물체를수출입둥의목적으로취급관리하는자와 유전자변형생물체를원료로이용하는자를말한다. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 9

취급관리유전자변형생물체를수출입둥을하는자가승인용도외의사용방지, 승인조건준수등안전성을확보하기위한일체의행위를말한다. 3. 수입승인대상 수입하고자하는경우질병관리본부장의승인을얻어야하는시 험ㆍ연구용유전자변형생물체는다음과같다. 종명까지명시되어있지아니하고인체병원성여부가밝혀지지아니한미생물을이용하여얻어진유전자변형생물체 척추동물에대하여몸무게 1kg당 50% 치사독소량이 100ng 미만인단백성독소를생산할능력을가진유전자변형생물체. 해당단백성독소목록 보툴리늄독소 (A, B, C, D, E, F형 ) 파상풍독소 이질신경독소 디프테리아독소 기타척추동물에대하여몸무게 1kg당 50% 치사독소량이 100ng 미만의수치를갖는것으로알려진독소 10 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

의도적으로도입된약제내성유전자를가진유전자변형생물체. ( 의학적, 수의학적으로치료에사용되는약제에대한내성을발현하는내성유전자를포함하는유전자변형생물체 ) 단, 아래의경우는제외한다. 인정숙주-벡터계 (LMO 통합고시별표 3-2 부표 ) 를이용한 ampicillin, chloramphenicol, hygromycin, kanamycin, streptomycin 또는 tetracycline 내성유전자도입 Kanamycin, neomycin 내성유전자 (nptⅡ) 또는 hygromycin 내성유전자 (hph) 를선발표지유전자로포함하는유전자변형식물 국민보건상국가관리가필요한병원성미생물인 고위험병원체 를이용하여얻어진유전자변형생물체. 고위험병원체목록 세균및진균페스트균 (Yersinia pestis) 탄저균 (Bacillus anthracis) 양브루셀라균 (Brucella melitencis) 돼지브루셀라균 (Brucella suis) 비저균 (Burkholderia mallei) 장출혈성대장균 O157(Escherichia coli O157) II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 11

멜리오이도시스균 (Burkholderia pseudomallei) 보툴리눔균 (Clostridium botulinum) 큐열균 (Coxiella burnetii) 야토균 (Francisella tularensis) 발진티푸스균 (Rickettsia prowazekii) 홍반열리케치아균 (Rickettsia rickettsii) 콕시디오이데스이미티스균 (Coccidioides immitis) 콜레라균 (Vibrio cholerae 01, 0139) 바이러스및프리온 헤르페스 B 바이러스이스턴이콰인뇌염바이러스핸드라바이러스마버그바이러스니파바이러스남아메리카출혈열바이러스두창바이러스 크리미안콩고출혈열바이러스에볼라바이러스라싸바이러스원숭이폭스바이러스리프트벨리열바이러스진드기매개뇌염바이러스소두창바이러스 베네주엘라이콰인뇌염바이러스중증급성호흡기증후군코로나바이러스조류인플루엔자인체감염증바이러스우해면양뇌병증벙원체 12 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

4. 제출서류및승인심사절차 제출서류 유전자변형생물체의수입승인을얻고자하는신청인은아래의 구비서류및전자문서 1 부를제출하여야한다. 별지제10호서식시험 연구용유전자변형생물체수입승인신청서 1부 수입계약서 ( 수입을대행하는경우에는수입대행계약서를포함 ) 또는주문서사본 1부 운반경로 운반수단및운반업자가기록된운반계약서또는자가운반계획서 1부 취급 보관에관한안전관리방안과안전관리에필요한전문인력 설비현황에관한서류 10부 LMO통합고시별표 3-3 유전자변형생물체의명칭 특성및용도에관한서류 10부 LMO통합고시별지제3-1호서식시험 연구개요서 10부 신청방법접수방법 : 방문, 우편처리기한 : 접수한날로부터 270일이내단, 기승인된유전자변형생물체와동일한유전자변형생물체를계속수입하는경우, 10일이내결과통보수수료 : 2만원, 수입인지로납부 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 13

단, 동법시행령제 31 조에의거하여대학, 정부출연연구기관, 국 공립연구기관, 특정연구기관, 한국보건산업진흥원은수수료면제 심사절차질병관리본부장은위해가능성이큰유전자변형생물체수입으로인한위해성, 사용용도의타당성, 운반및보관안전관리마련등을심사하여승인여부를결정한다. 신청인 LMO 수입승인신청서수입계약서 or 주문서사본운반계약서 or 자가운반계약서취급안전관리방안등 LMO 명칭, 특성및용도자료시험연구개요서 결과통보 신청자료보완심사결과 270일이내 질병관리본부접수 1차자료검토전문가심사위원회검토최종검토및심사결과보고결재 자료보완 유전자변형생물체의국가간이동등에관한통합고시 ( 이하 LMO 통합고시 ) 제 3-2 조에의거하여신청인이제출한서류 14 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

및자료제출면제해당내용이적합하지아니하거나제출된자 료에문제가있다고판단되어 검토가필요한경우에는 30 일이 내에서보완에필요한기간을정하여자료보완을요구할수있으며, 자료보완에소요된기간은처리기간에산입되지아니한다. 보완요구를받은신청인은 LMO통합고시별지제3-3호서식의자료보완기간연장요청서에보완에필요한기간을명시하여기간연장을요청할수있으며, 질병관리본부장은신청인의해당사유를고려하여보완기간을정하여통지할수있다. 신청반려 LMO 통합고시제3-2조에의거하여신청인이정해진기간내에자료를보완하지아니하거나보완내용이불충분하여검토가불가능하다고판단되는경우, 질병관리본부장은그이유를명시하여신청인에게기제출된승인신청서를반려할수있다. 변경승인 LMO 통합고시제3-3조에의거하여수입승인또는조건부수입승인을받은자가승인을얻은아래의사항을변경하고자하는경우에는변경승인신청을할수있다. 상호명, 주소및연락처등 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 15

수입수량, 운반계획및운반계약등 전문인력및설비현황등신청인은변경승인신청을위하여다음의서류를제출하여야한다. LMO통합고시별지제3-4호서식시험 연구용유전자변형생물체수입승인사항변경승인신청서 기통지된수입승인서또는조건부수입승인서 변경내용을증명하는서류질병관리본부장은변경승인신청서를접수한날부터 10일이내에변경승인, 조건부변경승인또는불승인여부를결정하여관련서식에따라신청인에게통보하여야한다. 벌칙법제40조제1항에의거하여시험 연구용유전자변형생물체를승인또는변경승인을얻지아니하고시험 연구용유전자변형생물체를수입한자는 3년이하의징역또는 5천만원이하의벌금에처한다. 법제42조제2항에의거하여유전자변형생물체의취급 관리에적합한책임자지정, 설비적정유지및관리, 비상조치방법강구등취급관리기준을준수하지아니한자는 1년이하의징역또는 2천만원이하의벌금에처한다. 16 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

5. 유전자변형생물체의명칭 특성및용도에관한서류작성시 고려사항 1) 유전자변형생물체의명칭수입대상유전자변형생물체의보통명 ( 상품유래일반명칭 ), 분류학적학명, 계통명 ( 미생물의경우 : strain명, 혈청형, 생물형, 독소형등 ) 을기술한다. 예 ] NIBSC INFLUENZA REFERENCE VIRUS ; NIBRG-14 NIBRG-14 는 A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) 바이러스와 A/PR/8/34 (H1N1) 바이러스로부터역전사유전자기법을이용하 여만들어진 reassortant 인플루엔자바이러스 H5N1 형임. 2) 유전자변형생물체의특성 가. 유전자변형에사용된현대생명공학기술유전자변형생물체를얻기위하여인위적으로유전자를재조합하거나유전자를삽입하거나소실하는데이용된현대생명공학기술을상세하게기술한다. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 17

예 ] NIBRG-14는역전사유전자기법 (reverse genetics) 으로제조되었으며그과정은다음과같음. 인체에서분리된 H5N1형 wild type A/Viet Nam/1194/2004에서의 heamagglutinin (HA) 과 neuraminidase (NA) 유전자를분리하여 RT-PCR로증폭한후높은병원성을갖는 HA segment의 polybasic stretch 아미노산부위를일부제거 (deletion) 하여 vector에클로닝하고, NA segment 유전자는변형없이 vector에클로닝하여준비함. 18 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

또한 master 백신주인 H1N1형 A/PR/8/34의 6개 backbone segments (PB1, PB2, PA, NP, M, NS) 와 4개의 expression segments 각각을 vector에클로닝하여준비함. A/Viet Nam/1194/2004로부터유래된 HA-결실및 NA 플라스미드와 A/PR/8/34의 6개 backbone 플라스미드를함께 Vero 세포주내로삽입 (transfection) 하고, Vero 세포내에서 positive-와 negative-sense RNA와바이러스단백질이발현되면바이러스복제가시작되고 (rescue) 완전한새로운재조합바이러스입자 (NIBRG-14) 가만들어짐. 출처 : NIBSC, Derivation and Characterization of NIBRG-14: An A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) Vaccine Reference Strain Generated by Reverse Genetics 나. 도입유전자에의하여부여된특성수입하고자하는유전자변형생물체에도입되거나소실된유전자의유래, 변형여부, 크기, 불안정한유전형을가질잠재성, 다른숙주로의전달성가능성과도입 ( 결실 ) 유전자에의한발현물질의기능특성에대한자료를기술한다. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 19

예 ] NIBRG-14는 인플루엔자 감염환자에서 분리되어 마우스나, 페렛 (ferret), 계태아에서많은반복계대배양으로약독화되어인체비병원 성이면서 계태아에서 증식성이 좋은 인플루엔자 A 바이러스 H1N1형 A/PR/8/34로부터 유래된 6개 backbone segment 및 4개 expression 기능 (PA. PB1, PB2, NP) segment와베트남지역인플 루엔자환자로부터분리된고병원성 H5N1형 A/Viet Nam/1194/2004 로부터유래된 basic amino acid의 stretch가결여된 HA segment 와 NA segment를포함하고있어 A/PR/8/34의특성인유정란에서 증식성이우수한특성과 H5N1형을갖는비병원성인인플루엔자재조합 바이러스임. A/Viet Nam/1194/2004의 HA 내 basic amino acid의 stretch가결여된부위는아래와같음. A/Viet Nam/1194/2004 sequence at HA cleavage site CCT CAA AGA GAG AGA AGA AGA AAA AAG AGA GGA TTA Ser Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Plasmid DNA sequence at HA cleavage site CCT CAA CGA GAG -----deleted ---- ACG CGA GGA TTA Ser Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Reference virus NIBRG-14 sequence at HA cleavage site CCT CAA CGA GAG -----deleted ---- ACG CGA GGA TTA Ser Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu ; HA cleavage site 20 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

다. 도입유전자의기능및특성 ( 해당하는경우 ) (1) 제3-1조제1항제1호의규정에해당하는유전자변형생물체인경우, 도입유전자의기능, 특성및위해발생가능성유전자의도입또는소실로인하여발현되는단백질의생리학적기능, 분자생물학적특성, 병원성및독소생성, 항생제저항성증가등인체위해발생가능성에대하여기술한다. 예 ] 종명까지명시되어있지않고인체병원성여부가밝혀지지않은 Bacillus 균속에해당하는미생물에대한 Proteomics 분석결과, 탄저균 (Bacillus anthracis) 의단백질독소 PrAg과유사한단백질 spot A 가확인됨에따라단백질 spot A의아미노산서열을분석하고이를이용하여발현유전자염기서열을분서하였음. A 단백질의정제및병독성시험을위하여단백질 A 발현유전자를 E. coli에도입하여유전자변형생물체 (Bacillus1234-A) 를개발하였음. 유전자변형생물체 Bacillus1234-A에도입된단백질 A 발현유전자염기서열은아래와같음. (2) 제 3-1 조제 1 항제 2 호의규정에해당하는유전자변형생물체 인경루, 도입유전자가생산하는독소의독력, 적용범위및 생화학적특성 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 21

독소유전자의도입또는소실로인한독력변화, 감수성범위및 생화학적특성, 척추동물에대한유독성 (LD50), 독소의환경내 생존력등인체위해성을기술한다. 예 ] 보툴리눔신경독소 (Botulinum neurotoxins, BoNT) 는사람에게매우치명적인단백성독소로독소혈청형은 antibody neutralization의특이성에따라 A~G형으로분류됨. 사람에게는 A, B, E 및 F형이보툴리누스중독증을야기시켜근육마비및신경장애를유발시키는데이러한보툴리누스중독증의치료방법으로신경마비예방을위하여보툴리눔항독소를투여함. 보툴리눔신경독소 (BoNT) 는 zinc proteases로 3가지기능적 domains, 즉 N-terminal catalytic domain(light chain, LC), internal translocation domain(heavy chain, HCT) 과 C-terminal receptor binding domain(heavy chain, HCR) 을가지는데이들 domain은보툴리누스중독증치료를위한항독소생산에이용됨. 보툴리눔항독소생산용항원제조를위하여 Clostridium botulinum 혈청형 A1 Hall strain의 LC/A fragment를코드하는 DNA를 E. coli 숙주시스템에클로링하여유전자변형생물체 (BoNT 1234 LC/A) 를개발하였음. BoNT 1234 LC/A에도입된 LC/A 발현유전자염기서열은아래와같음. 참고문헌 : Sheng Chen and Joseph T. Barbieri, Unique substrate recognition by botulinum neurotoxins serotype A and E. Journal of Biological Chemistry 2006, 281(16):10906-10911 22 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

(3) 제3-1조제1항제3호의규정에해당하는유전자변형생물체인경우, 도입유전자의발현에의하여감수성이저하되는항생제및교차내성대상항생제종류, 해당항생제의치료적요법및사용빈도유전자의도입또는소실로인하여감수성이저하되거나교차내성발현이예상되는항생제종류및 MIC 값의변화, 내성을나타내는항생제의치료적요법등에대하여기술한다. 예 ] Quinolone계항생제는세균의 DNA gyrase와 topoisomerase IV 효소활성을방해하여결국세균의 DNA replication과 transcription을저지하여세균을사멸시키는기능을가지고있은데최근임상에서분리되는그람- 음성및그람-양성세균에서 quinolone계내성이증가하고있음. Quinolone계항생제에대한내성은주로 quinolones의표적이되는 DNA gyrase와 DNA topoisomerase IV를코드하는 chromosomal genes내돌연변이로인하여유도되며, 그밖에 plasmid-mediate 및 efflux pump 기능에의하여발현됨. Plasmid-mediated quinolone 내성은 Klebsiella pneumoniae 임상분리주에서처음으로발견되었는데 plasmid pmg252는 multiresistance-encoding plasmids이고 quinolone 내성유전자인 qnr을포함하고있음. 유전자 qnr은 218개아미노산으로구성된단백질을코드하며정제된단백질 Qnr은실험실내에서 DNA gyrase활성을방해하는것으로확인됨. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 23

최근 Shigella flexneri 2b 집단식중독발생시분리된 1주에서 quinolone 내성에관여하는새로운유전자를포함하는 plasmid (pah0376) 이확인되어 pah0376을제한효소 EcoRI과 HindIII로분절시켜 vector pbcsk에클로링하고숙주 E. coli HB101에도입하여새로이 quinolone 내성유전자 qnrs를포함하는유전자변형생물체 QnrS-E (pah0376과같은 quinolone 내성수준 ) 를개발하였음. 유전자 qnrs가발현하는단백질 QnrS는단백질 Qnr과 59% 아미노산상동성을가지며, qnrs의 resistance-encoding activity는 qnr과유사하여낮은수준의 quinolone 내성을나타내고 DNA gyrase변이에의한 quinolone 내성효과에유발함. 유전자변형생물체 QnrS-E에도입된 qnrs 유전자염기서열 (GenBank Accession number AB187515) 은아래와같으며, 향후 qnrs 유전자획득기전에대한연구에활용될것임. 참고문헌 Hata Mami, et al., Cloning of a novel gene for quinolone resistance from transferable plasmid in Shigella flexneri 2b. Antimicrob. Agents Chemother. 2005, 49(2):801-803 (4) 제3-1조제1항제4호의규정에해당하는유전자변형생물체인경우, 도입유전자로인해유발되는질병, 감염대상범위및감염성자료 ( 전파경로등 ) 유전자의도입또는소실로인하여유발되는병원성및질병정보 ( 감염대상, 감염량, 전파경로등 ) 변화에대하여기술한다. 24 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

예 ] NIBRG-14는숙주인 A/PR/8/34의 6개 backbone 분절 (PB2, PB1, PA, NP, M, NS) 외에고병원성인 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스의 HA 분절중고병원성에관여하는 basic amino acid의 stretch가결여된 HA(haemagglutinin) 분절과 NA(neuraminidase) 분절이도입된 reassortant임. - HA의기능은세포표면의 sialic acid receptors에특이적으로결합하여숙주세포에부착하여침입하는것을중재함. 인간인플루엔자바이러스의 HA는 α2-6 linked sialic acid를가지는세포수용체에선택적친화력을가지며, 조류인플루엔자바이러스의 HA는 α2-3 linked sialic acid를가지는세포수용체에선택적친화력을가짐으로숙주의범위를결정하게하는요소가됨. 그러나이러한 sialic acid 세포수용체의선택적친화력으로사람과조류등종을넘은감염을완전히배제할수있는것은아님. NIBRG-14주에도입된 HA분절은고병원성을갖는 polybasic amino acid stretch 부위중 1049번째염기부터 1060번째까지 12개의염기가제거되어사람과조류에대한병원성이소실되었음. 그러나마우스나페렛에서는정상적인 H5N1형바이러스보다병원성이낮으나질병유발가능성이있는것으로평가됨. - NA의기능은감염세포표면에있는 terminal sialic acid와근접 carbohydrate residue사이의 α-ketosidic linkage를분할을촉매하여바이러스의방출 (release) 을증진시킴. NIBRG-14주에도입된 NA분절은고병원성인 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스의 NA 분절을변형없이전달됨. 참고문헌 : WHO, Production of pilot lots of inactivated influenza vaccines from reassortants derived from avian influenza viruses; interim biosafety risk assessment. 2003 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 25

라. 숙주또는근연종과의생물학적특성의차이점수입하고자하는유전자변형생물체와해당유전자변형생물체개발시사용된숙주 ( 수용생물체 ) 또는근연종간의생물학적특성의차이점을기술한다. 예 ] 유전자변형바이러스인 NIBRG-14주의수용생물체인 A/PR/8/34는인플루엔자 A 바이러스의 H1N1형 prototype으로마우스나, 페렛 (ferret), 계태아에서많은계대배양을반복실시한결과약독화되어사람에서복제능력을완전히상실한비병원성이되었고, 이러한특성으로인체백신주로이용되고있으며 A/PR/8/34의독소생성, 알레르기유발체및기타유해생리할성물질생성에대하여현대까지보고된것이없음. NIBRG-14는 A/PR/8/34로부터 backbone 유전자를받아 A/PR/8/34의특성인유정란에서증식성이우수한특성을새로이갖게되었으나 HA분절과 NA분절은도입되지않아 A/PR/8/34와다른 H5N1형인플루엔자재조합바이러스로차이를나타냄. 마. 병원성, 독소생산성, 알레르기유발성및기타유해생리활성물질생산성여부 수입하고자하는유전자변형생물체의병원성, 독소생산성, 알레르기유발성및기타유해생리활성물질생산가능성, 위해성수준에대하여기술한다. 26 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

미생물인경우, 해당위험군, 감염량, 치사독소량, 전파경로등 병원성특성정보를추가적으로제공한다. 예 ] 유전자변형생물체인 NIBRG-14의병원성을조사하기위하여실험동물을이용한병원성시험결과는아래와같음. - 닭에대한병원성시험 : intravenous virus pathogenicity index (IVPI) 수치는 0.0으로조사됨에따라비병원성임 ( 백신기준 : IVPI 1.2 또는그미만 ) - 페렛에대한병원성시험 : A/Viet Nam/1194/2004 보다약한병원성으로기준에적합함 ( 백신기준 : 호흡기조직내 virus titers는양친바이러스보다낮고, virus replication은호흡기계내로제한되어야함. 쇠약함정도의임상적증상을보임.) - Plaquing test: 기준에적합함. ( 백신기준 : 트립신이없는세포에서는 plaque를형성하지않음 ) - Egg embryo test: 기준에적합함. ( 백신기준 : 계태아들을죽이지않음이러한결과를바탕으로 NIBRG-14주는조류및사람에대한병원성이약화되었음을알수있음. 수용생물체인 A/PR/8/34는제2위험군미생물이고고병원성인 H5N1 바이러스로부터도입된 HA분절은병원성이제거되어도입되었기때문에유전자변형바이러스인 NIBRG-14주는인체건강에대한위해가능성을고려한실험실취급위해수준에따라모든취급활동은생물안전 2+ 등급시설 (BL2+) 에서실시하여야함. NIBRG-14주의독소, 알레르겐및유해생리활성물질생산등에대하여아직보고된것이없음. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 27

바. 유전자변형생물체내도입유전자의위치및복제수 수입하고자하는유전자변형생물체내도입되거나소실된유전자 의위치및복제수 (copy number) 를기술한다. 예 ] NIBRG-14에 도입된 HA genome segment의 염기서열은 삽입 plasmid DNA와동일한데즉, HA cleavage site 일부 amino acids를 제외한나머지서열이 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스의 HA와모두일 치하였음. NIBRG-14에도입된 NA genome segment의염기서열은삽 입 plasmid DNA와 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스의 NA 서열과일 치하였음. NIBRG-14에도입된 HA genome segment 중제거된부위는아래와같음. A/Viet Nam/1194/2004 sequence at HA cleavage site CCT CAA AGA GAG AGA AGA AGA AAA AAG AGA GGA TTA Ser Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Plasmid DNA sequence at HA cleavage site CCT CAA CGA GAG -----deleted ---- ACG CGA GGA TTA Ser Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Reference virus NIBRG-14 sequence at HA cleavage site CCT CAA CGA GAG -----deleted ---- ACG CGA GGA TTA Ser Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu ; HA cleavage site 28 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

사. 도입유전자에의해생성되는단백질의발현정도및측정방법수입하고자하는유전자변형생물체내로도입된유전자에의하여생성되는단백질측정방법을기술하거나표적유전자소실에따른확인방법을기술한다. 예 ] NIBRG-14는다음과같은시험을통하여 HA 및 NA 항원단백질의발현정도를측정할수있음. - SRID(single radial immuno diffusion assay) : HA 함량측정용시험 - Neuraminidase Activity assay : NA 활성측정용시험 - SDS-PAGE : HA 항원및패턴분석 - Western blot : HA 항원및패턴분석 아. 유전자변형에사용된벡터의존재여부및제거방법수입하고자하는유전자변형생물체의재조합시사용된벡터가해당유전자변형생물체내에존재하는지여부와존재하지않은경우벡터제거방법을기술한다. 예 ] 유전자재조합바이러스 NIBRG-14를개발하기위하여사용된역전사유전자기법 (reverse genetics system) 과정중수용생물체및공여생물체로부터유래된유전물질은벡터를이용하여클로닝되어 vero 세포내로 transfection되고 vero 세포내에서각유전물질들이 rescue되어 NIBRG- 14를생성하는데이용된벡터들은 NIBRG-14주내로삽입되지않음. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 29

자. 검출및확인방법수입하고자하는유전자변형생물체를검출하거나확인할수있는방법 ( 형태학적, 생물학적, 생화학적방법등 ) 을기술한다. 숙주와구별하여확인할수있는방법을포함할수있다. 예 ] NIBRG-14의검출및확인방법은다음과같음. 항원성확인 : 표준항혈청 [NIBSC antiserum reagent for single radial diffusion assay of A/Viet Nam/1194/04(H5N1) influenza virus haemagglutinin] 을이용하여항원성을 SRID나 haemagglutination inhibition assay로확인 HA cleavage site 중제거된염기서열확인 : NIBRG-14의 RNA를이용한 RT-PCR로 HA segment를증폭한후 HA cleavage site를염기서열분석하여제거된 polybasic stretch amino acid 염기서열확인 유정란계대증식성및병원성확인시험유정란에서는높은증식율과모든계태아생존확인 차. 숙주의명칭, 분류학적특성및병원성, 독소생산성, 알레르기유발성등생물학적특성 수입하고자하는유전자변형생물체개발에사용된숙주 ( 수용생물 체 ) 의 명칭및분류학적특성, 병원성및독소생산성, 알레르기 유발성등생물학적특성의차이점을기술한다. 30 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

예 ] 수용생물체인인플루엔자바이러스 A/PR/8/34는 Puerto Rico 지역에서사람으로부터분리된인플루엔자 A 바이러스의 H1N1형 prototype으로마우스나, 페렛 (ferret), 계태아에서많은반복적인계대배양을통하여결과적으로병원성이약독화되어사람에서 A/PR/8/34 바이러스복제능력을완전히상실한비병원성백신주참조바이러스로최근유행하는 PI 대비를위한여러백신주개발에이용되고있음. A/PR/8/34의독소생성, 알레르기유발체및기타유해생리할성물질생성, 인체위해에대하여현대까지보고된것이없음. 카. 공여체의명칭, 분류학적특성및병원성, 독소생산성, 알레르기유발성등생물학적특성수입하고자하는유전자변형생물체개발에사용된공여체의명칭및분류학적특성, 병원성및독소생산성, 알레르기유발성등생물학적특성의차이점을기술한다. 예 ] 공여생물체인 A/Viet Nam/1194/2004는베트남지역의인플루엔자인체감염사례로부터분리된고병원성 H5N1형조류인플루엔자바이러스 (high pathogenic avian influenza, HPAI) 로 H5N1 인플루엔자바이러스의계통분류학적분류시 Clade 1에속하며, 그지역의조류종으로부터분리 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 31

한것과항원적특성이유사하다. A/Viet Nam/1194/2004 바이러스의헤마글루티닌 (heamaglutinin, HA) 은조류종에높은병원성을갖는 polybasic stretch 아미노산을포함하고있음. A/Viet Nam 1194/2004 는조류및인체에고병원성인바이러스이나독소생성, 알레르기유발체및기타유해생리할성물질생성에대하여현대까지보고된것이없음. PI 대비를위한인플루엔자 H5N1 백신후보바이러스주의개발이활발히진행되고있으며그중 A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) 은세계여러나라의백신제조회사에의해서백신개발시 H5N1 공여생물체로이용되고있음 3) 유전자변형생물체의용도 가. 주요용도 수입하고자하는유전자변형생물체의용도및타당성, 이로인해 우려되는사항을기술한다. 예 ] NIBRG-14는유정란에서증식성이우수한특성과함께 H5N1형인 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스로부터도입된고병원성 amino acid 부위가제거된 HA분절및 NA분절을도입받아 H5N1형이면서약독화된인플루엔자재조합바이러스로고병원성인플루엔자바이러스대유행에대비한역전사유 32 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

전자기법을이용한인플루엔자바이러스백신후보주개발및실험시참조바이러스로실험에이용됨. NIBRG-14 취급시흡입으로인한인플루엔자감염가능성을배제할수없음으로생물안전교육을이수한실험종사자에한하여취급및보관토록하며, 밀폐등급에적합한보관시설에서보관함. 또한 NIBRG-14의특성을유지하고유출을차단할수있는수송포장및표시를하여운송함. 나. 사용이승인된국가및승인용도 수입하고자하는유전자변형생물체의사용이승인된현황 ( 국가 포함 ) 및승인용도를기술한다. 예 ] 유전자재조합참조백신바이러스인 NIBRG-14주는적절한밀폐연구시설이확보되어있고각국가로부터필수적인승인및자격이있는경우에한하여분양되고있으며, 세계보건기구는인플루엔자백신개발등보건의료를위하여 NIBRG-14주를미국, 일본, 영국, 네덜란드, 대한민국, 캐나다등여러나라에분양하고있으며관련자료는세계보건기구 database (https://www.who.int/fluvirus_tracker/sample/display/sample_id/ 43) 에서확인할수있으며 NIBRG-14주를이용한주요 Pandemic influenza 백신개발현황은 IFPMA Influenza Vaccine Supply International Task Force 자료에서알수있음. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 33

6. 표시및안전취급관리 1) 유전자변형생물체표시 가. 표시사항시험 연구용등의유전자변형생물체를수입하는자는당해유전자변형생물체의용기나포장에다음각호의사항을표시하여야한다. 유전자변형생물체의명칭, 종류, 용도및특성 유전자변형생물체의안전한취급을위한주의사항 유전자변형생물체의수출자및수입자의성명 주소 ( 상세하게기재한다 ) 및전화번호 유전자변형생물체에해당하는사실 환경방출로사용되는유전자변형생물체해당여부 나. 표시방법시험 연구용등의유전자변형생물체를수입하는자는다음과같은방법으로표시하여야한다. 표시사항은명확히확인할수있는방식으로표시하여야하며다른표기나표식에가려지지않도록용기또는포장에직접인쇄하거나인쇄된라벨지등으로부착하여야한다. 유전자변형생물체를다중포장체계로포장하는경우에는각각 34 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

의용기나포장에모두표시하여야한다. 표시는한글을사용하도록하며, 필요한경우영어또는특성 표식을혼용하거나병기하여표시할수있다. 2) 유전자변형생물체취급관리 가. 취급관리시험 연구용등의유전자변형생물체를수입하는자는유전자변형생물체를취급또는관리함에있어다음의각호의사항을준수하여야한다. 이동시에는유전자변형생물체가외부로유출되지않도록밀폐하고용기또는포장이파손되지않도록운송하여야한다. 병원성미생물을이용하여감염가능성이있는유전자변형생물체의밀폐운송에필요한용기및포장규격은세계보건기구가정한 감염성물질의안전수송지침 에따른다. 유전자변형생물체의특성이유지될수있는보관시설및장비를확보하여적합한방법으로보관하여야하며취급ㆍ관리전담자또는책임자를지정하여안전하게관리하여야한다. 유전자변형생물체의운반및관리대장을작성하고보관하며, 유전자변형생물체의취급 관리를위한설비를적정하게유지 관리하여야한다. 이동및취급시주의사항을준수하여야한다. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 35

폐기하는경우, 멸균을원칙으로하되생존능력을완전히제거할수있는소각등으로대신할수있으며, 당해시험 연구용등의유전자변형생물체가포함된폐기물은멸균, 소각, 화학적방법으로불활성화시키는등위해가발생하지않도록처리하여야한다. 비의도적으로환경에방출되는경우에인체및환경에대한위해를방지할수있는비상조치를마련하여야한다. 나. 관리 운영기록의보존시험 연구용유전자변형생물체를수입하여운반및보관하는경우에는아래의관리대장에관리및운영에관한기록을작성하여 5년간보존하여야한다 ( 전자기록매체방법가능 ). 별지제27호서식유전자변형생물체수입관리대장 별지제28호서식유전자변형생물체운반관리대장 별지제29호서식유전자변형생물체보관관리대장 36 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 I 1. LMO 통합고시제3장 / 38 2. 별표 3-2 승인제외대상약제내성유전자 / 50 3. 별표 3-3 LMO 명칭 특성및용도정보목록 / 55 4. 별지제10호서식 LMO 수입승인신청서 / 58 5. 별지제3-1호서식 시험 연구개요서 / 59 6. 별지제3-3호서식 자료보완기간연장요청서 / 60 7. 별지제3-4호서식 승인사항변경승인신청서 / 61 8. 별지제27호서식 LMO 수입관리대장 / 62 9. 별지제28호서식 LMO 운반관리대장 / 63 10. 별지제29호서식 LMO 보관관리대장 / 64

부록 1. LMO 통합고시제 3 장 보건복지부고시제 2007-105 호 제 3 장시험ㆍ연구용등의유전자변형생물체의수입및 표시 취급관리등 제 1 절수입승인 제3-1조 ( 수입승인대상등 ) 1영제12조제1항및제1-4조제6호가목에의하여시험 연구용으로사용하거나박람회또는전시회에출품하기위하여다음각호의어느하나에해당하는유전자변형생물체를수입하고자하는자는질병관리본부장의승인을받아야한다. 1. 종명까지명시되어있지아니하고인체병원성여부가밝혀지지아니한미생물을이용하여얻어진유전자변형생물체 2. 척추동물에대하여몸무게 1kg당 50% 치사독소량 ( 특정한시간내에실험동물군중 50% 를죽일수있는단백성독소의접종량 ) 이 100ng 미만인단백성독소를생산할능력을가진유전자변형생물체. 해당단백성독소는별표 3-1과같다. 3. 의도적으로도입된약제내성유전자를가진유전자변형생물체. 38 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

다만, 별표 3-2에해당하는약제내성유전자를가진유전자변형생물체를제외한다. 4. 국민보건상국가관리가필요한병원성미생물을이용하여얻어진유전자변형생물체. 해당병원성미생물은 전염병예방법시행규칙 별표 1과같다. 2제1항에의하여수입승인신청을하고자하는자는규칙별지제 10호서식의시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체수입승인신청서에다음각호의서류 20부및전자문서 1부를첨부하여질병관리본부장에게제출하여야한다. 1. 수입계약서 ( 수입을대행하는경우에는수입대행계약서를포함한다 ) 또는주문서사본 2. 운반경로 운반수단및운반업자가기록된운반계약서또는자가운반계획서 ( 운반형태, 포장방법등에대한정보를포함하여야한다 ) 3. 취급 보관에관한안전관리방안과안전관리에필요한전문인력 설비현황에관한서류. 다음각목의정보를포함하여야한다. 가. 안전한취급 보관을위한주의사항나. 위해방지를위한비상조치사항다. 취급 보관에관여하는인력정보 ( 성명, 소속, 직위및안전관리방안숙지여부등 ) 라. 취급 보관설비및시설현황 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 39

4. 유전자변형생물체의명칭 특성및용도에관한서류. 별표 3-3의규정에의한정보를포함하여야한다. 5. 별지제3-1호서식의시험 연구개요서 ( 국가연구개발사업의연구개발계획서로대체할수있다 ) 또는별지제3-2호서식에의한박람회 전시회개요서 3별표 3-3에의한평가자료는다음각호의어느하나에해당하여야하며, 기재된순서에따라자료별색인번호및쪽을표시하여야하고, 요약보고서가외국어일때에는원문과번역문을각각첨부하여야한다. 1. 전문학술지에게재된자료 2. 우수실험실관리기준 (GLP) 에의하여시험한자료 3. 대학또는연구기관등국내외전문기관에서시험한것으로해당기관의장이발급하고그내용 ( 이경우연구기관의시험시설개요, 주요설비, 연구인력의구성, 시험자의연구경력등이기재되어야함 ) 을검토하여타당하다고인정할수있는자료 4. 외국에서유전자변형생물체의위해성심사당시제출된자료. 이경우그외국정부가유전자변형생물체의사용을승인하였음을확인할수있는자료 4질병관리본부장은제2항에불구하고자료의작성이이론적 기술적으로불가능하거나작성가능하더라도작성하는것이불필요하다고인정되는상당한이유가있는경우에는해당자료의제출 40 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

을면제할수있다. 5 수입승인을신청하고자하는자는질병관리본부장에게자료제 출범위등에대한사전상담을요청할수있다. 제3-2조 ( 수입승인 ) 1질병관리본부장은제3-1조제2항에의한수입승인신청서를접수받은때에는제3-6조에의한전문가심사위원회의의견을들어시험 연구용등의유전자변형생물체의위해성등을심사하고, 승인여부를결정한다. 2질병관리본부장은제출된자료의심사를위하여필요한경우신청인에게설명을요구할수있다. 3질병관리본부장은다음각호의어느하나에해당하는경우 30 일이내에서보완에필요한기간을정하여신청인에게자료보완을요구할수있으며, 자료보완에소요된기간은처리기간에산입되지아니한다. 1. 제출된자료가제3-1조제3항및제4항, 별표 3-3에적합하지아니한경우 2. 별표 3-3에의한평가자료에문제가있다고판단되어세부적인자료의검토가필요한경우 4질병관리본부장은신청인이제3항에의한기간내에자료를보완하지아니한때에는다시보완을요구할수있다. 이경우보완의기간은 10일로한다. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 41

5질병관리본부장은제3항및제4항의규정에불구하고보완요구를받은신청인이별지제3-3호서식의자료보완기간연장요청서에보완에필요한기간을명시하여기간연장을요청하는경우그사유를고려하여보완기간을정할수있다. 6질병관리본부장은신청인이제4항및제5항에의한기간내에자료를보완하지아니하거나보완내용이불충분하여검토가불가능한경우에는그이유를명시하여신청인에게승인신청서를반려할수있다. 7질병관리본부장은제3-1조제2항의규정에의한승인신청서를접수한날부터 270일이내에승인여부를결정하여규칙별지제 12호서식의시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체수입승인서, 시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체조건부수입승인서, 또는시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체수입불승인서를신청인에게통지하여야한다. 다만, 수입승인을받은유전자변형생물체와동일한유전자변형생물체를계속수입하는경우에는 10일이내에승인여부를결정하여신청자에게통보하여야한다. 8질병관리본부장은제7항에의한승인현황을매반기별로보건복지부장관에게보고하여야한다. 제 3-3 조 ( 수입승인사항의변경승인 ) 1 제 3-2 조제 7 항에의한수 42 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

입승인또는조건부수입승인을받은자가승인을얻은사항을변경하고자하는경우에는별지제3-4호서식의시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체수입승인사항변경승인신청서에다음각호의서류를첨부하여질병관리본부장에게제출하여야한다. 1. 수입승인서또는조건부수입승인서 2. 변경내용을증명하는서류 2질병관리본부장은제1항에의한신청서를접수한날부터 10일이내에변경승인여부를결정하고, 별지제3-5호서식의시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체수입승인사항변경승인서, 별지제3-5호서식의시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체수입승인사항조건부변경승인서또는시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체수입승인사항변경불승인서를신청인에게교부하여야한다. 3질병관리본부장은제2항에의한변경승인을결정하기위하여필요한경우에는신청인에게기간을정하여필요한자료의제출을요청할수있다. 제 3-4 조 ( 승인의취소 )1 질병관리본부장은다음각호의어느하 나에해당하는경우에는수입승인을취소할수있다. 다만, 제 1 호 또는제 2 호에해당하는경우에는승인을취소하여야한다. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 43

1. 수입승인을얻은시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체가국민의건강과생물다양성의보전및지속적인이용에위해를미치거나미칠우려가있다는사실이밝혀진경우 2. 속임수그밖에부정한방법으로승인을얻은경우 3. 수입승인을얻은시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체를승인을얻은용도와다르게사용하는경우 4. 법또는법에의한명령이나처분을위반하는경우 5. 안전관리에필요한전문인력및설비등이승인을얻을당시보다현저하게미달한경우 6. 시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체의수입승인을증명하는서류를다른사람에게양도하거나대여하는경우 2질병관리본부장은제1항에따라승인을취소한경우에는지체없이보건복지부장관에게보고하여야한다. 제3-5조 ( 재심사 ) 1제3-4조제1항제1호에의한처분에불복이있는자는처분이있은날부터 30일이내에규칙별지제18호서식의재심사요청서에재심사요청사유를증빙하는서류를첨부하여질병관리본부장에게제출하여야한다. 2질병관리본부장은제1항에의한재심사를요청받은경우에는산업자원부장관과협의및법제31조에의한바이오안전성위원회의심의를거쳐재심사에대한결정을하고, 제1항에의한재심사요 44 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

청서를접수한날부터 90일이내에재심사결과를재심사를요청한자에게통보하여야한다. 이경우수입승인, 조건부수입승인을하는때에는수입승인서또는조건부수입승인서를교부하여야한다. 제 3-6 조 ( 전문가심사위원회의 구성 운영 ) 1 질병관리본부장은 시험 연구용등의유전자변형생물체의수입승인여부를결정함에있어다음각호에대한자문및전문성확보를위하여전문가심사위원회를구성 운영할수있다. 1. 국내생물다양성의가치에미칠사회 경제적영향 2. 제3-1조제2항에의해제출된자료심사 3. 승인대상및승인제외대상목록 4. 그밖에승인에필요한사항 2제3-7조에의한시험 연구용등의유전자변형생물체의수입신고업무를수행하는기관의장은시험 연구용등의유전자변형생물체의수입신고와관련한절차등의자문을위하여전문가심사위원회를구성 운영할수있다. 3전문가심사위원회의구성및운영에관한세부사항은질병관리본부장또는제3-7조제2항에의한시험 연구용등의유전자변형생물체의수입신고업무를수행하는기관의장이정한다. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 45

제 3 절표시및취급관리등 제3-10조 ( 표시 ) 1시험 연구용등의유전자변형생물체를수입하는자는당해유전자변형생물체의용기나포장에다음각호의사항을표시하여야한다. 1. 유전자변형생물체의명칭, 종류, 용도및특성 2. 유전자변형생물체의안전한취급을위한주의사항 3. 유전자변형생물체의수출자및수입자의성명 주소 ( 상세하게기재한다 ) 및전화번호 4. 유전자변형생물체에해당하는사실 5. 환경방출로사용되는유전자변형생물체해당여부 2제1항에따라시험 연구용등의유전자변형생물체를수입하는자는다음과같은방법으로표시하여야한다. 1. 표시사항은명확히확인할수있는방식으로표시하여야하며다른표기나표식에가려지지않도록용기또는포장에직접인쇄하거나인쇄된라벨지등으로부착하여야한다. 2. 유전자변형생물체를다중포장체계로포장하는경우에는각각의용기나포장에모두표시하여야한다. 3. 표시는한글을사용하도록하며, 필요한경우영어또는특성표식을혼용하거나병기하여표시할수있다. 46 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

제3-11조 ( 취급관리 ) 시험 연구용등의유전자변형생물체를수입하는자는유전자변형생물체를취급또는관리함에있어다음의각호의사항을준수하여야한다. 1. 이동시에는유전자변형생물체가외부로유출되지않도록밀폐하고용기또는포장이파손되지않도록운송하여야한다. 병원성미생물을이용하여감염가능성이있는유전자변형생물체의밀폐운송에필요한용기및포장규격은세계보건기구가정한 감염성물질의안전수송지침 에따른다. 2. 유전자변형생물체의특성이유지될수있는보관시설및장비를확보하여적합한방법으로보관하여야하며취급ㆍ관리전담자또는책임자를지정하여안전하게관리하여야한다. 3. 유전자변형생물체의운반및관리대장을작성하고보관하며, 유전자변형생물체의취급 관리를위한설비를적정하게유지 관리하여야한다. 4. 이동및취급시주의사항을준수하여야한다. 5. 폐기하는경우에유전자변형생물체를불활성화또는멸균처리하여야한다. 6. 비의도적으로환경에방출되는경우에인체및환경에대한위해를방지할수있는비상조치를마련하여야한다. 제 3-12 조 ( 폐기처분등 ) 1 질병관리본부장또는과학기술부장관 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 47

과제3-7조제2항의유전자변형생물체의수입신고업무를수행하는기관의장 ( 이하 수입신고업무수행기관의장 이라고한다 ) 은법제19조및영제20조에따라질병관리본부장의승인또는변경승인을받지아니하거나신고하지아니한시험 연구용등의유전자변형생물체의소유자에대하여 30일이내의기간을정하여유전자변형생물체의폐기 반송등을명할수있다. 2질병관리본부장또는수입신고업무수행기관의장은제1항에따라폐기 반송등을명하는경우폐기장소를지정할수있다. 3질병관리본부장또는수입신고업무수행기관의장은시험 연구용등의유전자변형생물체의소유자가제1항에의한폐기 반송등의명령에따르지아니한경우에는당해시험 연구용등의유전자변형생물체의소유자의부담으로소속공무원으로하여금이를직접폐기 반송등을하게할수있다. 4제1항에의한폐기는멸균을원칙으로하되생존능력을완전히제거할수있는소각등으로대신할수있으며, 당해시험 연구용등의유전자변형생물체가포함된폐기물은멸균, 소각, 화학적방법으로불활성화시키는등위해가발생하지않도록처리하여야한다. 제 3-13 조 ( 보고및검사 ) 1 질병관리본부장또는수입신고업무수 행기관의장은법제 36 조에따라유전자변형생물체의안전관리를 48 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

위하여시험 연구용등의유전자변형생물체의수입승인을받거나또는신고를한자로하여금보고를하게하거나자료또는시료의제출을요구할수있다. 2질병관리본부장또는수입신고업무수행기관의장은시험 연구용등의유전자변형생물체의수입승인을얻거나신고를한자또는수입승인을받지아니하거나신고를하지아니한시험 연구용등의유전자변형생물체로판단되는물품을수입한자에대하여소속공무원으로하여금당해사무소 연구시설 보관장소등에출입하여관계서류나시설 장비및보관상태등을검사하게할수있다. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 49

부록 2. 승인제외대상약제내성유전자 [ 별표 3-2] 승인제외대상약제내성유전자 ( 제 3-1 조제 1 항제 3 호관련 ) 1. Ampicillin, chloramphenicol, hygromycin, kanamycin, streptomycin 또는 tetracycline 내성유전자 ( 부표에의한인정숙주-벡터계를이용한유전자변형미생물의수입또는개발 실험인경우에한한다 ) 인정숙주-벡터계 라함은생물학적으로안전성이높다고인정되는숙주와벡터의조합을말한다 2. Kanamycin, neomycin 내성유전자 (npt II) 또는 hygromycin 내성유전자 (hph)( 해당약제내성유전자를선발표지유전자로포함한유전자변형식물의수입또는개발 실험인경우에한한다 ) 50 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

[ 별표 3-2 부표 ] 인정숙주 - 벡터계 1. 자연조건에서의생존력이낮은숙주와숙주의존성이높은벡터를조합시켜이용함으로써환경으로의전파및확산가능성이낮거나유전학적, 생리학적및생태학적특성에기초하여사람에게안전성이높다고인정되는숙주-벡터계 가. Escherichia coli K12 또는 Escherichia coli B 숙주-벡터계숙주는항상 Escherichia coli K12, Escherichia coli B 또는이들의유도체로서접합능력이있는플라스미드를포함하지않고형질도입능력이있는박테리아파아지를갖고있지않으며벡터는비접합성플라스미드또는박테리오파아지및유도체인숙주-벡터계 나. Bacillus subtilis 또는 Bacillus licheniformis 숙주-벡터계고초균인 Bacillus subtilis 또는 B. licheniformis의유도체로서영양요구성돌연변이또는포자형성이 10-7 미만으로일어나는균주를숙주로하고접합에의한전달성을갖지않는플라스미드또는박테리오파지를벡터로하는숙주-벡터계 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 51

다. Saccaromyces cerevisiae 숙주-벡터계효모인 Saccharomyces cerevisiae를숙주로하며 S. cerevisiae의플라스미드, 미토콘드리아또는이들의유도체를벡터로사용하는숙주-벡터계 라. Pseudomonas putida 숙주 - 벡터계 Pseudonomas putida strain KT2440 과플라스미드 pkt262, pkt263, pkt264 를사용하는숙주 - 벡터계 마. Streptomyces 숙주-벡터계 Streptomyces coelicolor, S. lividans, S. parvulus, S. griseus strain과인정된벡터인 Streptomyces 플라스미드 SCP2, SLP1.2, pij101, actinophage phi C31과이들의유도체를사용하는숙주-벡터계 바. Neurospora crassa 숙주 - 벡터계 공기중산포를방지하기위하여변형된 Neurospora crassa 를숙주로하고이들의유도체를벡터로사용하는숙주 - 벡터계 사. Agrobacterium tumefaciens 숙주 - 벡터계 Agrobacterium tumefaciens 를숙주로사용하여 non- 52 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

tumorigenic disarmed Ti 플라스미드를벡터로사용하는숙 주 - 벡터계 2. 유전적소실등으로인하여특수한배양조건이외에는생존율이매우낮은숙주와숙주의존성이특히높은벡터를조합한경우로서환경으로의전파및확산이방지된다는것이확인된숙주-벡터계 가. Escherichia coli K12 숙주 - 벡터계 다른생물체로의유전자재조합분자의전달성또는숙주의생존 율이 10-8 미만으로일어나는숙주 - 벡터계 숙 주 벡 터 Escherichia coli K12 strain chi 1776 DP50supF Escherichia coli K12 DP50supF DP50 또는 DP50supF DP50 또는 DP50supF DP50 또는 DP50supF DP50supF DP50 또는 DP50supF DP50 또는 DP50supF psc101, pmb9, pbr313, pdh24, pbr322, pbr325, pbr327, pgl101, phbl Escherichia coli/ S. cerevisiae hybrid plasmid: YIp1, YEp2, YEp4, YIp5, YEp6, YRp7, YEp20, YEp21, YEp24, YIp25, YIp26, YIp27, YIp28, YIp29, YIp30, YIp31, YIp32, YIp33 λgt WES λb λgt ZJ vir λb λgt ALO λb Charon 3A Charon 4A Charon 16A Charon 21A Charon 23A Charon 24A 비고 : Escherichia coli K12 strain chi 2447, chi 2281 은 DP50 또는 DP50supF 균주와의사용이허용된람다벡터와함께사용이가능하다. II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 53

나. Saccharomyces cerevisiae 숙주 - 벡터계 숙 주 벡 터 ste-vc9이불활성화된변이주 ( 불임종 ) Saccharomyces cerevisiae SHY1, SHY2, SHY3, SHY4 YIp1, YEp2, YEp4, YIp5, YEp6, YRp7, YEp20, YEp21, YEp24, YIp25, YIp26, YIp27, YIp28, YIp29, YIp30, YIp31, YIp32, YIp33 다. Bacillus subtilis 숙주 - 벡터계 숙 주 벡 터 포자를생성할수없는변이주 Bacillus subtilis ASB 298 pub110, pc194, ps194, psa2100, pe194, pt127, pub112, pc221, pc223, pab124 54 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 3. LMO 명칭 특성및용도정보목록 [ 별표 3-3] 유전자변형생물체의명칭 특성및용도에관한서류에 포함하여야하는정보 ( 제 3-1 조제 2 항제 4 호관련 ) 1. 유전자변형생물체의명칭 2. 유전자변형생물체의특성가. 유전자변형에사용된현대생명공학기술나. 도입유전자에의하여부여된특성다. 도입유전자의기능및특성 ( 해당하는경우 ) (1) 제3-1조제1항제1호의규정에해당하는유전자변형생물체인경우, 도입유전자의기능, 특성및위해발생가능성 (2) 제3-1조제1항제2호의규정에해당하는유전자변형생물체인경우, 도입유전자가생산하는독소의독력, 적용범위및생화학적특성 (3) 제3-1조제1항제3호의규정에해당하는유전자변형생물체인경우, 도입유전자의발현에의하여감수성이저하되는항생제및교차내성대상항생제종류, 해당항생제의치료적요법및사용빈도 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 55

(4) 제3-1조제1항제4호의규정에해당하는유전자변형생물체인경우, 도입유전자로인해유발되는질병, 감염대상범위및감염성자료 ( 전파경로등 ) 라. 숙주또는근연종과의생물학적특성의차이점마. 병원성, 독소생산성, 알레르기유발성및기타유해생리활성물질생산성여부바. 유전자변형생물체내도입유전자의위치및복제수사. 도입유전자에의해생성되는단백질의발현정도및측정방법아. 유전자변형에사용된벡터의존재여부및제거방법자. 검출및확인방법차. 숙주의명칭, 분류학적특성및병원성, 독소생산성, 알레르기유발성등생물학적특성카. 공여체의명칭, 분류학적특성및병원성, 독소생산성, 알레르기유발성등생물학적특성 3. 유전자변형생물체의용도 가. 주요용도 나. 사용이승인된국가및승인용도 상기서류작성시주의사항 유전자변형생물체의명칭 특성및용도에관한서류는다음각 56 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

호의어느하나에해당하여야하며, 기재된순서에따라자료별색인번호및쪽을표시하여야하고, 요약보고서가외국어일때에는원문과번역문을각각첨부하여야함. (1) 전문학술지에게재된자료 (2) 우수실험실관리기준 (GLP) 에의하여시험한자료 (3) 대학또는연구기관등국내외전문기관에서시험한것으로해당기관의장이발급하고그내용 ( 이경우연구기관의시험시설개요, 주요설비, 연구인력의구성, 시험자의연구경력등이기재되어야함 ) 을검토하여타당하다고인정할수있는자료 (4) 외국에서유전자변형생물체의위해성심사당시제출된자료. 이경우그외국정부가유전자변형생물체의사용을승인하였음을확인할수있는자료 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 57

신청인 부록 4. LMO 수입승인신청서 시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체수입승인신청서 시험 연구용 박람회 전시회용 1상호 3사업장주소 5대표자성명 유전자변형생물체의특성 수입승인신청내용 13 사용기간 14 연구책임자 ( 사용기관책임자 ) 15 연구시설 7 명 칭 8부여된특성 9수입목적 10수입국 11수입수량 12수입금액 직위주소전화번호시설등록번호주소생물안전관리책임자 2 무역업고유번호 4 사업자등록번호 ( 법인등록번호 ) 6 전화번호 [ 별지제 10 호서식 ] 제 처리기간 270일 호 보통명학명계통명 성명 이메일주소 안전관리등급 BL- 소속성명 종명까지명시되어있지아니하고인체병원성여부가밝혀지지아니한미생물을이용하여얻어진유전자변형생물체 심사요청사항 ( 해당사항모두 표시 ) 척추동물에대하여보건복지부장관이고시하는단백성독소를생산할능력을가진유전자변형생물체 의도적으로도입된약제내성유전자를가진유전자변형생물체 ( 보건복지부장관이고시하는약제내성유전자를가진유전자변형생물체는제외됩니다 ) 국민보건상국가관리가필요하다고보건복지부장관이고시하는병원성미생물을이용하여얻어진유전자변형생물체 유전자변형생물체의국가간이동등에관한법률 제 9 조제 1 항, 동법시행령제 12 조제 2 항및동법시행규칙제 7 조제 1 항의규정에따라위와같이시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 의유전자변형생물체의수입승인을신청합니다. 년월일 수수료 2만원 질병관리본부장귀하 신청인 ( 서명 ) 58 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 5. 시험 연구개요서 [ 별지제3-1호서식 ] 시험 연구개요서 수입승인용 수입신고용 개발 실험승인용 1과제명 2 연구기간 년월일 ~ 년월일 3 연구 책임자 성명 소속 전화번호 직위 4 연구비 정부지원 : ( 부 처 청 ) 기관부담 기타 : 5 색인단어 (5 개내외 ) 국문 영문 연구의필요성 연구목표 연구내용및범위 연구방법 기대성과및활용방안 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 59

부록 6. 자료보완기간연장요청서 자료보완기간연장요청서 [ 별지제 3-3 호서식 ] 신 1 상 호 2 사업자등록번호 ( 법인등록번호 ) 청 인 3 대표자성명 5 사업장주소 4 주민등록번호 6 전화번호 7 자료보완사항 8 기간연장요청사유 9 자료제출기한 기간연장전 기간연장후 유전자변형생물체의국가간이동등에관한통합고시 제 3-2 조제 5 항, 제 4-3 조제 2 항제 2 호및제 9-11 조제 3 항의규정에따라위와같이자료보완 제출기한의연장을요청합니다. 년월일 신청인 ( 서명 ) 질병관리본부장 귀하 60 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 7. 변경승인신청서 시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체수입승인사항변경승인신청서 [ 별지제 3-4 호서식 ] 처리기간 시험 연구용 박람회 전시회용 10 일 신 1 상 호 2 수입승인번호 제 호 청 인 3 사업장주소 5 대표자성명 4 사업자등록번호 ( 법인등록번호 ) 6 전화번호 직 위 성명 7 연구책임자 주 소 전화번호 이메일주소 변경내용 8 변경전 9 변경후 유전자변형생물체의국가간이동등에관한통합고시 제3-3조제1항에따라위와같이시험 연구용 ( 박람회 전시회용 ) 유전자변형생물체수입승인사항의변경승인을신청합니다년월일 질병관리본부장 신청인 ( 서명 ) 귀하 첨부서류 1. 수입승인서또는조건부수입승인서 2. 변경내용을증명하는서류 II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 61

부록 8. LMO 수입관리대장 [ 별지제 27 호서식 ] 유전자변형생물체 개발 생산 수입 수출 판매 관리대장 연월일명칭 개 발 수량 수 매도자정보 입 수입량 자가사용량 생산 수출 판매 매입자정보 생산량수출량판매량 재고량 취급자 ( 서명또는인 ) 부서장또는책임자 ( 서명또는인 ) 62 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 9. LMO 운반관리대장 [ 별지제 28 호서식 ] 유전자변형생물체운반관리대장 연월일명칭운반량출발지점 도착지점 차량번호 상호 ( 성명 ) 위탁인 전화번호 운반자 ( 서명또는인 ) 사업자등록부서장번호또는또는책임자법인등록번호 ( 서명또는인 ) II. 시험 연구용 LMO 수입승인심사 63

부록 10. LMO 보관관리대장 [ 별지제 29 호서식 ] 연월일명칭위탁인정보 유전자변형생물체보관관리대장 입고출고재고량 입고량위탁인정보출고량합계보관량저장량비고 취급자 ( 서명또는인 ) 부서장또는책임자 ( 서명또는인 ) 64 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 1. 법률소개 / 66 2. 용어의정의 / 67 3. 개발및실험승인대상 / 68 4. 제출서류및승인심사절차 / 71 5. 개발 실험의위해성평가자료작성시고려사항 / 75 6. 생물학적위해성평가 / 127 부록Ⅱ / 131

III. 유전자변형생물체의개발및실험승인심사 1. 법률소개 개발및실험승인 유전자변형생물체의국가간이동등에관한법률 ( 이하 법 ) 법제22조제3항에의거하여연구시설의설치67운영에대한허가를받거나신고를한자가위해가능성이큰유전자변형생물체를개발하거나실험하는경우에는관계중앙행정기관장의장의승인을얻어야한다. 동법시행령제 23 조제 6 항제 1 호내지제 4 호에해당하거나제 6 호에서결정된유전자변형생물체개발및실험은질병관리본부 장의승인을얻어야한다. 승인또는불승인통지동법시행령제23조제7항에의거하여질병관리본부장은승인신청서를접수한날부터 60일이내에승인또는불승인을결정하여관련서식에따라신청인에게통지한다. 66 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

2. 용어의정의 유전자변형생물체유전자변형생물체 (Living Modified Organisms, LMO) 는다음의현대생명공학기술을이용하여얻어진새롭게조합된유전물질을포함하고있는생물체를말한다. 가. 인위적으로유전자를재조합하거나유전자를구성하는핵산을세포또는세포내소기관으로직접주입하는기술나. 분류학에의한과의범위를넘는세포융합으로서자연상태의생리적증식이나재조합이아니고전통적인교배나선발에서사용되지아니하는기술 연구시설 전실을포함한실험구역으로서안전관리의단위가되는구역또 는건물을말하며신고또는승인신청시의신청단위가된다. 실험구역 출입을관리하기위한전실에의하여다른구역으로부터격리된 실험실, 복도등으로구성되는구역을말한다. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 67

3. 개발및실험승인대상 질병관리본부장의승인을얻어야하는유전자변형생물체를개발 및실험대상은다음과같다. 종명까지명시되어있지아니하고인체병원성여부가밝혀지지아니한미생물을이용하는경우 척추동물에대하여몸무게 1kg당 50% 치사독소량이 100ng 미만인단백성독소를생산할능력을가진유전자를이용하는경우. 해당단백성독소유전자 보툴리눔독소 (A, B, C, D, E, F형 ) 파상풍독소 이질신경독소 디프테리아독소 기타척추동물에대하여몸무게 1kg당 50% 치사독소량이 100ng 미만의수치를갖는것으로알려진독소. 자연적으로발생하지아니하는방식으로생물체에약제내성유전자를의도적으로전달하도록하는경우 ( 의학적, 수의학적으로치료에사용되는약제에대한내성발현유전자를미생물에도입하는경우 ) 단, 아래의경우는제외한다. 68 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

인정숙주-벡터계 (LMO 통합고시발표 3-2 부표 ) 를이용하여 ampicillin, chloramphenicol, hygromycin, kanamycin, streptomycin 또는 tetracycline 내성유전자를인정숙주내로도입하는경우 Kanamycin, neomycin 내성유전자 (nptⅡ) 또는 hygromycin 내성유전자 (hph) 를선발표지유전자로이용하여유전자변형식물내로도입하는경우 국민보건상국가관리가필요한병원성미생물인 고위험병원체 를이용하는경우고위험병원체목록 세균및진균페스트균 (Yersinia pestis) 탄저균 (Bacillus anthracis) 양브루셀라균 (Brucella melitencis) 돼지브루셀라균 (Brucella suis) 비저균 (Burkholderia mellei) 장출혈성대장균 O157(Escherichia coli O157) 멜리오이도시스균 (Burkholderia pseudomallei) 보툴리눔균 (Clostridium botulinum) 큐열균 (Coxiella burnetii ) 야토균 (Francisella tularensis) 발진티푸스균 (Rickettsia prowazekii) 홍반열리케치아균 (Rickettsia rickettsii) Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 69

콕시디오이데스이미티스균 (Coccidioides immitis) 콜레라균 (Vibrio cholerae 01, 0139) 바이러스및프리온헤르페스 B 바이러스크리미안콩고출혈열바이러스이스턴이콰인뇌염바이러스에볼라바이러스핸드라바이러스라싸바이러스마버그바이러스원숭이폭스바이러스니파바이러스리프트벨리열바이러스남아메리카출혈열바이러스진드기매개뇌염바이러스두창바이러스소두창바이러스베네주엘라이콰인뇌염바이러스중증급성호흡기증후군코로나바이러스조류인플루엔자인체감염증바이러스우해면양뇌병증병원체 70 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

4. 제출서류및승인심사절차 제출서류 승인대상유전자변형생물체개발및실험을하고자하는신청인 은아래의구비서류및전자문서 1 부를제출하여야한다. 별지제25호서식유전자변형생물체개발 실험승인신청서 1부 LMO통합고시별지제3-1호서식시험 연구개요서 10부 LMO통합고시별지제9-2호서식개발 실험위해성평가자료제출표 10부 LMO통합고시별표 9-5의규정에의한개발 실험의위해성평가자료및그요약보고서 10부 신청방법 접수방법 : 방문, 우편 처리기한 : 접수한날로부터 60일이내 수수료 : 없음 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 71

심사절차질병관리본부장은위해가능성이큰유전자변형생물체를개발하거나이를이용하는실험에대한위해성, 신청내용의적합성, 연구시설안전등급결정의적정성, 안전관리수칙마련등위해성심사를통하여승인여부를결정한다. 신청인 LMO개발 실험승인신청서시험 연구개요서위해성평가자료자료제촐표위해성평가자료및요약보고서결과통보 신청자료보완심사결과 60일이내 질병관리본부접수 1차자료검토전문가심사위원회검토최종검토및심사결과보고결재 자료보완 유전자변형생물체의국가간이동등에관한통합고시 ( 이하 LMO 통합고시 ) 제9-11조에의거하여신청인이제출한자료및제출면제해당내용이적합하지아니하거나제출된자료에문제가있다고판단되어검토가필요한경우에는 30일이내에서보완에필요한기간을정하여자료보완을요구할수있으며, 자 72 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

료보완에소요된기간은처리기간에산입되지아니한다. 보완요구를받은신청인은 LMO통합고시별지제3-3호서식의자료보완기간연장요청서에보완에필요한기간을명시하여기간연장을요청할수있으며, 질병관리본부장은신청인의해당사유를고려하여보완기간을정하여통지할수있다. 신청반려 LMO통합고시제9-11조에의거하여신청인이정해진기간내에자료를보완하지아니하거나보완내용이불충분하여검토가불가능하다고판단되는경우에질병관리본부장은그이유를명시하여신청인에게기제출된승인신청서를반려할수있다. 변경승인 LMO 통합고시제3-3조에의거하여유전자변형생물체개발및실험승인을받은자는다음의사항에대한변경이발생할경우, 변경승인신청을할수있다. 상호명, 주소및연락처등 연구시설안전관리등급, 연구시설명, 연구책임자, 과제명, 연구기간등 전문인력및설비현황등안전관리에대한사항 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 73

신청인은변경승인신청을위하여다음의서류를제출하여야한다. LMO통합고시별지제9-3호서식유전자변형생물체개발 실험승인사항변경승인신청서 기통지된개발 실험승인서 변경내용을증명하는서류 벌칙법제40조제4항에의거하여승인을얻지아니하고유전자변형생물체개발및실험을실시한자는 3년이하의징역또는 5천만원이하의벌금에처한다. 법제42조제2항에의거하여유전자변형생물체의취급 관리에적합한책임자지정, 설비적정유지및관리, 비상조치방법강구등취급관리기준을준수하지아니한자는 1년이하의징역또는 2천만원이하의벌금에처한다. 유전자변형생물체를개발하거나실험하는과정에서개발, 운반, 보관되는모든유전자변형생물체는별지제 27 호, 제 28 호, 제 29 호서식에따른관리대장에기록하고및 5 년간보존하여야한다. 74 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

5. 개발및실험의위해성평가자료제출시고려사항 1) 유전자변형생물체의용도에관한자료 가. 개발 실험의배경및목적 개발하고자하는유전자변형생물체의개발배경및목적을기술한다. - 개발로인한효율성, 유용성및이로운점기술 유전자변형생물체를이용하는실험의배경, 필요성및목적을기술한다. 예 ] 역사적으로 1918년, 1958년 ~1959년과 1968년 1969년의인플루엔자바이러스대유행 (pandemic influenza) 발생으로많은인명피해와경제적손실이있었으며최근발생빈도가높은조류인플루엔자의출현은새로운인플루엔자대유행의가능성을시사하고있음. 세계보건기구 (WHO) 에따르면 2003년부터 2008년 4월 30일까지전세계조류인플루엔자인체감염증환자는모두 382명으로이중 241명이사망 ( 치사율 63%) 하였고, 2006년이후인체감염증발생환자수는다소감소하는경향을보이나, 역학적연관성이있는산발적발생증가, 사람간의전파를유발할수있는 H5N1바이러스의진화가능성등의이유로대유행발생이우려되고있음. 현재독감치료제로사용중인타미플루등치료제공급부족및막 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 75

대한생산비용의문제점과함께타미플루내성조류인플루엔자바이러스발견등으로신종인플루엔자대유행발생시제어할수있는효과적인치료및예방방법이부재한상황을고려할때, 가장효과적인신종인플루엔자대유행대응방법은백신개발이라사료됨. 그러나인플루엔자바이러스의특성상대유행원인바이러스를예측하기어렵기때문에미리백신을생산하여비축하는것이불가능함으로다양한항원의모형백신개발하고확보하여인플루엔자유행시개발된유행바이러스주의항원을가지는모형백신을이용하여백신생산의소요시간을단축한다면인플루엔자대유행대응의효과적인방안이될것으로사료됨. 나. 주요용도 개발하고자하는유전자변형생물체의용도및타당성을기술한다. 실험에사용하는용도및이로인해우려되는사항을기술한다. 예 ] 인플루엔자대유행의원인바이러스를예측하기어렵기때문에다양한인플루엔자 HA 및 NA 항원을가지는모형백신개발및확보는인플루엔자예방을위한가장실질적인대응방안임. 국내유행하는계절형인플루엔자바이러스분리주의다양한항원을분석하고이들항원정보를가지는인플루엔자모형백신을개발하기위하여참조 76 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

백신바이러스로 NIBRG-14주를이용하고자하며그용도는아래와같음. - 유정란을이용한인플루엔자백신개발을위한 seed virus로이용 - 유정란유래신종인플루엔자모형백신생산공정개발용시료 - 고효능모형백신제형개발및효능평가용항원 - 개발후백신생산용 seed virus 유전자재조합바이러스 NIBRG-14 취급시흡입으로인한인플루엔자감염가능성을배제할수없음으로생물안전교육을이수한실험종사자에한하여취급및보관토록하며, 반드시위해성평가를통하여적합한생물안전밀폐등급연구시설에서생물안전장비및개인보호장비를착용하고취급함. 다. 사용이승인된국가및승인용도 개발하고자하는유전자변형생물체와유사한경우의국외승인여부사례및용도를기술한다. 유전자변형생물체의실험사용이승인된현황및승인용도를기술한다. 예 ] 세계약 10 개국의백신제조회사들이정부당국및민간연구소의지 원하에 AI 대유행대비하여인플루엔자 A 형의 H5, H2, H7 또는 H9 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 77

에대한 seed virus 개발이진행되고있으며, 세계보건기구는인플루엔자백신개발등보건의료를위하여 NIBRG-14주를비롯한유전자재조합참조백신바이러스를적절한밀폐연구시설이확보되고필수적인승인및자격이있는경우에한하여각국가및연구기관에분양하고있으며, NIBRG-14주의경우미국, 일본, 영국, 네덜란드, 대한민국, 캐나다등여러나라에분양되었음. NIBRG-14주를이용한주요 pandemic influenza 백신개발현황은아래의표와같음.( 출처 : IFPMA Influenza Vaccine Supply International Task Force) 표 1. NIBRG-14 를이용한 pandemic influenza 백신개발현황 나 라 회사명 백신형태 일 본 Biken, Denka, Seiken Inactivated whole virion 이탈리아 오스트레일리아 네델란드 Chiron(Novatis) CSL Nobilon Solvay Inactivated surface antigen Inactivated spilit Inactivated whole virion Inactivated surface antigen 78 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

2) 유전자변형생물체에관한자료 가. 명칭 개발하고자하는유전자변형생물체의예상되는분류학적명칭 ( 학명, strain명, 일반명 ) 및혈청형, 생물형이있는경우기술한다. 실험에사용하는유전자변형생물체의분류학적명칭 ( 학명, strain명, 일반명, 상품명 ) 및혈청형, 생물형등을기술한다. 예 ] NIBSC INFLUENZA REFERENCE VIRUS ; NIBRG-14 NIBRG-14는 A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) 바이러스와 A/PR/8/34 (H1N1) 바이러스로부터역전사유전자기법을이용하여만들어진 reassortant 인플루엔자바이러스 H5N1 형임. 나. 도입유전자에의하여부여된특성유전자변형생물체에삽입되거나소실된도입유전자로인하여새로이부여된특성등에대한자료를기술한다. 제5항제다호도입유전자에관한자료 에서상세하게통합, 기술할수있다. 예 ] 실험에사용되는인플루엔자참조바이러스 NIBRG-14는비병원성이면서계태아에서증식성이좋은 A/PR/8/34 (H1N1) 의 6개 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 79

segments와고병원성인 A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) 바이러스의고병원성표현형에관여하는 polybasic stretch amino acids가결여된 HA (haemagglutinin) segment와 NA (neuraminidase) segment 를포함하도록재조합하여만든바이러스 (reassortant) 로써 A/PR/8/34의특성인유정란에서증식성이우수한특성과 H5N1형을갖는조류비병원성인인플루엔자재조합바이러스임. 유전자재조합된 NIBRG-14는 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스의 HA와 NA 단편을포함하는 2개의플라스미드, A/PR/8/34 의 6개 backbone 플라스미드와 4개발현기능플라스미드 (PA. PB1, PB2, NP) 단편을포함함. H5Ni 4 expression plasmids PR8 HA and NA rescue plasmids Vero cells 6 backbone rescue plasmids Rescued virus: NIBRG-14 Nature Reviews Microbiology 2, 842-847 80 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) 바이러스의 HA, NA 유전자및 A/PR/8/34 (H1N1) 의 6 개유전자에대한특성은 제 5 항제다호도 입유전자에관한자료 ' 에서자세히기술함. 다. 숙주또는근연종과의생물학적특성의차이점 개발하고자하는유전자변형생물체와숙주 ( 수용생물체 ) 또는근연종과의생물학적특성의차이점을기술한다. 실험에이용하고자하는유전자변형생물체와해당유전자변형생물체개발시사용된수용생물체또는근연종과의생물학적특성의차이점을기술한다. 예 ] 유전자재조합된 reassortant NIBRG-14의수용생물체로작용한 A/PR/8/34와비교할경우, A/PR/8/34는 H1N1형의인체유래인플루엔자바이러스로지속적인계대배양으로인체비병원성및유정란증식성이우수한특성이있으나 NIBRG-14는 H5N1형으로저병원성이며유정란증식이우수한특성을가짐. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 81

라. 병원성, 독소생산성, 알레르기유발성및기타유해생리활성물질생산가능성 개발하고자하는유전자변형생물체또는실험에이용하는유전자변형생물체의병원성, 독소생산성, 알레르기유발성및기타유해생리활성물질생산가능성에대하여기술한다. 미생물인경우, 해당위험군, 감염량, 병독성, 전파경로등병원성특성정보를제공한다. 예 ] 유전자재조합된 NIBRG-14는영국의 NIBSC(the National Institute for Biological Standards and Control) 품질관리시다음과같은시험을통해비병원성임이보증됨. 병원성시험닭병원성시험결과, intravenous virus pathogenicity index (IVPI) 수치는 0.0으로나타났으며페렛의경우에는 A/Viet Nam/1194/2004 보다약한병원성으로, A/PR/8/34과유사한비병원성으로검증되었음. Plaquing test결과, 트립신이있는 MDCK 세포주에서는 plaque를형성하였지만트립신이없는세포에서는 plaque를형성하지않았음. NIBRG-14는유정란에서는높은성장율을보이며모든계태아들이생존하였으나, 대조적으로 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스는모든계태아들이죽었음. 또한 NIBRG-14의 HA 유전자의서열분석결과, 조류에대한병원성결정에중요한요소가되는 HA segment 내에 polybasic amino acids가제거되었음이확인되어, 결론적으로따라서 NIBRG-14는비병원성으로평가되었으며, 82 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

NIBRG-14는본래의야생형바이러스의 ploybasic cleavage site를포함하고있지않으며, 새로운 site reforming을방해하기위한변이도일어나지않은것으로분석되었음. 유정란을이용한추가적인계대배양에서 NIBRG-14는비병원성과 HA 유전자의제거된 ploybasic cleavage site 안전성이검증되었음. 항원성시험 HI assay 수행결과, NIBRG-14는 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스와유사한항원성을갖고있었음. 무균시험 NIBRG-14는세균이나곰팡이의오염여부에대한세균생장배지, 곰팡이생장배지, 한천배지 (blood agar plate) 를이용한무균시험결과에서도오염이검출되지않았음. 마. 유전자변형생물체내도입유전자의위치및복제수 개발하고자하는유전자변형생물체또는실험에이용하는유전자변형생물체내삽입되거나소실된도입유전자의위치및복제수를기술한다. 예1] NIBSC 자료에따르면, NIBRG-14의 HA genome segment의염기서열은삽입을위하여 HA cleavage site의일부 amino acid를제거하여제작한 plasmid DNA와동일하였음. 제작, 삽입된 plasmid DNA 염기서열은 HA cleavage site 지역을제외한나머 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 83

지서열이 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스의 HA와모두일치하였음. 또한 NIBRG-14의 NA genome segment의염기서열은기존삽입 plasmid DNA, A/Viet Nam/1194/2004 바이러스의 NA 서열과일치하였음. A/VietNam/1194/2004 sequence at HA cleavage site CCT CAA AGA GAG AGA AGA AGA AAA AAG AGA GGA TTA Ser Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Plasmid DNA sequence at HA cleavage site CCT CAA CGA GAG ----- deleted ---- ACG CGA GGA TTA Ser Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu Reference virus NIBRG-14 sequence at HA cleavage site CCT CAA CGA GAG ----- deleted ---- ACG CGA GGA TTA Ser Gln Arg Glu Thr Arg Gly Leu ; HA cleavage site 예2] 녹농균의 PA2491유전자의기능상실을유도하기위하여 gentamicin 내성유전자 aacc1를삽입시킨 PA2491:aacC1를 plasmid integration homologous recombination방법을통하여 genomic DNA의 PA2491유전자와교체함. 84 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Genomic DNA HindⅢ SacⅡ SacⅡ BamHl PA2491 Gm R 바. 도입유전자에의해생성되는단백질의발현정도및측정방법 개발하고자하는유전자변형생물체또는실험에이용하는유전자변형생물체내삽입된도입유전자의발현으로생성되는단백질의종류, 기능및측정방법을기술한다. 예 ] 유전자재조합바이러스 NIBRG-14는다음과같은시험을통하여 HA 와 NA항원단백질의발현정도를측정할수있음. - SRID(single radial immuno diffusion assay): HA 함량측정용시험 - Neuraminidase Activity assay: NA 활성측정용시험 - SDS-PAGE: HA 항원및패턴분석 - Western blot: HA 항원및패턴분석 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 85

사. 유전자변형에사용된벡터의존재여부및제거방법 개발하고자하는유전자변형생물체가유전자변형에사용될벡터를포함하는지의여부또는벡터가제거된다면제거방법에대하여기술한다. 실험에이용하는유전자변형생물체내에유전자변형시사용된벡터가잔류하는지여부또는제거되었다면제거방법을기술한다. 예1] A/Viet Nam/1194/2004 바이러스와 A/PR/8/34 바이러스의각각의유전정보를 cloning 한 plasmid vector는유전자재조합바이러스 NIBRG-14주의 rescue를위한역전사유전자기법 (reverse genetics system) 에사용되는데최종산물인 NIBRG-14주내로삽입되지않음. 예2] Homologous recombination을통한표적유전자 (PA2491) 의교체를유도하기위하여 suicide vector pex100t(atcc87436) 를사용하였으며, suicide vector는유전자변형생물체 ( 숙주 ) 내에서복제되지않음. 86 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

아. 검출및확인방법 개발하고자하는유전자변형생물체또는실험에이용하는유전 자변형생물체를검출하고확인할수있는방법을기술한다. 예1] 유전자재조합바이러스 NIBRG-14의검출및확인방법은다음과같음. 항원성확인표준항혈청 [NIBSC antiserum reagent for single radial diffusion assay of A/Viet Nam/1194/04 (H5N1) influenza virus haemagglutinin] 을이용하여항원성을 SRID assay나 HI(haemagglutination inhibition) assay로확인 HA cleavage site 중제거된염기서열확인 NIBRG-14RNA를이용한 RT-PCR로 HA segment를증폭한후 HA cleavage site를염기서열분석하여제거된 polybasic stretch amino acid 염기서열확인 유정란계대증식성및병원성확인시험유정란에서는높은증식율과모든계태아생존확인 예2] PA2491 유전자기능이상실된유전자변형녹농균의검출및확인방법은다음과같음. 특이 primer를이용한 PCR 및염기서열분석 PA2491 유전자에대한특이 primer를이용한 PCR product 크기여부및염기서열분석 항생제내성양상확인 gentamicin 내성유전자도입에의한항생제내성변화확인및 gentamicin MIC 값변화확인 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 87

3) 숙주에관한자료 가. 명칭, 유래및분류학적특성 개발하거나실험에이용하는유전자변형생물체의숙주 ( 수용생물체 ) 의분류학적명칭 ( 학명, strain명, 일반명 ) 및그유래, 혈청형, 생물형등생물학적특성을기술한다. 종명까지명시되지아니하고인체병원성여부가밝혀지지아니한미생물인경우, 생물학적및생화학적실험결과에근거한분류학적특성, 병원성및독소생성실험자료를기술한다. 예 ] 명칭 : A/Puerto Rico/8/34 ( 약칭 PR8) NIBRG-14주의수용인플루엔자바이러스인 A/PR/8/34는 H1N1형으로 Puerto Rico 지역에서발생한인플루엔자환자로부터분리된인플루엔자 A 바이러스의 H1N1형 prototype임. A/PR/8/34 바이러스는마우스나, 페렛 (ferret), 배아상태의계란에서많은계대배양을 반복실시되었고, 그결과 약독화되어사람에서복제능력을완전히 상실하여비병원성이되었고, 사람을위한백신주임. Reassortant 인 NIBRG-14 에도입된 A/PR/8/34 의 6 개의분절및 기능은아래와같음. 88 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

단백질기능 PB2 (RNA polymerase) PB1 (RNA polymerase) PA (RNA polymerase) NP (nucleocapsid protein) M (Matrix protein) NS (nonstructural protein) RNA polymerase subuint, cap-binding RNA polymerase subuint, endonuclease RNA polymerase subuint nucleocapsid protein, RNA binding Matrix protein, nuclear export of vrnps ion channel, integral membrane protein nuclear export of vrnps 나. 개발 실험하고자하는유전자변형생물체와유사한용도의유전자변형생물체의숙주로이용된사례개발하거나실험에이용하는유전자변형생물체와유사한용도로사용되고있는유전자변형생물체의숙주 ( 수용생물체 ) 로이용된사례를기술한다. 예 ] A/PR/8/34 (H1N1) 는바이러스병원성연구를위한페렛과마우스등동물감염실험, 면역반응시험, 항바이러스제제시험에널리사용되고있으며, 인체및동물인플루엔자백신개발의수용생물체로많이이용되고있음. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 89

인플루엔자백신개발이용현황 - G9/PR8; H9N2형조류인플루엔자바이러스 A/chicken/Hong Kong/G9/97(G9) 의 HA 및 NA genes과 A/Puerto Rico/8/34 (PR8) 의 6 internal genes으로구성된 reassortant virus (Novartis V&D, Italy) - Eurasian H7N7/PR8; H7N7형조류인플루엔자바이러스 A/Netherlands/219/03 (NL219) 의 surface glycoproteins genes 과 A/Puerto Rico/8/34(PR8) 의 6 internal genes 으로 구성된 reassortant virus (Vaccine 2008 Mar 25;26(14):1742-50) - High-growth reassortant virus H7N2-PR8; H7N2형조류인플루엔자바이러스 low-pathogenicity A/TurkeyVirginia/4529 /02 (TK/VA/02) 의 HA 및 NA genes과 A/Puerto Rico/8/34 (PR8) 의 6 internal genes으로구성된 reassortant virus (Clinical and Vaccine Immunology, November 2007, 14(11): 1425-1432) 다. 숙주및근연종에서의독소생산성, 알레르기유발성및기타유해생리활성물질생산성여부숙주 ( 수용생물체 ) 및근연종이독소및독성, 알레르기유발체및기타유해생리활성물질을생산하는지여부와생산물에대한특성을기술한다. 90 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

예 ] A/PR/8/34 (H1N1) 바이러스는 PI 백신의 reassortant에 internal genes를제공하는인플루엔자바이러스로마우스나, 페렛 (ferret), 배아상태의계란에서반복적인계대배양을통하여완전히약독화된상태이며인간에게서복제할능력이없어진상태임. A/PR/8/34 의독소생성, 알레르기유발체및기타유해생리할성물질생성에대하여현대까지보고된것이없음. 라. 미생물인경우, 병원성존재여부및알려진병원체와의관련성해당미생물의위험군제시, 사람및동 식물에대한병원성여부, 기존에알려진병원체와의연관성등에대하여기술한다. 병원성이있는경우감염량, 전파경로, 역학자료등정보를제공한다. 예 ] A/PR/8/34 (H1N1) 는척추동물세포뿐만아니라유정란계대시높은증식율을보임. 1960년대말이후 A/PR/8/34) 는유행인플루엔자 A 백신주와결합하여 'high-growth reassortants' 를생산하는데사용되어왔음. 현재까지 A/PR/8/34로인한인체위해는알려진것이없음. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 91

4) 공여체에관한자료 가. 명칭, 유래및분류학적특성 개발하거나실험에이용하는유전자변형생물체의공여체에대한자료로분류학적명칭 ( 학명, strain명, 일반명 ), 그유래, 혈청형, 생물형등생물학적특성을기술한다. 종명까지명시되지아니하고인체병원성여부가밝혀지지아니한미생물인경우, 생물학적및생화학적실험결과에근거한분류학적특성, 병원성및독소생성실험자료를기술한다. 예 ] 명칭 : A/Viet Nam/1194/2004 A/Viet Nam/1194/2004는 H5N1형으로베트남지역의인플루엔자인체감염사례로부터분리된고병원성조류인플루엔자바이러스 (high pathogenic avian influenza, HPAI) 로 H5N1 인플루엔자바이러스의계통분류학적분류시 Clade 1에속하며, 그지역의조류종으로부터분리한것과항원적특성이유사하다. A/Viet Nam/1194/2004의표면항원인 HA(heamaglutinin) 의단백질구성정보는조류종에높은병원성을갖는 polybasic stretch amino acids를포함하고있음. 92 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

나. 개발 실험하고자하는유전자변형생물체와유사한용도의유전자변형생물체의공여체로이용된사례개발하거나실험에이용하는유전자변형생물체와유사한용도로사용되고있는유전자변형생물체의공여체로이용된사례를기술한다. 예 ] 현재 WHO Global Influenza Programme에의해대유행대비를위한인플루엔자 H5N1 백신후보주개발이활발히진행되고있으며이를위하여 WHO는적합한밀폐연구시설이확보되고소유에대한자격과필요성이허가된세계여러연구기관에한하여분양하고있음. A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) 은세계여러나라의백신제조회사에의해서백신개발시표면항원 HA 및 NA 유전정보공여바이러스로이용되고있음 ( 표참조 ). 표 1. A/Viet Nam/1194/2004(H5N1) 를이용한백신개발현황 Type of vaccine Producer Substrate Inactivated whole virion Biken, Japan Denka Seiken, Japan Kitasato Institute, Japan Kaketsuken, Japan GSK Biologicals, Belgium Nobilon, Netherlands Omninvest, Hungary Sinovac Biotech, China Egg Egg Egg Egg Egg Cell Egg Egg Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 93

Type of vaccine Inactivated split virus Producer CSL Ltd, Australia GSK Biologicals, Belgium Sanofi Pasteur, France Substrate Egg Egg Egg Inactivate subunit Microgen, Russia Microgen, Russia Novartis V&D, Italy Solvay Pharmaceuticals, Netherlands Solvay Pharmaceuticals, Netherlands Egg Egg Egg Egg MDCK cells 다. 공여체및근연종에서의독소생산성, 알레르기유발성및기타유해생리활성물질생산성여부공여체및근연종이독소및독성, 알레르기유발체및기타유해생리활성물질을생산하는지여부와생산물에대한특성을기술한다. 예 ] A/Viet Nam/1194/2004는조류및인체에고병원성특성을가지고있으나독소생성, 알레르기유발체및기타유해생리할성물질생성에대하여현대까지보고된것이없음. 94 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

라. 미생물인경우, 병원성존재여부및알려진병원체와의관련성해당미생물의위험군제시, 사람및동 식물에대한병원성여부와기존에알려진병원체와의연관성등에대하여기술한다. 병원성이있는경우감염량, 전파경로, 역학자료등정보를제공한다. 예 ] A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) 는 2004년에서 2005년 3월사이발생한 H5N1 인플루엔자유행발생시 (52명사망 / 총 89명감염 ) 베트남지역의인플루엔자인체감염사례로부터분리된조류인플루엔자바이러스로인체및동물 ( 조류 ) 에고병원성인플루엔자바이러스의 HA에서확인되는 RERRRKKR polybasic cleavage site를가지고있는고병원성으로 wild-type A/Viet Nam/1194/2004주는제 3위험군으로분류됨. 조류인플루엔자바이러스는호흡기, 접촉등으로전파되며고병원성 H5N1 HA polybasic 분절부위를가지고있는조류인플루엔자는사람및동물감염시폐, 간, 신장등의장기에감염하여치명적인질병을야기함. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 95

5) 유전자재조합특성에관한자료 가. 유전자변형에사용된현대생명공학기술유전자변형생물체를개발하기위하여인위적으로유전자를재조합, 삽입또는소실하는데이용되었거나이용될현대생명공학기술을상세하게기술한다. 예 ] NIBRG-14는역전사유전자기법 (reverse genetics) 을통하여제조되었으며그과정은다음과같음. 인체에서분리된 H5N1형 wild type A/Viet Nam/1194/2004에서의 heamagglutinin (HA) 과 neuraminidase (NA) 유전자를분리하여 RT-PCR로증폭한후높은병원성을갖는 HA 분절의 polybasic stretch 아미노산부위를일부제거 ( 결실 ) 하여 plasmid vector에클로닝하고, NA 분절유전자는변형없이 vector에클로닝하여준비함. 또한 master 백신주인 H1N1형인 A/PR/8/34의 6개 backbone segments (PB1, PB2, PA, NP, M, NS) 와 4개의 expression segments(rna 바이러스의복제, 전사를위한효소유전자 ) 각각을 plasmid vector에클로링하여준비함. A/Viet Nam/1194/2004로부터유래된 HA-결실및 NA 플라스미드와 A/PR/8/34의 6개 backbone 플라스미드를함께 Vero 세포주내로삽입 (transfection) 하고, Vero 세포내에서 positive-와 negative-sense RNA와바이러스단백질이발현되면바이러스복제가시작되고 (rescue) 완전한새로운유전자재조합바이러스 NIBRG-14가제조됨. 96 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Flu strain 1 Flu strain 2 A flu virus contains eight gene segments. The goal is to combine the desired HA and NA genes from flu strain 1 with the six other genes from flu strain 2, which grows well in eggs and is harmless in humans HA antigen NA antigen HA gene Additional plasmids are created using the remaining six genes flu strain 2 NA Plasmids HA After removing the dangerous part of the HA gene, scientists splice the HA and NA genes from flu strain 1 into circular pieces of DNA called plasmids HA antigen Sientists insert the HA and NA plasmids from flu strain 1 and the six plasmids NA carrying genes from flu strain 2 into antigen animal cells growing in the laboratory. New flu strain Link Studio for NIAID Growing animal cells New flu strain The genes in the plasmids instruct the anomal cells to make the desired new flu strain. 출처 : http://www3.niaid.nih.gov/topics/flu/research 상기과정중 cloning과 plasmid DNA preparation은 BL2 실험실 MSC(class III microbiological safety cabinet) 에서수행되었으나 reverse genetics 과정은 BL4 실험실내 MSC에서수행됨. 또한 vero cell의 transinfection 과정도 BL4 실험실내 CBI (cell biology & imaging) unit에서수행되었고 rescued virus의 egg passage과정도 BL4 실험실내 class I MSC에서수행하였음. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 97

나. 벡터에관한자료 (1) 명칭, 기능및유래된생물체유전자변형을위한현대공학기술에이용되는벡터의명칭, 벡터가유래된생물체에대한자료, NCBI 의 Genebank 등국제유전자은행등록번호, 벡터의주요기능및용도등을기술한다. 예 1] 사용된 reverse genetics vector는 ppst이다. A/PR/8/34(PR8) 의 Pa, Pb1, Pb2, NP, M 및 NS genome segement를포함하는 6개의 ppst-파생 plasmids와 PR8의 Pa, Pb1, Pb2 및 NP protein 발현을위한 4개의 helper plasmids를영국 Oxford 대학 George Brownlee 교수로부터분양받아각 plasmids DNA를 E. coli JM109에형질전환시킨후보관함. A/Viet Nam/1194/2004의 HA 와 NA의 encoding genome segments를각각ppst vector에 cloned시킴. Cloning 과정동안 HA segment 는 Subbarao et al, 의방법에따라 HA cleavage site 내 polybasic stretch amino acid가제거됨. 예 2] 사용된벡터는 ppolisapit 과 pgt-h 임. 새로운 basic cloning vector 인 ppolisapit 는 PolI promoter downstream 위치에 the 98 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

murine rdna terminator sequence (positions +572 to +715) 를가지고있으며 PolI promoter와 terminator sequences는 SapI restriction site를포함하는 24bp linker sequence (5'- AGAAGAGCCAGATCTGGCTCTTCC-3') 에의해분리됨. Plasmid ppolisapit는 ppoli-cat-rt (Pleschka et al., J. Virol. 70,4188-4192,1996) 로부터파생된것으로 ppolisapit내로도입되어증폭된 PCR products는 SapI에의해절단됨. ppolisapit는인플루엔자 A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) 의 6개 backbone segments 유전자 (Pa, Pb1, Pb2, NP, M, NS) 와 A/Viet Nam/1194/2004 (H5N1) 의 2개표면항원유전자 (HA, NA) 클로닝에사용되어역전사중합효소연쇄반응 (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) 에의해서도입유전자를증폭함. pgt-h는 expression vector로 A/PR/8/34(PR8) 의 Pa, Pb1, Pb2, NP 단백질발현을위한 helper plasmid 역할을함. pgt-h vector 의 promoter는세포내에서단백질의 high-level expression을유도하는것으로보고되었음 (Berg et al., 1993 BioTechniques, 14,972-978). pgt-h plasmid의 Bcl I cloning site 내로 Pb1, Pb2, PA 및 NP 단백질발현을위한 ORF이도입됨 (Berg et al., 1993, ibid.). 예 3] Suicide vector pex100t [ ATCC 87436, Nucleotide (GenBank): U17500] Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 99

pex100t vector 크기는 5.8460kb 이고, 선별표지유전자는 ampr(bla), sacb(sacb) 이며취급시생물안전 1 등급시설이권장됨. (2) 구성요소및도입유전자를포함한지도벡터구성유전자, 제한효소에의한절단위치, 삽입코든, 프로모터, 선발표지유전자및도입유전자를포함하는지도를제공한다. 100 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

예1] 역전사유전자기법 (reverse genetics) 을통한인플루엔자유전자재조합바이러스 rescue를위한 vector ppolisapit와 pgt-h 의구성유전자및도입유전자 (Pa, Pb1, Pb2, NP, M, NS, HA 및 NA 유전자 ) 를포함하는지도는아래와같다. 예2] 녹농균 PA2491유전자의기능상실을유도하기위하여 gentamicin 내성유전자 aacc1를삽입시킨 PA2491:aacC1를 suicide vector pex100t (ATCC87436) 내로삽입한후 homologous recombination 을통하여 wild-type 녹농균 PAO1 내 PA2491유전자와교체시킴. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 101

그림. PA2491:aacC1 유전자가삽입된 pex100t vetor (3) 병원성, 독소등위해염기서열의존재여부벡터가가지는병원성, 독소등위해염기서열준재여부와존재하는위해염기서열을제거하고나무력화한경우그방법및안전성에대하여기술한다. 예 ] 벡터 ppolisapit과 pgt-h는병원성, 독소등위해염기서열를포함하지않음. 실험과정중벡터내위해염기서열이확인되는경우즉시폐기할예정임. 102 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

(4) 다른생물체로의전달가능성및숙주범위 숙주내에서벡터의복제수및안전성에대한정보와숙주의범위 및다른생물체로벡터가전달될가능성에대하여기술한다. 예 ] 벡터 ppolisapit과 pgt-h 는재조합 DNA로부터인플루엔자바이러스를 rescue하는데사용되어왔으며, 숙주의범위변화및다른생물체로벡터가전달될가능성에대해아직보고된것이없음. (5) 선발표지유전자 벡터내존재하는선발표지유전자의존재여부및해당표지유 전자의염기서열및기능등특성을기술한다. 예 ] pex100t 벡터내선발표지유전자로 ampicillin 내성유전자 (bla) 가존재하며 β-lactamase를생산함. bla 유전자는 861bp이며염기서열을아래와같음. 1 ttaccaatgc ttaatcagtg aggcacctat ctcagcgatc tgtctatttc gttcatccat 61 agttgcctga ctccccgtcg tgtagataac tacgatacgg gagggcttac catctggccc 121 cagtgctgca atgataccgc gagacccacg ctcaccggct ccagatttat cagcaataaa 181 ccagccagcc ggaagggccg agcgcagaag tggtcctgca actttatccg cctccatcca Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 103

241 gtctattaat tgttgccggg aagctagagt aagtagttcg ccagttaata gtttgcgcaa 301 cgttgttgcc attgctacag gcatcgtggt gtcacgctcg tcgtttggta tggcttcatt 361 cagctccggt tcccaacgat caaggcgagt tacatgatcc cccatgttgt gcaaaaaagc 421 ggttagctcc ttcggtcctc cgatcgttgt cagaagtaag ttggccgcag tgttatcact 481 catggttatg gcagcactgc ataattctct tactgtcatg ccatccgtaa gatgcttttc 541 tgtgactggt gagtactcaa ccaagtcatt ctgagaatag tgtatgcggc gaccgagttg 601 ctcttgcccg gcgtcaatac gggataatac cgcgccacat agcagaactt taaaagtgct 661 catcattgga aaacgttctt cggggcgaaa actctcaagg atcttaccgc tgttgagatc 721 cagttcgatg taacccactc gtgcacccaa ctgatcttca gcatctttta ctttcaccag 781 cgtttctggg tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa taagggcgac 841 acggaaatgt tgaatactca t 다. 도입유전자에관한자료 (1) 도입유전자의기능및특성 ( 해당되는사항만기술 ) 유전자변형생물체에도입되거나소실된유전자의유래, 변형여 부, 도입유전자의기능및특성등에대한자료를기술한다. ( 가 ) 제9-9조제1항제1호의규정에해당하는경우유전자의삽입또는소실로인하여변화또는발현된단백질의생물학적특성, 병원성및독소생성가능성, 항생제저항성증가등인체위해발생가능성에대하여기술한다. 104 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

예 ] 종명까지명시되어있지않고인체병원성여부가밝혀지지않은 Bacillus 균속에해당하는미생물에대한병원성발현을확인하기위하여병원성단백유사 spot 을보이는 A 단백질발현유전자를 E. coli expression 숙주-벡터시스템을이용하여도입하여유전자변형생물체 (Bacillus1234- A E) 를개발하고자함. 개발된유전자변형생물체 (Bacillus1234-A E) 를배양하여 A 단백질을정제한후병원성및병독성시험을위하여마우스, 기니픽, 토끼등실험동물에접종하여 LD50 등을측정하고, A 단백질의아미노산서열분석을실시하고자함. 유전자변형생물체 Bacillus1234-A E에도입된유전자염기서열은아래와같음. ( 나 ) 제9-9조제1항제2호의규정에해당하는경우도입유전자의발현으로생성된단백질의독력, 적용범위및생화학적특성, 척추동물에대한유독성 (LD50), 독소의환경내생존력등인체위해성을기술한다. 예 ] 보툴리눔신경독소 (botulinum neurotoxins, BoNT) 는사람에게매우치명적인단백성독소로이들독소의혈청형은 antibody neutralization의특이성에따라결정됨. 화학적으로불활성화된보툴리눔신경독소로부터생산되는백신은매우제한적임으로발은중요함. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 105

보툴리눔신경독소 (BoNT) 의마우스에대한 LD50 는아래와같음. Toxin LD50 ng/kg 비 고 C. botulinum toxin A C. botulinum toxin B (proteolytically activated) C. botulinum toxin C1 (proteolytically activated) C. botulinum toxin C2 (proteolytically activated) C. botulinum toxin D C. botulinum toxin E C. botulinum toxin F (proteolytically activated) 1.2 1.2~2.0 1.1 1.2 0.4 1.1 2.5 i.p. i.p. i.v. i.p. i.p. i.v. 보툴리눔신경독소 (BoNT) 는 zinc proteases로 ~150-kDa single chain protein로 3가지기능적 domains을가짐. 즉 N-terminal catalytic domain (light chain, LC), internal translocation domain (heavy chain, HCT) 과 C-terminal receptor binding domain (heavy chain, HCR) 임. BoNT는 flaccid paralysis를유도하기위하여 SNARE protein을분할하는데 plasma membrane 상의 SNAP25 불활성화를위하여 BoNT/A는 SNAP25 197과 198 residues를분할하고, BoNT/E는SNAP25 180과 181 residues를분할하며, BoNT/C는 SNAP25와 syntaxin을모두분할함. BoNT는분할을위하여 SNAP25의광범위한 regions을인지하는데그기전은명확하지않음. LC/A 와 LC/E 에의한 optimal cleavage domain을조사하고자 LC/A 와 LC/E fragment를코드하는 DNA를각각 pet-15b에클로링하여유전자 106 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

변형생물체 (BoNT 1234 LC/A-E 및 BoNT 2345 LC/E-E) 를개발하고자함. 개발한유전자변형생물체 (BoNT 1234 LC/A-E 및 BoNT 2345 LC/E-E) 를배양하여 His-LC/A, His-LC/E를정제하고병독성및항혈청생산에이용하고자함. 유전자변형생물체 (BoNT 1234 LC/A-E 및 BoNT 2345 LC/E-E) 에도입된 LC/A 및 LC/E 발현유전자염기서열은아래와같음. ( 다 ) 제9-9조제1항제3호의규정에해당하는경우도입유전자로발현된단백질로인하여감수성이저하되거나교차내성발현이예상되는항생제종류및 MIC 값의변화여부, 내성을나타내는항생제의치료효능성등에대하여기술한다. 예 ] β-lactam제중 penicillin이나 cephem제는포도알균감염등다양한병원성미생물감염에의한질병치료를목적으로사용되고있은데, meca 와 mecr1 유전자는 β-lactam제중 penicillin이나 cephem제내성발현에관여하는약제내성유전자로 meca 유전자의기능은세균의 PBP (penicillin-binding protein) 2' 생성과관련이있으데 PBP 2' 는세균의 PBP 와 pentapeptide 및 pentaglycine 의가교반응을저해하여세포 벽완성을저지하는 penicillin 제 (methicillin 제 ) 나 cephalosporine 치료 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 107

시내성을나타냄. meca 유전자의유래는포도알균속공통의기원인어떤세균에서수직유전되었거나포도알균사이에서수평으로전달되었을것으로추정되고있음. meca operon 에는 PBP 2' 생산억제인자인 MecI 를코드하는 meci 유전자와 PBP 2' 의생산유도에필요한 signal 전달단백인 MecR1을코드하는 mecr1 유전자가있음. 본실험에서는 mecr1의일부유전자를결실시켜 MecA 및 PBP 2' 발현을비교하고, penicillin이나 cephem제에대한 MIC 값의변화여부, 교차내성발현이예상되는항생제종류등을분석하고자함. ( 라 ) 제 9-9 조제 1 항제 4 호의규정에해당하는경우 도입유전자의발현단백질로인하여유발되는병원성및감염 정보 ( 질병발생, 감염량, 전파경로등 ) 에대하여기술한다. 예 ] 유전자재조합바이러스 NIBRG-14는 A/PR/8/34의 6개분절 (PB2 PB1, PA, NP, M, NS) 외에고병원성인 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스의 HA 분절중고병원성에관여하는 polybasic amino acid stretch가결여된 HA 분절과 NA 분절이도입된 reassortant임. - HA의기능은세포표면의 sialic acid receptors에특이적으로결합하여숙주세포에부착하여침입하는것을중재함. 인간인플루엔자바이러스의 HA는 α2-6 linked sialic acid가지는세포수용체에선택적친화력을가지 108 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

며, 조류인플루엔자바이러스의 HA는 α2-3 linked sialic acid가지는세포수용체에선택적친화력을가짐으로숙주의범위를결정하게하는요소가됨. 그러나이러한 sialic acid 세포수용체의선택적친화력으로사람과조류등종을넘은감염을완전히배제할수있는것은아님. NIBRG-14주에도입된 HA분절은고병원성을갖는 polybasic amino acid stretch 부위인 1049번째염기부터 1060번째까지 12개의염기가제거되어사람과조류에대한병원성이소실되었음. 그러나마우스나페렛에서는정상적인 H5N1형바이러스보다병원성이낮으나질병유발가능성이있는것으로평가됨. - NA(neuraminidase) 의기능은감염세포표면에있는 terminal sialic acid와근접 carbohydrate residue사이의 α-ketosidic linkage 를분할을촉매하여바이러스의방출 (release) 을증진시킴. NIBRG-14주에도입된 NA분절은고병원성인 A/Viet Nam/1194/2004 바이러스의 NA 분절을변형없이전달됨. - HA( 고병원성을갖는 polybasic amino acid stretch 부위제거 ) 및 NA 유전자가도입된 NIBRG-14주가생산하는 HA 및 NA 단백질은감염성과위해성을갖지않음. - 유전자재조합 (reassortment) 과정동안, 인플루엔자바이러스내유전자의변이가발생할수있으며, 이러한가설적가능성은새로이제작된 H5N1 PR8 reassortant와자연발생적인체또는동물인플루엔자바이러스사이에서 secondary reassortant가발생할수있음을의미함. 비록 H5N1 PR8 reassortant가인체에비감염성이라할지라도인체인플루엔자바이러스로부터유래된 secondary reassortant는사람에대한감염성을가질수있으며유행성위협이될수있음. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 109

(2) 염기서열 ( 위해염기서열의존재여부포함 ) 도입유전자의염기서열을제공하고다른유전자와의재조합등변 형여부및그내용, 위해염기서열의존재여부에대하여기술한다. 예 ] NIBRG-14 주에도입된 A/Viet Nam/1194/2004 의 HA 및 NA 분절염기서열각각을아래와같음. - HA 분절의경우고병원성을갖는 polybasic amino acid stretch 부위인 1049 번째염기부터 1060 번째까지 12 개의염기가제거됨. 빨간색의염기는 cleavage site 의일부아미노산치환부위임. - NA 분절의경우 A/Viet Nam/1194/2004 의유전자를그래로도입함. 도입된 HA 염기서열 1 AGCAAAAGCA GGGGTCCAAT CTGTCAAAAT GGAGAAAATA GTGCTTCTTT 51 TTGCAATAGT CAGTCTTGTT AAAAGTGATC AGATTTGCAT TGGTTACCAT 101 GCAAACAACT CGACAGAGCA GGTTGACACA ATAATGGAAA AGAACGTTAC 151 TGTTACACAT GCCCAAGACA TACTGGAAAA GACACACAAT GGGAAGCTCT 201 GCGATCTAGA TGGAGTGAAG CCTCTAATTT TGAGAGATTG TAGTGTAGCT 251 GGATGGCTCC TCGGAAACCC AATGTGTGAC GAATTCATCA ATGTGCCGGA 301 ATGGTCTTAC ATAGTGGAGA AGGCCAATCC AGTCAATGAC CTCTGTTACC 351 CAGGGGATTT CAATGACTAT GAAGAATTGA AACACCTATT GAGCAGAATA 401 AACCATTTTG AGAAAATTCA GATCATCCCC AAAAGTTCTT GGTCCAGTCA 451 TGAAGCCTCA TTGGGGGTGA GCTCAGCATG TCCATACCAG GGAAAGTCCT 501 CCTTTTTCAG AAATGTGGTA TGGCTTATCA AAAAGAACAG TACATACCCA 551 ACAATAAAGA GGAGCTACAA TAATACCAAC CAAGAAGATC TTTTGGTACT 601 GTGGGGGATT CACCATCCTA ATGATGCGGC AGAGCAGACA AAGCTCTATC 651 AAAACCCAAC CACCTATATT TCCGTTGGGA CATCAACACT AAACCAGAGA 701 TTGGTACCAA GAATAGCTAC TAGATCCAAA GTAAACGGGC AAAGTGGAAG 751 GATGGAGTTC TTCTGGACAA TTTTAAAACC GAATGATGCA ATCAACTTCG 801 AGAGTAATGG AAATTTCATT GCTCCAGAAT ATGCATACAA AAT TGTCAAG 851 AAAGGGGACT CAACAaTTAT GAAAAGTGAA TTGGAATATG GTAACTGCAA 901 CACCAAGTGT CAAACTCCAA TGGGGGCGAT AAACTCTAGC ATGCCATTCC 110 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

951 ACAATATACA CCCTCTCACC ATCGGGGAAT GCCCCAAATA TGTGAAATCA 1001 AACAGATTAG TCCTTGCGAC TGGGCTCAGA AATAGCCCTC AACGAGAG 1051 ACGCGAGGAT TATTTGGAGC TATAGCAGGT T T TATAG AGG 1101 GAGGATGGCA GGGAATGGTA GATGGTTGGT ATGGGTACCA CCATAGCAAC 1151 GAGCAGGGGA GTGGGTACGC TGCAGACAAA GAATCCACTC AAAAGGCAAT 1201 AGATGGAGTC ACCAATAAGG TCAACTCGAT TATTGACAAA ATGAACACTC 1251 AGTTTGAGGC CGTTGGAAGG GAATTTAACA ACTTAgAAAG GAGAATAGAG 1301 AATTTAAACA AGAAGATGGA AGACGGGTTC CTAGATGTCT GGACTTATAA 1351 TGCTGAACTT CTAGTTCTCA TGGAAAACGA GAGAACTCTA GACTTTCATG 1401 ACTCAAATGT CAAGAACCTT TACGACAAGG TCCGACTACA GCTTAGGGAT 1451 AATGCAAAGG AgCTGGGTAA CGGTTGTTTC GAGTTCTATC ATAAATGTGA 1501 TAATGAATGT ATGGAAAGTG TAAGAAACGG AACGTATGAC TACCCGCAGT 1551 ATTCAGAAGA AGCAAGACTA AAAAGAGAGG AAATAAGTGG AGTAAAATTG 1601 GAATCAATAG GAATTTACCA AATATTGTCA ATTTATTCTA CAGTGGCGAG 1651 CTCCCTAGCA CTGGCAATCA TGGTAGCTGG TCTATCCtTA TGGATGTGCT 1701 CCAATGGGTC GTTACAaTGC AGAATTTGCA TTTAAATTTG TGAGTTCAGA 1751 TTGTAGTTAA AAACACCCTT GTTTCTACT 도입된 NA 염기서열 1 AGCAAAAGCA GGAGTTTAAA ATGAATCCAA ATCAGAAGAT AATAACCATC 51 GGATCAATCT GTATGGTAAC TGGAATAGTT AGCTTAATGT TACAAATTGG 101 GAACATGATC TCAATATGGG TCAGTCATTC AATTCACACA GGGAATCAAC 151 ACCAATCTGA ACCAATCAGC AATACTAATT TGCTTACTGA GAAAGCTGTG 201 GCTTCAGTAA AATTAGCGGG CAATTCATCT CTTTGCCCCA TTAACGGATG 251 GGCTGTATAC AGTAAGGACA ACAGTATAAG GATCGGTTCC AAGGGGGATG 301 TGTTTGTTAT AAGAGAGCCG TTCATCTCAT GCTCCCACTT GGAATGCAGA 351 ACTTTCTTTT TGACTCAGGG AGCCTTGCTG AATGACAAGC ACTCCAATGG 401 GACTGTCAAA GACAGAAGCC CTCACAGAAC ATTAATGAGT TGTCCTGTGG 451 GTGAGGCTCC CTCCCCATAT AACTCAAGGT TTGAGTCTGT TGCTTGGTCA Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 111

501 GCAAGTGCTT GCCATGATGG CACCAGTTGG TTGACAATTG GAATTTCTGG 551 CCCAGACAAT GGGGCGGTGG CTGTATTGAA ATACAATGGC ATAATAACAG 601 ACACTATCAA GAGTTGGAGG AACAACATAC TGAGAACTCA AGAGTCTGAA 651 TGTGCATGTG TAAATGGTTC TTGCTTTACT GTAATGACTG ACGGACCAAG 701 TAATGGTCAG GCATCACATA AGATCTTCAA AATGGAAAAA GGGAAAGtGG 751 TTAAATCAGT CGAATTGGAT GCTCCTAATT ATCACTATGA GGAATGCTCC 801 TGTTATCCTg ATGCCgGCgA AATCACATGT GTGTGCAGGG ATAATTGGCA 851 TGGTTCAAAT CGGCCATGGG TATCTTTCAA TCAAAATTTG GAGTATCAAA 901 TAGGATATAT ATGCAGTGGA GTTTTCGGAG ACAATCCACG CCCCAATGAT 951 GGAaCAGGTA GTTGTGGTCC GGTGTCCTCT AACGGGGCAG GTGGgGTAAA 1001 AGGGTTTTCA TTTAAATACG GCAATGGTGT CTGGATCGGG AGAACCAAAA 1051 GCACTAATTC CAGGAGCGGC TTCGAAATGA TTTGGGATCC AAATGGGTGG 1101 ACTGAAACGG ACAGCAGCTT TTCAGTGAAA CAAGATATCG TAGCAATAAC 1151 TGATTGGTCA GGATATAGCG GGAGTTTTGT CCAGCATCCA GAGCTGACAG 1201 GACTAGATTG CATAAGACCT TGTTTCTGGG TTGAGTTGAT CAGAGGGCGG 1251 CCCAAAGAGA GCACAATTTG GACTAGTGGG AGCAGCATAT CTTTTTGTGG 1301 TGTAAATAGT GACACTGTGG GTTGGTCTTG GCCAGACGGT GCTGAGTTGC 1351 CATTCACCAT TGACAAGTAG TTTGTTCAAA AAAACTCCTT GTTTCTACT (3) 조절인자및유전자기능에영향을주는기타인자 도입유전자의발현을조절하거나기능에영향을주는기타인 자에대하여기술한다. 예 ] Reassortant인 NIBRG-14주는 A/Viet Nam/1194/2004로부터고병원성유전자가제거된상태의 HA 분절과 NA분절을도입받은유전자변형생물체로도입분절발현의조절이나기능에영향을주는기타인자는없음. 112 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

6) 안전관리에관한자료 가. 시험 연구기관내생물안전위원회의심사결과에관한자료 기관생물안전위원회에서실시한유전자재조합실험에대한생 물안전심의결과서를첨부한다. 예 ] 기관생물안전위원회또는생물안전심의를수행하는기관내위원회에서해당유전자재조합실험을심의한생물안전심의결과서복사본또는 PDF 파일 ( 부록 1 참고 ) 부록 II-14 : 기관생물안전위원회생물안전심의결과서양식참조 나. 취급 보관방법에관한자료 (1) 취급 보관시안전관리등급결정에대한근거유전자변형생물체를개발하거나이용하는실험의생물안전을위하여결정한연구시설안전관리등급을제시하고, 결정에대한근거및자료를기술한다. 예 ] 조류인플루엔자대유행 (pandemic) 징후에대한대비로인플루엔자백신 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 113

의안전한생산및품질관리가필요해짐에따라 WHO 에서는국제적인바이오안전성을위한가이드라인을제시하고있음. 2003년 11월, WHO에서는 Production of pilots lots of inactivated influenza vaccines from reassortants derived from avian influenza viruses Interim biosafety risk assessment' 를통해조류인플루엔자바이러스예비생산에대한안전성에대해잠정적인가이드라인을제시하였으며, 2005년 10월에는 'WHO biosafety risk assessment and guidelines for the production and quality control of human influenza pandemic vaccines' 를통해인간인플루엔자백신생산및관리, 바이오안전성위해요소에대한가이드라인을최종적으로제시하였음. 제시된가이드라인을따르면, 백신생산인플루엔자참조바이러스 NIBRG-14는 A/Viet Nam/1194/2004 ( 제3위험군 ) 와 A/PR/8/34 ( 제2위험군 ) 로부터역유전학의방법을이용하여만들어진 H5N1형 reassortant 이나 A/Viet Nam/1194/2004로부터병원성유전자가결실된 HA를도입받아비병원성으로재조합되어사람, 닭등에비병원성임으로위해성이중간으로 NIBRG-14를이용하는모든실험은생물안전 2+ 등급 (BL 2+) 연구시설에서취급및보관하도록권장되고있음. 이상적인 BL 2+ 실험실은음압이유지되어야하며, 모든바이러스배양실험은 BSC 내에서수행하여야함. 그러나이러한작업환경이원활치않은경우에는다른적절한방어장치시스템을이용하고, 바이러스배양시 open bench의사용을금지하고, 실험종사자는 HEPA filter가장착된 powered full-face respirators를사용하여방어하며, 항바이러스예방적조치를취하여야함. 다만, NIBRG-14주와 wild-type H5N1 바이러스주를이용하는동물실험 114 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

은반드시생물안전 3 등급 (BL 3) 연구시설에서수행하여야하며, 실험종사 자는개인호흡보호장비 (personal air-powered respirators) 등개인보호 장비를착용하고생물안전확보를위한적합한행동지침을준수하여야함. 첨부자료 : 취급 보관시안전관리등급결정에대한근거자료참조 (2) 취급 보관설비및시설현황유전자변형생물체를개발하거나이용하는실험시사용되는생물안전작업대 (BSC), 고압증기멸균기, 병원체보관장비등을기술하고, LMO법에의거하여기신고또는허가된연구시설설치 운영확인자료를첨부한다. 예 ] NIBRG-14를이용하는 BL 2+ 연구시설안전관리에대한세부사항은 WHO Laboratory Biosafety Manual (Third edition 2004, WHO Geneva) 에명시된 BL 2 시설설비조건과부가적인생물안전장비, 개인보호장비, 기타주의사항등을포함함. 1. NIBRG-14 바이러스가사람이나동물바이러스와혼합되는것을방지하는자체실험절차마련 2. 실험실출입제한하고입구에실험중임을표시 3. 반드시생물안전작업대 (Bio Safety Cabinet: BSC) 을사용하며가능하다면음압이있는 BL 2 연구시설내에서별도분리구역내생물안전작업대사용 (BL 2+) Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 115

4. 공기가외부공간이나환경으로배출되기전에여과할수있게 HEPA filter를사용 5. BL 2+ 연구시설에서배출된모든폐기물의정화시스템 (decontamination system) 구축 ; 고압증기멸균기등멸균처리절차마련 6. 가스-사용훈증소독등비준된정화과정을통하여연구시설지역의정화 7. 실험복 ( 전신보호복 ), 장갑, 호흡보호장비 (N95 마스크등 ), 안면보호대등실험에적합한개인보호장비착용 8. 감염사고발생에대비한치료및응급조치대책마련 9. 실험종사자에게항바이러스예방적조치이행 ( 인플루엔자백신접종등 ) - LMO 통합고시별지제9-5 호서식에의거한연구시설설치 운영신고확인서복사본또는 PDF 파일첨부 - LMO 법시행규칙별지제23호서식에의거한연구시설설치 운영허가서복사본또는 PDF 파일첨부 - 해당실험실에설비된생물안전장비목록을기술하거나관련사진및설명자료첨부 (3) 노출시응급처치, 비상조치등안전관리수칙 유전자변형생물체를이용하는실험중비의도적사고등으로 인하여시험 연구자가유전자변형생물체에노출되거나유전자 변형생물체가유출된경우를대비하기위한응급조치, 유전자 116 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

변형생물체취급에대한주의사항및위해예방조치등안전관 리수칙을기술한다. 예 ] 연구원실험실생물안전지침 에수록된실험실생물안전사고대응 및응급조치준수사항을이행함. 제 5 장실험실생물안전사고대응및응급조치 미생물및감염성물질을취급하던중실험종사자의신체가직접노출되거나흡입, 섭취등의사고, 병원체를접종한실험동물에물리거나감염성물질이유출되는등의생물안전사고는이러한물질들을취급하는곳에서는언제나발생가능하다. 생물안전사고가발생한경우, 실험종사자는응급조치후팀장및팀생물안전관리자에게즉시보고하여적절한의료적처치를받을수있는관련절차등이신속하게수행될수있도록해야한다. 1. 실험자에대한조치가. 감염성물질등이안면부에접촉되었을때 1) 눈에물질이튀거나들어간경우, 즉시 Eye washer 또는흐르는깨끗한물을사용하여 15분이상세척한다. 2) 필요한경우샤워실을이용하여전신을세척한다. 3) 발생사고에대해팀장에게즉시보고하고필요한조치를받는다. 4) 팀장은기관생물안전관리책임자또는의료관리자에게보고하고취급하 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 117

였던감염성물질을고려한적절한의학적조치등을취한다. 나. 감염성물질등이안면부를제외한신체에접촉되었을때 1) 장갑또는실험복등착용하고있던개인보호구를벗는다. 2) 즉시흐르는물로세척또는샤워한다. 3) 오염부위를소독한다. 4) 발생사고에대해팀장에게즉시보고하고필요한조치를받는다. 5) 팀장은기관생물안전관리책임자또는의료관리자에게보고하고취급하였던감염성물질을고려한적절한의학적조치등을취한다. 다. 감염성물질등을섭취한경우 1) 즉시실험복을벗고즉각적인의료적처치가가능하도록의료관리자에게연락하여조치에따르고의료기관으로이송한다. 2) 섭취한물질과사고사항을즉시기록하여치료에도움이될수있도록관련자들에게전달한다. 라. 기타물질또는실험중부상을당했을경우 1) 발생한사태에대하여팀장및의료관리자에게즉시보고하여필요한조치를받는다. 2) 팀장은기관생물안전관리책임자또는의료관리자에게보고하고취급하였던감염성물질을고려한적절한의학적조치등을취한다. 118 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

2. 사고상황에대한조치미생물및감염성물질에관련된연구를수행하는각각의실험실에는생물학적유출처리키트 (biological spill kit) 등을비치하여발생할수있는유출사고에대비하도록한다. 키트는유출사고에빠르게대처할수있도록필요한물품들로구성되어있다. 기본물품으로소독제, 멸균용봉투, 종이타월, 소독제, 멸균용봉투, 종이타월, 개인보호구 ( 일회용장갑, 보안경, 마스크등 ) 및깨진유리조각을집을수있는핀셋, 빗자루등의도구도필요하다. 또한화학유출처리키트 (chemical spill kit) 또는범용유출처리키트 (universal spill kit) 등을함께구비할수있다. 가. 실험구역내에서감염성물질등이유출된경우 1) 종이타월이나소독제가포함된흡수물질등으로유출물을천천히덮어에어로졸발생및유출부위가확산되는것을방지한다. 2) 유출지역에있는사람들에게사고사실을알려실험자들이즉시사고구역을벗어나게하고팀장및관리자에게보고하고지시에따른다. 3) 사고시발생한에어로졸이가라앉도록 20 30분간방치한후, 개인보호구를착용하고사고지역으로돌아간다. 4) 장갑을낀손으로핀셋을사용하여깨진유리조각등을집고, 소형의날카로운기기 ( 주사바늘등 ) 는손상성폐기물전용용기에넣는다. 5) 유출된모든구역에효과적으로미생물을비활성화시킬수있는소독제를첨가하고 20분이상그대로둔다. 6) 종이타월및흡수물질등은의료폐기물전용용기에넣는다. 7) 소독제를사용하여유출된모든구역을닦는다. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 119

8) 청소가끝난후처리작업에사용했던기구등은의료폐기물전용용기에넣어처리하거나재사용할경우소독및세척한다. 9) 장갑, 작업복등오염된개인보호구는의료폐기물전용용기에넣어처리하고, 노출된신체부위를비누와물을사용하여세척하고, 필요한경우소독및샤워등으로오염을제거한다. 나. 생물안전작업대내에서감염성물질등이유출된경우 1) 생물안전작업대의팬을가동시킨후유출지역에있는사람들에게사고사실을알리고팀장및관리자에게보고한다. 2) 장갑, 호흡보호구등개인보호구를착용하고 70% 에탄올등의효과적인소독제를사용하여작업대벽면, 작업표면및이용한장비들에뿌리고적정시간동안방치해둔다. 3) 종이타월을사용하여소독제와유출물질을치우고모든실험대표면을닦아낸다. 4) 생물안전작업대에서모든물체들을제거하기전에벽면에묻어있는모든물질을살균처리하고 UV램프를작동시킨다. 5) 청소작업이끝난후처리작업에사용했던기구등은의료폐기물전용용기에넣어처리하거나재사용할경우소독및세척한다. 6) 장갑, 작업복등오염된개인보호구는감염성폐기물전용용기에넣어폐기하고, 노출된신체부위를비누와물을사용하여세척하며필요한경우소독및샤워등으로오염을제거한다. 7) 만일유출된감염성물질이생물안전작업대안으로들어간경우, 생물안전관리자에게알리고지시에따른다. 120 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

(4) 보관표시및폐기방법유전자변형생물체의특성을유지하고안전하게보관할수있도록보관방법및표시사항을기술한다. 또한유전자변형생물체를폐기하는경우, 유전자변형생물체의생존능력을완전히제거하고불활성화할수있는폐기방법을기술한다. 예 ] 보관방법 - 연구시설내지정구역에시건장치된 -70 냉동고에 NIBRG-14 바이러스를보관하고해당유전자변형생물체가보관및취급되는관련장비에생물재해표시를부착하여위해성을고시함. - NIBRG-14 바이러스보관용기에는해당유전자변형생물체의명칭, 관리번호, 균주정부등을표시사항을표기하고, LMO 법시행규칙별지제29호서식 유전자변형생물체보관관리대장 및별지제27호서식 유전자변형생물체개발관리대장 에입고, 출고, 재고수량등을기록 보관함. - NIBRG-14 바이러스및관련실험으로인한개발유전자변형생물체의취급 관리를위하여전담관리자를지정하여운영하고있음. - NIBRG-14 바이러스및관련실험으로인한개발유전자변형생물체의취급 관리를위한설비의적정한유지를위한점검등관리를이행함. 폐기방법 - NIBRG-14 바이러스, 개발된유전자변형생물체및관련혼합오염된실험재료등은고압증기멸균등의방법으로완전히사멸한후 폐기물관리법 에의거한의료폐기물처리방법에따라처리함. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 121

(5) 취급 보관에관여하는인력정보유전자변형생물체를개발하거나이용하는실험에참여하여유전자변형체를취급하고보관하는시험 연구자및관리책임자의성명, 소속, 직위, 학력, 연락처, 실험경험및생물안전교육이수여부등에대하여기술한다. 예 ] 유전자재조합바이러스 NIBRG-14 바이러스를이용하는실험에참여하여유전자변형체를취급하고보관하는시험 연구자인력정보는아래와같음. 소속 성명 직위학력연락처실험경험 생명 공학연구소 백신개발팀 * ** 책임연구원선임연구원연구원연구원 박사박사석사석사 380-1234 380-1235 380-1236 380-1237 3년 2년 1년 6개월 1년 6개월 * ; 연구책임자 ** ; NIBRG-14 바이러스전담관리자본실험에참여하는연구원모두기관생물안전교육을이수하였음. 122 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

다. 유전자변형미생물의동 식물접종에관한자료 ( 해당되는경우 ) (1) 접종대상동 식물의명칭및분류학적특성유전자변형미생물을접종할대상동 식물의명칭및분류학적특성, 유사한목적으로이용된사례등에대하여기술한다. 예 ] 실험목적 : 고병원성 AI 바이러스 (A/Vietnam/1194/2004) 의고병원성에관여하는 polybasic stretch amino acids가결여된 HA segment를포함하도록하여병원성이낮게 rescue된 reassortants NIBRG-14주의병원성및면역원성확인시험을위하여주로닭과페렛, 마우스등에접종실험을실시함. 실험동물 : - 4주 ~8주령 SPF(specific-pathogen-free) 인닭 (Leghorn, Gallus gallus var. domesticus 등 ) - 5주 ~6주령 female BALB/c 마우스 - 4개월 ~8개월페렛 유사연구사례 > - 한국에서분리된 H3 조류인플루엔자바이러스의잠재적병원성평가를위하여닭, 마우스에접종하여해당바이러스복제를조사함 (Journal of General Virology, 2008. 89:949-957). - 역전사유전자기법으로생산된 H5N1 인플루엔자백신의면역력및효능성을확인하기위하여 4~6 개월페렛을이용한접실험실시함 (Journal of Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 123

Infectious Diseases, 2006. 194:159-167). - 역전사유전자기법으로생산된 H5N1 candidate reassortant NIBRG-12 의병원성시험을위하여 6주령닭과페렛에접종실험실시함 (Vaccine, 2005, 23:2943-2952). - Production of pilot lots of inactivated influenza vaccines from reassortant derived from avian influenza viruses; Interim biosafety risk assessment, 2003, WHO (2) 실험및폐기방법 유전자변형미생물을접종하는실험의과정및방법, 안전준수 수칙등을기술하고, 실험동물의폐기방법을기술한다. 예 ] NIBRG-14 바이러스의병원성시험 4주 ~8주령 SPF 닭 (Leghorn, Gallus gallus var.domesticus 등 ) 에 NIBRG-14주배양 1/10 희석액 0.2ml 접종하여 10일간관찰함. * 병원성확인시험을위한바이러스접종량은 Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines 2000' 및 국제수역사무국 규정에준하여결정함. * AI 바이러스의고병원성확인시험 ; 국제수역사무국 (OIE) 규정분리된바이러스를 4주 ~8주령 SPF 닭에접종하고 10일간관찰하여, 8마리중 6마리이상 ( 치사율 75%) 의폐사를나타내는경우를고병원성으로판단함. 124 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

유전자변형미생물접종실험동물시 SOP 및안전수칙을준수하여시행함. 폐기방법 실험중발생하는실험재료및동물등실험폐기물은고압증기멸균등불 활성화하여 폐기물관리법 및실험동물처리규정에따라처리함. (3) 동 식물밀폐안전관리등급및시설관련사항유전자변형미생물을동 식물에접종하는실험의생물안전을위하여결정한연구시설안전관리등급을제시하고, 결정에대한근거및자료를기술한다. 예 ] 인플루엔자참조백신 NIBRG-14주의병원성확인및면역력시험을위하여아래의실험동물을이용한접종실험은 LMO 법에의거하여신고된 BL 2 연구시설 (BL 2+) 에서실시하고자함. 단, NIBRG-14주와 wild-type H5N1 바이러스주를이용하는동물실험을수행할경우, 반드시 LMO 법에의거하여허가된실험동물실을포함한생물안전 3등급 (BL 3) 연구시설에서개인호흡보호장비, 전신보호복등적절한개인보호장비를착용하고기관의 생물안전 3등급연구시설운영지침 을준수하여수행함. 출처 : Production of pilot lots of inactivated influenza vaccines from reassortant derived from avian influenza virus, 2003, WHO( 첨부 ) Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 125

표. 판데믹백신생산에대한특성및적정밀폐시설제안 백신바이러스 HA receptor 실험동물대상 * 생산밀폐시설제안 고병원성바이러스유래 H5, H7 재조합바이러스 α2,3 residues Ferret, Chicken, Sequence, Plaquing, Egg embryo BSL 2 + 비병원성바이러스유래 H5, H7 재조합바이러스 α2,3 residues Ferret, Chicken, Sequence, Plaquing, Egg embryo BSL 2 + Non-H5, H7 재조합바이러스 α2,3 residues Ferret BSL 2 + Non-H5, H7 재조합바이러스 α2,6 residues Ferret BSL 2 + H5, H7 고병원성바이러스 α2,3 residues 적용안됨 BSL 3 + H5, H7 비병원성바이러스 α2,3 residues Ferret, Chicken, Sequence, Plaquing, Egg embryo BSL 2 + Non-H5, H7 바이러스 α2,3 residues Ferret BSL 2 + Non-H5, H7 바이러스 α2,6 residues Ferret BSL 2 + * WHO 참조실험실에의해수행되는실험출처 : WHO biosafety risk assessment and guidelines for the production and quality control of human influenza pandemic vaccines 126 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

6. 생물학적위해성평가 현대생명공학기술을이용하여병원성, 독소생성이나약제내성유전자등을가지는위해가능성이있는유전자변형생물체를개발하거나실험하는과정은상대적으로인체위해발생가능성과위해심각성이크다고할수있다. 이러한이유로위해가능성이큰유전자변형생물체를취급하는경우에는반드시과학적근거를바탕으로한생물학적위해성평가 (biological risk assessment) 를실시하고그결과추정된위해를제거하거나최소화할수있는연구시설안전등급의결정, 생물안전장비및개인보호장비등을생물안전을확보하는것이중요하다. 유전자변형생물체개발및실험의위해성평가과정에는해당되는숙주, 공여체, 도입유전자, 유전자변형생물체의특성, 이용되는현대생명공학기술등실험내용과실험환경및안전관리등위험요소들이평가및심사시고려되어야한다. 병원성미생물를이용한실험의경우생물학적위해성평가과정은다음과같다. 1) 위험요소확인 (Hazard identification) 위험요소확인과정은유전자재조합실험을수행하는과정에어 떠한위험요소가있는지를확인하는과정이다. 위험요소는해 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 127

당유전자변형생물체및미생물요소, 수행하고자하는실험 내용및과정, 생물안전관리등실험환경요소, 실험종사자의 생리학적또는면역학적특성및생물안전이행요소등을포함한다. 2) 위험요소특성 (Hazard Characterization) 위험요소특성단계는해당유전자변형생무레및병원체정보, 실험내용및실험실환경과실험종사자의건강상태및실험습관등의상호관련성을포함하여위험요소의특성을기술하는과정이다. 미생물요소 : 해당유전자변형생물체및미생물의감염량및전파경로, 병원성및독성, 환경내안전성, 유전물질전달성, 항생제내성양상, 숙주의범위, 미생물위험군류, 실험실-획득감염정보등 실험종사자요소 : 실험종사자의면역상태, 연령, 기저질환, 질병에대한과거력, 개별숙주의감수성, 임신여부, 상재균총의특성등 실험환경요소 : 실험시병원체의농도및양, 노출빈도및기간, 에어졸발생여부, 병원성매개체의접촉, 동물실험및유전자재조합실험여부, 확보된생물안전밀폐연구시설등급, 안전및응급조치등 128 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

3) 노출평가 (Exposure assessment) 실험종사자에게병원체에실질적으로노출된양또는예상치에대한정성적, 정량적평가를하는과정이다. 즉, 병원체또는독소의농도, 노출량, 빈도및기간, 숙주의면역수준및병원체에대한감수성, 발생하는위해그리고용량-반응분석을통해얻어진정보등을이용하여병원체또는독소의위해가능성을정성적, 정량적으로평가하는것이다. 4) 위해특성 (Risk characterization) 위해특성단계는위해성평가의마지막단계로위험요소확인에서노출평가까지의정보를통합하여위해발생가능성과건강에미치는심각성을정성적으로또는정량적으로위해추정하는과정이다. 위해추정을통하여결과적으로해당실험의위해정도가낮음, 중간, 높음, 매우높음으로나타낼수있다. 이러한해당실험의위해특성결과는발생가능한위해를제거하거나최소화할수있는위해관리와연계되어적합한연구시설밀폐등급결정및실험실생물안전관리를수립하는데활용된다. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 129

부록 II 1. LMO 통합고시제9장 / 132 2. 별표 3-2 승인제외대상약제내성유전자 / 139 3. 별표 9-5 개발 실험위해성평가자료목록 / 144 4. 별지제25호서식 LMO 개발실험승인신청서 / 148 5. 별지제3-1호서식시험 연구개요서 / 149 6. 별지제9-2호서식개발 실험평가자료제출표 / 150 7. 별지제3-3호서식자료보완기간연장요청서 / 151 8. 별지제9-3호서식승인사항변경승인신청서 / 152 9. 별지제9-5호서식연구시설설치 운영신고확인서 / 153 10. 별지제23호서식연구시설설치 운영허가서 / 154 11. 별지제27호서식 LMO 개발관리대장 / 155 12. 별지제28호서식 LMO 운반관리대장 / 156 13. 별지제29호서식 LMO 보관관리대장 / 157 14. 기관생물안전위원회생물안전심의결과서양식 / 158 15. 미생물의위험군분류 / 159

부록 1. LMO 통합고시 제 9 장 보건복지부고시제 2007-105 호 제 9 장연구시설의설치 운영허가 신고및실험의승인 제 2 절개발 실험에대한승인 제9-9조 ( 승인대상개발 실험 ) 1제9-3조에의한연구시설의설치 운영에대한허가를받거나, 제9-5조에의한신고를한자는연구시설의안전관리등급별로유전자변형생물체를개발하거나실험을실시할수있다. 다만, 다음각호의어느하나에해당하는경우에는질병관리본부장의승인을얻어야한다. 1. 종명까지명시되어있지아니하고인체병원성여부가밝혀지지아니한미생물을이용하는경우 2. 척추동물에대하여몸무게 1kg당 50% 치사독소량이 100ng 미만인단백성독소를생산할능력을가진유전자를이용하는경우. 해당단백성독소는별표 3-1과같다. 3. 자연적으로발생하지아니하는방식으로생물체에약제내성유전자를의도적으로전달하도록하는경우. 다만, 별표 3-2에해당하는약제내성유전자의경우를제외한다. 132 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

4. 국민보건상국가관리가필요한병원성미생물을이용하는경우. 해당병원성미생물은전염병예방법시행규칙별표 1과같다. 2제1항에도불구하고다음각호의어느하나에해당하는개발 실험을하고자하는경우영제23조제7항에의하여유전자변형생물체의용도에따라관계중앙행정기관의장의승인을얻어야한다. 1. 포장시험등환경방출과관련한실험을하는경우 2. 그밖에산업자원부장관이바이오안전성위원회의심의를거쳐위해가능성이크다고인정하여고시한유전자변형생물체의개발또는실험을하는경우 제9-10조 ( 개발 실험의승인 ) 1제9-9조제1항에의한유전자변형생물체의개발 실험승인을얻고자하는자는규칙별지제25호서식의유전자변형생물체개발 실험승인신청서에다음각호의서류 20부및전자문서 1부를첨부하여질병관리본부장에게제출하여야한다. 1. 별지제3-1호서식에의한시험 연구개요서 ( 국가연구개발사업의연구개발계획서로대체할수있다 ) 2. 별지제9-2호서식의개발 실험위해성평가자료제출표 3. 별표 9-5의규정에의한개발 실험의위해성평가자료및그요약보고서 2제9-9조제2항제1호에의한유전자변형생물체의개발 실험승인을얻고자하는자는규칙별지제25호서식의유전자변형생물체개 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 133

발 실험승인신청서에다음각호의서류 20부및전자문서 1부를첨부하여과학기술부장관또는제9-1조제2항각호의관계중앙행정기관의장또는위임기관의장에게제출하여야한다. 다만, 농업용유전자변형생물체의포장시험등환경방출과관련한실험을하는경우에는제4-19조에의한다. 1. 별지제3-1호서식에의한시험 연구개요서 2. 관계중앙행정기관의장등이정하여고시하는위해성평가자료 3제9-9조제2항제2호에의한유전자변형생물체의개발또는실험승인을얻고자하는자는규칙별지제25호서식의유전자변형생물체개발 실험승인신청서에산업자원부장관이별도로정하여고시하는위해성평가자료를관계중앙행정기관의장등에게제출하여야한다. 4제1항제3호, 제2항제2호및제3항에의한평가자료는기재된순서에따라자료별색인번호및쪽을표시하여야하고, 요약보고서가외국어일때에는원문과번역문을각각첨부하여야하며, 다음각호의어느하나에해당하여야한다. 1. 전문학술지에게재된자료 2. 우수실험실관리기준 (GLP) 에의하여시험한자료 3. 대학또는연구기관등국내외전문기관에서시험한것으로기관의장이발급하고그내용 ( 이경우연구기관의시험시설개요, 주요설비, 연구인력의구성, 시험자의연구경력등이기재되어야함 ) 을검토하여타당하다고인정할수있는자료 134 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

5질병관리본부장또는관계중앙행정기관의장등 ( 이하 승인기관의장 이라한다 ) 은제1항부터제4항까지의규정에도불구하고평가자료의작성이이론적 기술적으로불가능하거나작성이가능하더라도작성하는것이불필요하다고인정되는경우에는해당자료의제출을면제할수있다. 6개발 실험승인을신청하고자하는자는승인기관의장에게자료제출범위등에대한사전상담을요청할수있다. 7승인기관의장은제1항부터제3항까지의의한승인신청서를접수한날부터 60일이내에다음각호의사항에대하여심사하고제9-14조에의한유전자변형생물체개발 실험전문가심사위원회의의견을들어승인여부를결정하고, 승인여부를신청인에게통지하여야한다. 이때개발 실험을승인하는경우규칙별지제26호서식의유전자변형생물체개발 실험승인서를교부하여야하며승인하지아니하는경우에는그사유를통지하여야한다. 1. 신청된유전자변형생물체의개발 실험에대한위해성 2. 신청내용의적합성 3. 개발 실험계획의적정성 제 9-11 조 ( 자료의보완등 ) 1 승인기관의장은다음각호의어느하 나에해당하는경우 30 일이내에서보완에필요한기간을정하여신 청인에게자료보완을요구할수있으며, 자료보완에소요된기간은 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 135

제9-10조제7항의소요기간에는산입되지아니한다. 1. 제출된자료가미비한경우 2. 평가자료에문제가있다고의심되어세부적인자료의검토가필요한경우 2승인기관의장은신청인이제1항에의한기간내에자료를보완하지아니한때에는다시보완을요구하여야한다. 이경우보완의기간은 10일로한다. 3승인기관의장은제1항및제2항에도불구하고보완요구를받은신청인이별지제3-3호서식의자료보완기간연장요청서에보완에필요한기간을명시하여기간연장을요청하는경우그사유를고려하여보완의기간을정할수있다. 4승인기관의장은신청인이제1항부터제3항까지에의한기간내에자료를보완하지아니하거나보완내용이불충분하여검토가불가능한경우에는그이유를명시하여신청인에게승인신청서를반려할수있다. 5승인기관의장은제출된자료의심사를위하여필요한경우신청인에게설명을요구하거나출석을요구할수있으며, 소속공무원으로하여금신청인의연구시설에출입하여확인하게할수있다. 제 9-12 조 ( 승인사항의변경승인 ) 1 제 9-10 조제 7 항에의한개발 실 험승인을받은자가승인받은사항을변경하고자하는경우에는별 136 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

지제9-3호서식의유전자변형생물체개발 실험승인사항변경승인신청서에다음각호의서류를첨부하여승인기관의장에게제출하여야한다. 1. 규칙별지제25호서식의개발 실험승인서 2. 변경내용을증명하는서류 2승인기관의장은제1항에의한변경승인신청서를접수한날부터 30일이내에변경승인여부를결정하고, 별지제9-4호서식의유전자변형생물체개발 실험승인사항변경승인서를교부하여야하며변경승인하지아니하는경우에는그사유를통지하여야한다. 제9-13조 ( 승인취소 ) 1승인기관의장은다음각호의어느하나에해당하는경우개발 실험의승인및승인사항의변경승인을취소할수있다. 1. 유전자변형생물체의개발 실험이승인된범위내에서이행되지아니하였거나변경승인을받지아니하고변경했을경우 2. 승인을받은시험 연구용유전자변형생물체의개발 실험이국민의건강과생물다양성의보전및지속적인이용에위해를미치거나미칠우려가있다는사실이밝혀진경우 2승인기관의장은제1항에의해승인취소할경우에는유전자변형생물체의개발 실험을하는자에게미리취소사유를통지하고, 10 일이상의기간을정하여소명할수있는기회를제공하여야한다. Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 137

제9-14조 ( 전문가심사위원회의구성 운영 ) 1승인기관의장은개발 실험승인여부를결정함에있어다음각호에대한자문및전문성확보를위하여전문가심사위원회를구성 운영할수있다. 1. 국민의건강과생물다양성의보존및지속적인이용에미칠영향 2. 신청자가제출한개발 실험의위해성평가자료심사 3. 개발 실험의위해성평가목록 4. 그밖에승인에필요한사항 2전문가심사위원회의구성 운영에대한세부적인사항은승인기관의장이정한다. 138 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 2. 승인제외대상약제내성유전자 [ 별표 3-2] 승인제외대상약제내성유전자 ( 제 3-1 조제 1 항제 3 호관련 ) 1. Ampicillin, chloramphenicol, hygromycin, kanamycin, streptomycin 또는 tetracycline 내성유전자 ( 부표에의한인정숙주-벡터계를이용한유전자변형미생물의수입또는개발 실험인경우에한한다 ) * 인정숙주-벡터계 라함은생물학적으로안전성이높다고인정되는숙주와벡터의조합을말한다 2. Kanamycin, neomycin 내성유전자 (npt II) 또는 hygromycin 내성유전자 (hph)( 해당약제내성유전자를선발표지유전자로포함 한유전자변형식물의수입또는개발 실험인경우에한한다 ) Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 139

[ 별표 3-2 부표 ] 인정숙주 - 벡터계 1. 자연조건에서의생존력이낮은숙주와숙주의존성이높은벡터를조합시켜이용함으로써환경으로의전파및확산가능성이낮거나유전학적, 생리학적및생태학적특성에기초하여사람에게안전성이높다고인정되는숙주-벡터계 가. Escherichia coli K12 또는 Escherichia coli B 숙주-벡터계숙주는항상 Escherichia coli K12, Escherichia coli B 또는이들의유도체로서접합능력이있는플라스미드를포함하지않고형질도입능력이있는박테리아파아지를갖고있지않으며벡터는비접합성플라스미드또는박테리오파아지및유도체인숙주-벡터계 나. Bacillus subtilis 또는 Bacillus licheniformis 숙주-벡터계고초균인 Bacillus subtilis 또는 B. licheniformis의유도체로서영양요구성돌연변이또는포자형성이 10-7 미만으로일어나는균주를숙주로하고접합에의한전달성을갖지않는플라스미드또는박테리오파지를벡터로하는숙주-벡터계 140 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

다. Saccaromyces cerevisiae 숙주-벡터계효모인 Saccharomyces cerevisiae를숙주로하며 S. cerevisiae의플라스미드, 미토콘드리아또는이들의유도체를벡터로사용하는숙주-벡터계 라. Pseudomonas putida 숙주 - 벡터계 Pseudonomas putida strain KT2440 과플라스미드 pkt262, pkt263, pkt264 를사용하는숙주 - 벡터계 마. Streptomyces 숙주-벡터계 Streptomyces coelicolor, S. lividans, S. parvulus, S. griseus strain과인정된벡터인 Streptomyces 플라스미드 SCP2, SLP1.2, pij101, actinophage phi C31과이들의유도체를사용하는숙주-벡터계 바. Neurospora crassa 숙주 - 벡터계 공기중산포를방지하기위하여변형된 Neurospora crassa 를 숙주로하고이들의유도체를벡터로사용하는숙주 - 벡터계 사. Agrobacterium tumefaciens 숙주 - 벡터계 Agrobacterium tumefaciens 를숙주로사용하여 nontumorigenic disarmed Ti 플라스미드를벡터로사용하는숙주 - 벡터계 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 141

2. 유전적소실등으로인하여특수한배양조건이외에는생존율이매우낮은숙주와숙주의존성이특히높은벡터를조합한경우로서환경으로의전파및확산이방지된다는것이확인된숙주-벡터계 가. Escherichia coli K12 숙주 - 벡터계 다른생물체로의유전자재조합분자의전달성또는숙주의생존율 이 10-8 미만으로일어나는숙주 - 벡터계 숙 주 벡 터 Escherichia coli K12 strain chi 1776 DP50supF Escherichia coli K12 DP50supF DP50 또는 DP50supF DP50 또는 DP50supF DP50 또는 DP50supF DP50supF DP50 또는 DP50supF DP50 또는 DP50supF psc101, pmb9, pbr313, pdh24, pbr322, pbr325, pbr327, pgl101, phbl Escherichia coli/ S. cerevisiae hybrid plasmid: YIp1, YEp2, YEp4, YIp5, YEp6, YRp7, YEp20, YEp21, YEp24, YIp25, YIp26, YIp27, YIp28, YIp29, YIp30, YIp31, YIp32, YIp33 λgt WES λb λgt ZJ vir λb λgt ALO λb Charon 3A Charon 4A Charon 16A Charon 21A Charon 23A Charon 24A 비고 : Escherichia coli K12 strain chi 2447, chi 2281 은 DP50 또는 DP50supF 균주와의사용이허용된람다벡터와함께사용이가능하다. 142 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

나. Saccharomyces cerevisiae 숙주 - 벡터계 숙 주 벡 터 ste-vc9이불활성화된변이주 ( 불임종 ) Saccharomyces cerevisiae SHY1, SHY2, SHY3, SHY4 YIp1, YEp2, YEp4, YIp5, YEp6, YRp7, YEp20, YEp21, YEp24, YIp25, YIp26, YIp27, YIp28, YIp29, YIp30, YIp31, YIp32, YIp33 다. Bacillus subtilis 숙주 - 벡터계 숙 주 벡 터 포자를생성할수없는변이주 Bacillus subtilis ASB 298 pub110, pc194, ps194, psa2100, pe194, pt127, pub112, pc221, pc223, pab124 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 143

부록 3. 개발 실험위해성평가자료목록 [ 별표 9-5] 개발 실험의위해성평가자료의제출범위 ( 제 9-10 조제 1 항제 3 호관련 ) 1. 유전자변형생물체의용도에관한자료가. 개발 실험의배경및목적나. 주요용도다. 사용이승인된국가및승인용도 2. 유전자변형생물체에관한자료가. 명칭나. 도입유전자에의하여부여된특성다. 숙주또는근연종과의생물학적특성의차이점라. 병원성, 독소생산성, 알레르기유발성및기타유해생리활성물질생산가능성마. 유전자변형생물체내도입유전자의위치및복제수바. 도입유전자에의해생성되는단백질의발현정도및측정방법사. 유전자변형에사용된벡터의존재여부및제거방법아. 검출및확인방법 144 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

3. 숙주에관한자료가. 명칭, 유래및분류학적특성나. 개발 실험하고자하는유전자변형생물체와유사한용도의유전자변형생물체의숙주로이용된사례다. 숙주및근연종에서의독소생산성, 알레르기유발성및기타유해생리활성물질생산성여부라. 미생물인경우, 병원성존재여부및알려진병원체와의관련성 4. 공여체에관한자료가. 명칭, 유래및분류학적특성나. 개발 실험하고자하는유전자변형생물체와유사한용도의유전자변형생물체의공여체로이용된사례다. 공여체및근연종에서의독소생산성, 알레르기유발성및기타유해생리활성물질생산성여부라. 미생물인경우, 병원성존재여부및알려진병원체와의관련성 5. 유전자재조합특성에관한자료가. 유전자변형에사용된현대생명공학기술나. 벡터에관한자료 (1) 명칭, 기능및유래된생물체 (2) 구성요소및도입유전자를포함한지도 (3) 병원성, 독소등위해염기서열의존재여부 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 145

(4) 다른생물체로의전달가능성및숙주범위 (5) 선발표지유전자다. 도입유전자에관한자료 (1) 도입유전자의기능및특성 ( 해당되는경우 ) ( 가 ) 제9-9조제1항제1호의규정에해당하는개발 실험을하는경우, 도입유전자의기능, 특성및위해발생가능성 ( 나 ) 제9-9조제1항제2호의규정에해당하는개발 실험을하는경우, 도입유전자가생산하는독소의독력, 적용범위및생화학적특성 ( 다 ) 제9-9조제1항제3호의규정에해당하는개발 실험을하는경우, 도입유전자의발현에의하여감수성이저하되는항생제및교차내성대상항생제종류, 해당항생제의치료적요법및사용빈도 ( 라 ) 제9-9조제1항제4호의규정에해당하는개발 실험을하는경우, 도입유전자로인해유발되는질병, 감염대상범위및감염성자료 ( 전파경로등 ) (2) 염기서열 ( 위해염기서열의존재여부포함 ) (3) 조절인자및유전자기능에영향을주는기타인자 6. 안전관리에관한자료가. 시험 연구기관내생물안전위원회의심사결과에관한자료나. 취급 보관방법에관한자료 (1) 취급 보관시안전관리등급결정에대한근거 146 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

(2) 취급 보관설비및시설현황 (3) 노출시응급처치, 비상조치등안전관리수칙 (4) 보관표시및폐기방법 (5) 취급 보관에관여하는인력정보 ( 성명, 소속, 직위, 학력, 연락처, 실험경험및생물안전교육이수여부 ) 다. 유전자변형미생물의동 식물접종에관한자료 ( 해당되는경우 ) (1) 접종대상동 식물의명칭및분류학적특성 (2) 실험및폐기방법 (3) 동 식물밀폐안전관리등급및시설관련사항 상기서류작성시주의사항상기서류는다음각호의어느하나에해당하여야하며, 기재된순서에따라자료별색인번호및쪽을표시하여야하고, 요약보고서가외국어일때에는원문과번역문을각각첨부하여야함. (1) 전문학술지에게재된자료 (2) 우수실험실관리기준 (GLP) 에의하여시험한자료 (3) 대학또는연구기관등국내외전문기관에서시험한것으로해당기관의장이발급하고그내용 ( 이경우연구기관의시험시설개요, 주요설비, 연구인력의구성, 시험자의연구경력등이기재되어야함 ) 을검토하여타당하다고인정할수있는자료 (4) 외국에서유전자변형생물체의위해성심사당시제출된자료. 이경우그외국정부가유전자변형생물체의사용을승인하였음을확인할수있는자료 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 147

1상 호 신청인 3사업장주소 ( 시험연구기관 ) 4대표자성명 6과 제 명 7연 구 기 간 성 명 8연구책임자 주 소 전화 번호 시설등록번호 9연구시설 주 소 생물 안전 관리책임자 부록 4. LMO 개발 실험승인신청서 유전자변형생물체개발 실험승인신청서 2 사업자등록번호 ( 법인등록번호 ) 5 전화번호 직 [ 별지제 25 호서식 ] ( 신규, 계속, 변경 ) 년월일 ~ 년월일 소 속 위 이메일주소안전관리등급 성 BL- 명 처리기간 60일 1. 종명까지명시되어있지아니하고인체병원성여부가밝혀지지아니한미생물을이용 2. 척추동물에대하여보건복지부장관이고시하는기준이상의단백성독소를생산할능력을가진유전자를이용 10 심사요청사항 ( 해당사항모두 표시 ) 3. 자연적으로발생하지아니하는방식으로생물체에약제내성유전자를의도적으로전달 ( 보건복지부장관이안전하다고인정하여고시하는경우는제외됩니다 ) 4. 국민보건상국가관리가필요하다고보건복지부장관이고시하는병원미생물을이용 5. 포장시험 ( 圃場試驗 ) 등환경방출과관련된실험 6. 그밖에산업자원부장관이바이오안전성위원회의심의를거쳐위해가능성이크다고인정하여고시한유전자변형생물체의개발또는실험 유전자변형생물체의국가간이동등에관한법률 제 22 조제 3 항, 동법시행령제 23 조제 7 항및동법시행규칙제 14 조제 4 항의규정에따라위와같이유전자변형생물체의개발 실험승인을신청합니다. 년월일 신청인 ( 서명또는인 ) 질병관리본부장 귀하 148 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 5. 시험 연구개요서 [ 별지제3-1호서식 ] 시험 연구개요서 수입승인용 수입신고용 개발 실험승인용 1과제명 2 연구기간 년월일 ~ 년월일 3 연구 책임자 성명 소속 전화번호 직위 4 연구비 정부지원 : ( 부 처 청 ) 기관부담 기타 : 5 색인단어 (5 개내외 ) 국문 영문 연구의필요성 연구목표 연구내용및범위 연구방법 기대성과및활용방안 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 149

부록 6. 개발 실험평가자료제출표 개발 실험의위해성평가자료제출표 1 2 3 4 5 6 가나다가나다라마바사아자가나다라가나다라마가 나 다 가 나 다 자료번호 * (1) (2) (3) (4) (5) (1) (2) (3) (1) (2) (3) (4) (5) (1) (2) (3) 150 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집 ( 가 ) ( 나 ) ( 다 ) ( 라 ) ( 마 ) ( 바 ) 구분개발실험 * 자료번호는별표 9-5의번호임.

부록 7. 자료보완기간연장요청서 자료보완기간연장요청서 [ 별지제 3-3 호서식 ] 신 1 상 호 2 사업자등록번호 ( 법인등록번호 ) 청 인 3 대표자성명 5 사업장주소 4 주민등록번호 6 전화번호 7 자료보완사항 8 기간연장요청사유 9 자료제출기한 기간연장전 기간연장후 유전자변형생물체의국가간이동등에관한통합고시 제 3-2 조제 5 항, 제 4-3 조제 2 항제 2 호및제 9-11 조제 3 항의규정에따라위와같이자료보완 제출기한의연장을요청합니다. 년월일 신청인 ( 서명 ) 질병관리본부장 귀하 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 151

부록 8. 승인사항변경승인신청서 유전자변형생물체개발 실험승인사항변경승인신청서 1상 호 신청인 ( 시험연구기관 ) 3사업장주소 5대표자성명 7과 제 명 8연 구 기 간 성 명 9연구책임자 주 소 전화번호 시설등록번호 10연구시설 주 소 생물안전 관리책임자 11 변경전 2승인번호 4사업자등록번호 ( 법인등록번호 ) 6전화번호 직 [ 별지제 9-3 호서식 ] ( 신규, 계속, 변경 ) 년월일 ~ 년월일 소 속 변경내용 위 이메일주소안전관리등급 성 12 변경후 BL- 명 처리기간 30일 유전자변형생물체의국가간이동등에관한통합고시 제 9-12 조제 1 항에의하여위와같이유전자변형생물체개발 실험승인사항의변경승인을신청합니다. 년월일 신청인 ( 서명또는인 ) 질병관리본부장 귀하 152 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 9. 연구시설설치 운영신고확인서 연구시설설치 운영신고확인서 [ 별지제 9-5 호서식 ] 신청인 1상 호 3주 소 5대표자성명 ( 전화번호 ) 2 확인번호 4 사업자등록번호 ( 법인등록번호 ) 6 주민등록번호 제 호 신고내용 연구시설 7설치 운영책임자 ( 성명 ) ( 전화번호 ) 8 규모 ( 시설내역 ) 9설치 운영장소 10 안전관리등급 유전자변형생물체의국가간이동등에관한통합고시 제 9-5 조제 3 항에의하 여위와같이연구시설의설치 운영신고서를접수하였음을확인합니다. 년월일 관계중앙행정기관장 인 Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 153

부록 10. 연구시설설치 운영허가서 연구시설설치 운영허가서 [ 별지제 23 호서식 ] 신청인 1상 호 3주 소 5대표자성명 2 확인 번호 4 사업자등록번호 ( 법인등록번호 ) 6 주민등록번호 제 호 7 설치 운영장소 허가내용 8 규모 ( 시설내역 ) 9안전관리등급 10 허가조건 유전자변형생물체의국가간이동등에관한법률 제22조제1항, 동법시행령제 23조제3항및동법시행규칙제14조제2항의규정에따라위와같이연구시설의설치 운영을허가합니다. 년월일질병관리본부장인 154 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 11. LMO 개발관리대장 [ 별지제 27 호서식 ] 유전자변형생물체 개발 생산 수입 수출 판매 관리대장 연월일명칭 개 발 수량 수 매도자정보 입 수입량 자가사용량 생산 수출 판매 매입자정보 생산량수출량판매량 재고량 취급자 ( 서명또는인 ) 부서장또는책임자 ( 서명또는인 ) Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 155

부록 12. LMO 운반관리대장 [ 별지제 28 호서식 ] 유전자변형생물체운반관리대장 연월일명칭운반량출발지점 도착지점 차량번호 상호 ( 성명 ) 위탁인 전화번호 운반자 ( 서명또는인 ) 사업자등록부서장번호또는또는책임자법인등록번호 ( 서명또는인 ) 156 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 13. LMO 보관관리대장 [ 별지제 29 호서식 ] 연월일명칭위탁인정보 유전자변형생물체보관관리대장 입고출고재고량 입고량위탁인정보출고량합계보관량저장량비고 취급자 ( 서명또는인 ) 부서장또는책임자 ( 서명또는인 ) Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 157

부록 14. 기관생물안전위원회생물안전심의결과서 유전자재조합실험생물안전심의결과서 기 관 명 성명 ( 대표자 ) 주 소 생물안전위원회 IBC 접수과제번호 연구과제명 ( 실험명 ) 총 연 구 기 간 수행부서 공여병원체 도입유전자 숙 주 벡 터 주요실험내용 실험의위해수준 백신접종현황 IBC 심의결과승인번호생물안전등급 위원장직위 생물안전심의기관정보 소속전화번호생물안전심의신청과제정보 낮음 높음 중간 매우높음 치료제유효성기관생물안전위원회심의결과 국가승인대상 기관승인 기관신고 BL1 BL2 BL3 등록번호 심사대상기간연구책임자해당위험군 신청안전등급 유효기간연구시설등록번호 BL1 BL2 BL3 승인조건 생물안전위원회는위와같이신청연구과제 ( 유전자재조합실험 ) 에대한생물안전심의결과서를통보합니다. 년월일 기관생물안전위원장 ( 서명또는인 ) 158 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

부록 15. 미생물의위험군분류 유전자재조합실험지침 보건복지부고시제 2007-39 호 [ 별표 2] 생물체의위험군분류 ( 제 5 조제 1 항관련 ) 1. 세균의위험군분류 (1) 제4위험군해당세균없음 (2) 제3위험군 Bacillus Bartonella Brucella Burkholderia Coxiella Francisella Mycobacterium Orientia B. anthracis B. bacilliformis B. abortus B. canis B. melitensis B. ovis B. suis B. mallei ( 구 )Pseudomonas mallei B. pseudomallei C. burnetii F. tularensis M. africanum M. bovis (BCG주제외 ) M. tuberculosis O. tsutsugamushi ( 구 )Rickettsia tsutsugamushi Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 159

Pasteurella Rickettsia Yersinia P. multocida type B R. akari R. australis R. canada R. conorii R. japonica R. montana R. parkeri R. prowazekii R. rhipicephali R. rickettsii R. siberica R. typhi ( 구 )Rickettsia mooseri Y. pestis (3) 제2위험군 Acinetobacter Actinobacillus Actinomyces Aeromonas Amycolata Archanobacterium Arizona Bacillus A. baumannii ( 구 )Acinetobacter calcoaceticus 전종 A. bovis A. israelli A. naeslundii A. pyogenes ( 구 )Corynebacterium pyogenes A. hydrophila A. punctata A. autotrophica ( 구 )Nocardia autotrophica A. haemolyticum A. hinshawii ( 구 )Salmonella arizona B. cereus 160 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Bartonella Bordetella Borrelia Burkholderia Calymmatobacterium Campylobacter Chlamydia Clostridium Corynebacterium B. henselae B. quintana ( 구 )Rochalimaea quintana B. vinsonii ( 구 )Rochalimaea vinsonii B. pertussis B. parapertussis B. recurrentis B. burgdorferi ( 구 )Pseudomonas; B. mallei, B. pseudomalei는제외 C. granulomatis C. coli C. fetus C. jejuni C. psittaci C. trachomatis C. pneumoniae C. botulinum C. chauvoei C. difficile C. haemolyticum C. histolyticum C. novyi C. perfringens C. septicum C. tetani C. bovis C. jeikeium C. diphtheriae Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 161

C. pseudotuberculosis C. renale C. ulcerans Dermatophilus D. congolensis Edwardsiella E. tarda Erysipelothrix E. rhusiopathiae Escherichia E. coli ( 장관병원성전종 ) Fusobacterium F. necrophorum ( 구 )Sphaerophorus necrophorus Fusiformis necrophorus Haemophilus H. ducreyi H. influenzae Helicobacter H. pylori Klebsiella 전종 Legionella 전종 Leptospira L. interrogans ( 전혈청형 ) Listeria L. monocytogenes Moraxella 전종 Mycobacterium M. avium complex M. asiaticum M. bovis (BCG 주 ) M. chelonei M. fortuitum M. kansasii M. leprae M. malmoense M. marinum M. paratuberculosis M. scrofulaceum 162 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Mycoplasma Neisseria Nocardia Pasteurella Plesiomonas Pseudomonas Rhodococcus Salmonella Shigella Staphylococcus Streptobacillus Streptococcus M. simiae M. szulgai M. ulcerans M. xenopi 전종 N. gonorrhoeae N. meningitidis N. asteroides N. brasiliensis N. farnicica N. otitidiscaviarum N. transvalensis P. haemolytica P. multocida (Pasteurella multocida type b 제외 ) P. pneumotropica P. shigelloides P. aeruginosa R. equi ( 구 )Corynebacterium equi 전종및전혈청형 S. dysenteriae S. boydii S. flexneri S. sonnei S. aureus S. moniliformis S. agalactia S. pneumoniae Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 163

Treponema Vibrio Yersinia S. pyogenes T. carateum T. pallidum T. pertenue V. cholerae V. parahemolyticus V. vulnificus Y. enterocolitica Y. pseudotuberculosis (4) 제1위험군 (2) 및 (3) 에해당되지않는종. 다만, 종명까지동정되어있지않고인체병원성여부가밝혀지지않은것은제외한다. 2. 바이러스의위험군분류 (1) 제4위험군 Arenaviridae Bunyaviridae Filoviridae Flaviviridae Guanarito virus Junin virus Lassa virus Machupo virus Sabia virus South American haemorrohagic fever virus Crimean-Congo hemorrhagic fever virus Ebola virus Marburg virus Omsk hemorrhagic fever virus 164 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Central European encephalitis virus Hanzalova virus Hypr virus Kumlinge virus Kyasanur Forest disease virus Russian spring-summer encephalitis viruses Herpesviridae Herpesvirus simiae(herpesvirus B Monkey B virus Cercopithecine herpesvirus[chv-1], B virus) Paramyxoviridae Equine morbillivirus(hendra virus) Hendra-like virus Nipah virus Poxviridae Variola virus 현재까지규명되지않은출혈열바이러스의원인바이러스 (2) 제3위험군 Arenaviridae Bunyaviridae Lymphocytic choriomeningitis virus(lcm) (neurotropic strain) Mopeia virus Estero Real virus Shokwe virus Fort Sherman virus Akabane virus Germiston virus Kairi virus Oropouche virus Rift Valley fever virus Thiafora virus Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 165

Coronaviridae Flaviviridae Orthomyxoviridae Dugbe virus Nairobi sheep disease virus Hantaan virus Sin nombre virus SARS-CoV (Severe Acute Respiratory Syndrome) Cacipacore virus Gadgets Gully virus Israel turky meningitis virus Kedougou virus Koutango virus Louping ill virus Meaban virus Murray Valley encephalitis virus Negishi virus Powassan virus Rocio virus Sal Vieja virus San Perlita virus Saumarez Reef virus Sepik naranjal virus Spondweni virus St. Louis encephalitis virus Tick-borne encephalitis virus Wesselsbron virus West nile virus Yaounde virus Yellow fever virus Avian influenza virus affecting human 166 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Poxvviridae Monkeypox virus Prions Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs) agent [Creutzfeldt-Jacob disease and kuru, Bovine spongiform enephalopathy(bse) other related animal TSEs] Retroviridae Human immunodeficiency virus(hiv) types 1, 2 Human Tcell lymphotropic virus(htlv) types 1, 2 Simian immunodeficiency virus (SIV) Rhabdoviridae Vesicular stomatitis virus Rabies virus(wild strain) Togaviridae Semliki Forest virus Venezuelan equine encephalomyelitis virus (3) 제2위험군 Adenoviridae Arenaviridae Bunyaviridae Caliciviridae Coronaviridae Human adenovirus Junin virus candid #1 vaccine strain Lymphocytic choriomeningitis virus (LCM) (non-neurotropic strains) Tacaribe virus complex Bunyamwera virus Puumala virus Seoul virus Rift Valley fever virus vaccine strain MP-12 그외3군및4군에서제외된전종 Norovirus Sapovirus Coronavirus Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 167

Flaviviridae Dengue virus serotypes 1, 2, 3 and 4 Japanese encephalitis virus Yellow fever virus vaccine strain 17D Hepatitis C virus(hcv) 그외3군및4군에서제외된전종 Hepadnaviridae Hepatitis B virus (HBV) Hepatitis D (delta) virus (HDV) Herpesviridae Epstein Barr virus Human cytomegalovirus Herpes simplex virus 1 and 2(HSV1 and 2) human herpesvirus types 3, 4, 5, 6 and 7 Varicella zoster virus Orthomyxoviridae Influenza viruses types A, B and C 기타벼룩매개 orthomyxoviruses를포함한전종 Papovaviridae 모든 human papilloma viruses Paramyxoviridae Human parainfluenza viruses types 1, 2, 3 and 4 Human respiratory syncytial virus Measles virus Mumps virus Newcastle disease virus Parvoviridae Human parvovirus (B19) Piconaviridae Hepatitis A virus (HAV) Human echoviruses Human coxsackieviruses types A and B Human rhinoviruses Polioviruses, all types, wild and attenuated Poxviridae Monkeypox virus, Alastrim, Smallpox, Whitepox 를포함한일부제한된 Poxviruses를제외한전종 168 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Reovirudae Rhabdoviridae Rhabdoviridae Togaviridae Unclassified Coltivirus, human Rotavirus, Orbivirus를포함한전종 Rabies virus VSV-Indiana, San Juan, Glasgow 를포함한 Vesicular stomatitis virus 중실험실에적응된바이러스주 Rubella virus Chikungunya virus 131/25 vaccine strain Eastern equine encephalomyelitis viruses O'nyong-nyong virus Ross river virus Bebaru virus Sindbis virus Venezuelan equine encephalomyeitis vaccine strain TC-83 Western equine encephalomyelitis viruses Hepatitis E virus(hev) (4) 제1위험군 (1), (2) 및 (3) 에해당되지않는바이러스. 다만, 종명까지동정되어있지않고인체병원성여부가밝혀지지않은것은제외한다. 3. 진균의위험군분류 (1) 제4위험군해당진균없음 (2) 제3위험군 Blastomyces(Ajellomyces) B. dermatitidis Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 169

Coccidioides Histoplasma Histoplasma C. immitis H. capsulatum var H. capsulatum H. capsulatum var H. duboisii (3) 제2위험군 Acremonium Aspergillus Arthroderma(Trichophyton) Blastomyces(Ajellomyces) Candida Cladosporium Cladosporium(Xylohypha) Cryptococcus Cryptococcus Dactylaria(Ochroconis) Emmonsia Epidermophyton Exophiala(Wangiella) Fonsecaea Fusarium A. spp A. spp. A. simii(some strains) B. dermatitidis C. spp C. bantianum C. trichoides C. neoformans var C. gattii C. neoformans var C. neoformans D. gallopava E. parva E. parva var E. crescens E. spp. E. dermatitidis F. pedrosol F. compacta F. moniliforme F. solani 170 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Madurella Microsporum Neotestudina Paecilomyces Paracoccidioides Penicillium Pneumocystis Sporothrix Trichophyton M. grisea M. mycetomati M. spp. N. rosatii P. spp P. brasiliensis P. marneffei P. carinii S. schenckii T. spp (4) 제1위험군 (2) 및 (3) 에해당되지않는종. 다만, 종명까지동정되어있지않고인체병원성여부가밝혀지지않은것은제외한다. 4. 기생충의위험군분류 (1) 제4위험군해당기생충없음 (2) 제3위험군해당기생충없음 (3) 제 2 위험군 조중류 (Cestode) Cysticercus C. cellulosae ( 유구낭미충 ) Echinococcus E. granulosus ( 단방조충 ) Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 171

E. multilocularis ( 다방조충 ) E. vogeli ( 포겔다방조충 ) Hymenolepis H. diminuta ( 쥐조충 ) H. nana ( 왜소조충 ) Taenia T. solium ( 유구조충 ) T. saginata ( 무구조충 ) T. asiatica ( 아시아조충 ) 선충류 (Nematode) Ancylostoma A. ceylanicum ( 실론구충 ) A. duodenale ( 두비니구충 ) Ascaris A. lumbricoides ( 회충 ) A. suum ( 돼지회충 ) Brugia B. malayi ( 말레이사상충 ) B. timori ( 티몰사상충 ) Enterobius E. vermicularis ( 요충 ) Loa L. loa ( 로아사상충 ) Necator N. americanus ( 아메리카구충 ) Onchocerca O. volvulus ( 회선사상충 ) Strongyloides S. stercoralis ( 분선충주혈흡충증 ) Trichinella T. spiralis ( 선모충 ) Wuchereria W. bancrofti ( 반크롭프트사상충 ) 흡중류 (Trematode) Clonorchis C. sinensis( 간흡충 ) Echinostoma E. hortense( 호르텐스극구흡충 ) Fasciola F. hepatica ( 간질 ) F. gigantica ( 거대간질 ) 172 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Gymnophalloides G. seoi ( 참굴큰입흡충 ) Heterophyes H. nocens ( 유해이형흡충 ) Metagonimus M. yokogawai ( 장흡충 ) Paragonimus P. westermani ( 폐흡충 ) Pygidiopsis P. summa ( 표주박이형흡충 ) Schistosoma S. haematobium ( 방광주혈흡충 ) S. intercalatum ( 장간막주혈흡충 ) S. japonicum ( 일본주혈흡충 ) S. mansoni ( 만손주혈흡충 ) S. mekongi ( 메콩주혈흡충 ) 원충류 (Protozoa) Babesia B. bovis ( 쇠바베스열원충 ) B. divergens ( 분기바베스열원충 ) Babesia B. microti ( 쥐바베스열원충 ) Cryptosporidium C. parvum ( 작은와포자충 ) Entamoeba E. coli ( 대장아메바 ) E. gingivalis ( 잇몸아메바 ) E. hartmanni ( 작은아메바 ) E. histolytica ( 이질아메바 ) Giardia G. lamblia ( 람블편모충 ) Iodoamoeba I. butschlii ( 요드아메바 ) Isospora I. belli ( 사람등포자충 ) I. hominis ( 맹장포자충 ) Leishmania L. aethiopica ( 이디오피아리슈만편모충 ) L. braziliensis ( 피하리슈만편모충 ) L. donovani ( 내장리슈만편모충 ) L. major ( 큰리슈만편모충 ) Ⅲ. LMO 개발및실험승인심사 173

L. mexicana ( 멕시코리슈만편모충 ) L. peruvania ( 페루리슈만편모충 ) L. tropica ( 피부리슈만편모충 ) Microsporidium ( 미포자충류 ) Naegleria N. fowleri ( 파울러자유아메바 ) Plasmodium P. cynomolgi ( 유인원원충 ) P. falciparum ( 열대열원충 ) P. malariae ( 사일열원충 ) P. ovale ( 난형열원충 ) P. vivax ( 삼일열원충 ) Sarcocystis S. lindemanni ( 린데만근육포자충 ) S. suihominis ( 돼지근육포자충 ) Toxocara T. canis ( 개회충 ) Toxoplasma T. gondii ( 톡소포자충 ) Trichomonas T. hominis ( 장세모편모충 ) T. tenax ( 구강편모충 ) T. vaginalis ( 질편모충 ) Trypanosoma T. brucei ( 브르스파동편모충 ) T. cruzi ( 크르스파동편모충 ) T. gambiense ( 감비아파동편모충 ) T. rangeli ( 랑겔파동편모충 ) T. rhodesiense ( 로데시아파동편모충 ) (4) 제1위험군 (3) 에해당되지않는기생충. 다만, 종명까지동정되어있지않고인체병원성여부가밝혀지지않은것은제외한다. 174 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Ⅳ. 참고문헌

IV. 참고문헌 1. 유전자변형생물체의국가간이동등에관한법률, 동법시행령, 시행규칙및통합고시 2. 유전자재조합실험지침, 2007 3. 시험 연구용유전자변형생물체수입승인제도가이드라인, 2007, 질병관리본부 4. 연구시설신고 허가제도및유전자변형생물체개발 실험승인제도가이드라인, 2007, 질병관리본부 5. 생물안전 3등급연구시설운영지침, 2007, 질병관리본부 6. 실험실생물안전지침, 2007, 질병관리본부 7. Annex 5 WHO biosafety risk assessment and guidelines for the production and quality control of human influenza pandemic vaccines, 2005, WHO 8. Chen S. Barbieri J. T., Unique substrate recognition by botulinum neurotoxins serotype A and E, J. Biol. chem. 2006. 281(16): 10906-10911 9. Derivation and characterisation of NIBRG-14: an A/Viet 176 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

Nam/1194/2004(H5N1) vaccine reference strain generated by reverse genetics, 2005, NIBSC 10. Fodor, E., et al., Rescue of influenza a virus from recombinant DNA, Journal of Virology, 1999. 9679-9682 11. Govorkova, E. A., et. al., Immunization with reversegenetics-produeced H5N1 influenza vaccine protects ferrets against homologus and heterologous challenge, Journal of Infectious Diseases, 2006. 194:159-167 12. Hata., M., et. al., Uoning of a novel gene for quinolone resistance from a transferable plasmid in Shingella flexneri 26, Artimicrob. Agents Chemother 2005. 49(2) : 801-803 13. Hoffmann, E., et. al., A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids, Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. 97(11):6108-6113 14. Hoffmann, E., et. al., Eight-plasmid system for rapid generation of influenza virus vaccines, Vaccine, 2002. 20:3165-3170 15. Influenza reference virus NIBRG-14 05/160, 2005, the Ⅳ. 참고문헌 177

National Institute for Biological Standards and Control. 16. Jadhao, S. J., et. al., Development of Eurasian H7N7/ PR8 high growth reassortant virus for clinical evaluation as an inactivated pandemic influenza vaccine, Vaccine 2008. 25;26(14):1742-50 17. Kerschen, E. J. et. al., snr-1 gene is required for nitrate reduction in Pseudomonas aeruginosa PAO1, Journal of Bacteriology, 2001. 183(6):2125-2131 18. Nicolson, C., et. al., Generation of influenza vaccine viruses on vero cells by reverse genetics: an H5N1 candidate vaccine strain produced under a quality system, Vaccine, 2005. 23:2943-2952 19. Pappas, C., et. al., Development and Evaluation of an Influenza Virus Subtype H7N2 Vaccine Candidate for Pandemic Preparedness, Clinical and Vaccine Immunology, 2007. 14(11):1425-1432 20. Production of pilot lots of inactivated influenza vaccines from reassortant derived from avian influenza viruses; Interim biosafety risk assessment, 2003, WHO 178 시험 연구단계 LMO 승인심사설명집

21. Song, MS., et. al., Ecology of H3 avian influenza viruses in Korea and assessment of their pathogenic potentials, Journal of General Virology, 2008. 89:949-957 22. Wood, J. M. & R. J. S., From lethal virus to life-saving vaccine: developing inactivated vaccines for pandemic influenza, Nature Reviews Microbiology, 2004. 2:842-847 감사의글 본설명집발간과관련하여 LMO 개발및실험위해성평가자료 작성예시에도움을주신 ( 재 ) 목암생명공학연구소관계자님께감사드 립니다. Ⅳ. 참고문헌 179