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pissn 229-53 / eissn 2465-9223 J. Fd Hyg. Saf. Vl. 33, N. 5, pp. 399~403 (208) https://di.rg/0.303/jfhs.208.33.5.399 Jurnal f Fd Hygiene and Safety Available nline at http://www.fdhygiene.r.kr 수벌번데기로부터식중독세균및곰팡이독소안전성평가 김세건 우순옥 장혜리 최홍민 문효정 한상미 * 국립농업과학원농업생물부 Safety Investigatin n Fdbrne Pathgens and Myctxins in Hneybee Drne Pupas Se-Gun Kim, Sn-Ok W, Hye-Ri Jang, Hng-Min Chi, Hy-Jung Mn, and Sang-Mi Han* Department f Agricultural Bilgy, Natinal Institute f Agricultural Science, Wanju 55365, Krea (Received June 7, 208/Revised July 3, 208/Accepted August 26, 208) ABSTRACT - In this study, safety investigatins n harmful micrrganisms and myctxins were cnducted n hneybee drne pupae as a new fd material, which is rich in nutrients and capable f being mass prduced in apiaries. The hneybee drne pupae prduced in apiaries were cllected frm three different regins in Krea and frzen immediately. Subsequently, the samples were subjected t freeze-drying. Accrding t the Krean Fd Cde test methd, clifrms, Salmnella species, Staphylcccus aureus, and enterhemrrhagic Escherichia cli were nt detected in 280 hneybee drne pupas. In additin, myctxins, aflatxin B, chratxin A, dexynivalenl, and zearalenne were nt detected. Therefre, it is prpsed that the hneybee drne pupae cllected frm the beehives and immediately frzen as safe frm harmful micrrganisms and myctxins and can be used as a fd material Key wrds : Hneybee drne pupa, Nvel fd, Sanitary indicatr micrrganisms, Myctxins 전세계적으로인구의증가와식생활수준이높아짐에따라육류소비가크게증가하고있는실정이다. 이로인한가축개체수의증가가환경오염과식량난을야기하고있어, 기존의인류식량의공급원이외의새로운대안을찾게되었다 ). 국제연합식량농업기구 (FAO) 에서는 2050년경세계인구가약 90억명에달할것으로추정하여현재보다두배이상식량이필요할것으로예상하여곤충을인류의새로운단백질공급원중의하나로주목하였다 2). 일부곤충의영양학적가치는쇠고기와비슷한수준이며, 곤충은사육하는동안소나돼지등의가축보다적은양의온실가스와암모니아가스를방출하기때문에환경오염문제의우려가없는친환경적인식품으로보고되고있다. 또한곤충은가축에비해사육면적이좁아토지이 3-5) 용효율이높으며, 한번에알을수십개에서수백개낳으며, 년에여러번세대가순환되므로빠른기간에대량생산이가능하다는장점이있다. 식용곤충은식용을목적으로한곤충으로아시아, 유럽, *Crrespndence t: Sang-Mi Han, Department f Agricultural Bilgy, Natinal Institute f Agricultural Science 66, Nngsaengmyeng-r Ise-myen Wanju-gun Jellabuk-d, Krea Tel: 82-63-238-2896, Fax: 82-63-238-383 E-mail: sangmih@krea.kr 아프리카, 미주등지에서 2,000여종에가까운곤충을섭취하고있다. 식용으로이용되는곤충은벌목 (Hymenptera 6,7) spp.), 나비목 (Lepidptera spp.), 메뚜기목 (Orthptera spp.) 과흰개미목 (Ispetra spp.) 등이있다. 이러한식용곤충은일반적으로조단백질함량이 50~60% 정도로매우높게함유되어있는단백질공급원으로서의중요성이보고된바있고, 조지방함량은 8.~59%, 섬유소함량은 4.9~2.%, 그밖의풍부한무기물과비타민 B군등을함유하고있어식품으로서가치가높다. 8,9) 현재국내에서식품의약품안전처의식품공전에등록되어식용으로유통및판매가가능한곤충은총 7종이다. 기존에식용가능한곤충으로예전부터오랜기간식용하여식품공전에등재되어있는누에 (Bmbyx mri L.), 메뚜기 (Oxya japnica Tungberg), 백강잠 ( 누에유충이백강병균 Beauveria bassiana Vuill. 의감염에의한백강병으로경직사한몸체 ) 이있고, 최근농촌진흥청에서과학적입증을거쳐갈색거저리유충 (Tenebri mlitr L.), 흰점박이꽂무지유충 (Prtaetia brevitarsis L.), 장수풍뎅이유충 (Allmyrina dischtma L.) 과쌍별귀뚜라미 (Gryllus bimaculatus L.) 를새로운식품원료로등록하였다 0). 현재우리나라의식용곤충시장은 205년 60억원에서 2020년에는,04억원으로크게증가할것으로예측하고있으며 ), 399

400 Se-Gun Kim, Sn-Ok W, Hye-Ri Jang, Hng-Min Chi, Hy-Jung Mn, and Sang-Mi Han 식용곤충을이용한다양한요리법과가공제품등이개발되고있다. 서양종꿀벌 (Apis mellifera L.) 의수벌은일벌이나여왕벌과달리외적을방어하기위한벌침을갖고있지않으며, 여왕벌과교미하는일외에는아무것도안하고식량만소비하기때문에수벌은쓸모없는존재로알려져있다. 그러나수벌은일본과중국등아시아지역과유럽등지에서는식용으로사용되어초콜릿, 제과, 주류및기능성식품의원료로사용되고있으며우리나라에서도고문헌인 신농본초경( 神農本草經 ) 이나 본초강목( 本草綱目 ) 에수벌을섭식하였다는기록이남아있다. 따라서수벌은 2,3) 식품원료로서이용가치가높을뿐만아니라기능성식품으로개발가능성이높다. 무엇보다도수벌은양봉농가에서쉽게생산가능하며생산방법이확립되어있다는점에서산업화하기에경제성이높다. 수벌의성충은여왕벌보다는체구가작고, 일벌보다는 2~3배체구가크다. 수 4) 벌은일벌과여왕벌과는달리성충까지도달하는데소요되는시간이긴데유충은 3주가량, 번데기는 2~3일소요되어 4주이후에성충이된다. 5) 따라서본연구는양봉농가에서쉽게생산할수있는수벌번데기를식품소재화하기위하여식약처 새로운식품원료안전성평가가이드라인 에따라수벌번데기원료에대한유해미생물및곰팡이독소검출여부를분석하여새로운식재료로써안전하게사용될수있는기초정보를제공하고자하였다. Materials and Methds 실험재료본시험에사용된서양종꿀벌 (Apis mellifera L.) 의수벌번데기는충남청양, 전북김제, 경남창녕의양봉농가에서 207년 5월에서 6월, 그리고 208년 4월중에생산된것을사용하였다 (Table, Fig. ). 수벌번데기는 4월이후꿀벌이번식하는시기에수벌번데기전용소비 ( 벌집틀 ) 를벌통안에넣어두었다. 이때양봉농가에서는벌꿀채취를위하여꿀벌수를늘려야하기때문에벌통에 개의수벌번데기전용소비만을넣어두고, 6월이후벌꿀채취 Table. Samples cllected and tested in this study Place Sampling year Number f sampling hives Chungnam Chengyang (CC) 208 50 Jenbuk Gimje (JG) 208 0 Gyengnam Changnyeng (GC) Fig. 2. Cllected hneybee drne pupae. 207 20 208 00 가끝난시기엔수벌번데기소비를늘려수벌번데기생산을늘린다. 일반적으로소비를넣고 20일이후봉개된소비를멸균된칼로베어낸후핀셋을이용하여수벌번데기를꺼냈다 (Fig. 2). 소비에서수벌번데기를채취후곧바로액체질소에넣어운반하였으며 20 C 냉동고에보관하며분석시료로사용하였다. 벌통에서꺼낸수벌번데기는각각다른용기에보관하여시험에사용하였다. 시료전처리 20 C에서냉동보관한수벌번데기시료를실험에사용하기위해각각의소비를동결건조방법으로전처리하였다. 수벌번데기를동결건조하기위하여동결건조기 (SFDSM24L, Samwn Freezing Engineering C.) 에서 72 시간동안처리하였다. 전처리를한각각의시료는실험전까지 70 C에서냉동보관하였다. Fig.. Cllectin prcess f hneybee drne pupa frm bee hives. (A) drne pupa cmb take ut in bee hives, (B) remve the hneybees frm cmb with brush, and (C) drne pupa s cmb.

Safety Investigatin n Fdbrne Pathgens and Myctxins in Hneybee Drne Pupas 40 식중독세균분석식중독세균과유해독소잔류여부는한국기능식품연구원 ( 성남, 한국 ) 에의뢰하여분석하였다. 대장균군 (Clifrms) 분석은식품공전의대장균군 BGLB (brilliant green lactse bile brth, Hardy diagnstics, CA, USA) 배지법에따라수벌번데기 25 g에 9배의정제수를넣고균질화한후균질액 ml를 BGLB 배지에접종하고 36 C에서 48시간동안배양한다음 BGLB 배지 (Hardy diagnstics, CA, USA) 가스의발생여부에따라대장균군을확인하였다. 살모넬라 (Salmnella spp.) 분석또한식품공전의살모넬라분석법에따라수벌번데기 25 g에 9배의펩톤수 (peptn water) 를넣고 36 C에서 24시간동안 차배양한후배양액 0. ml 를 0 ml Rappaprt-Vassiliadis 배지에접종하여 42 C에서 24시간동안 2차배양하였다. 2차배양액을 XDL (xylse lysine desxychlate) agar에접종한다음 36 C에서 24시간동안배양하여배지에서분홍색집락형성여부를확인하여살모넬라의검출여부를평가하였다. 황색포도상구균 (Staphylcccus aureus) 분석은식품공전의황색포도상구균정성시험법에따라 0% 염화나트륨용액을첨가한 TSB (tryptic sy brth) 배지 225 ml에수벌번데기 25 g 을넣고 36 C에서 24시간동안배양하여난황첨가만니톨 식염한천배지에접종한다음다시 36 C에서 24시간동안배양한후황색불투명집락을나타내고주변에혼탁한백색환의집락형성을확인하여황색포도상구균의검출여부를판단하였다. 장출혈성대장균 (Enterhemrrhage Escherichia cli) 분석은식품공전의장출혈성대장균분석법에따라 mtsb (mdified tryptne sy brth) 배지 225 ml에수벌번데기 25 g을넣고 36 C에서 24시간동안배양한배양액 ml를취하여세척한후멸균증류수 200 µl를섞어 0 분간끓인다음원심분리하여상등액 5µL를주형 DNA 로사용하였다. PCR 분석은 VT, VT2 프라이머를사용하여수행하였고최종산물반응액을 2% agarse로전기영동한다음 UV를이용하여반응생성물 (VT: 80 bp, VT2: 255 bp) 을확인하여장출혈성대장균의검출여부를평가하였다. 곰팡이독소인아플라톡신 (aflatxin) 분석은식품공전의아플라톡신분석법에따라추출, 정제, 유도체화및 HPLC 분석을통하여아플라톡신 B 을확인하였다. 즉, 수벌번데기 25 g에 % 염화나트륨용액 00 ml을첨가하여균질화한후 % 트윈 20 용액을가하여추출하였고추출액 20 ml를면역친화성컬럼에주입하여해당물질을정제하였다. 컬럼용출액은트리플루오로초산을가하여유도체화한후아세토니트릴 물 (80:20, v/v) 혼합액을첨가한다음 0.45 µm 멤브레인필터로여과하여 HPLC 분석시료로사용하였다. 아플라톡신 B 의 HPLC-FLD (Agilent 260) 분석은검출파장 Ex = 360 nm, Em = 450 nm, 컬럼 C8 UG20 (Shiseid, 4.6 250 mm, 5 µm), 컬럼온도 40 C, 흐름속도.0 ml/min 및주입량 20 µl이었으며, 이동상은아 세토니트릴 (slvent A) 과물 (slvent B) 을사용하여 0~5분까지 (A) 25%, 5~5.분까지 (A) 25~30%, 5.~2분까지 (A) 30% 로설정하였다. 오크라톡신 A (chratxin) 분석은식품공전의오크라톡신 A 분석법에따라수벌번데기 25 g 을아세토니트릴 물 (60:40, v/v) 00 ml에첨가하고균질화한다음여액에 PBS를혼합하여면역친화성컬럼크로마토그래피를실시하고, 용출액을질소농축한후아세토니트릴 물 초산 (99:99:2, v/v/v) 혼합용액 ml을첨가하여분석시료로사용하였다. 오크라톡신 A의 HPLC- FLD (Agilent 260) 분석은검출파장 Ex = 333 nm, Em = 460 nm, 컬럼 C8 UG20 (4.6 250 mm, 5 µm), 컬럼온도 40 C, 흐름속도.0 ml/min 및주입량 40 µl이었으며, 이동상은아세토니트릴 물 초산 (99:99:2, v/v/v) 혼합용액을사용하였다. 데옥시니발레놀 (Dexynivalenl) 분석은식품공전의데옥시니발레놀분석법에따라수벌번데기 20 g 을아세토니트릴 메탄올 물 (25:25:50, v/v/v) 00 ml에첨가하고균질화한다음원심분리하여상등액을정제용컬럼에주입하고물로세척한후아세토니트릴로용출시켰다. 수집한용출액은질소로농축하고아세토니트릴 물혼합액 ml를가하여녹인후여과한것을분석시료로사용하였다. 데옥시니발레놀의 HPLC-DAD (Agilent 260) 분석은검출파장 220 nm, 컬럼 C8 UG20 (4.6 250 mm, 5 µm), 컬럼온도 40 C, 흐름속도 0.7 ml/min 및 주입량 40 µl이었으며, 이동상은아세토니트릴 (slvent A) 과물 (slvent B) 을사용하여 0~4분까지 (A) 0~20%, 4~20 분까지 (A) 20% 로설정하였다. 제랄레논 (Zearalenne) 분석은식품공전의제랄레논분석법에따라수벌번데기 25 g 을염화나트륨 2g, 트윈 20 ml 및추출용액 00 ml를첨가하고균질화한다음원심분리하여상등액을정제용컬럼에주입하고물로세척한후메탄올로용출시켰다. 수집한용출액은질소로농축하고아세토니트릴 메탄올 물 (0:55:35, v/v/v) 혼합액 ml를가하여녹인후여과한것을분석시료로사용하였다. 제랄레논의 HPLC-FLD (Shiseid Nanspace SI-2) 분석은검출파장 Ex = 275 nm, Em = 450 nm, 컬럼 C8 UG20 (4.6 250 mm, 5 µm), 컬럼온도 40 C, 흐름속도.0 ml/min 및주입량 20 µl이었으며, 이동상은아세토니트릴 메탄올 물 (0:55:35, v/v/ v) 혼합액을사용하였다. Results and Discussin 식중독세균오염도조사새로운식품원료로사용하기위해서는유해미생물로대장균군, 살모넬라, 황색포도상구균및장출혈성대장균이검출되어서는아니된다. 그러나아직까지곤충을식품원료로사용하기위한유해미생물의종류와기준은마련되지않은실정이다. 따라서본연구에서는유해미생물이

402 Se-Gun Kim, Sn-Ok W, Hye-Ri Jang, Hng-Min Chi, Hy-Jung Mn, and Sang-Mi Han Table 2. Fdbrne Pathgen cntents f hneybee drne pupas cllected frm Krean apiary Bacteria samples Clifrms Salmnellae spp S. aureus Enterhemrrhage E. cli CC ) (n 5) = 50) ND 6) ND ND ND JG 2) (n = 0) ND ND ND ND 7 GC 3) (n = 20) ND ND ND ND 8 GC 4) (n = 00) ND ND ND ND ) CC: Chungnam Chengyang 2) JG: Jenbuk Gimje 3) 7 GC: Gyengnam Changnyeng, sampling year is 207 4) 8 GC: Gyengnam Changnyeng, sampling year is 208 5) n is sampling number f bee hives 6) ND : Nt detected Table 3. Myctxins cntents f hneybee drne pupas cllected frm Krean apiary Myctxins Samples Aflatxin Ochratxin Dexynivalenl Zearalenne CC ) (n 5) = 50) ND 6) ND ND ND JG 2) (n = 0) ND ND ND ND 7 GC 3) (n = 20) ND ND ND ND 8 GC 4) (n = 00) ND ND ND ND ) CC: Chungnam Chengyang 2) JG: Jenbuk Gimje 3) 7 GC: Gyengnam Changnyeng, sampling year is 207 4) 8 GC: Gyengnam Changnyeng, sampling year is 208 5) n is sampling number f bee hives 6) ND : Nt detected 수벌번데기에서검출되는지를평가하고자하였다. 수벌번데기를새로운식품원료로사용하기위하여유해미생물인대장균군, 살모넬라, 황색포도상구균및장출혈성대장균의검출여부를확인한결과모두검출되지않았다 (Table 2). 모든시료에서대장균군, 살모넬라, 황색포도상구균및장출혈성대장균이검출되지않은것으로확인되어수벌번데기의생산단계에서유해미생물의감염은안전한것으로사료된다. 이는기존의봉개된벌집은무균상태로유지된다는보고와일치하는것으로확인되었다. 수벌번데기는봉개된소비를칼로베어깨끗한비닐팩에옮겨곧바로냉동보관하는과정에서는유해미생물의감염에안전한것으로확인되었다. 곰팡이독소오염도조사우리나라에서곤충을식품원료로사용하고자하는연구는 200년이후시작하여현재 4종의곤충만이식품원료로등록되었으며곤충을식품원료로등록하기위해서는안전성등많은연구와자료수집이필요한실정이다. 곤충을식품원료로등록하는데있어유해물질에대한규정이나기준치등이아직까지명확히설정되어있지않은상태이다. 꿀벌의수벌은로열젤리와화분그리고벌꿀이 먹이원으로서자연에서얻어지는천연물이다. 그러나밀원상태가좋지않고많은먹이원이필요할경우엔천연화분이아닌대용화분으로사양하는경우도일부있을수있기때문에곰팡이독소에대한안전성도평가하고자하였다. 그결과검사한모든시료에서어떠한곰팡이독소도검출되지않았다 (Table 3). 건전한꿀벌의벌통은무균상태를유지하는것으로알려져있는데꿀벌이식물로부터채집한강력한살균및방부효과를갖는프로폴리스를사용하여벌집의출입구와빈틈을메워서벌집내부를보강하여벌집속을무균상태로만들어유해한미생물의침입을방지한다고알려져있다. 본연구에서도벌집속에서채 6) 집한수벌번데기로부터세균및곰팡이오염이관찰되지않았는데이는선행연구의결과와일치하였다. 하지만단백질, 아미노산등다양한영양성분을지닌수벌번데기의보관및유통상태에따라세균과곰팡이오염은피할수없을것으로생산이후보관과이동시에미생물오염방지를위한청결과냉동상태유지가중요하리라생각된다. 따라서, 향후보관기간과이동방법에따른유해미생물오염도를비교관찰할필요가있다.

Safety Investigatin n Fdbrne Pathgens and Myctxins in Hneybee Drne Pupas 403 Acknwledgement 본연구는농촌진흥청농업기초기반연구 ( 과제번호 : PJ034202) 에의하여수행되었으므로감사를드립니다. 국문요약 본연구에서는양봉농가에서대량생산이가능하고영양이풍부한꿀벌수벌번데기를새로운식품원료로사용하기위하여유해미생물과곰팡이독소에대한안전성시험을수행하였다. 검사시료는국내 3지역의양봉농가에서직접생산한수벌번데기를채취후곧바로냉동운반하여동결건조하여사용하였다. 식품공전시험법에따라대장균군 (Clifrms), 살모넬라 (Salmnella spp.), 황색포도상구균 (Staphylcccus aureus) 및장출혈성대장균 (Enterhemrrhage Escherichia cli) 에대한검출여부를조사한결과 280개의벌통에서채취한수벌번데기전부에서전혀검출되지않았다. 또한곰팡이독소인아플라톡신 B (aflatxin), 오크라톡신 A (chratxin), 데옥시니발레놀 (dexynivalenl) 그리고제랄레논 (zearalenne) 이수벌번데기에서전혀검출되지않았다. 따라서벌통내소비에서채취하여곧바로냉동보관한수벌번데기는유해미생물과곰팡이독소로부터안전한것으로확인되어식품원료로사용이가능할것으로사료된다. Reference. Alstn J.M., Beddw J.M., Pardey P.G.: Agricultural research, prductivity, and fd prices in the lng run. Science, 325, 209-20 (2009). 2. Van Huis A., Van Itterbeeck J., Klunder H., Mertens E., Hallran A., Muir G., Vantmme P.: Edible insects: future prspects fr fd and feed security. N. 7. Fd and agriculture rganizatin f the United natins (FAO). Rme, Italy (203) 3. FAO. Edible Frest Insects. Human bite back. Rme (203). 4. Onincx D.G.A.B., Van Itterbeeck J., Heetkamp M.J.W., Van den Brand H., Van Ln J.J.A.: An explratin n greenhuse gas and ammnia prductin by insect species suitable fr animal r human cnsumptin. PLs ne, 5, e4445 (200). 5. Yates-Deer E.: The Wrld in a Bx? Fd Security, Edible Insects, and One Wrld, One Health Cllabratin. Sc. Sci. Med., 29, 06-2 (205). 6. MacEvilly C.: Bugs in the system. Nutr. Bull., 25, 267-268 (2000). 7. Ramus-Elrduy J.: Anthrp-entmphagy: cultures, evlutin and sustainability. Entml. Res., 39, 27-288 (2002). 8. Bukkens S.G.F.: The nutritinal value f edible insects. Ecl. Fd Nutr., 36, 287-39 (997). 9. Pembertn R.W.: The use f the Thai giant waterbug, Lethcerus indicus (Hemiptera: Belstmatidae), as human fd in Califrnia. The Pan-Pacific Entmlgist, 64, 8-82 (988). 0. Baek M., Hwang J.S., Kim M.A., Kim S.H., G T.W., Yun E.Y.: Cmparative analysis f nutritinal cmpnents f edible insects registered as nvel fds. J. Life Sci., 27, 334-338 (207).. Ministry f agriculture, fd and rural affairs. Agriculture, fd and rural affairs statistics yearbk. Krea (207). 2. Winstn M.L.: The Bilgy f the Hney Bee. Harvard University Press, (99). 3. Kim B.H., Y Y.W., Park S.J., Sng W.J., Shin J.N., Oh D.H., W G.Y., Lee G.W., Jang Y.D., J G.Y., J S.G., Chi G.S.: Apilgy. Sunjin, Seul, Krea (996). 4. D H.G.: Shinnngbnchgyeng. Eui Seng Dang Publishing C., Krea (2003). 5. Lee S.J.: Cmpendium f Materia Medica. Peple s Medical Publishing Huse C., LTD, China (950). 6. Ghisalberti E.L.: Prplis: a review. Bee Wrld, 60, 59-84 (979).