발간등록번호 11-1543000-001735-01 ( )
국가연구개발사업의관리등에관한규정제 18 조에따라보고서열람에동의 합니다. - 1 -
보고서요약서 과제고유번호 해당단계 연구기간 2015.12.11. ~2016.12.10. 단계구분 ( 해당단계 )/ ( 총단계 ) 중사업명 고부가가치식품기술개발사업 연구사업명 세부사업명 연구과제명 대과제명 세부과제명 프로바이오틱 Lactobacillus sakei 사균분말 생산을위한살균공정개발 해당단계 참여 연구원수 총 : 4명내부 : 4명외부 : 명 해당단계 연구개발비 정부 :48,000 천원 민간 :16,000 천원 계 :64,000 천원 연구책임자 김병천 총연구기간 총 : 4 명 정부 :48,000 천원 참여 내부 : 4 명 총연구개발비 민간 :16,000 천원 연구원수 외부 : 명 계 :64,000 천원 연구기관명및 소속부서명 프로바이오닉기술연구소참여기업명 : 프로바이오닉 위탁연구연구기관명 : 연구책임자 : 요약 고농도의프로바이오틱유산균의사균제품생산을위하여소형의마이크로웨이브를이용할수있는연속살균처리공정을개발하고, 고압고온반응기를이용한열처리방법을제시함 Lactobacillus sakei 사균분말시제품생산및사균체유산균분말에포함된유산균의유전자단편화및형태적안정성을확인 프로바이오틱유산균사균체의정량을위한지방산정량분석방법제시 보고서면수 : 70 쪽 - 2 -
. 국문요약문 코드번호 D-01 연구의목적및내용 연구개발성과 연구개발성과의활용계획 ( 기대효과 ) 중심어 (5 개이내 ) 고농도세포살균사균변색극초단파 - 3 -
. 영문요약문 코드번호 D-02 Purpose& Contents Results Expected Contribution Development of heat treatment process for production of high concentration of ghost probiotic lactic acid bacteria (>10 11 CFU/ml) Keywords Concentrated cells Sterilization Dead cell Discoloration Microwave - 4 -
- 5 -
1. 연구개발과제의개요 1 2. 국내외기술개발현황 10 3. 연구수행내용및결과 11 4. 목표달성도및관련분야에의기여도 65 5. 연구결과의활용계획등 67 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 67 7. 연구개발성과의보안등급 67 8. 국가과학기술종합정보시스템에등록한연구시설 장비현황 67 9. 연구개발과제수행에따른연구실등의안전조치이행실적 67 10. 연구개발과제의대표적연구실적 68 11. 기타사항 69 12. 참고문헌 70
1. 연구개발과제의개요 1-1. 연구개발목적 - 고농도의프로바이오틱유산균사균분말제품생산에적합한살균방법선정 - 사균분말의변색을일으키지않는최적의살균공정개발 - 시험규모의발효기에서생산되는 를이용한사균분말시제품생산 1-2. 연구개발의필요성 프로바이오틱은살아있는미생물로인간의건강에도움을줄수있음 프로바이오틱의효과 - 소화촉진 - 살아서장에도달 - 식품의형태로섭취가능 - 유해균이장내에서증식하는것을방지 - 장운동개선을도움 - 건강에유익한대사산물을생산함 최근연구에는장점막의면역에도움을줄수있는것으로알려졌음 상용화되어시판되는유산균의제품에다양한형태의제품으로이용되고있음 유산균생균 (live cell) 은제품에포함된유산균을배양하면다시자랄수있음 사균은프로바이오틱과같은효과가없는것으로생각되었으나, 최근의연구결과는사균이생균과동등하거나더뛰어난효과가보고되고있음 유산균사균 (dead cell) 제품은제품에포함된유산균이모두사멸상태인제품임 유산균사균 (dead cell) 효과 : 세포벽의구조안정성 ( 일본연구팀, Fujiki et al. 2012) - 열처리에의한면역조절물질의조성을변화하는구조적화학적변화 - Lactobacillus plantarum L-137의면역조절에서세포벽 (cell wall) 의구조가면역세포를자극하는주요한요소로생각됨 - Lactobacillus plantarum L-137의세포벽이저온보관에서도보관시간이길어지면불안전해짐또한인체의소화액과접촉에의해세포벽이약화됨 - 열처리사멸은 Lactobacillus plantarum L-137의세포벽이안정성을증가하였음 - 열처리사멸된 Lactobacillus plantarum L-137과생균과의비교에서사멸된유산균이더만은 interleukin-12를생산하였음 - 또한인공장액에서처리했을경우도열처리사멸된 L-137의활성은유지되었음 - 열처리사멸된 L-137이대장염이유발된마우스모델시험에서더높은효과를보였음 - 1 -
그림 1-1. 열처리사멸한 Lactobacillus plantarum L-137 의 Iinterleukin-12 유도효과 열처리사균에의한면역조절물질인 interleukin-12 의생산이높았음 흰색막대, 비열처리유산균 ; 검은색막대열처리사멸유산균 그림 1-2. 생균과사균 Lactobacillus plantarum L-137 의세포직경분포 인공위액과인공장액에 Lactobacillus plantarum L-137 생균과열처리사균을 처리한후, 세포직경의분포를분석함 - 2 -
유산균사균 (dead cell) 효과 : 유전자발현조절 ( 유럽연구팀, Demont et al., 2016) - Lactobacillus paracasei NCC 2461을이용한연구 - Human Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) 에서면역조절물질의증가에서사균에의한 IL-10의생산이더높았음 - Lactobacillus paracasei NCC 2461는 IL-10의생산과조절 FoxP3+ 의증가를유도함 - 이러한면역물질생산에서생균과열처리사균은다른활성을나타냄 - 열처리된유사균은 microrna의차별적인발현을이용하여 IL10 mrna의안정성에영향을줌 - 프로바이오틱은 RNA 단편을가지고있으며, 열처리로파쇄된막을통해배출된 RNA 단편이숙주의유전자발현에영향을줄수있음 - 몇몇의프로바이오틱균주에서 mirna-27a와 70% 이상의상동성을가지는서열이다수존재함이확인됨 그림 1-3. 생균혹은열처리된 Lactobacillus paracasei NCC 2461에의한 PBMCs세포에서 Cytokine 발현 A. 상증액에분비된 IL-10 단백질 B. 생균혹은열처리된 L paracasei NCC 2461에의해 PBMCs세포에서증가된 IL10 mrna 발현 C. PBMCs세포에서 IL10 mrna의 half-life D. PBMC 제공자 5명의시료에서보이는 IL10 mrna half-life의중간값 - 3 -
그림 1-4. mir-27a 의서열과 6 개의프로바이오틱균주의게놈이가지는서열에서 70% 이상의유사성을가지는염기서열의수 사균체제조의이유 - 일부생리활성기능은생균보다사균이더뛰어난효과를가지고있음 - 생균인경우저온보관에서도세포구성성분의분해가일어나지만열처리사균은안정성이증가됨 - 사균체는생균제와는비슷하거나뛰어난생리활성을보일수있음 (Demont et al. 2015) - 사균체의이용은생균제생산및판매과정의균수를유지하기위해필요한저온저장등의유통과정의단계가감소됨 - 생균은온도상승으로사멸함으로열처리공정이필요한다양한형태의생균제가공제품은생산하기곤란함 사균체제조국내외의제조현황 - 국내 : 경희대와바이오제닉스가유산균관련연구에사균체생산연구도포함하여진행 - 국외 : 일본에서는제품이생산판매되고있음유럽에서도꾸준한연구가진행중임 - 4 -
그림 1-5. 일본 K 주식회사에서 2010 년에생산한사균체생산공정도 현재일본에서는기능성유산균의경우생균뿐아니라사균제품의수효도증가하고 있음 국내에서개발된토종기능성유산균의국외수요가증가하고있음 일반적으로저농도의유산균시료에포함된유산균은간단한열처리로쉽게사균으로 전환됨 고농도유산균의사균화를위한열처리는유산균의변색을야기할수있음 살균공정과색소생성과의상관관계 - 가열에의한당이함유된식품처리는캐러멜화라는당의갈변반응을유발시킴 - Fructose는 110 에서캐러멜화가진행되고, Galactose, Glucose, Sucrose는 160 C에서캐러멜화가진행됨 - 고농도의균체를열처리하는과정에서시간이증가하면갈변반응에의한변색도증가함 - 유산균의세포벽성분에는 Glucose를포함한다양한육탄당이포함되어있음으로열처리에의한변색은당연한결과임 (Know & Holmwood, 1968) 유산균분말제품의생산은통상적으로균체를회수한후, 동결건조방법으로유산균 균체의수분을제거하여유산균의활성을유지함 - 5 -
분말형태의유산균사균을만드는과정에서는균체의살균과분말제품의변색방지를 모두충족해야함 특히배양후동결건조를위해원심분리한유산균은균체의농도가높아짐. 고농도의균체 (>10 11 CFU/ml) 의경우고농도의균체를용기에넣은후 121 고압증기살균기 (autoclave) 를이용한살균에서용기내의균체 1회의 autoclave 처리에의해완전히살균되지않음. 고농도의균체 (>10 11 CFU/ml) 의경우살균효율을증진시키기위해반복적인열처리를 하는경우열처리시간의증가에따라갈변화가유도될수있고최종분말형태제품의 변색일발생할수있음 사균체의수효가늘어날것으로예측되는현시점에서, 기능성유산균균체의변색이 유발되지않고, 고농도의균체시료를효과적으로살균할수있는공정의개발이필요함 극초단파는물질이내부에에너지를전달하여시료내부의온도를올릴방법임 극초단파를이용한사균제조공정은균체의색을변화시키지않고균체를모두살균할 수있는최적의방법을제시할수있을것으로사료됨 기존의살균기술과마이크로웨이브살균기술의특징및장단점비교필요 장점 - 기존장비이용 기존의살균기술 마이크로웨이브살균기술 - 고농도미생물살균이용이함 - 열전달방식이전자파로전달 : 2450 MHz 의주파수로시료내부와외부에동일한열전달가능 : 시료내부외부동일하게열전달 - 균체변색없음 단점 - 고농도미생물살균이잘되지않음 - 열전달방식의차이로미생물입자내부로열전달이어려움 : 시료외부로부터내부로열전달 - 균체변색발생 - 신규장비필요 - 마이크로웨이브의장비제작및조립 - 최적살균조건을찾기위한전자파조사방법결정이필요함 - 열처리후건조 - 마이클웨이브처리후건조 균체변색 - 6 -
열처리에의해균체사멸이원활하게진행되지않음을나타내는선행연구 - 고온에서장시간처리후 Lactobacillus sakei의생균수변화 - 고농도의균체를사멸하기위해열처리시 6일간의 85 처리에서도최초사용한 5 10 10 (CFU/g) 의균은실험종료후에 10 7 (CFU/g) 이상생존하였음 그림 1-6. 열처리후균체사멸 - 열처리에의한유산균분말의변색 : 10 7 (CFU/g) 이상이생존한열처리시료에서균체의색이갈색으로변색되었음 - 열처리에의한유산균분말의품질변화 : 장시간고온처리시균체시료에서는탄냄새가남 그림 1-7. 사균체분말생산을위한가열후분말의변색 마이크로웨이브에의한열전달방식의문제점 - 마이크로웨이브파장에의해기기내부에서특정부분에만열이집중되는현상이발생 - 가정용전자렌지는하부의회전판에의해시료의열전달을도움 - 고농도세균의전자파처리는연전달의효율성을올리는방법이필요함 - 마이크로웨이브조사장치내의열전달이일정하지않음 - 7 -
유산균시장분석 - 기능성프로바이오틱이사용된제품의시장은점차증가하는추세임 - 8 -
1-3. 연구개발범위 1- - 9 -
- 10 -
3. 연구수행내용및결과 - 11 -
- 12 -
- 13 -
Pro65 Wet cell을살균수와혼합하여생균수가 CFU/ml 농축액제조 제조된농축액 1L를조리용유리용기에첨가 마이크로웨이브를 10분간격 30분까지처리하며갈변화, 온도, 생균수측정 - 14 -
- 15 -
1-16 -
- 17 -
- 18 -
- 19 -
- 20 -
- 21 -
- 22 -
- 23 -
- 24 -
- 25 -
Gas Chromatograph 장비 Gas Chromatograph 170 C to 270 C at 5 C per minute flame ionization detector - 26 -
나. 연구결과 - 27 -
시험구 CFU/g 1 3.22E+11 2 3.02E+11 3 3.88E+11 4 3.71E+11 5 3.45E+11 표준편차 3.5E+10 평균 3.45E+11-28 -
- 29 -
시험구 ( 처리시간, 분 ) CFU/mL 1 (10) 2 (20) 3 (30) - 30 -
10 높이 (cm) 시간 ( 초 ) 3.8 30s 50s 70s 100s 130s 162s 192s 9 30s 60s 90s 120s 150s 180s 12 30s 60s 90s - 31 -
12-32 -
A +++ ++++ +++ B ++++ ++++ +++ ++++ +++ ++ +++ ++++ ++++ + +++ +++ ++++ ++++ +++ ++++ ++ ++ ++++ ++++ C ++++ ++ ++ D + + ++ ++ ++++ ++++ ++++ + ++++ ++++ ++++ ++ ++ +++ ++++ ++++ +++ +++ ++++ 13 14-33 -
15-34 -
16-35 -
17-36 -
19 1-37 -
마이크로웨이브연속조사용나선형유리관설계및제작 마이크로웨이브연속조사를위해전자레인지내에장착된나선형유리관 - 38 -
마이크로웨이브연속조사를위해조사장치구성 마이크로웨이브연속조사 차 - 39 -
마이크로웨이브연속조사 차 마이크로웨이브연속조사 차 - 40 -
마이크로웨이브연속조사중유체속도및전자파강도에의한시료 탄화 탄화시료의 를이용한세척 탄화시료 마이크로웨이브연속조사 차 차반복 마이크로웨이브연속조사 차 개연결처리 - 41 -
- 42 -
- 43 -
- 44 -
게놈 를 추출한후 전기영동으로확인함 - 45 -
생균체에비해사균체의 는많은단편화가진행된것으로나타남 단편화된 의 크기는약 정도에집중되는것으로나타남 - 46 -
수를늘리면증류수에서도 의증폭이관찰됨 의증폭산물의양이 의것보다많은것으로나타남 - 47 -
A B Lactobacillus sakei Probio 65 세포의마이크로웨이브처리에의한형태 A, 처리전 ; B, 처리후 - 48 -
A B Lactobacillus sakei Probio 65 세포의 에의한형태변이 A; Autoclave 처리전, B; Autoclave 처리후 A B Lactobacillus sakei Probio 65 동결건조사균의현미경사진 A; Autoclave 처리사균, B; 마이크로웨이브처리사균 - 49 -
- 50 -
사균체시료동결건조된시료의세포수 (CFU/g) 1 1.2E+12 2 1.1E+12 3 7.3E+11 4 9.7E+11 5 1.5E+12 6 1.4E+12 7 1.3E+12 표준편차 2.8E+11 평균 1.2E+12-51 -
- 52 -
(A) (B) (C) - 53 -
Methyl palmitate 의구조 분석에사용되는시료의양및조성 표준물질 : Methyl palmitate 1mg + hexane ; Methyl palmitate 0.5mg + hexane ; Methyl palmitate 0.1mg + hexane ; Methyl palmitate 0.01mg + hexane 생균혹은사균의동결건조시료 : 시료1 10mg : 시료2 10mg : 시료3 10mg : 시료2 10mg + 0.1mg Gylceryl triundecanoate : 시료3 10mg + 0.1mg Gylceryl triundecanoate : 시료4 10mg + 0.1mg Gylceryl triundecanoate : 시료3 100mg + 0.1mg Gylceryl triundecanoate : 시료4 100mg + 0.1mg Gylceryl triundecanoate : 시료5 10mg + 0.1mg Gylceryl triundecanoate : 시료6 10mg + 0.1mg Gylceryl triundecanoate - 54 -
다른시험구에서배양한 Lactobacillus sakei Probio 65 균체의지방산 구성 FAME # 구성비율 ( 평균, n=10, %) 표준편차 14:0 3.4 1.5 16:0 26.0 1.6 18:0 1.1 1.2 18:1 w9c 24.2 3.9 Sum F 3 & 7.4 1.7 Sum F 7 16.2 9.8 Sum F 8 19.1 6.1 Methyl palmitate (mg/ml) # GC chromatogram의 Response area 0 0 0.01 8172 0.1 79342 0.5 394313 1 771221 10 6502000 100 65120000-55 -
μ μ μ - 56 -
다른 batch 의 Lactobacillus sakei Probio 65 사균체시료에서추출한 FAME 중 methyl palmitate 의 response area 로추정한 methyl palmitate 의양 - 57 -
다. 연구개발성과 공인분석기관검사성적서 - 58 -
발명의명칭 마이크로웨이브처리장치출원일자 년 월 일출원번호 출원인 주식회사프로바이오닉발명자 김병천 박용하 마이크로웨이브처리장치의대표도 - 59 -
발주제폼포장및배송내역 - 60 -
제품발주서 - 61 -
2 사균체시제품식품표시및소포장 사균체시제품 10Kg - 62 -
사균체제조공정서 제조공정서 제품명 Lactobacillus sakei Probio 65 사균 상호 프로바이오닉사업장소재지 등록번호 314-81-33767 전화 070-4923-0650 팩스 02-566-0652 전라북도전주시덕진구원장동길 111-18 공정공정조건기능성지표수율 종균배양 종균확인 : 종균의 16s rdna 염기서열확인배양배지 : MRS broth medium* ( 별첨 1) 배양조건 : 37, 16~18 시간배양 * 배양배지는종균배양과본배양에서동일 유산균 1 10 8 CFU/mL 100 본배양 배양배지 : MRS broth medium ( 별첨 1) 배양조건 : 30~37, 16~18 시간배양종균및물 : 유산균 3% 및물 91.494% 투입 유산균 2 10 9 CFU/mL 100 원심분리 균현탁 살균 회전속도 : 15,000rpm 시간 : 3~4 시간 세포현탁 : 살균수와혼합후균질화 살균조건 1*: 마이크로웨이브연속처리장치처리 *2 회연속해서반복살균조건 2 # : 121, 15min 열처리후상온에서 1 일방치 # 3 회연속해서반복 유산균수 1 10 11 CFU/g 유산균수 < 1000 CFU/g 0.6 0.6 예비동결 예비동결조건 : 영하 40 / 6~12 시간 동결건조 분쇄 사균원말 동결건조조건 : 5torr, 영하 40 에서영상 20 로 온도변화, 60 시간 분쇄기에서분쇄 Lactobacillus sakei Probio 65 사균 Methyl palmitate 1.8mg/g Methyl palmitate 1.8mg/g 0.19 0.19-63 -
사업화성과 사업화성과및매출실적 항목 세부항목 성과 매출액 개발제품개발후현재까지 0.05억원향후 3년간매출 2억원관련제품개발후현재까지 50억원향후 3년간매출 200억원 국내 : 1% 개발후현재까지국외 : 0.1% 개발제품국내 : 1% 사업화향후 3년간매출시장국외 : 30% 성과 점유율국내 : 5% 개발후현재까지국외 : 50% 관련제품국내 : 20% 향후 3년간매출국외 : 50% 세계시장 현재제품세계시장경쟁력순위 위 경쟁력순위 3년후제품세계시장경쟁력순위 위 사업화계획및매출실적 항목세부항목성과 사업화소요기간 ( 년 ) 3 소요예산 ( 백만원 ) 50 예상매출규모 ( 억원 ) 현재까지 3 년후 5 년후 0.05 2 5 사업화계획 시장점유율 단위 (%) 현재까지 3 년후 5 년후 국내 1 3 5 국외 0.1 0.3 0.5 향후관련기술, 제품을응용한타모델, 제품개발계획 개별인정형사균체프로바이오틱제품생산 무역수지개선효과 ( 단위 : 억원 ) 현재 3년후 5년후 수입대체 ( 내수 ) 수 출 - 64 -
4. 목표달성도및관련분야기여도 4-1. 목표달성도 - 65 -
- 66 -
5. 연구결과의활용계획 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 7. 연구개발결과의보안등급 8. 국가과학기술종합정보시스템에등록한연구시설장비현황 9. 연구개발과제수행에따른연구실등의안전조치이행실적 - 67 -
10. 연구개발과제의대표적연구실적 코드번호 D-12 번호 구분 ( 논문 / 특허 / 기타 논문명 / 특허명 / 기타 소속 기관명 역할 논문게재지 / 특허등록국 가 Impact Factor 논문게재일 / 특허출원일 사사여부 ( 단독사사또는중복사사 ) 특기사항 (SCI 여부 / 인용횟수등 ) 1 특허마이크로웨이브처리장치 프로바 이오닉 주관대한민국 2016.11.08 단독. 2 논문 Self-medication and antibiotic resistance: Crisis, Current challenges, and prevention 프로바 이오닉 주관사우디아라비아 1.78 2017. 1.12. 단독 SCIE Application of microwave for the 3 기타 production of ghost probiotics 프로바 이오닉 주관대한민국. 2016.4.22... with concentrated Lactobacillus cells - 68 -
11. 기타사항 - 69 -
12. 참고문헌 - 70 -
8. 뒷면지 주의 1. 이보고서는농림축산식품부에서시행한고부가가치식품기술개발사업의연구보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표하는때에는반드시농림축산식품부에서시행한고부가가치식품기 술개발사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개하여서는아니됩니다.