J Korn So Foo Si Nutr 한국식품영양과학회지 46(4), 417~425(17) https://oi.or/1.3746/jkn.17.46.4.417 GS 위암세포에서 kt/gsk-3β/p53 신호경로조절을통한벌사상자에탄올추출물의 G1 Cll Cyl rrst 유도효과 임은경 1 김은지 1 김보민 1 김상용 2 하성호 3 김영민 1 1 한남대학교생명시스템과학과 2 신안산대학교식품생명과학과 3 한남대학교화공신소재공학과 Ethnol Extrt rom Cniium monniri (L.) Cusson Inus G1 Cll Cyl rrst y Rultin kt/gsk-3β/p53 Sinlin Pthwys in GS Gstri Cnr Clls Eun Gyon Lim 1, Eun Ji Kim 1, o Min Kim 1, Sn-Yon Kim 2, Sun Ho H 3, n Youn Min Kim 1 1 Dprtmnt o ioloil Sins n iothnoloy n 3 Dprtmnt Chmil Eninrin, Hnnm Univrsity 2 Dprtmnt o Foo Sin & io Thnoloy, Shinnsn Univrsity STRCT Cniium monniri (L.) Cusson is istriut in Chin n Kor, n th ruit o C. monniri is us s tritionl Chins miin to trt runl n pin in ml nitli. In this stuy, w xmin th nti-prolirtion n ll yl rrst ts o thnol xtrts rom C. monniri (CME) in GS stri nr lls. Our rsults show tht CME supprss ll prolirtion n inu rls o ltt hyrons (LDH) in GS lls y 3-(4,5-imthyl-2-thizolyl)-2,5-iphnyl-2H-ttrzolium romi ssy n LDH ssy. Cll morpholoy ws ltr y CME in os-pnnt mnnr. In orr to intiy th ll yl rrst ts o CME, w invstit ll yl nlysis tr CME trtmnt. In our rsults, CME inu ll yl rrst t G1 phs. Protin kins (kt) plys mjor rol in ll survivl mhnisms suh s rowth, ivision, n mtstsis. kt protin rults vrious ownstrm protins suh s lyon synths kins-3β (GSK-3β) n tumor protin p53 (p53). Exprssion lvls o p-kt, p-gsk-3β, p53, p21, ylin E, n ylin-pnnt kins 2 (CDK2) wr trmin y Wstrn lot nlysis. Protin lvls o p-kt, p-gsk-3β, n ylin E wr ru whil thos o p53, p21, n p-cdk2 (T14/Y15) wr lvt y CME. Morovr, trtmnt with CME, LY292 (phosphoinositi 3-kins/kt inhiitor), IO (GSK-3β inhiitor), n Piithrin-α (p53 inhiitor) show tht ll yl rrst ts wr mit throuh rultion o th kt/gsk-3β/p53 sinlin pthwy. Ths rsults sust tht CME inus ll yl rrst t G1 phs vi th kt/gsk-3β/p53 sinlin pthwy in GS stri nr lls. Ky wors: kt/gsk-3β/p53 sinlin pthwy, GS, thnol xtrts rom Cniium monniri, G1 rrst 서 벌사상자 [Cniium monniri (L.) Cusson] 는산형과의일년생초본으로중국과한국에분포하며, 여성의생식기질환및화농성피부염에효과적인한약재로알려져있다 (1). 벌사상자의대표적인성분에는 osthol과 xnthotoxol 등이있으며, 벤젠고리 (nzn rin) 를가지고있어주로에탄올과같은유기용매로추출이이루어진다 (2,3). 이러한 Riv 3 Jnury 17; pt 21 Frury 17 Corrsponin uthor: Youn Min Kim, Dprtmnt o ioloil Sin n iothnoloy, Coll o Li Sin n Nno Thnoloy, Hnnm Univrsity, Djon 354, Kor E-mil: sysy38@mil.om, Phon: +82-42-629-87 론 벌사상자의활성성분은 nulr tor kpp (NF-κ) 와 miton-tivt protin kins(mpk) 신호경로의활성을차단하여면역기능을개선하고, 염증반응을유발하는것으로알려진일산화질소 (nitri oxi, NO) 의생성을저해하여염증반응을억제하는것으로알려져있다 (4-6). 이외에도인체유방암세포에벌사상자로부터추출한 osthol을처리하였을때암의전이 (mtstsis) 와관련이깊은세포이동 (ll mirtion) 및세포침투 (ll invsion) 가저해되었다고보고되었으며, 벌사상자 99% 에탄올추출물을 HCT 116 대장암세포주에처리하였을때 G1기세포주기정지와세포사멸 (poptosis) 을유도한다고보고되었다 (7-9). 이처럼최근에는기존항암제의여러가지부작용과내성에대한문제점이증가함에따라천연추출물에함유된
418 임은경 김은지 김보민 김상용 하성호 김영민 다양한생리활성물질의항암효과를규명하기위한많은연구가진행되고있다 (1-12). Protin kins (PK/kt) 는세포의생존과분열, 이동과관련된단백질로많은암종에서과발현되고있으며, lyon synths kins-3β(gsk-3β), tumor protin p53 (p53) 과같은 ownstrm 단백질의발현및활성을조절하여암세포의증식을유도한다 (13). 인산화된 kt는 GSK-3 β의 srin 9 잔기에인산기를붙임으로써 GSK-3β의활성을억제하는것으로알려져있으며, 불활성화된 GSK-3β는 p53과결합하여세포내 p53의위치를조절하고, p53이핵으로이동하지못하도록저해함으로써 p53의표적유전자들의전사활성을조절하여세포의성장및분열을유도한다 (14,15). 세포주기 (ll yl) 는 G1, S, G2 및 M기로구성되어있으며, G1기와 G2기에세포주기를조절하는 hkpoint 가존재하는것으로알려져있다 (16). 정상적인세포는 DN m, ROS, luos privtion과같은스트레스에의하여손상을입게되면 hkpoint를통해세포분열을중지하지만이와달리암세포는스스로분열을조절하지못하고비정상적인분열을통하여무한정적인증식을한다 (16, 17). 세포주기의진행에있어서중요하게작용하는인자로는 ylin과 ylin-pnnt kins(cdk) 가있으며, ylin-cdk 복합체가형성되어야다음주기가진행된다 (18). G1/S hkpoint에는 ylin D-CDK4/6 복합체와 ylin E-CDK2 복합체가관여하며, G2/M hkpoint에는 ylin -CDK2 복합체와 ylin -CDK1 복합체가관련되어있다 (19). Cylin과 CDK는많은암세포주에서과발현되고있으며, ylin-cdk 복합체의저해가세포주기정지 (ll yl rrst) 를통한암세포의증식억제에효과적인것으로보고되었다 (). CDK kins inhiitor(cki) mily로는 p53, p21, p27이있으며, 이들은 ylin-cdk 복합체를저해하여세포주기정지를유도하는것으로알려져있다 (18,21). 따라서본연구에서는벌사상자에탄올추출물 (CME) 을 GS 위암세포에처리한후세포주기정지유도효과가발생하는지확인하였고, 세포주기와관련된단백질의발현변화와 kt/gsk-3β/p53 신호경로의조절을확인함으로써 CME 가어떠한신호경로를통하여세포주기정지를유도하는지확인하고자하였다. 재료및방법실험재료본실험에서사용된벌사상자는동경종합상사 ( 주 )(Soul, Kor) 에서구입하였고, 벌사상자 1 에 99.9% 에탄올 ml를가하여 72시간동안상온에서환류추출하였다. 이러한방법으로추출된벌사상자에탄올추출물 (CME) 을 6 μm iltr ppr(qulittiv iltr ppr NO.1, Toyo Roshi Kish, Lt., Tokyo, Jpn) 로 2회여과하여감압농축시킨후수득된추출물은 -86 C에서보관하였다. 농도별 CME는상기추출물을동일용량의 imthylsuloxi (DMSO) 에녹여만들었으며, - C에서냉동보관하여사용하였다. LY292와 IO는 Cliohm(Sn Dio, C, US) 에서구입하였고, Piithrin-α는 Sim-lrih Co.(St Louis, MO, US) 에서구입하였으며, 각각 mm, 1 mm, 1 mm stok으로만들어사용하였다. 세포배양본실험에서사용된 GS 세포는 mrin Typ Cultur Colltion(TCC, Rokvill, MD, US) 에서분양받았으며, 1% tl ovin srum(fs, HyClon Lortoris In., Lon, UT, US) 과 1% ntiiotis가포함된 RPMI 16 mi(hyclon Lortoris In.) 를사용하여 5% CO 2, 37 C 조건에서배양하였으며, HCT 세포는 Dr. Fusni(Grmn Cnr Rsrh Cntr, DKFZ, Hilr, Grmny) 으로부터분양받아 1% tl ovin srum과 1% ntiiotis가포함된 DMEM mi (HyClon Lortoris In.) 를사용하여 5% CO 2, 37 C 조건에서배양하였다. 48시간마다 Trypsin-EDT(Hy- Clon Lortoris In.) 를이용하여세포를부유상태로만든다음세포를 1 1 6 lls/ml로분주하고계대배양하였다. MTT ssy 12 wll plt에 GS 세포를 1 1 5 lls/ml로분주하고 24시간동안안정화한후 CME를처리하여 24, 48시간동안 5% CO 2, 37 C 조건에서배양하였다. 배양이끝난후 5 m/ml 3-(4,5-imthyl-2-thizolyl)-2,5-iphnyl- 2H-ttrzolium romi(mtt, Sim-lrih Co.) solution을각 wll당 μl씩첨가하여 1시간동안 CO 2 inutor에서반응시켰다. MTT solution이포함된 mi를제거하고 PS wshin 후 PS를완전히제거하였다. 각 wll당 DMSO 15 μl를첨가하여생성된 ormzn을모두녹인다음 96 wll plt에 1 μl씩옮긴후 ELIS miroplt rr(io-r mol 6, io-r Lortoris In., Tokyo, Jpn) 로 595 nm에서흡광도를측정하였다. 측정은모두 3번이상하였으며, 이에따른평균값과표준오차는 Mirosot Exl prorm을사용하여분석하였다. LDH rls ssy LDH 방출량은 Pir TM LDH Cytotoxiity ssy Kit (Thrmo Sintii, Rokor, IL, US) 을사용하여측정하였다. 24-wll plt에 GS 세포를 1 1 4 lls/ml로분주하여 24시간동안배양시킨후 CME를농도별 (~1 μ/ml) 로처리하였다. 24시간배양후 hih ontrol에 1
GS 위암세포에서벌사상자추출물의 G1 rrst 유도효과 419 Lysis ur(thrmo Sintii) 를 5 μl 첨가하여 CO 2 inutor에서 45분동안반응시켰다. 각 wll의상등액을 96-wll plt에 5 μl씩옮긴다음 Rtion Mixtur(.6 ml o ssy ur with 11.4 ml o Sustrt Mix) (Thrmo Sintii) 5 μl와암실에서 3분동안반응시킨후 ELIS miroplt rr(io-r mol 6, io- R Lortoris In.) 로 49, 6 nm에서흡광도를측정하였다. 측정은모두 3번이상하였으며, 이에따른평균값과표준오차는 Mirosot Exl prorm을사용하여분석하였다. 세포형태학적변화관찰 6-wll plt에 GS 세포를 wll당 1 1 5 lls/ml로분주하여 24시간동안배양한다음 CME를농도별 (~1 μ/ml) 로처리하였다. 24시간동안배양시킨후도립현미경 ( mniition, xiovrt 1, Ziss, Orkohn, Grmny) 을이용하여 ll morpholoy hn를관찰하였다. 유세포분석기를통한세포주기측정세포주기는유세포분석기 (Fluorsn-tivt Cll Sortin, FCS) 를사용하여측정하였다. GS 세포를 mm ish에 1 1 5 lls/ml의농도로분주하여 24시간배양후, CME를 24시간동안농도별 (,, μ/ml) 로처리하였다. 배지를제거하고 PS로 wshin 한후 Trypsin-EDT(HyClon Lortoris In.) 를처리하고 ntriu(3, rpm, 5분 ) 를통하여세포를모아주었다. PS.3 ml로세포를부유시키고 7% 에탄올.7 ml로세포를고정하였다. 고정된세포를다시 PS로세척하고 RNs (1 m/ml) 2.5 μl와 PI(25 m/ml) 를각각 2.5 μl씩첨가하여상온에서 3분간염색시킨다음, Flow ytomtry- FCS Cnto(D iosins, Driv Frnklin Lk, NJ, US) 로분석하여결과를측정하였다. Wstrn lot nlysis 6-wll plt에 GS 세포를 wll당 1 1 5 lls/ml로분주하여 24시간동안배양한다음 CME를농도별 (,, μ/ml) 로처리한후, 24시간동안 CO 2 inutor에서배양하였다. 배양이끝난세포에 RIP lysis ur[25 mm Tris-Cl(pH 7.4), 1% NP,.5% soium oxyholt, 15 mm NCl, 1 mm PMSF] 를각 wll에 15 μl씩첨가하여단백질을분리한후 14, rpm, 4 C에서 분동안원심분리하여상등액을취하였다. 추출한단백질은 ELIS rr를이용하여 595 nm에서흡광도를측정하여정량한후 8%, 12% rylmi l을이용하여전기영동을실시한다음 nitrollulos mmrn에 trnsr 하였다. 그다음에 2% ovin srum lumin(s) 을이용하여상온에서 1시간 3분동안 lokin 한후, 1차항체를 4 C에서 밤새반응시키고 2차항체를결합시킨다음실험결과를측정하였다. 통계처리통계프로그램인 SPSS(22., IM Corp., rmonk, NY, US) 를사용하였고실험설계에대한분산분석은독립표본 t-tst(inpnnt smpl t-tst) 와일원배치분산분석 (on-wy NOV) 을실시하였고, 일원배치분산분석에대한사후검정은 Dunn의다중범위검정 (multipl rn tst) 을통하여검정하였다. 각자료는 3번이상의반복된실험을통하여얻은결과로검정하였고 P<.5인경우통계적으로유의한것으로판정하였다. 결과및고찰 CME 처리에따른 GS 위암세포의증식억제유도효과및형태학적변화관찰암세포는비정상적인세포분열을통하여과다증식하는특징을가지고있으며, 선행연구에따르면천연추출물이암세포증식억제에효과적이라고보고되었다 (22,23). 따라서본연구에서는 CME가 GS 위암세포의생존율에미치는영향을알아보기위하여농도별로 CME(1~1 μ/ml) 를처리한후 MTT ssy를실시하였다. 그결과 Fi. 1에서와같이 CME를 GS 위암세포에처리하였을때농도의존적으로세포생존율이감소하는것을확인하였으며, 24시간처리군보다 48시간처리군에서더높은세포증식억제유도효과를확인하였다. 세포가손상을입게되면세포질에존재하던젖산탈수소효소 (ltos hyrons, LDH) 가세포외부로방출되는것으로알려져있으며, 방출되는 LDH 의양을측정하여세포독성정도를정량적으로확인할수있다 (). 본연구에서는 CME의세포독성을측정하기위하여 CME를농도별로처리한후방출되는 LDH 양을측정하였으며, 그결과농도의존적으로 LDH 방출량이증가하는것을확인하였다 (Fi. 1). 정상세포인인간상피세포 (HCT) 에 CME를농도별로처리하였을때세포생존율이감소하지않은것으로보아 CME 처리에의한세포생존율감소및세포독성유도효과는 GS 위암세포에한정적인것으로확인하였다 (Fi. 1C). 정상세포는핵이나세포질의형태가일정하고세포의이동과관련된 lmllipoi와 ilopoi가잘관찰되지만, 세포사멸시에는세포골격단백질의변화로인하여세포질이응축되고핵이분절되며, lmllipoi와 ilopoi의소실과같은특이적인형태학적변화가관찰된다 (24,25). 선행연구에의하면 GS 위암세포에양유향, 흑마늘추출물과같은천연추출물을처리하였을때세포밀도의감소및핵의응축과같은형태학적변화가관찰되는것으로보고되었다 (26,27). 이에따라본연구에서도 CME를 24시간동안처리한후형태학적변화를관찰하였다. 그결과 Fi. 1D에서
임은경 김은지 김보민 김상용 하성호 김영민 4 LDH rls (% o ontrol). 16 14 12 NS 1 8 N 1 GS, CME (μ/ml), 24 h Cll viility (% o ontrol). C NS 1 GS, CME (μ/ml), 24 h 1 N HCT, CME (μ/ml), 24 h Fi. 1. Cytotoxi n nti-prolirtion ts o thnol xtrts rom Cniium monniri (CME) in GS stri nr lls. () Clls wr trt with vril onntrtions o CME (1 1 μ/ml) or 24 h n 48 h. Cll viility ws msur y MTT ssy. () LDH rls ws msur y LDH rls ssy. (C) Cll viility o HCT lls. Cll viility ws msur y MTT ssy. Th sttistil nlysis o th t ws rri out y us o t-tst. P<.5,,##P<.1, n,###p<.1 ws ompr to ontrol. NS: not siniint (h xprimnt, n=3). (D) Th ll morpholoy hn tr trtmnt o CME ws osrv y invrt mirosops ( mniition, xiovrt 1, Ziss, Orkohn, Grmny). 와 같이 농도가 증가할수록 일정했던 모양이 불규칙적으로 확인하였다. 선행연구에서도 다양한 암세포주에 천연추출 바뀌었으며 세포질의 응축과 lmllipoi와 ilopoi의 소 물을 처리하였을 때 G1기 정지가 유도된다고 보고되었다 실로 인하여 세포가 ll ultur plt에 부착하지 못하고 (16,,29). 본 연구에서도 CME 처리에 따라 G1기의 세포 떨어짐으로써 세포 밀도가 감소하는 것을 확인하였다. 따라 가 증가하는 것으로 보아 GS 위암세포의 증식 억제 유도 서 본 실험들을 통하여 CME의 처리가 GS 위암세포에서 효과는 G1기 정지에 의한 것임을 확인하였다. 세포증식을 억제하고 세포독성 효과를 보이며, 세포의 형태 학적 변화를 유도한다는 것을 확인하였다. CME 처리에 따른 세포주기 관련 단백질의 조절 CME 처리에 의한 GS 위암세포의 세포주기 정지 유도 효과 srin 9 잔기에 인산화를 유도하여 GSK-3β를 비활성화시 암세포의 증식에 중요한 역할을 하는 kt는 GSK-3β의 세포주기가 정지되면 세포는 손상된 DN를 복구하고 세 키고, 비활성화 상태의 GSK-3β는 세포주기와 밀접하게 관 포주기 진행에 필요한 단백질을 합성하여 다음 주기(phs) 련된 p53의 분해를 유도하여 암세포의 비정상적인 분열을 로의 진행을 유도하지만, 복구할 수 없는 심각한 손상을 입 돕는 것으로 알려져 있다(14,15,3). p53은 핵 안으로 이동 게 되면 스스로 사멸에 이르는 것으로 알려져 있다(28). 이 하여 p21의 전사를 유도하며, p21 단백질은 ylin-cdk 에 따라 본 연구에서는 CME 처리에 의한 세포증식 억제 복합체를 저해함으로써 세포주기 정지를 유도한다(18). G1 유도 효과가 세포주기 정지에 의한 것인지 알아보기 위하여 기와 관련된 ylin-cdk 복합체는 ylin E와 CDK2가 있 CME를 농도별(,, μ/ml)로 24시간 동안 처리한 으며, p21이 CDK2에 결합하여 복합체의 형성을 저해하는 후 세포주기를 측정하였다. 그 결과 Fi. 2에서와 같이 아무 것으로 보고되었다(16). 이에 따라 본 연구에서는 CME를 것도 처리하지 않은 ontrol군에서는 G1기가 42.54%이지 GS 위암세포에 농도별(,, μ/ml)로 24시간 동안 만, CME 농도별 처리군에서는 μ/ml에서 49.4%, 처리한 후 세포주기와 관련된 단백질들의 발현 변화를 μ/ml에서 57.93%, μ/ml에서 62%로 증가하는 것을 wstrn lot nlysis를 통하여 확인하였다. 그 결과 p-
GS 위암세포에서벌사상자추출물의 G1 rrst 유도효과 421 GS, CME (μ/ml), 24 h G1 S G2 PI % o ll. ' ' ' '' ' '' Non GS, CME (μ/ml), 24 h DN Contnt Fi. 2. Cll yl rrst t o CME in GS stri nr lls. Clls wr trt with vril onntrtions o CME ( μ/ml) or 24 h. () CME ours ll yl rrst t G1 phs. Cll yl rrst ts wr msur y low ytomtri () Th rph o ll yl phss. Th sttistil nlysis o th t ws rri out y us o on-wy NOV with Dunn s multipl rn tst (P<.5) (h xprimnt, n=3). Similr roups wr lssii usin this hrtr (-, ', n ''-). kt, p-gsk-3β, ylin E의발현이저해되었으며 (Fi. 3, 3), p-p53, p53, p21, p-cdk2(t14), p-cdk2(y15) 의발현이증가하는것을확인하였다 (Fi. 3, 3C). 선행연구 에서도 p53과 p21의증가가 ylin E의발현을억제하고, CDK2의 Thr 14, Tyr 15 잔기에인산화를시킴으로써 G1 기정지를유도한다고보고되었다 (16,,31). 따라서본실 p-kt Sr473 kt p-p53 Sr15 p53 p-gsk-3β Sr9 GS, CME (μ/ml), 24 h N Rltiv n intnsity (ols). 1.2 1.8.6.4.2 1. Non 1. 1..8.6.5.5.3.3.2.1. p-kt p-gsk3β Cylin E GSK-3β C 72.1 Non p21 p-cdk2 Tyr15 p-cdk2 Tyr14 Cylin E β-tin Rltiv n intnsity (ols). 7 5 3 1 49.5 26. 21.4 12.8 8.3 14.6 15.4 11.3 8.3 6.7 1. 1. 1. 1.9 2.9 1. 1. p-p53 p53 p21 p- CDK2(T14) p- CDK2(Y15) Fi. 3. CME rults ll yl-mit protin. () CME ts on p-kt, t-kt, p-p53, p53, p-gsk-3β, t-gsk-3β, p21, p-cdk2 (T14/Y15), n ylin E in GS stri nr lls. Clls wr trt CME ( μ/ml) or 24 h. Protin lvls wr trmin y wstrn lottin. Th β-tin pro srv s protin-loin ontrol. ( n C) Th rltiv n intnsitis wr quntii. Th sttistil nlysis o th t ws rri out y us o t-tst. P<.1 ws ompr to ontrol (h xprimnt, n=3).
422 임은경 김은지 김보민 김상용 하성호 김영민 험을통하여 CME의처리가 p-kt의발현을저해함으로써 p-gsk-3β의발현을저해하고, p53과 p21의발현을증가시킴으로써 ylin E의발현감소와 p-cdk2의인산화를조절하여 G1기세포주기정지를유도하는것을확인하였다. kt, GSK-3β, p53 저해제가 GS 위암세포의증식과세포주기정지에미치는영향 kt, GSK-3β, p53 저해제가 GS 위암세포의증식과세포주기정지에미치는영향을알아보기위하여 GS 위암세포에 CME와 LY292(PI3K/kt 저해제 ), IO(GSK-3 β 저해제 ), Piithrin-α(p53 저해제 ) 를각각또는병행처리 하여세포생존율과세포주기를측정하였다. 선행연구에의하면 LY292를처리하였을때암세포의증식이억제되고, IO와 Piithrin-α 처리시에는암세포의생존율이증가한다고보고되었다 (,32). Fi. 4에서나타난바와같이 GS 위암세포에 LY292를처리하였을때 CME 처리군과비슷한증식억제유도효과가관찰되었으며, IO와 Piithrin-α를각각 CME와병행처리하였을때는 CME 처리에의한증식억제유도효과가관찰되지않았다. Fi. 4에서도 LY292 처리군에서는 ontrol 군에서 43.15% 였던 G1 기세포가 48.32% 로증가했지만, CME/IO 처리군에서는 44.97%, CME/Piithrin-α 처리군에서는 44.16% 로 G1기 GS, 24 h CME μ/ml LY292 μm Cll viility (% o ontrol). 1 1 1 PI CME μ/ml IO 1 μm - + - - + - + CME μ/ml - - + - - - - LY292 μm - - - + + - - IO 1 μm - - - - - + + Piithrin-α 1 μm CME μ/ml Piithrin-α 1 μm DN Contnt C G1 S G2 % o ll. ' '' '' ' '' ' ' ' '' - + - - + - + CME μ/ml - - + - - - - LY292 μm - - - + + - - IO 1 μm - - - - - + + Piithrin-α 1 μm Fi. 4. CME inus nti-prolirtion ts n ll yl rrst t G1 phs vi rultin KT/GSK-3β/p53 sinlin pthwys. Clls wr trt with μm LY292 or 1 μm IO or 1 μm Piithrin-α or μ/ml CME or 24 h. () Cll viility ws msur y MTT ssy. Th sttistil nlysis o th t ws rri out y us o on-wy NOV with Dunn s multipl rn tst (P<.5) (h xprimnt, n=3). Similr roups wr lssii usin this hrtr (-). () Cll yl rrst ts wr msur y low ytomtri. (C) Th rph o ll yl phss. Th sttistil nlysis o th t ws rri out y us o on-wy NOV with Dunn s multipl rn tst (P<.5) (h xprimnt, n=3). Similr roups wr lssii usin this hrtr (-, '-', n ''-).
GS 위암세포에서벌사상자추출물의 G1 rrst 유도효과 423 p-kt Sr473 kt p-p53 Sr15 p53 p-gsk-3β Sr9 GSK-3β p21 GS, 24 h - + - - + - + CME μ/ml - - + - - - - LY292 μm - - - + + - - IO 1 μm - - - - - + + Piithrin-α 1 μm Rltiv n intnsity (ols). 4. 3. 2. 1. Non CME LY292 IO CME+IO Piithrin-α CME+Piithrin-α 2.6 2.3 2.3 2. 1.5 1.6 1. 1. 1..9 1..8.8.6.6.5.5.3.3.3.1 p-cdk2 Tyr15 p-cdk2 Tyr14. p-kt p-gsk3β Cylin E Cylin E β-tin C Rltiv n intnsity (ols). 5. 4. 3. 2. 1.. 1. 2.6 4.2 3.7 1.7 1.6 1..9.4.5.2.2.2.2 1. 2.6 Non LY292 CME+IO CME+Piithrin-α CME IO Piithrin-α 1.5 1.4 1.4 1.3 1. 1. 1.1 1..3.2.2.2.1.1.1.2... p-p53 p53 p21 p-cdk2(t14) p-cdk2(y15) Fi. 5. CME rults ll yl-mit protins vi rultin KT/GSK-3β/p53 sinlin pthwys. Clls wr trt with μm LY292 or 1 μm IO or 1 μm Piithrin-α or μ/ml CME or 24 h. () Th xprssion o p-kt, t-kt, p-p53, p53, p-gsk-3β, t-gsk-3β, p21, p-cdk2 (T14/Y15), n ylin E protins in GS stri nr lls. Protin lvls wr trmin y wstrn lottin. Th β-tin pro srv s protin-loin ontrol. ( n C) Th rltiv n intnsitis wr quntii. Th sttistil nlysis o th t ws rri out y us o on-wy NOV with Dunn s multipl rn tst (P<.5) (h xprimnt, n=3). Similr roups wr lssii usin this hrtr (-). 정지가관찰되지않았다. 각처리군의자세한세포주기비율은 Fi. 4C에자세히나타내었다. 이러한결과를통하여 CME 처리에의한세포증식억제및 G1기정지유도효과가 kt/gsk-3β/p53 신호경로를통하여일어나는것임을확인하였다. kt, GSK-3β, p53 저해에따른세포주기관련단백질의조절 GS 위암세포에서 LY292, IO, Piithrin-α의처리가세포주기관련단백질에미치는영향을알아보기위하여각각의저해제를단독처리또는 CME와병행처리한후 wstrn lot nlysis를실시하였다. LY292의처리는 kt의인산화를저해함으로써 PI3K/kt 신호경로를차단하고 IO는 p-gsk-3β의발현을증가시키며, Piithrin-α 는 p53의전사활성을억제하여 p21의전사를저해한다. 저해제처리에따른세포주기관련단백질의발현변화를확인한결과, LY292 처리시 CME 처리군과유사하게 p- kt, p-gsk-3β, ylin E의발현이저해되었고, p-p53, p53, p21, p-cdk2(t14), p-cdk2(y15) 의발현이증가하는것을확인하였다 (Fi. 5). 또한, IO와 Piithrin-α를 CME 와각각병행처리하였을때세포주기관련단백질의발현이 ontrol군과유사한것을확인하였다. 이는 GSK-3β와 p53 신호경로가저해되었을때 CME 처리에의한세포주기관련단백질조절효과가나타나지않았다는것으로볼수있다. 따라서이러한결과를바탕으로 CME 처리에의한 GS 위암세포의 G1기세포주기정지유도효과는 kt/gsk-3β /p53 신호경로와관련된단백질들의발현조절을통하여일어난것으로확인하였다.
424 임은경 김은지 김보민 김상용 하성호 김영민 요 약 REFERENCES 벌사상자는여성의생식기질환이나화농성피부염에주로사용되어온한약재로, 최근들어암과관련된연구가많이이루어짐에따라벌사상자의항암효과에대한관심이높아지고있다. 벌사상자의대표적인성분인 osthol, xnthotoxol 등은벤젠고리화합물로에탄올과같은유기용매에잘용해된다. 이에따라본연구에서는 GS 위암세포에서벌사상자에탄올추출물 (CME) 에대한세포주기정지유도효과를확인하고자하였다. CME 처리에의한 GS 위암세포의증식억제유도효과및세포독성효과를확인하기위하여 MTT ssy와 LDH rls ssy를실시한결과, 농도및시간의존적으로세포생존율이감소하였으며, 농도의존적인세포독성효과를확인하였다. 또한, CME의농도가증가할수록 GS 위암세포의형태학적변화가관찰되었다. 이러한세포증식억제유도효과가세포주기정지에의한것인지확인하기위하여 CME를농도별로 24시간동안처리한후세포주기를측정하였다. 그결과 G1기의세포가농도의존적으로증가함을확인하였다. 그리고 CME의처리가세포주기와관련된단백질에미치는영향을알아보기위하여 wstrn lot nlysis를실시하여 G1기세포주기정지와관련된신호단백질들의발현변화를확인하였다. 그결과 CME의처리가세포증식과분열에중요한역할을하는 p-kt와 p-gsk-3β의발현을저해하는것을확인하였고, 이에따라 p53의발현과활성이증가하여 p21의발현이증가함을확인하였다. 또한, p21의증가에따른 ylin E의발현감소와 CDK2의비활성화상태인 p-cdk(t14), p- CDK(Y15) 의발현증가를확인하였다. 이와같은 CME의세포주기억제유도효과가일어나는신호경로를확인하기위하여 LY292(PI3K/kt 저해제 ), IO(GSK-3β 저해제 ), Piithrin-α(p53 저해제 ) 를 CME와각각또는병행처리한후 MTT ssy, 세포주기측정, wstrn lot nlysis를진행하였다. 그결과 LY292의처리는 CME 처리군과유사하게세포생존율을저해시키고 G1기정지를유도했으며, 세포주기단백질을조절하였다. 또한, GSK-3β와 p53 저해제를처리하였을때 CME를병행처리했음에도불구하고세포증식억제나 G1기정지와같은항암효과가나타나지않았으며, 관련신호경로단백질의변화도관찰되지않았다. 이러한결과는 CME의처리가 kt/gsk-3β/p53 신호경로를조절하여 ylin E의발현을감소시키고 CDK2 의활성을억제함으로써 G1기세포주기정지를유도함을확인하였다. 감사의글본연구는 17년도 ( 주 ) 포바이오의연구용역비에의해수행되었음. 1. Yn LL, Wn MC, Chn LG, Wn CC. 3. Cytotoxi tivity o oumrins rom th ruits o Cniium monniri on Lukmi ll lins. Plnt M 69: 191-195. 2. Liu, Wu Y, Qin G, Chn Y. 13. Optimum xtrtion o osthol n imprtorin rom th ruits o Cniium monniri (L.) Cusson y suprritil lui. Sp Si Thnol 48: 652-658. 3. Lio PC, Chin SC, Ho CL, Wn EIC, L SC, Kuo YH, Jyshok N, Chn J, Don WC, Cho LK, Hu KF. 1. Osthol rults inlmmtory mitor xprssion throuh moultin NF-κ, miton-tivt protin kinss, protin kins C, n rtiv oxyn spis. J ri Foo Chm 58: 1445-1451. 4. Kn OH, Kim SY, Kwon DY. 15. Ethyl tt rtion o Cniium monniri (L). Cussion supprsss PM plus 23187-inu inlmmtion rtion throuh lok o NF-κ n MPK tivtion. Korn J Phrmon 46: 195-2. 5. Zhn ZR, Lun WN, Chun HY, Chn CW. 15. Osthol: rviw on its iotivitis, phrmoloil proprtis, n potntil s ltrntiv miin. Evin-s Complmntry ltrn M 15: 919616. 6. Liu J, Zhn W, Zhou L, Wn X, Lin Q. 5. nti-inlmmtory t n mhnism o osthol in rts. Zhon Yo Ci 28: 12-16. 7. Lim EG, Kim GT, Kim M, Kim EJ, H SH, Kim SY, Kim YM. 16. poptoti ts n ll yl rrst ts o xtrts rom Cniium monniri (L.) Cusson throuh rultin kt/mtor/gsk-3β sinlin pthwys in HCT116 olon nr lls. J Li Si 26: 663-672. 8. Lim EG, Kim GT, L SH, Kim SY, Kim YM. 16. poptoti ts o xtrt rom Cniium monniri (L.) Cusson y nosin monosphospht-tivt protin kins-inpnnt pthwy in HCT116 olon nr lls. Mol M Rp 13: 4681-4688. 9. Yn D, Gu T, Wn T, Tn Q, M C. 1. Ets o osthol on mirtion n invsion in rst nr lls. iosi iothnol iohm 74: 143-1434. 1. kimoto M, Iizuk M, Knmtsu R, Yoshi M, Tkn K. 15. ntinr t o inr xtrt inst pnrti nr lls minly throuh rtiv oxyn spismit utoti ll th. PLoS ONE 1: 1265. 11. Kim, Im M, Gu MJ, M JY. 16. Ethnol xtrt o Lophthri Hr xhiits nti-nr tivity in humn nr lls y supprssion o mtstti n nioni potntil. Si Rp 6: 36277. 12. Votto PS, Dominus S, Souz MM, Silv Júnior FMR, Cls SS, Filuir DMV, Clmntin RM, Priml EG, Vllohi L, Furlon E, Trin GS. 1. Toxiity mhnisms o onion (llium p) xtrts n ompouns in multiru rsistnt rythrolukmi ll lin. iol Rs 43: 429-437. 13. Kim D, Chun J. 2. kt: vrstil mitor o ll survivl n yon. J iohm Mol iol 35: 16-115. 14. Kitishi Y, Koyshi M, Kikut K, Mtsu S. 12. Rols o PI3K/KT/GSK3/mTOR pthwy in ll sinlin o mntl illnsss. Dprss Rs Trt 12: 752563. 15. Jos KM, hv SR, Frrro DJ, Join JJ, Hllhn DE, Thotl D. 12. GSK-3β: iuntionl rol in ll th pthwys. Int J Cll iol 12: 9371. 16. Kim M, Kim GT, Lim EG, Kim EJ, Kim SY, H SH, Kim YM. 15. Cll yl rrst o xtrt rom rtmisi nnu
GS 위암세포에서벌사상자추출물의 G1 rrst 유도효과 425 Linné. vi kt-mtor sinlin pthwy in HCT116 olon nr lls. Korn So iothnol ion J 3: 223-229. 17. Shrr CJ. 1996. Cnr ll yls. Sin 274: 1672-1677. 18. Lim S, Klis P. 13. Cks, ylins n CKIs: rols yon ll yl rultion. Dvlopmnt 1: 379-393. 19. Gérr C, Goltr. 14. Th ln twn ll yl rrst n ll prolirtion: ontrol y th xtrllulr mtrix n y ontt inhiition. Intr Fous 4: 1375.. Kim EJ, Kim GT, Kim M, Lim EG, Kim SY, H SH, Kim YM, Yoo JG. 15. Cll yl rrst ts y rtmisi nnu Linné in Hp3 livr nr ll. Korn So iothnol ion J 3: 175-181. 21. Pitnpol J, Stwrt Z. 2. Cll yl hkpoint sinlin: Cll yl rrst vrsus poptosis. Toxioloy 181-182: 475-481. 22. L HN, Shin S, Choo GS, Kim HJ, Prk YS, Kim SK, Jun JY. 16. Inhiitory ts o spinh,, n onion xtrts on rowth o nr lls. J Korn So Foo Si Nutr 45: 671-679. 23. Shin S, L HN, Choo GS, Kim HJ, Prk K, Kim S, Jun JY. 16. Inution o poptosis in humn nr lls with xtrts o Trxum ornum, Youni sonhioli n Ixris ntt. J Foo Hy S 31: 51-58. 24. Prk SY, Kim JY, Prk KW, Kn KS, Prk KH, So KI. 9. Ets o thiosulints isolt rom llium turosum L. on th rowth o humn nr lls. J Korn So Foo Si Nutr 38: 13-17. 25. Kwon HN, n WS, Kim JY, Prk JR, Jon JR. 11. Et o r tmntosum M. xtrts on hptorinom ll. Korn J Foo Si Thnol 43: 787-79. 26. Ymmn M, Nuyn PH, yi MT, Méru F, Vron C. 15. ntiprolirtiv n propoptoti ts o l, ruit n stm xtrts o Pisti lntisus on humn olon n stri nr ll lins. Int J v Phrm iol, Chm 4: 738-745. 27. Shin DY, Yoom MK, Choi YW, Gwon OC, Kim JI, Choi YH. 9. poptosis inution y lk rli xtrts in GS humn stri rinom lls. Cnr Prv Rs 14: 35-358. 28. rnzi D, Foini M. 8. Rultion o DN rpir throuhout th ll yl. Nt Rv Mol Cll iol 9: 297-38. 29. Mur H, Hwt M, Ekhtir, ljpw, s, Drwish H, Snti O, Ghnnm. 16. Inution o G1- phs ll yl rrst n poptosis pthwy in MD-M- 231 humn rst nr lls y sult polyshri xtrt rom Lurni ppillos. Cnr Cll Int 16: 39. 3. Kulikov R, ohm K, lttnr C. 5. Glyon synths kins 3-pnnt phosphoryltion o Mm2 rults p53 unn. Mol Cll iol 25: 717-71. 31. L HS, Kim EJ, Kim SH. 15. Ethnol xtrt o Innotus oliquus (Ch mushroom) inus G 1 ll yl rrst in HT-29 humn olon nr lls. Nutr Rs Prt 9: 111-116. 32. Kim EJ, Kim GT, Kim M, Lim EG, H SH, Kim SY, Kim YM. 16. poptoti t o xtrt rom rtmisi nnu Linné y kt/mtor/gsk-3β sinl pthwy in Hp3 humn hptom lls. J Li Si 26: 764-771.