약용천연물화학 2014.03.13 < 목적 > 의약품의발전에있어서천연물화학의역사, 역할, 중요성을인식하고, 중요한약리활성을갖는천연유기화합물의생합성, 분포, 추출, 분리정제및구조동정은물론, 개개의화합물군에대한화학적성질, 구조및약리작용등을이해하여, 천연물로부터신약개발및기능성식품은물론건강한삶을위해응용할수있도록한다. 1. 천연물 (natural product) - a chemical compound or substance produced by a living organism - 동물, 식물의기관, 세포내용물, 분비물, 추출물, 광물, 미생물 - Organic compounds in the molecular weight range 100-2,000. (single chemical entities) - Structurally complex & diverse molecules - Produced as part of a chemical defense system to protect the producing organism from attack - synthesis of antimicrobial compounds by plants that are infected by bacteria and fungi (phytoalexins) - synthesis of highly toxic natural products in the skins of Central American frogs to deter predation by other animals - found in nature that usually has a pharmacological or biological activity for use in pharmaceutical drug discovery and drug design. - drug discovery screens or bioassays - can be produced by total synthesis, or can be a starting point (precursor) for a semisynthetic compound, or can act as a template for a structurally different total synthetic compound. - can be prepared by total synthesis. - 천연물화학 (natural product chemistry) - penicillin, morphine, and paclitaxel (Taxol). - 1 -
2. 천연물화학의역사 - 고전적의미의천연물화학 - 천연물로부터유용한물질을분리, 정제하고이들의화학적구조를결정하며이러한화합물의생물활성을연구하는학문, 전형적인다학제간학문으로다양한인접과학특히유기화학, 분석화학, 생화학, 약리학과함께발전함 - 1769년 Scheele: 포도로부터주석산분리 - 1806년 Serturner: 아편으로부터 morphine 분리 - 현대에서는신약후보물질을창출하는중요한학문분야의하나로발전 - 2 -
< 천연물로부터개발된의약품 > - 3 -
scopolamine( 스코폴라민 ): 부교감신경억제제, 침샘, 기관지분비샘, 땀샘의분비억제와눈동자확대와심박축진억제, 멀미약 Taxol: 유방암치료제 H 3 C O O O OH CH 3 O NH H 3 C O CH 3 CH 3 H OH O OH O O O CH 3 O O Aspirin Morpine Quinine Pseudoephedrine Vinblastine <Medicinal agents from natural soures> Khellin Ammi visnaga ( 미나리과 ) 관상동맥혈관확장작용 carbocromene 관상동맥혈관확장작용 Dicoumarol 자주개나리 혈액응고저해제 warfarin potassium 항응고약 Morphine 아편, 진통제 dextromethorphan 진통제 Physostigmine 카르발두 cholinesterase 저해제 축도, 안과영역의치료약 n e o s t i g m i n e methylsulfate cholinesterase 저해제, 중증근무력증, 근위축 Cocaine 코카엽, 국소마취제 procaine 국소마취제 Atropine 미치광이풀 부교감신경차단제 homatropine 부교감신경차단제 산동약 ephedrine 마황 진해제 methamphetamine 각성제 - 4 -
<Medicinal Plant/ Botanical Drugs> health care management and public health 3. 천연물화학의중요성 - 5 -
4. 생약 - crud drug, 그본질이변하지않은상태의천연물 ( 동물, 식물, 광물, 미생물 ) - 유효성분의추출, 제제를만들기위한천연물 - 생약학 (pharmacognosy) - 약에관한지식, 생약을연구하는학문 - 생약자원으로부터직. 간접적으로새로운의약품의개발및응용에대하여연구하는학문 - 인간에게유익한천연자원에대한활용연구 4. 의약화학 (Medicinal chemistry) - the design and synthesis of novel drugs - based on an understanding of how they work at the molecular level - pharmacodynamics - pharmacokinetics - 6 -
5. 천연물 or 생약의연구분야 : 새로운치료영역개발, 약리기전을가지는신약의가능성 - 서지학적연구 - 생물학적특성연구 - 약효평가 - 약효성분의규명 - 구조와활성상관관계의규명 - 품질평가법의설정 - 재배학적연구 6. 천연물의연구와전망 - 천연물 : 그자체가약물 - lead compound 도출을통한의약품개발 - 초기연구는화학구조결정에국한, 현재는활성시험과병행한천연물의유효성분규명연구 - 약리학및생화학의발달 - 천연의약품, 건강기능성식품 - 새로운생리활성측정법의개발, 새로운생리활성물질또는선도화합물개발 7. Neutraceutical - Nutrition + pharmaceutical - 동양의약의식약동원을의미 - 식용으로사용되던천연물에서특정질병에유효한성분을찾아내이를신약이전의치료보조제형태로개발 - 7 -
8. 천연물신약 - 품질, 효능, 안전성이확보된식물약품의개발 - 효능을결정짓는특정성분에의한다는원칙 - 품질의표준화 9. 천연물연구의감소원인 - 한정된분자타겟에대한고효율활성검색의도입 (HTS: high through put screening) - combinatorial chemistry - 8 -
- 분자타겟의증가 - 감염성질환치료제연구의위축 - biomaterials 의수집에관한제약 10. Why? 천연물인가? New Drugs-New Opportunities Botanical Drugs in the 21st Century, 천연물신약 ( 天然物新藥 ) 天然物新藥硏究開發促進法 (2000년 7월 ) - 천연물을활용한의약품연구개발을촉진하기위해제정 - 2단계사업 (2006년-2010년) 확정으로향후 5년간 1,677억원의정부재원투자 - 천연물성분을이용하여연구개발한의약품으로조성성분, 효능이새로운것을천연물신약으로정의 - 9 -
Plant-Derived Natural Products as "Lead Molecules ( 선도화합물 )" in the Design, Synthesis and Development of New Drugs - 10 -
* NCE (New Chemical Entities) - 11 -
< 신약개발의과정 > - 12 -
Pipeline from Traditional Medicines: Safety and efficacy established Cost-saving process: Shorter development timelines, Lower risk, Lower cost Targeting major unmet needs: 치매, 관절염등과같은만성퇴행성질환 Developing own IP ( 지적재산권확보 ) Out-license to Big Pharma: Milestones and royalties 기능성식품소재와천연물신약으로동시개발가능 - 13 -
11. 분자타겟 - 효소 (enzymes) - active site: 효소표면에존재, 기질이결합하고반응이일어나는곳 - mechanism of catalysis, selectivity - inhibitors: competitive, noncompetitive, reversible inhibitors - receptors - agonists and antagonists - binding site - carrier proteins - structural proteins: tubulin - uncleic acids - lipids - carbohydrates - 14 -
12. 천연물신약개발의화학적과정 13. 생물활성에따른분액의일반화된방법 14. 천연물의친화성을활용한시스템 - 15 -
15. 식물대사의상호연관성 ( 생합성경로 ) - 16 -
추출 ( 抽出, Extraction), 분리 ( 分離, Separation), 정제 ( 精製, Purification) 1) 재료 (Plant materials) - 기원식물및동물의학명, 채집장소및시간, 사용부위 ( 전체또는특정부위 ) 를명확히기록 - 신선품또는건조품에따라추출용매결정 - 신선품, 건조불충분한것 : hexane, ethyl acetate 사용시효율저하 - 건조가잘되고, 가능한한세분말로한것이추출율이좋음 2) 추출 (Extraction) - 추출용매의선택은목적물질을잘녹이고, 농축조작도용이한용매로사용일반적으로극성이큰물질 ( 당, 배당체, 아미노산등 ) 은극성이높은용매로, 극성이작은물질 (terpenoid, steroid등의지환상화합물, 방향족화합물 ) 은극성이낮은용매에녹기쉽다. - 동일화합물이라도관능기가하전한상태 (-COO -, -NH + 3 등 ion형 ) 에서는그렇지않은상태 (-COOH, -NH 2 등유리형 ) 와비교하여현저히극성이높게된다. - 추출에자주이용되는용매 : 석유 ether, hexane, (benzene, chloroform), methylene chloride, ether, ethyl acetate, acetone, butanol, isopropanol, ethanol, methanol, water - 주로저극성성분과극성성분을함께함유하는 methanol 추출액을많이사용 3) 분획 (fractionation) - 서로섞이지않는두용매를사용하여가용부와불용부로분획하는방법 ( 용매분획 ), alkaloid의경우산, 알카리조절하여분획 - 엑스를수용액으로한후, Amberlite XAD나 Diaion HP등의 polystyrene계수지 column을통과시켜유기화합물을흡착시킨후, 물-metanol 혼액, methanol, acetone, chloroform등의순서로유출시켜극성이큰화합물에서작은화합물의순으로유출, 분획하는방법 - polystyrener계수지는역상계흡착제의성질을나타내어지용성이강한물질을보다강하게흡착하고, 또수용성인배당체라도방향족화합물배당체보다도지환상화합물배당체쪽을강하게흡착한다 - 17 -
4) 분리과정의추적 - TLC법이용 : Rf 0.2-0.7사이의둥근반점 ( 흡착제및전개용매변경 ) - 검출법 : UV 254 nm ( 형광제혼합 TLC plate사용 ), UV 365 nm 황산발색, vanillin-황산, anisaldehyde-황산 - 정색시약활용 : Alkaloid-Mayer 시약, Dragendorf 시약당-Fehling시약배당체, 탄수화물-Molisch반응 Phenol성물질-FeCl 3 시약 Steroid, triterpenoid, saponin-libermann burchard 반응정유-picric acid 알코올포화용액 5) 분리, 정제 - Chromatography법이용 - 순상 chromatography: normal phase, 극성이큰고정상은극성이큰물질에대하여친화성이강하며이동상을극성이작은것에서큰것으로변화시키면극성이작은것부터용출 - 역상 chromatography: reverse phase, 위와반대 - Chromatography의종류흡착 (adsorption chromatography) - 18 -
분배 (partition chromatography) 여지 (paper chromatography) 박층 (thin layer chromatography, TLC) 이온교환 (ion exchange chromatography, IEC) 고속액체 (high performance liquid chromatography, HPLC) 가스 (gas chromatography) 6) 천연물로부터생리활성물질의분리, 정제 Retention Mechanism (Basis of Separation) - Adsorption: Ability of solute molecules to interact with the stationary phase - Ion-Exchange: Ability of the sample ions to exchange with the counter-ions and bind to the stationary phase - Size Exclusion (Gel permeation, Gel filtration): Ability of molecules to penetrate chromatography particles - Partition: Ability of solutes to distribute between two liquid phases - Biological Specificity: Specific interactions of biological molecules, Antigen-antibody, Enzyme-inhibitor, DNA-DNA binding, DNA-protein, Receptor-agonist/antagonist - 19 -
- 20 -
Column Operation 1. Selection of Column Condition: TLC (Thin-layer Chromatography) 를통한 solvent system결정 2. Column packing and Equilibration: Slurry Packing (Wet Packing), Dry packing 3. Sample Application 4. Column Development: Gradient Formation, Gravity, Air/Nitrogen Pressure, Vacuum Pumped (Low and Medium Pressure) 5. Detection - 21 -
- 22 -
- 23 -
크로마토그래피 (chromatography) 1. 정의 Chromatography - Chromos(color)+ graphein(write) = 색층분석법 1906년러시아식물학자 Michael Tswett의논문에서처음사용. 석회석흡착분말이충진된컬럼을통해나뭇잎의색소를분리하는연구시도 (Liquid-Solid). Molecular components in a mixture are separated because of their affinities for two substances called phases. 어떤물질을두상 ( 相 ) 에대한친화력차이를이용하여혼합물중에서단일성분으로분리하는과정 2. 원리혼합된시료성분이이동상과고정상사이를흐르면서흡착, 분배, 이온교환또는분자크기배제작용등에의해각각의단일성분으로분리되는것을말한다. 분리, 정성, 정량등의분석목적과분리, 정제, 분취목적에이용된다. 3. 분류 4. 겔크로마토그래피의개념도 5. 고정상 silica(sio 2, slightly acidic and polar) - 24 -
alumina(al 2 O 3, slightly basic and polar) magnesium oxide charcoal(nonpolar) starch 6. 이동상 - organic solvent (Hex, EtOAc, MeOH, CHCl3 등 ) - Buffer (phosphate buffer 등 ) 7. open column chromatography 8. Adsorption( 흡착 ) chromatography - 가장오래된 chromatography type - 25 -
- 고정상으로사용되는고체흡착체의표면과이동상으로사용되는액체 (ex.tlc) 에대한친화력의차이가분리를좌우. - GSC의경우이동상은비활성기체를이용하므로고정상에대한시료의친화력차이로만분리. - paper chromatography의경우 cellulose 격자사이에붙잡혀있는 water에분배되는원리를이용하므로분배크로마토그래피에해당. - Intermolecular forces Van der Waals Electrostatic Hydrogen bonding(polar): 가장중요 Hydrophobic interaction(nonpolar) 9. Partition( 분배 ) chromatography - 가장일반적인 chromatography type - 고정상으로사용되는고체지지체의표면액상과이동상으로사용되는액체에대한분배력의차이가분리를좌우. - 고정상은다공성지지체에화학적으로결합되어있음. - Normal phase 고정상은이동상보다 more polar 비극성화합물이먼저용출된다. - Reverse phase 비극성고정상과극성이동상사이의분배정도차이이용 극성화합물이먼저용출된다. - 원리 - 일반적으로사용하는 reverse phase column의경우극성의물질이비극성의물질보다먼저분리되어나오게된다. - Bonded phase의개발 (J J. Kirkland. J. Chromatogr. Sci. 7, 361, 1969) 로고정상에대한이동상의조성변화, 이동상변형제첨가등다양한응용상의변화가가능하게됨으로써널리사용하게됨. 10. Ion-Exchange( 이온교환 ) chromatography 이온성화합물및무기이온의분리에사용 - 26 -
eletrostatic force 이용 polystyrene or silica gel 표면에이온성을가진화합물을화학적으로결합한고정상사용 이동상으로완충액사용 시료의분리는 ph, 이온세기, 이동상에포함된이온종류의영향을받는다. 11. Size Exclusion( 크기배제 ) chromatography 일정한크기의공극을형성시킨다공성 polystyene이나 silica gel을충진입자로사용한다. 공극의크기에따라분리되는시료의분자량대가다르다. 시료의물리적특성 ( 크기 ) 에따른분리이다. 이동상은고정상에대해비활성이며 - 수용성용매일경우 GFC(gel filtration chromatography) - 지용성용매일경우 GPC(gel permeation chromatography) 12. HPLC - High Performance Liquid Chromatography - 27 -
- 물질의분리혹은분취를통한정량을위해이동상을액체로사용하는크로마토그래피시스템. - 기기의 hardware 구성은이동상을흘려보내기위한 pump 와 detector( 검출기 ) 가기본적으로필요하며, 시료주입용으로 injector(or autosampler) 가필요하다. 분리를위한고정상은 column을통해제공된다. - 28 -