Title: Biacore getting started kit 를이용한 KD 값도출방법 목차 1. 실험목적 2. 실험개요와필요한시약및소모품 2.1 실험개요 2.2 필요한시약및소모품 3. 실험방법과결과 3.1 ph-scouting for pre-concentration 3.2 Immobilization 3.3 Regeneration scouting 3.4 Interaction analysis 4. References 1. 실험목적 Biacore 입문자를위한 system operation, experience design 및 Biacore software 사용법에대 한이해 2. 실험개요와필요한시약및소모품 2.1 실험개요 A. ph scouting for pre-concentration B. Immobilization of ligand on a chip C. Regeneration scouting D. Interaction analysis 2.2 필요한시약및소모품 Getting started kit (anti-beta2u-glubulin antibody, beta2u-glubulin)
Product Name Contents Order code Getting started kit 1mg/ml anti-beta2u-glubulin antibody 50 μl 100 μg/ml beta2u-glubulin) 50 μl BR-1008-36 CM5 chip Pack of 3ea BR-1005-30 (For Biacore T200,T100) Pack of 3ea BR-1000-12 (For other system) Amine coupling kit 750mg 1-ethy-3(3- BR-1000-50 dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride(edc), 115mg N- Hydroxysuccinimide(NHS), 10.5ml 1.0M ethanolamine-hcl ph 8.5 Acetate 4.0 1 x50 ml BR-1003-49 Acetate 4.5 1 x50 ml BR-1003-50 Acetate 5.0 1 x50 ml BR-1003-51 Acetate 5.5 1 x50 ml BR-1003-52 Regeneration scouting kit 11 ml ethylene glycol BR-1005-56 11 ml 10mM glycine-hcl ph1.5 11 ml 10mM glycine-hcl ph2.0 11 ml 10mM glycine-hcl ph2.5 11 ml 10mM glycine-hcl ph3.0 11 ml 4.0M magnesium chloride 11 ml 0.2M sodium hydroxide 11 ml 0.5% sodium dodecyl sulphate (SDS) 20 ml 10% Surfactant P20 HBS-EP+ 10X Buffer 1 x 1000ml BR-1006-69 4 x 50ml BR-1008-26 Getting started kit (anti-beta2u-glubulin antibody, beta2u-glubulin) 3. 실험방법과결과 3.1 ph-scouting for pre-concentration: 3.1.1 Purpose Ligand 가 dextran 의 charge 를가지는 chip surface 에잘모여드는 buffer 의 ph 를찾아냅니다. Ligand 의 pi > buffer ph : Ligand 는 + Charge 띰 Ligand 의 pi < buffer ph : Ligand 는 - Charge 띰 따라서 Immobilization buffer 의 ph 는 3.5 보다는높아야하며 Ligand 의 pi 보다는낮아야합니다. ph3.5<immobilization buffer<ligand pi 3.1.2 Material
200mM HBS-P+ Buffer 10mM sodium acetate, ph 4.0, 4.5, 5.0, 5.5 50mM NaOH Sensor Chip CM5 1mg/ml anti-beta2μ-glubulin antibody (getting started kit) Ligand의 final 농도가 10 μg/ml이되도록 10mM sodium acetate의 ph별로 200 μl를준비합니다. 10mM sodium acetate ph 4.0 198 μl + 1mg/ml antibody 2 μl 10mM sodium acetate ph 4.5 198 μl + 1mg/ml antibody 2 μl 10mM sodium acetate ph 5.0 198 μl + 1mg/ml antibody 2 μl 10mM sodium acetate ph 5.5 198 μl + 1mg/ml antibody 2 μl 3.1.3 Procedure 1. System control 창에서 run menu > choose Wizard > Surface Preparation > Immobilization ph Scouting 을선택합니다. 2. Flow path 2 를선택합니다. 3. Ligand name과 injection parameters를입력합니다. Contact time : 120sec Flow rate : 10 μl/ml 4. Wash solution, 50mM NaOH 입력합니다. (ph scouting후 Chip 표면에정정기적인력으로모여있는 ligand 제거하기위함 ) Contact time : 30sec Flow rate : 50 μl/ml 5. Run Wizard를 click하면 reagent rack이보이며각각의 reagents의자리와 volume이표기된 diagram이보인다. 지정된자리에준비된 Ligand와 reagents를넣어줍니다. 6. Wizard template 와 result file 을저장하고 method 를실행시킵니다. 7. Running 이끝나면어떤 ph 에서가장높은 Response 가나타났는지확인합니다. Example> 아래그림과같이 ph 에따른 response level 을확인한다. 비록 Pre-concentration level 은 ph
가낮을수록높게나타나는현상이있지만, immobilization 하고자하는 target RU 가모두도달하는 한다면보다 mild 한조건의 ph 를선택합니다. 3-2 Immobilization 3.2.1 Purpose ph Scouting에서선택한 buffer의 ph를사용하여 Immobilization 하고자하는 RU만큼 Chip에 ligand 를고정화하는단계입니다. 3.2.2 Material Amino coupling kit (100mM NHS, 400mM EDC, 1M Ethanolamine) (NHS와 EDC는 Powder로제공되며, 10ml의 DW로녹여 100mM NHS, 400mM EDC농도로만들어각각 150 μl로분주하여냉동보관함 ) 50mM NaOH Sensor Chip CM5 Ligand : 200 μl of 10 μg/ml anti-beta2 μ-globulin antibody in 10Mm sodium acetate, ph5.5 3.2.3 Procedure 1. System control 창에서 run menu > choose Wizard > Surface Preparation > immobilization 를선 택합니다. 2. chip type 을 CM5 로선택하고, blank flow cell 1, Immobilize flow cell 2 를선택합니다. Contact time: 420 sec (7 min)
Flow rate: 5 μl/ml 3. aim for immobilization level을선택하고고정화하고자하는 RU를입력합니다. Immobilization level : 1200 RU <Calculate the Rmax> Rmax = Immobilized RU * Stoic ration *(analyte MW / ligand MW) Stoic ratio: if each analyte molecule can bind 5 ligand molecules, then the ratio is 1/5. 4. Next 를 click 하면 reagent rack 이보이며각각의 reagents 의자리와 volume 이표기된 diagram 이보인다. 지정된자리에준비된 Ligand 와 reagents 를넣어줍니다. 5. Wizard template 와 result file 을저장하고 method 를실행시킵니다. 6. Running 이끝나면 Immobilization 하고자하는 target RU 에도달했는지확인합니다. <Example> 일반적인 immobilization result sensorgram 3-3. Regeneration scouting 3.3.1 Purpose Ligand와 analyte와 binding test 후 slow dissociation rate(<10-3 sec) 이라면, immobilized ligand로부터 analyte를제거하기위해 regeneration이필요합니다.
이때사용되는 solution은 ligand의 activity에영향을주지는조건을찾아야합니다. 3.3.2 Material 32nM beta-2μ-globulin in HBS-P+ buffer 10mM glycine, ph 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 (Regeneration kit) 3.3.3 Procedure 1. System control 창에서 run menu > Run sensorgram 을선택합니다. 2. Multi Detection, Fc 1,2 : 2-1을선택합니다. Fc 1 : reference cell Fc 2 : Immobilized ligand cell 3. Flow rate 10 μl/ml를선택합니다. 4. Command tab 에서 Inject command 를이용하여 analyte 32nM beta-2μ-globulin 을 120 sec 동안 흘려줍니다. 5. Reference line 을이용하여 injection start 전 15 sec 에 baseline report point 를지정하고, injection end 전 15 sec 에 binding level report point 를지정합니다. 6. Command tab 에서 flow command 를이용하여 flow rate 를 50 μl/ml 로변경합니다. 7. 준비된 10mM glycine regeneration buffer 를 High ph 에서 Low ph 순서로 injection 하며, report point 는 injection end 후 15 sec 로지정하여 chip 표면에남아있는 analyte 의 binding RU 를 측정합니다. <General guidance> Ideal regeneration: Analyte response is consistent after repeated injections and within 10% of the level in the 1 st injection Too mild conditions: The analyte response decreases and the baseline response increases Too harsh conditions: The analyte response decreases and the baseline response is constant or decreases 8. 적당한 regeneration buffer 를확인이된다면위과정을멈춥니다. <Example> Binding response 와 baseline 이일정하게유지되는 ph 2.5 가적당한 regeneration 조건이다.
3-4 Interaction analysis 3.4.1 Purpose Immobilized Ligand 와 analyte 의농도별 interation 을이용하여 ka 와 kd 를구하여 KD 를도출합니다. 3.4.2 Material Analyte: 100 μg/ml(8.5 μμ) beta2μ-globulin(mw 11,800 Da) HBS-P+ buffer 10mM Glycine, ph2.5 3.4.3 Procedure 1. Sample 준비합니다. 2. Analyte 의 final 농도가 32nM 에서 1/2 Dilution 하여 2nM 까지준비하며, double reference 로 0 nm(buffer only) 또한준비합니다. 3. System control 창에서 run menu > choose Wizard > Kinetic Analysis 를선택합니다. 4. Sample Injection parameters 를입력합니다. Multi Detection, Fc 1,2 : 2-1 을선택합니다. Fc 1 : reference cell Fc 2 : Immobilized ligand cell
Flow rate: 30 μl/ml Injection time: 120 sec Dissociation time: 300 sec 5. Analyte name, MW 및준비된 analyte 의농도를입력합니다. 6. Regeneration solution name(10mm Glycine ph 2.5) 과 injection parameters를입력합니다. Flow rate: 50 μl/ml Injection time: 30 sec Stabilization time: 60 sec 7. Next를 click하면 reagent rack이보이며각각의 reagents의자리와 volume이표기된 diagram이보입니다. 지정된자리에준비된 Ligand와 reagents를넣어줍니다. 8. Kinetic Wizard template 와 result file 을저장하고 Kinetic analysis 를실행시킨니다. 9. Running 이완료되면 evaluation software 를사용하여 fitting 하여 ka, kd 및 KD 값을구합니다. <Example> anti-beta2 μ-globulin antibody 와 beta2μ-globulin 의 KD 값은일반적으로 3.0*10-9 정도 로나옵니다. 4. Reference 4.1 Using Biacore to Measure the Binding Kinetics of an Antibody-Antigen Interaction
Michael Murphy 1, Laure Jason Moller 1, JoAnne Bruno 1 Biacore, Inc., Piscataway, New Jersey Publication Name: Current Protocols in Protein Science Unit Number: Unit 19.14 4.2 BIACORE Sensor Surface Handbook