대한쉐담도연구회지 1998; 3: 168-173 인체담즙에서 Helicobacter pylori 의생장및형태변화 단국대학교의과대학외과학교실내과학교실 z 생명과학연구원소화기연구센터 김정택 노임환이학성 2 01 종화 2 = Abstract = Growth and Morphological Changes of Helicobacter pylori in Human Bile Jung Tail Kim, M.D., 1m Hwan Roe, M.D. 1, Hak Sung Lee, M.D. 2 and Jong Hwa Lee, M.D. 2 Department of Surgery, linternal Medicine 2 Life Sciences Institute Research Center for Gastroenterology Dankook Universiη College of Medicine, Chunan, Korea Background/Aims: H. pylori is veη sensitive in vitro to bile acid, but recent reports have noticed that the growth of H. pylori was not affected in bile reflux gastritis, and H. pylori DNA was detected in the human bile from diseased bile duct. Under the certain pathological conditions, altered bile component could cause to change inhibitory factors for the growth of H. pylori in vivo. We investigated if H. pylori could grow in human bile. Methods: The growth rate was studied in 10%, 20%, 50% and 90% of human bile from twenty cases with bile duct disease(17 of bile duct stone, 3 of bile duct cancer). And the morphological change of H. pylori was also studied by 3 hour incubation of active rod formed H. pylori in 10%, 20 % and 50% bile. Results: H. pylori isolate was grown in 19 samples of 10% bile, in 13 of 20% bile, and in 2 samples of 50% and 90% bile, respectively. And morphological change from rod to obvious coccoid was observed after 3 hours incubation in 20% bile showing inhibitory effect to H. pylori growth. But there was no difference in morphology in 20% bile showing growth of H. pylori. Conclusion: H. pylori is possible in human bile from the diseased bile duct, and thereby this organism could cause bile duct diseases. Further studies will be needed if there can be difference in H. pylori protein between the bile resistant and bile susceptible H. pylori Key Words: H. pylori, Human bile, Morphological changes, Growth 연락처검정택, 천안시안서동 29 번지 단국대학교의과대학외과학교실 168
김정택외 3 인인체담즙에서의 H, pylori 169 서론정상적인조건에서담즙산은장내세균의번식을저해하는효과가있으며 1-3 Helicobacter pylori 도담즙산에매우예민하여 deoxycholic acid와 chenodeoxycholic acid 같은인체담즙산의주요담즙산에대해성장이억제되거나생존하지못한다는것이생체외실험연구상보고4 되고있다그러나최근에와서는담즙역류성위염에서도 H pylori가검출되었고 5, 6 위부분절제술을받은환자의잔여위조직에서도 H, pylori가생존한다는것이보고7 되고있어생체내에서의담즙산의세균생장억제효과는확실히밝혀지지못한실정이다또한담즙산이풍부허있는십이지장에서도 H. pylori가어렵지않게검출된다는연구보고 8도있어생체내에서 H. pylori와인체담즙과의관계에대한새로운연구규명이필요하다. 이는최근 Helicobacter DNA가인체담관질환의담즙에서검출되고있다는연구보고9-13가시작되고있는시점에서검출되는 Helicobacter가 H. pylori일가능성이있는지추측해보는중요한연구가될수있기때문이다즉담즙산에저항성있게생장할수있는 H. pylori가존재할가능성및 H. pylori가아닌동물에서이미밝혀진다른종류의 Helicobacter가인체담즙에생장할가능성이있다고할수있다. 본연구의목적은 H. pylori가인체담즙에서생장할수있는지연구함으로써담관질환의담즙에서검출되는 Helicobacter가담즙에저항성있는 H. pylori 일가능성이있는지조사하였다. 대상및방법 1. 담즙채취및농도구성담관질환이있는 20예의환자에서. 담즙을채취하였으며, 위십이지장에존재할수있는 H. pylori 를배제하기위해경피경간담관배액관을가지는환자만을선택하였다. 담관질환의구성은 17예의간내담관담석증과 3예의담관암이었다. 채취된담 즙은멸균을위해 121 0 C에서 5분간압력멸균 (auto c1ave) 하였다 14 이후담즙은 H, pylori의액체배양액을섞어 10%, 20%, 50%, 90% 의여러농도로구성하였다. 2. 담즙에서의 H. pylori 배양액체배지배양액과혼합하여만든 10%, 20%, 50%, 90% 의담즙에서 H. pylori를액체배양하였으며배양후 2-3일째어 1 H. pylori의생장여부를판정하였다. 판정은 urease, catalase, oxidase 검사를시행하여 H. pylori임을확인한후에위상차현미경시야에서직접검경하였다. 3. H. pylori의형태변화액체배양배지에서활발하게생장하고있는배양 2일째의 H. pylori 간균상태에 207~ 의담즙의농도를모두 20% 로만들어혼합한후 3시간후에위상차현미경을통하여 H. pylori 간균형의형태변화를관찰하였다. 결과 1. 담즙에서의 H. pylori 생장성적 10% 의인체담즙농도에서는 20개의담즙검체중 19개 (95%) 의검체인대부분에서 H. pylori는액체배양 2일째에활발한간균상태로잘생장하였다. 20% 의담즙농도에서는 207~ 의검체중 13개 (65%) 에서 H. pylori가잘생장하였으며 50% 의담즙농 도에서는 20개중 2 개 (10%) 의검체에서 H. pylori 가활발허생장하였다이들검체는 90% 로담즙농도를증가하였던경우에도 H. pylori가매우활발한간균상태로잘배양되고있어인체내담즙에따라서는 H. pylori가매우잘생장할수있다는것을관찰하였다 (Fig. 1). 2.20% 담즙에서의 H. pylori으 형태변화 H. pylori가활발한간균상태를유지하고있는애양 2 일째의액체배양배지에 207~ 의담즙을각각추가하여 20% 의농도가되게한후 3시간후에
170 대한쉐담도연구회지, 제 3 권제 2 호 1998 Fig. 1. H. pylori was active moti1e rod fonn after 2 days of incubation in the broth media containing 90% bi1e. Fig. 2. Rod fonned H. pylori was not changed in shape after 3 hours of incubation in 20% bile from some patients (A), and after 3 hours of incubation in 20% bile from another patients, H. pylori was converted rapidly to coccoid fonn (8). 위상차현미경으로검경한결과담즙산에예민한 H. pylori들은활발한간균에서움직임이거의없 고 찰 는구균형태로전환되었다. 또한담즙산에저항성 있는 H. pylori들은 20% 의 담즙농도에서도활발 최근인체담관질환의담즙에서연쇄중합반응 한간균상태를유지하였다 (Fig. 2). 법상확인되고있는 Helicobacter DNA에대한보고9-13가있은이후담즙에서검출되는 DNA가담
김정택외 3 인 인체담즙에서의 H. pylori 171 즙에저항성있게생존할수있는 H. pylori 인지, 혹은 H. pylori 이외에아직정확히규명되지못한 Helicobacter 의다른아종 (subtype) 인지밝혀지지 않았지만인체담즙에서도 Helicobacter 가존재할 가능성에대해큰의미를가지게되었다. 담즙에 서발견되는 Helicobacter 가아직까지는배양분 리에성공하지못하여균주를정확히파악하는 것이어렵고또한이에대한엄상적인의미가무 엇인지밝혀져있지못하지만 15 과거담즙산에매 우예민하여인체담즙에서생장하지못할것 4 으 로짐작되었던 Helicobacter 가인체의담즙에존 재하고병을유발할수있는가능성을제시하고 있어의미가매우크다고하겠다그런데 Helicobacter 가모든인체담즙에다생존하는것은아 니고본실험결과에서와마찬가지로일부환자 들의담즙에서가능하였다. 이는정상이아닌담 관폐쇄의병적인조건에서는담즙의구성성분이 바뀌어세균에대한생장억제효과가감소되거나 소실될수있어 Helicobacter 등의세균생장이가 능할것 16, 17으로추측할수있다실제적으로정상 적인담즙에서는세균이존재할수없지만, 병적 인조건에서는 E. Coli, Klebsiella spp. 등의세균 이 장관으로부터상행성감염되어담관감염을 일으키는것 18, 19과관련지을수있다최근에보고 된 Fox 등 12 의 연구에서는담석증을동반한만성 담냥염이있는칠레인들의수술후담즙과담냥 에서 Helicobacter 가있음을발견하고염기서열 확인을통해그것이 H. pylori 가아닌 H. bilis, H. pullorum, H. rappini 라고밝혔고이들균주가동 물이아닌인체담즙에서도존재하며질환유발 원인드로서작용할가능성도보고하였다. 그러나 Lin 등 11 의보고에서는담관폐쇄를동반한담쉐관 질환의담즙에서발견된 Helicobacter 는부분적인 엽기서열결과 H. pylori 라고발표하였다. 특히 Lin 등 11 은 H. pylori 가십이지장내에서도존재한다 는보고 8 를토대로십이지장내의 H. pylori 가담관 내로이동하였을가능성도제시하였다. 또한국내 에서는노등9, 10의연구에서도담관질환이있는환 자의담즙에서 He /icobacter DNA 가검출되었음을 보고하고있어담관질환과 Helicobacter의존재및관계에대해서는임상적의미를규명하려는연구가계속되어져야하겠다. 흥미로운것은본실험결과에서처럼 H. pylori 가 10% 농도의인체담즙에서는대부분잘생장하고있고 20% 농도의담즙인경우에서도배양후 3일째에도활발한생장을하고있었다. 어떤환자들의담즙에서는 50% 내지 90% 의매우담즙산이풍부히함유되어있는담즙에서도 H. pylori 가잘생장하고있음을관찰하여담관질환의담즙에서발견되는 Helicobacter DNA가 H. pylori일가능성도충분히있음을확인하였다. 그런데 H pylori가생장할수있는담즙은환자마다차이가있는것으로생각할수있어 20% 의담즙농도를촬발한간균상태의 H. pylori의액체배양배지에추가하였을때뚜렷한형태변화의차이를관찰할수있었다즉 20% 의담즙농도에민감하게반응하는 H. pylori는 20% 의담즙을추가한지불과 3시간후에활발한간균이대부분구균형태로바뀌어 H. pylori에게불리한환경이가해졌음을알수있었다. 저자들은이상태에서구균형의 H pylori를다시좋은조건에서배양하여간균형의 H. pylori로전환시키지는못하였다. 그러나 20% 담즙산에저항성있는 H. pylori는담즙추가시에도형태변화가거의없이매우운동성이빠른간균을유지하고있었다. 그러므로담즙산에예민하다고보고되었던생체외실험연구와는달리인체담즙에서는담즙산의변형이오는것으로짐작할수있다. 본실험의결과를토대로 H. pylori가담관질환이있는환자의담관담즙에서생장할수있고위내에존재하는 H. pylori가십이지장및유두부주위에서존재하다가담관내로상행성이동하였을가능성이있는것 a로판단할수있었다. 따라서과거연구보고결과담관담즙에서검출되는 He /icobacter DNA에대해서는일부분은 H. pylori가관여할수있을것으로생각되었다결론적으로 H. pylori는인체담즙에서생장이가능하며향후에는인체담즙중에서세균억제효과
172 대한혜담도연구회지제 3 권제 2 호 1998 가있는담즙산의성분규명이필요하고담즙에저항성있는 H. pylori 균주와담즙에예민한균주간의차이에대해서도연구가필요할것으로보인다. 요약목적 : H. pylori는담즙산에매우민감하여성장이억제되거나생존하지못한다고주장되어왔으 는형태변화없이활발한간균형을유지하였다. 결론 : H. pylori는담관질환을가진인체내담즙에서생존할수있을것으로추정되며그에따른질병유발도가능할것으로생각된다. 향후의연구에서는담즙에서생육가능한 H. pylori와담즙에민감한 H. pylori 간에단백질에서의차이가있는지규명하는실험이요구되어지며또한각담즙을분석하여세균억제인자가무엇인지규명하는작엽이진행되어야할것으로보인다. 나최근담즙역류성위염및부분위절제술후의 잔여위조직에서도 H. pylori 가생존할수있음이 색인단어 H. pylori, 담즙, 형태변화, 생장 보고되어있다. 또한담관질환환자의담즙에서도 연쇄중합반응볍 (Polymerase chain reaction: PCR) 에의해 H. pylori DNA가검출되어인체담즙에서의 H. pylori의생육가능성을시사하고있다. 즉정상이아닌담관폐쇄등의병적인조건에서는담즙의구성성분이바뀌어박테리아에대한성장억제효과가감소되거나소실될수있을것으로추측된다. 저자들은인체담즙에서 H. pylori가생육할수있는지연구하였다대상및방법 : 20예의담관질환 ( 간내담관담석증 17, 담관암 3) 환자에서경피경간배액관을이용하여담즙을채취하였다. 세균을제거한후담즙은 10%, 20%, 50%, 90% 농도로 H. pylori의배양배지에추가하여배양 2-3 일째에생장변화를관찰하였다. 또한배양 30시간후최대로간균형태를유지하는 H. pylori의배양배지에 20% 담즙농도를추가하여 3시간후에 H. pylori의형태학적변화를관찰하였다. 결과 : 20예의담즙검체중 10% 의농도에서는 19예 (95%) 의담즙에서 H. pylori는모두생장하였고 20% 농도에서는 13예 (65%) 가생장가능하였다. 50% 에서는 2예 (10 % ) 의담즙에서만이생육가능하였고이들 2예는 90% 담즙농도에서도생장하였다. 20% 담즙농도에서 H. pylori의생육을억제하였던담즙과생육을억제하지않았던담즙을배양 30시간후가장활발한간균형태의 H. pylori에첨가하였던경우생육을억제시킨담즙에서는 3시간후빠른시간에현격한구균형태로의변화가관찰되었다. 생육이가능한담즙이첨가된실험군에서 참고문헌 1. Floch MH, Gerhengoren W, El1iott S, Spiro HM: Bile acid inhlbition of intestinal microflora. A function bile acid? Gastroenter이ogy 1971; 61 : 228-233. 2. Williams RC, Showalter R, Kem F: The effect of bile sa1t and ch이 estyramine on intestinal anaerobic bacteria. Gastroenterology 1975; 69: 483-49 1. 3. Huhtanen CM: Bile acid inhibition of Clostridium botulinum. Appl Environ Microbiol 1979; 38: 216-218 4. Hänninem ML: Sensitivity of Helicobacter pylori to different bile salts. Eur J Clin Microl Infect Dis 1991; 10: 515-518. 5. Kellosalo J, Alavaikko M, Laitinen S: Effect of biliary tract produce on duodenogastric reflux and the gastric mucosa. Scand J Gastroenterol 1991; 26: 1272-1278. 6. Sobala GM, 0 Conner HI, Dewar EP, King RF, Axon AT, Dixon MF: Bile reflux and intestinal metaplasia in gastric mucosa. J Clin Pathol 1993; 46: 235-240. 7. Robles Campos R, Lujan Mompean JA, Parrilla Paricio P, Berm멍 o Lopez J, Liron Ruiz R, Torralba Martinez JA, Morales Cuenca G, Molina Martinzez JA: Role of Helicobacter pylori infection and duodenogastric reflux in the pathogenesis of alkline reflux gastritis after gastric operation. Surg Gynecol Obstet 1993; 176: 594-598. 8. Prewett EJ, Bickley J, Owen RJ, Pounder RE: DNA pattem of Helicobacter pylori is이 ated from gastric antrum, body and duodenum. Gastroenter이ogy 1992; 102: 829-833. 9. 노임환, 이영인, 진영주, 임창영, 송일한, 김정원, 김정 태, 양미라, 이종화, 신지현. 담관당석증및담관암환자
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