( 뒷면 ) 109089-3 1cm 2cm 발간등록번호 11-1541000-001410-01 ( 앞면 ) 목이버섯의 품종육성 대량재배시스템확립 및 식품 약리활성분석과 보안과제 ( ), 일반과제 ( ) 과제번호 109089-3 5cm 목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의품종육성ㆍ대량재배시스템확립, 식품ㆍ약리활성분석과식품소재화 Mass culture system and species improvement, food pharmacological action and food materials of Auricularia auricula-judae 주 의 ( 편집순서 8) 식품소재화 (15 포인트고딕계열 ) 6cm 농림수산식품부 3cm 경상북도농업기술원 9cm 농림수산식품부 4cm
제출문 농림수산식품부장관귀하 이보고서를 목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의품종육성 ᆞ 대량재배 시스템확립, 식품 ᆞ 약리활성분석과식품소재화 과제의보고서로제출합니다. 2012 년 4 월일 주관연구기관명 : 경상북도농업기술원 주관연구책임자 : 조우식 세부연구책임자 : 조우식 연 구 원 : 최충돈 연 구 원 : 최성용 연 구 원 : 박소득 협동연구기관명 : 경북대학교 협동연구책임자 : 박승춘 연 구 원 : 최명진 연 구 원 : 레 자 위탁연구기관명 : 전진바이오팜 위탁연구책임자 : 이태훈 연 구 원 : 장훈창 - 1 -
요약문 Ⅰ. 제목 목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의품종육성ㆍ대량재배시스템확립, 식품ㆍ 약리활성분석과식품소재화 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 연구목표 l 새로운식용및약용버섯대량생산재배기술보급으로농가의소득증대. l 농산자원의식용ᆞ약리효능검증에따른버섯소비촉진. l 버섯을이용한제품의개발범위확대. l 목이버섯의대량생산기술및효능 ( 특허출원, 품종등록 ) l 목이버섯추출물에대한제제화에따른식품ᆞ약리활성의검증. l 목이버섯에대하여확립된약리활성검정시스템을기반으로생체기능조절물질 ( 이하, BMM) 을약용버섯에서탐색 ( 다검정시스템이용 : 항암활성, 항혈전활성, 항염증활성, 항당뇨활성, 항균활성, 면역활성에대한 DB화구축 ) l 목이버섯의품질관리시스템의확립 l 목이버섯의대량생산기술개발 - 교배균주육성, 최적배지개발, 재배환경구명, 접종기술개발 l 목이버섯의추출, 분리및정제공정개발, 생체기능조절물질의제형공정별최적화및저장성시험 l 목이버섯가공제품개발로새로운소득원창출 연 - 2 -
목이버섯의대량생산이가능하게되면현재중국등지에서거의대부분수입에의존하는국내소요량 ( 약400톤, 약 60억원, 2007년 ) 의대체가가능하여수입대체효과및국내버섯농가의새로운소득품목화되어농가수익증대효과가기대됨. 표. 목이버섯수입동향 ( 단위 : ton) 구분 2002 2003 2004 2005 2006 2007 수입량 ( 건물중 ) 44 71 125 257 254 392 * 관세청자료 또한부가가치가높은균류유래약용물질 (mycomedicinal) 의생산및개발이가능하게되므로야생버섯의인공재배기술의개발은새로운버섯의대량재배기술확립과기능성성분의개발에의한새로운가치의창출등으로농민의수익증대와신약개발에크게이바지할것으로기대됨. - 3 -
Ⅲ. 연구개발내용및범위 l l l 선발육종에위한목이버섯생육재배시 험 : 수집및분양계통 10여종. l 최적배지개발 : 배지재료의 이화학적, 물리적특성조사 l 목이버섯에관한특허및정보화분석 목이버섯처리별및추출법에따 l 목이버섯영양성분분석 른식품ㆍ약리활성 ( 영양성분, 항 l 목이버섯추출별항암활성비교 암, 항균및항산화 ) 탐색 l 목이버섯추출별항균활성비교 l 목이버섯추출별항산화비교 l 목이버섯을이용한추출액의 1차상품 화 -미네랄성분분석 목이버섯및목이버섯추출액의 -식품성분분석식품소재화 - 베타 - 글루칸함유량의분석 l 목이버섯의추출액및가공제품에대한제제화 l l l l l 목이버섯에대한제품화프로그램작성 l 목이버섯추출별항염증, 면역활성비 교시험, 미백효능비교시험, rat에서단 목이버섯추출별에따른실험동회경구독성시험물에서식품ㆍ약리활성및독성시 l 질환모델동물을이용한당뇨및지질저험하제에대한효능검정 l 생체조절다기능성물질에대한단회경구 독성시험 l 목이버섯을이용한추출액의발효물에 대한상품화 목이버섯의추출액의 발효물에 l 대용량발효시스템에서조건확립 대한식품소재화 l 대용량정제공정개발 l 추출 / 분리 / 정제공정중기능성원료의 대량생산 - 4 -
l 발효전과후의미네랄성분분석 l 발효전과후의식품성분분석 l 발효전과후의베타-글루칸함유량의 분석 l l l l 유통을위한자실체의최적건조방법구 명 : 열풍건조, 동결건조, 원적외건조, 건조기, 자연건조 ( 양건, 음건 ) 등 l 조사내용 : 색도, 효능, 경도등 l 약용버섯추출생체조절다기능성물질에 대한항암활성, 항균활성, 항혈전, 항염 목이버섯및추출액의농약잔류 증및당뇨에대한동물시험 l 약용버섯으로부터생체조절다기능성물분석법및멜라민분석에의한품질제조법에대한최적화 질관리설정 l 목이버섯, 목이버섯추출액및발 효액의식품소재화 l l l l l 농약잔류분석 MRL 설정 ( 감마에이치에이치, 구아자틴, 글루포시네이트암모늄, 글리포세이트 ) 목이버섯을이용한다양한식품소재군의개발목이버섯추출액을이용한식품가공제품목이버섯발효액을이용한발효가공제품의개발대용량목이버섯추출원료개발목이버섯의유통및저장성시험 Ⅳ. 연구개발결과 1. 세부과제 : 목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의품종육성ㆍ대량재배시스템확 립 가. 진흙버섯류균의기본적정배지를선발하기위하여 PDA, Czapek dox, MEA, YMA, MCM 배지등 12종의배지를제조하여균사생장을조사한결과는 Table 4 와같다. 균사생장은 MEA, Glucose peptone, MCM, Malt Yeast extract 배지에서양호하였고, Czapek dox, Leonian, Hennerberg 배지에서는균사가눈에띄지않을정도의무색투명한상태로배지표면에퍼지는현상을나타내어공시균의배양에는부적합하였다. 목이버섯균의균사생장에는유기태질소원이나복합질소원이함유된배지에서균사생장이양호하였다. 목E 균주는목F 균주에비해생육이부진하였으며, 균사체배양시색깔은대체적으로흰색을나타내었다. - 5 -
나. 목이버섯류균사생장에적합한탄소원농도및질소원과의비율을조사한결과탄소원 (Glucose) 의농도 2% 와 C/N비가 10:1일때균사생장과밀도가양호하였다. 이것은이등 (2004) 이목질진흙버섯 (P. linteus) C/N비 10:1에서균사생장과밀도가양호하였다는보고와유사하였다. 다. 탄소원은균류에있어서탄수화물, 단백질, 지질, 핵산등의합성과에너지공급원으로서균의생장에필수적인영양원이다. 각종탄소원이진흙버섯류의균사생장에미치는영향을조사한결과는단당류인 Glucose, Mannose를첨가한배지에서균사생장이양호하였고, 2당류인 Maltose에서도대체로양호한편이었다. 목이버류의탄소원은주로단당류가적합하였다. 라. 발색반응배지에서의균주간효소분해능력를비교하였다. 투명환은발색반응배지내에고르게분포하여존재하는발색시약에결합된효소의기질이목이버섯균에서분비된세포외효소와반응하여기질이분해되면서나타나기때문에투명환의크기가크면세포외효소분비능력이우수하다고할수있다. 따라서목이버섯균주간에세포외효소분비능력비교평가는균사의접종원으로부터투명환이형성된부분까지길이를측정하여비교하였다. 0~20mm의투명환이보이는균주는효소분비능력이약한균주 (W), 20~50mm의투명환이보이는균주는중도적인효소분해능력을보이는균주 (M), 그리고 50mm 이상의투명환을보이는균주를효소분비능력이강한균주 (S) 로구분하여평가하였다. 마. A. auricula-judae의균사생장최적온도를구명하고자 15 에서 35 까지 5 간격으로처리하여균사를배양한결과 Fig. 1에서와같이 25~30 가배양적온으로나타났다. 이는목이의진탕배양방법으로균사체생산시최적온도가 25~ 30 라는보고 ( 홍등, 1983) 와유사한경향이었다. 처리의배양소요일수는 31일, 초발이소요일수 15일, 자실체생육일수 18일로나타났다. 수량의경우배지당생체중이 295 g, 건물중이 31 g으로나타났다. 사. 참나무톱밥봉지배지 (2.4kg) 를이용하여목이버섯재배시생체중 572g, 건물중 51g 의생산이가능하였다. 2007년약 400톤수입되는목이버섯의수입대체효과가기대된다. 기존 1.2kg 배지와비교하여인건비, 재료비등의절감으로 1,000봉지 ( 일 ) 생산농가의경우연간 15,000천원의소득향상효과가예상된다. 아. 균주별배양특성은목 C 가 PDA 38.3mm, 톱밥배지 89mm 로생육이부진한데 비해, ASI 16023 은 PDA 51.3mm, 톱밥배지 102.3mm 로생육이빨랐다. 균주별 - 6 -
자실체생육특성은참나무톱밥봉지배지 (2.4kg) 이용재배시목 C 가배양소요일수 60 일, 초발이소요일수 18 일, 자실체생육일수 36 일, 생체중 949g 으로우수하였다. 경상북도농업기술원에서배양완료된자실체형성용배지를 3개농가에서실증시험을수행하였다. 시험장소는고령군쌍림면, 경산시자인면, 대구시학정동농가에서경북농업기술원목이버섯생육시험시험하우스와동일하게버섯자실체의유도및관수등의방법으로 2011년 9월부터 11월에걸쳐수행한결과, 초발이소요일수 16~17일, 자실체생육일수 34~37일, 생체중 585~645g으로지역적인차이는나타나지않았다. 2. 협동과제 : 목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의식품 ᆞ 약리활성분석과식 품소재화 가. 본연구의목적은목이버섯 70% 에탄올추출액에서분리된여러용매의분획물 ( 에탄올, dichloromethane, 에틸아세테이트, butanol 및물 ) 의에대하여 P388D1 대식세포와육종의 180 cells에서 antitumor 활성을평가하고비교하는것이었다. 각용매의분획 (0.01 mg/ml, 0.3 mg/ml) 의이위의두세포주에서 antitumor 활성이농도-의존적으로나타났다. 항암활성은 MTT와 SRB의 assays 로확인하였고항암활성은두방법에서통계적차이는없었다. dichloromethane 분획의 IC 50 값은 sarcoma 180 세포에서 94.2 μg/ml로다른분획추출물보다낮은농도를보였다. Dichloromethane (DCM) 분획추출물은 BALB/c mice에서고형암에대하여항암활성을보였다. 비장의거대증과높은 splenic index는 tumor-bearing mice에서발견되었으나 DCM 분획추출물은이를방지하였다. 이결과는항암활성의후보물질로 DCM 분획추출물이가장높은활성을보였다. 나. 목이버섯디클로르메탄의층의함염증효과를조사하였다. 목이버섯의디클로르메탄층은 10 μg/ml 이하의농도에서농도-의존적인방법으로 LPS에의해서유도된염증반응을억제하였다. 더욱이 RT-PCR 결과는 inflammatory cytokines (IL-6, TNF-α and IL-1β) mrna의발현이억제되었다. 그러나디클로르메탄층은 IL-6 mrna을억제하지않았다. 단백질수준에서 IL-1β cytokine의발현은농도의존적으로억제되었다. 결론적으로목이버섯의에탄올추출액은 RAW264.7 cell에서 LPS에의해유도되는 NO, IL-6, TNF-α 그리고 IL-1β 발현을억제하였다. - 7 -
Auricularia auricula-judae, Phellinus gilvus, Ganoderma lucidum extracts 와한국전통식물추출물에대해서 P388D1 대식세포를이용하여항암활성을비교하고자실시하였다. 목이버섯추출액 (44.21%) 과마른진흙버섯추출액 (39.46 %), Ganoderma lucidum 추출액 (36.64%) 를비교시항암활성에차이가없었다. 100 한국야생식물중에서 Morus bombycis for. Kase, Draba nemorosa var hebecarpa, Sedum oryzifolium, Lotus corniculatus var. japonicus 그리고 Auricularia auricula-judae 70% ethanol extracts는 41.85%, 37.31%, 30.29%, 31.98% 그리고 25.40% 의억제율을 3 mg/ml의농도에서보였다. 50% 항암억제율 (IC50) 는 1.81, 1.49, 1.05, 1.10 그리고 0.72 mg/ml를보였다. Sarcoma 180, NCI H358 그리고 SNU 1 세포주에대해서는목이버섯추출액은 65.71%, 69.76% 그리고 68.01% 각각보여주었다. 위의결과를종합시에는 4개의야생식물과 Auricularia auricula-judae, Phellinus gilvus, Ganoderma lucidum extracts는비슷한수준의항암활성을나타내었으며이러한추출액은새로운항암제의후보물질로가능성을나타내었다. 본연구의목적은 70% 목이버섯에탄올추출액으로부터분획추출물에대하여기관지폐포암과위암을이용하여항암활성을비교하는것이고특히 DCM 추출액의활성성분을확인하고자하였다. 70% 에탄올추출액에서추출한각용매추출액은농도-의존적인항암활성을보였다. DCM에서의주요성분은 5,11,17,23-tetrakis (1,1-dimethyl)-28-methoxypentacyclo (65.85%) 과 diazane (6.17%) 이다. 특히 diazane과 gibberellic acid (GA3) 는 Gas Chromatography Coupled Mass Spectroscopy (GC-MS) analysis에서분석되었지만 DCM 분획물보다는약한항암활성을보여새로운성분이포함되어있다는것을암시한다. IC 50 value를기초로 gibberellic acid는작은항암활성을보였다. Apoptosis에대하여조사한결과 Bcl-2의 down-regulation과 P53의과발현을용매분획물과 diazane 구리고 gibberellic acid의존재하에서보였다. Dichloromethane (DCM) fraction의 DPPH free radical 소거의강한활성과 antioxidant activity index (AAI) 는 1.24로항산화기능성식품으로의응용이가능할뿐만아니라항암활성을갖는기능성식품의중요한소재로활용이가능할것으로사료되었다. - 8 -
Ⅴ. 연구성과및성과활용계획 1. 새로운약용버섯재배기술보급으로농가의소득증대 ( 농가이전기술 ): 1차산업 2. 목이버섯을이용한제품의개발범위확대 ( 기술개발 ) : 2차산업 3. 목이버섯추출액을이용한효능검정 4. 목이버섯을이용한가공품의개발 5. 언론홍보 (TV, 신문 ): 새로운야생버섯의대량생산기술개발및효능. 6. 농민의계약재배에따른농가소득의향상과기업의제품생산에의한매출액증대 7. 논문발표, 농민교육등으로버섯농가이용확대. - 9 -
SUMMARY Ⅰ. TITLE Mass culture system and species improvement, food pharmacological action and food materials of Auricularia auricula-judae Ⅱ. OBJECTIVE AND NECESSITY Auricularia auricula-judae is called wood ear, free ear, black ear mushroom, and free jelly fish etc. and is mainly cultivated in China,Taiwan,Thailand and Indonesia. This is an edible mushroom and has reddish brown, gelatinous, usually wrinkled or veined surface and with out distinctive smell. A. auricula-judae has been consumed medicinally as it demonstrates significant antitumor, cardiovascular, and hypercholesterolemic effects. This study has been conducted to development of mass culture system and species improvement, food pharmacological action and food materials of Auricularia auricula-judae. Ⅲ. RESULTS OF THE STUDY 1. This study was carried out to obtain the basic information for mycelial culture conditions of Auricularia auricula-judae According to colony diameter and mycelial density, the media for suitable mycelial growth of them were shown in PDA, YMA and MCM. The optimum temperature for mycelial growth was 25~30. Carbon and nitrogen sources were mannose and dextrin, respectively. The optimum C/N ratio was 10:1 to 2:1 with 2% glucose concentration, vitamin was thiamine-hcl and biotine, organic acid was succinic acid and lactic acid, and mineral salt was MgSO 4 ᆞ7H 2 O, - 10 -
KH 2 PO 4 and NaCl. 2. Auricularia auricula-judae, which is also known as wood ear, free ear, black ear mushroom, and free jelly fish, is an edible mushroom. Present experiments were conducted to determine the possibility of artificial culture with oak sawdust of A. auricula-judae. The duration of mycelial growth and days of pinhead formation of oak sawdust bag (1.4kg) were 2 9~32days and 13~17days, respectively. The yield of mushroom fresh fruitbody was 275~350g. 3. To obtain basic information on the detection of cellulolytic activity in Auricularia auricula-judae, the influences of dye reagent, ph, and temperature were assessed. Chromogenic dye (Congo Red, Phenol Red, Remazol Brilliant Blue, and Trypan Blue) was individually incorporated into a medium containing either carboxymethyl-cellulose, Avicel, or D-cellobiose as a polysaccharide carbon substrate. The other assessments utilized phs ranging from 4.5 to 8.0 and temperatures from 15 35. Overall, when A. auricula-judae species were transferred onto media contained Congo red and adjusted ph7.0 and then incubated at 25 for 5 days, the clear zone indicative of cellulolytic activity was more pronounced. 4. Auricularia auricula-judae, which is also known as wood ear, free ear, black ear mushroom, and free jelly fish, is an edible mushroom. Present experiments were conducted to determine the possibility of artificial culture with oak sawdust of A. auricula-judae. The duration of mycelial growth and days of pinhead formation of oak sawdust bag (1.4kg) were 2 9~32days and 13~17days, respectively. The yield of mushroom fresh fruitbody was 275~350g. A. auricula-judae and Auricularia polytricha mushrooms were compared by the morphology in the electric microscope etc. They were similar but showed a little differences. And fine structure of basidiospore was investigated. 1) A. auricula-judae GBAA-01, GBAA-02, ASI 16023, ASI 16033 of Basidiospores were kidney-shape and its size is 11.0~14.4 4.0~5.3 μm. 2) A.polytricha ASI 16009, ASI 16021 were kidney-shape and its size is 11.1~13.3 3.9~5.1 μm. - 11 -
5. Comparative antitumor activity of different solvent fractions from an Auricularia auricula-judae ethanol extract in P388D1 and sarcoma 180 cells: The objective of this study was to evaluate and compare the antitumor activity of different solvent fractions (ethanol, dichloromethane, ethyl acetate, butanol and water) of the Auricularia auricula-judae 70% ethanol extract on the P388D1 macrophage and sarcoma 180cells. A dose-dependent antitumor activity of each solvent fraction (from 0.01 mg/ml to 0.3 mg/ml) was shown against both cell types. These cytotoxic effects of all the tested fractions were confirmed on the MTT and SRB assays, without statistical differences each other. IC50 value of dichloromethane fraction was 94.2 g/ml against sarcoma 180 cells lower than any other solvent fractions. The potent antitumor effect of the dichloromethane (DCM) fraction was also found against solid tumor in BALB/c mice. The splenomegaly and higher splenic index were found in tumor-bearing mice, with the DCM fraction returning to the negative control values. Thus, the results indicated the dichloromethane fraction may have potential ingredients as antitumor candidates. 6. Anti-inflammatory activity of dichloromethane extract of Auricularia auricula-judae in RAW264.7 cells The present study investigated the anti-inflammatory effects of dichloromethane extract of Auricularia auricula-judae. Dichloromethane extract of Auricularia auricula-judae inhibited Lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide (NO) production significantly in a dose-dependent manner in the concentration 10 μg/ml (p < 0.05). Furthermore, RT-PCR results of this study indicated that the extract markedly reduced the expressions of inflammatory cytokines (IL-6, TNFα and IL-1β) mrna in LPS-treated murine RAW 264.7 macrophages, which could possibly ameliorate the inflammation. Nevertheless, dichloromethane extract of Auricularia auricula-judae did not show complete inhibition of IL-6 mrna expression. The inhibition of IL-1β cytokine at protein level was also observed in a dose dependent manner. In conclusion, the current study revealed thepreviously unknown effect of dichloromethane ethyl extract of Auricularia auricula-judae inhibitions of - 12 -
the production of NO, IL-6, TNF-α and IL-1β in LPS-stimulated macrophages. 7. Comparative antitumor activity of Auricularia auricula-judae extracts against tumor cells in vitro The present study was carried to compare the anti-tumor activity of Auricularia auricula-judae, Phellinus gilvus, Ganoderma lucidum extracts and 100 Korean wild plants in the P388D1 macrophage cell line. In comparison with the antitumor activity of Auricularia auricula-judae extract(44.21%) was not differed significantly (P<0.05) with Phellinus gilvus (39.46%) and Ganoderma lucidum (36.64%) at 1 mg/ml of concentration. Among 100 wild plants, Morus bombycis for. Kase, Draba nemorosa var hebecarpa, Sedum oryzifolium, Lotus corniculatus var. japonicus and Auricularia auricula-judae 70% ethanol extracts exhibited the viability of tumor cells by 41.85%, 37.31%, 30.29%, 31.98% and 25.40% at 3 mg/ml of concentration, while inhibition concentration (IC50) values were 1.81, 1.49, 1.05, 1.10 and 0.72 mg/ml respectively. In sarcoma 180, NCI H358 and SNU 1 cell lines, the inhibitory activities of Auricularia auricula-judae extract were 65.71%, 69.76% and 68.01% respectively. Taken together, the results obtained from the present study indicated that four plants extracts (4% of tested wild plants) and Auricularia auricula-judae extract with similar levels of Phellinus gilvus and Ganoderma lucidum extracts may be as the candidates of the new potential anti-tumor agents. 8. In vitro antitumor and antioxidant activities of dichloromethane fraction of Auricularia auricula-judae 70% ethanol extracts The aim of this study was to investigate the antitumor activity of solvent fractions from Auricularia auricula-judae 70% ethanol extract and confirmed the active components of dichloromethane (DCM) fraction showing a potent antitumor activity than other fractions in the broncheoalveolar and gastric cancer cells. The solvent fractions of Auricularia auricula-judae extract, inhibited the growth proliferation of tumor cells in dose-dependent manner. The principle components of dichloromethane fraction were 5,11,17,23-tetrakis (1,1-dimethyl)-28-methoxypentacyclo (65.85%) and diazane (6.17%). The antitumor active components, diazane and gibberellic acid (GA3) were - 13 -
identified in this fraction by Gas Chromatography Coupled Mass Spectroscopy (GC-MS) analysis and found lower antitumor activities than dichloromethane fraction. So, the unknown components of dichloromethane fraction were responsible for its cytotoxic effects on tumor cells. On the basis of IC50 value, gibberellic acid was little cytotoxic itself. The apoptosis of tumor cells were induced by the down-regulation of Bcl-2 and over-expression of P53 on the presence of solvent fractions, diazane and gibberellic acid. The strong ability of dichloromethane (DCM) fraction to scavenge the DPPH free radicals and the antioxidant activity index (AAI) was 1.24. Thus, these findings suggest that the dichloromethane fraction might be used as functional feed additive that suppress the tumor growth in the body and enhancing antioxidant activity. - 14 -
CONTENTS Ⅰ. Mass culture system and species improvementof Auricularia auricula-judae. 1. Summary of Project 2. Charactererization of cultured Auricularia auricula-judae 3. Biochemical Characterization of the tree ear fungus 4. Wood ears of the fruiting bodies produced by Sawdust cultivation and Breeding 5. Application in mushroom farm Ⅱ. Food pharmacological action and food materials of Auricula ria auricula-judae 1. Summary of Project 2. Comparative antitumor activity of different solvent fractions from an Auricularia auricula-judae ethanol extract in P388D1 and sarcoma 180 cells 3. Anti-inflammatory activity of dichloromethane extract of Auricularia auricula-judae in RAW264.7 cells 4. Comparative antitumor activity of Auricularia auricula-judae extracts against tumor cells in vitro 5. In vitro antitumor and antioxidant activities of dichloromethane fraction of Auricularia auricula-judae 70% ethanol extracts - 15 -
Ⅰ. 목이 (Auricularia auricula-judae) 의품종육성 ᆞ 대량재배시스템 확립 제 1 장. 연구개발의개요 제 2 장. 국내외연구개발현황 제 3 장. 목이버섯류의배양적특성조사 제 4 장. 목이버섯균류의생화학적특성조사 제 5 장. 톱밥재배에의한목이버섯의자실체생산및계통육성 Ⅱ. 목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의식품 ᆞ 약리활성분석과 식품소재화 제 1 장. 총론 제 2 장. P388D1 과 sarcoma 180 cell 에서목이버섯에탄올추출액으로부터여러 용매분획의비교항암효과시험 제 3 장. RAW264.7 cells 에서목이버섯의디클로메탄층의항염증효과시험 제 4 장. 목이버섯추출물의항암활성 - 16 -
목이 (Auricularia auricula-judae) 의품종육성ㆍ 대량재배시스템확립 제 1 장연구개발과제의개요 1. 서언 목이버섯 (Auricularia) 의이름은그리스어인 Auricula" 에서왔으며 귀 (ear)" 라는뜻이다. 따라서보통나무귀 (tree ear), Jew's 귀또는귀버섯이라고불린다. 즉자실체의형태가귀와비슷하고 ( 그림 1), 촉감이고무질과젤라틴질에의해귀처럼느껴지기때문이다. Lowy에의해분류된목이버섯 10여종류가운데목이 (A. auricula) 와털목이 (A. polytricha) 가가장인기있는버섯으로두종류모두사물기생균이다. 목이는최초로인공재배된버섯으로보고되었는데, A.D. 600년경부터중국에서재배되어왔다. 그림 1. 야생목이버섯 1) 목이의생물학목이는세계적으로널리분포되어있고, 특히한국, 중국, 일본등지에서는다량의야생버섯이발견되고있다. 목이의종류는크게나누어서목이목 (Auriculariales) 목이과 (Auriculariaceae) 목이속 (Auricularia) 에속하는목이 (Auricularia auricula) 와털목이 (Auricularia polytricha) 가있고, 흰목이목 (Tremellales) 흰목이과 (Tremellaceae) 흰목이속 (Tremella) 에속하는흰목이 (Tremella fuciformis) 가있다. 이들은각종활엽수의고사목이나반고사목에서생장하고있으며, 버섯의모양이사람의귀와같아서중국에서는목이 ( 木耳 ), 우리나라에서도목이또는흐 - 17 -
르레기, 일본에서는해파리또는기쿠라케 ( キクラケ ) 라고하며, 서구에서는 ear mushroom이라고도한다. 이중에서목이는보통흑목이라고하면, 중국에서는검정귀버섯으로불리는데, 대량으로재배되고있다. 이버섯은다른버섯보다맛과씹는촉감이좋아서널리애용되고있다. 2) 버섯의형태적특성및식품적가치가. 형태적특성야생목이는봄부터가을에걸쳐활엽수의고목 ( 枯木 ), 마른가지에군생 ( 群生 ) 하며, 전세계에분포한다. 자실체 ( 字實體 ) 는지름 3~12cm로종형~귀형이며젤라틴질이다. 갓표면은미세한털이빽빽이나있으며황갈색~갈색이다. 아랫면의자실층은평활하나불규칙한연락맥 ( 連絡脈 ) 이있으며표면보다옅은색이다. 담자기는원통형이며, 가로막에의해 4실이된다. 포자 ( 胞子 ) 는 11~17 4~7μm로콩팥형이고, 표면은평활하고, 포자문 ( 胞子紋 ) 은백색이다 ( 그림.1). 식용버섯이며중국요리특히잡채요리에많이사용된다. 목이는따뜻하고건조한지역에서생장이잘되므로, 남부지방에서의재배가적당하다. 버섯의외부형태는종 ( 鐘 ) 또는귀모양이며, 버섯의지름이 2~6cm 내외이고잎맥모양의주름살이있다. 버섯의조직은한천질로서부드러우나탄력성이있어질긴편이며, 건조하게되면딱딱하고얇아지게된다. 생버섯상태에서는표면의색깔이적갈색이지만건조되면남흑색을띠며, 안쪽에는짧은털이있다. 그러나이같은털은짧고부드러워서식용하는경우에아무런지장이없다. 버섯은대가거의없고갓만발달되어있으며, 앞면과뒷면의색깔이다르다. 앞면은비교적반들반들하고, 흑갈색윤기를띠고있으며, 아래로오그라들어있다. 그러나뒷면에는옅은색깔을띤, 번식기관인담자층이있고, 돌기가있으며, 연한회백색의짧은털이있어앞면보다흰빛을띠게된다. 버섯의담자포자는신장형으로서크기가 4~9μm 6~5μm 정도이다. 나. 식품및약리적가치목이는특유한맛과향이있고씹는촉감이좋으며, 버섯이변질되지않고건조가잘되어보관과저장성이강한장점이있다. 또, 표 1, 2, 3, 4에서보는바와같이영양가가비교적높아서, 단백질이 11.3%, 칼륨 1200mg, 인 434mg, 철및칼슘이많으며, 각종비타민의함량이높다. 특히섬유소함량이높고교질상물질이많 - 18 -
아서, 식용하게되면식도및위장을씻어내는특수한작용을하게된다. 외국에서는인체내에들어간털및섬유모양의잡물질을제거하는데효과적이므로, 광부또는방직공장근로자들이애용하고있다. 의학적으로는혈액을적당히응고시키는작용이있어서출산모또는출혈이심한환자에게도이용할수있다. 중국에서는예부터불로장생의버섯으로인식되어있으며, 지금도검정귀버섯으로널리알려져전국민이즐겨먹고있다. 항암, 심혈관질환, 항고콜레스테롤효과가있는것으로보고되어있다 ( 이등, 1981; Chen, 1989; Cheung, 1996; Misaki and Kakuta, 1995). 목이버섯의식품적가치는특유의맛과향이있고씹는촉감이좋으며, 버섯이변질되지않고건조가잘되어보관과저장성이강한장점이있으며, 목이버섯의국내수요는 2007년 392톤을수입하는등대부분중국에서수입되고있으나최근들어경북, 경기등지에서재배가시도되고있다. - 19 -
제 2 장국내외기술개발현황 중국에서식용과약용으로이용되어왔으며, 목이 (A. auricularia) 는온대지역에서주로발견되고주요생산국은중국, 대만등지이며비닐백 ( 봉지 ) 재배를주로하며재배지의재한을적게받는다. 1987년농촌진흥청에서목이1호가육성되었으나 ( 소규모재배시험, 850ml톱밥배지 ), 목이버섯의대량생산기술은국내에서연구된바없으며, 목이버섯의대량생산기술은본연구진 ( 경북농업기술원 ) 에서수행하여상당한결과를도출하였다. - 20 -
제 3 장연구개발수행내용및결과 1. 목이버섯균류의배양적특성조사 가. 시험방법본연구에사용한균주는 Table 1에표시하였다. Auricularia auricula-judae 6계통을사용하였으며, 버섯균주보관용배지는 PDA(Merck사 ) 를사용하였으며, PDA배지에 30 항온기에 7~10일간배양된균사의선단부위를직경 5mm cork borer로절단하여접종원으로사용하였으며 30 항온기에서 10일간격으로계대배양하면서본실험에사용하였다. Table 1. List of Phellinus spp. strains used in this study Scientific name Strain name Common name Origin culture Auricularia auricula-judae 목A Mogjilbeoseot GBAA-01 Auricularia auricula-judae 목B Mogjilbeoseot GBAA-02 Auricularia auricula-judae 목C Mogjilbeoseot GBAA-03 Auricularia auricula-judae 목D Mogjilbeoseot GBAA-04 Auricularia auricula-judae 목E Mogjilbeoseot GBAA-05 Auricularia auricula-judae 목F Mogjilbeoseot GBAA-06 (1) 배지선발적정배지를선발하기위하여 PDA(Potato dextrose agar) 를비롯한 12종의배지를이용하였으며각각의배지는 121 에서 20분간고압살균후살균된 Petri-dish( 직경 8.5cm ) 에 20ml씩분주하여조제하였으며, PDA배지, 30 에서 7 일간배양된목질진흙버섯균들의균사선단부분을직경 5mm cork borer로균사체를조제한배지의중앙에접종하였다. 접종된배지는 30 의항온기에서 9일간배양하여균사생장, 밀도, 색도를조사하였다. 시험균주의균사생장에적합한배지를구명하기위한배지조성은 Table 2와같다. - 21 -
Table 2. Composition of media used in this study Media and composition(g/l) Nutritional Malt Czapek Glucose Henner reagents PDA MEA YEA YMA Yeast Leonian MCM dox peptone -berg extract Lilly Hoppkins Glucose 10 10 10 25 20 50 10 Sucrose 30 Maltose 10 Peptone 3 10 5 2 Yeast extract 5 10 3 5 2 Malt extract 30 15 3 3 Potato extract 4 DL- Asparagine 2 Dextrose 20 10 NaNO 3 3 2 MgSO 4 ㆍ7H 2 O 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 KCl 0.5 FeSO 4 ㆍ7H 2O 0.01 0.02 CaCl 2 ㆍ2H 2O 0.1 ZnSO 4 ㆍ7H 2O MnSO 4 ㆍ5H 2O 0.01 K 2 HPO 4 1 1 KH 2 PO4 1 1 0.5 1 1 0.1 KNO 3 2 2 Agar 15 15 20 20 20 20 20 20 20 20 20 20-22 -
(2) 배양온도공시균주의균사생육최적온도를구명하기위하여 MEA(Malt extract agar) 를기본배지로하여직경 5mm cork borer로잘라낸균사체를접종하여 10, 15, 2 0, 25, 30, 35 로조절된항온기에서 10일간생육시켜균사생장길이를측정하였다. (3) 탄소원기본배지는버섯최소배지 (Mushroom Minimal Media, MMM, Dextrose 20g, MgSO 4 0.5g, KH 2 PO 4 0.46g, K 2 HPO 4 1g, Asparagine 2g, Thiamine HCl 120 μg, Bacto Agar 20g, DW 1,000ml ) 에탄소원 Sucrose, Lactose, Dextrin, Mannitol, Maltose, Glucose, Fructose, Sorbitol, Mannose, Starch 10종의탄소원을각각 2% 씩첨가하여, petri dish에 20ml씩분주하여공시균주를접종하였고, 30 항온기에서 10일간배양후균사생장, 밀도, 색도를조사하였다. (4) 질소원기본배지버섯최소배지 (MMM) 에질소원 Yeast extract, Malt extract, Pepton, Urea, Ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium sulfate, Pottasium nitrate, sodium nitrate, calcium nitrate, Glutamic acid, Arginine 12종의질소원을각각 0.2% 씩첨가하여, petri dish에 20ml씩분주하여공시균주를접종하였고, 30 항온기에서 10일간배양후균사생장, 밀도, 색도를조사하였다. (5) 최적 C/N비선발버섯최소배지 (MMM) 를기본배지로하여질소원 NaNO 3 을 0.2% 로고정시키고탄소원으로 Glucose 농도를 10, 8, 6, 4, 2, 1, 0.4, 0.2% 로하여, C/N비가 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 1:1이되도록첨가하여, petri dish에 20ml씩분주하여공시균주를접종하였고, 30 항온기에서 9일간배양후균사생장, 밀도, 색도를조사하였다. (6) Vitamin의영향기본배지는버섯최소배지 (Mushroom Minimal Media, MMM, Dextrose 20g, MgSO 4 0.5g, KH 2 PO 4 0.46g, K 2 HPO 4 1g, Asparagine 2g, Thiamine HCl 120 μg, Bacto Agar 20g, DW 1,000ml ) 로하였고, thiamine-hcl 0.1mg /l, - 23 -
riboflavin 0.5mg /l, biotine 0.005mg /l, pyridoxine 0.5mg /l, nicotinamide 2.0 mg /l의농도로비타민류를살균수에혼합하여 Metrical membrane filter(0.2μm ) 로여과한후에기본배지살균후첨가하여, petri dish에 20ml씩분주하여공시균주를접종하였고, 30 항온기에서 9일간배양후균사생장, 밀도, 색도를조사하였다. (7) 유기산버섯최소배지에 Acetic acid, Citric acid, Maleic acid, Lactic acid, Succinic acid, Fumaric acid 6종의유기산을각각 0.1% 씩첨가하고, petri dish에 20ml씩분주하여공시균주를접종하였고, 30 항온기에서 9일간배양후균사생장, 밀도, 색도를조사하였다. (8) 미량요소최적미량요소를구명하기위해무기염류가배제된 YM 고체배지 (Peptone 5g, Yeast extract 3g, Malt extract 3g, Dextrose 10g, Agar 20g, DW 1,000ml ) 를기본배지로하여 MgSO 4 ᆞ7H 2 O 등 9종을처리농도 0.1% 로첨가하여살균후 petri dish에 20ml씩분주하여공시균주를접종하였고, 30 항온기에서 9일간배양후균사생장, 밀도, 색도를조사하였다. 나. 시험결과 (1) 배지선발진흙버섯류균의기본적정배지를선발하기위하여 PDA, Czapek dox, MEA, YMA, MCM 배지등 12종의배지를제조하여균사생장을조사한결과는 Table 4 와같다. 균사생장은 MEA, Glucose peptone, MCM, Malt Yeast extract 배지에서양호하였고, Czapek dox, Leonian, Hennerberg 배지에서는균사가눈에띄지않을정도의무색투명한상태로배지표면에퍼지는현상을나타내어공시균의배양에는부적합하였다. 목이버섯균의균사생장에는유기태질소원이나복합질소원이함유된배지에서균사생장이양호하였다. 목E 균주는목F 균주에비해생육이부진하였으며, 균사체배양시색깔은대체적으로흰색을나타내었다. - 24 -
(2) 배양온도목이버섯균의균사생장최적온도를구명하고자 10 부터 5 간격으로 35 까지처리하여균사를배양한결과, Fig. 3에서와같이 25 ~30 범위에서균사생장이가장양호하였으며, 20 이하와 30 이상의온도에서는생장이극히저조하였다. (3) 탄소원탄소원은균류에있어서탄수화물, 단백질, 지질, 핵산등의합성과에너지공급원으로서균의생장에필수적인영양원이다. 각종탄소원이진흙버섯류의균사생장에미치는영향을조사한결과는 Table 5에서와같이단당류인 Glucose, Mannose를첨가한배지에서균사생장이양호하였고, 2당류인 Maltose에서도대체로양호한편이었다. 이등 (2004) 은균사생장과밀도면에서볼때 malt extract가가장좋은탄소원이며, xylose를첨가한배지에서는 control 배지보다균사생장이부진하다고보고하였고, 지등 (1996) 은 D-glucose, D-mannose, dextrose를첨가한배지에서균사생장이가장양호하다고하였다. 이는실험결과와대체로일치하였으며목이버류의탄소원은주로단당류가적합하였다. (4) 질소원질소원은세포질을구성하고있는주요성분의합성에필수적인영양원으로각종질소원이목이버섯류균의생장에미치는영향을조사한결과는 Table 6과같다. Malt extract가균사생장및밀도가가장양호하였으며, Amino acid류인 L-glutamic acid를첨가한배지에서도균사생장이양호하였다. 복합질소원인 Peptone을첨가한배지에서도균사생장이양호하였으나, 유기태질소원인 Urea 첨가시균사생장이부진하였다. 무기태질소원인 Potassium nitrate와 Sodium nitrate에서는 Ammonium태질소원보다균사생장이빠른편이었다. 이등 (2004) 은질소원선발에서 yeast extract가가장양호하였고, peptone과 NH 4 NO 3 첨가배지에서는질소원을첨가하지않은배지보다균사생장이떨어졌다고보고하였으며, 지등 (1996) 은유기태질소원인 cassamino acid와 Amino acid류인 L-alanine, L-glutamic acid를첨가한배지에서균사생장이가장양호하였다고보고한내용과유사한결과로판단된다. (5) 최적 C/N 비 목이버섯류균사생장에적합한탄소원농도및질소원과의비율을조사한결과는 Table 7 에서와같이탄소원 (Glucose) 의농도 2% 와 C/N 비가 10:1 일때균사생장 - 25 -
과밀도가양호하였다. 이것은이등 (2004) 이목질진흙버섯 (P. linteus) C/N 비 10:1 에서균사생장과밀도가양호하였다는보고와유사하였다. (6) Vitamin의영향기본배지는버섯최소배지 (MMM) 에각종 vitamin을첨가하여균사생장량을조사한결과는 Table 8과같다. Riboflavin, Pyridoxine, Nicotinamide도생육이비슷한수준으로양호하였으나, Thiamine-HCl과 Biotin의생육이상대적으로더욱양호하였다. (7) 유기산기본배지 (MMM) 에각종유기산을 0.1% 씩첨가하여균사생장량을조사한결과는 Table 9에서와같이 succinic acid와 lactic acid에서양호하였고, acetic acid에서는전혀균사가생장하지못하였다. (8) 미량요소최적미량요소를구명하기위해무기염류가배제된 YM 고체배지를기본배지로하여 MgSO 4 ᆞ7H 2 O, KH 2 PO 4, KCl 등 9종을처리농도 0.1% 로첨가하여균사생장량등을조사한결과는 Table 10과같이 MgSO 4 ᆞ7H 2 O와 KH 2 PO 4 에서양호하였고, ZnSO 4 ᆞ7H 2 O 처리구에서는거의균사가생장하지못하였다. - 26 -
PDA MEA YEA Czapek dox Glucose peptone YMA Malt Yeast extract Leonian MCM Hennerberg Lilly Hoppkins a): C; compact, SC; somewhat compact, ST; somewhat thin, T; thin b): Br; brownish, SY; somewhat Yellowish, Y; Yellowish, W; Whitish z): Values in the same line with different literal differ at Duncan's multiple range test (P<0.05) and results are mean ± standard deviation of three replicates. - 27 -
Sucrose 67.7±2.1 ab 27.3±5.2 ab 21.7±2.5 bc 31.0±2.9 a 58.7±4.2 bc Lactose 45.3±9.5 c 25.3±4.6 ab 21.0±3.7 bc 42.0±9.4 a 66.3±2.6 ab d 71.0±1.0 a c 80.3±1.2 a Dextrin 54.0±6.5 bc 50.7±7.3 a 22.0±0.8 bc 57.0±12.8 a 68.7±2.6 ab 80.0±0.8 a Mannitol 66.3±2.6 ab 29.0±0.8 ab 20.7±2.9 bc 36.0±5.4 a 69.0±0.8 a 82.0±0.8 a Maltose 61.3±1.9 abc 25.3±1.2 ab 19.3±1.2 bc 31.3±1.2 a 57.7±2.1 cd 79.7±0.5 a Glucose 44.7±2.5 c 20.0±0.8 b 16.3±2.1 c 27.7±2.1 a 45.3±2.9 e 51.3±2.5 b Fructose 64.3±4.8 ab 27.0±7.0 ab 24.0±3.7 bc 33.0±2.9 a 57.7±4.8 cd 67.7±3.8 a 47.7±20.3 53.0±18.8 Sorbitol 66.7±2.6 ab a 42.7±8.7 a a 60.3±2.6 ab c 81.7±0.5 a Mannose 73.0±2.4 a 29.3±2.5 ab 21.0±1.6 bc 55.7±9.9 a 50.0±0.8 de 79.0±2.9 a Starch 61.3±8.7 abc 35.7±4.5 ab 30.3±0.5 ab 41.3±2.6 a 60.3±3.7 ab c 69.0±12.2 a - 28 -
Yeast extract 46.3±7.6 a 67.0±2.0 a 69.0±4.6 a 64.7±2.1 a 46.3±1.5 a 75.7±2.1 a Malt extract 42.0±4.0 ab 43.7±1.5 b 35.0±7.1 b 50.7±3.8 b 41.3±1.5 ab 75.7±0.6 a Peptone 36.0±2.6 bc 22.3±4.2 c 21.3±1.5 bcd 35.3±4.7 c 24.7±1.5 def 60.3±7.5 c Urea 14.0±1.0 e 13.3±1.5 cd 14.3±2.1 d 9.7±2.1 e 15.0±1.0 fg 32.3±1.5 d Ammonium nitrate 14.0±1.0 e 9.7±2.1 d 14.0±3.0 d 15.7±4.2 de 37.3±3.1 abc 69.0±1.0 abc Ammonium chloride 21.3±2.1 de 10.3±2.3 d 15.0±1.0 d 17.7±1.5 de 29.3±4.9 cde 70.7±1.5 ab Ammonium acetate 27.0±1.0 cd 18.7±8.0 cd 19.0±2.0 cd 21.7±6.4 d 22.7±2.1 ef 60.3±1.5 c Ammonium sulpate 24.7±3.8 d 10.0±1.0 d 10.0±1.0 d 15.3±1.5 de 29.3±2.1 cde 60.7±2.5 c Potassium nitrate 41.0±3.6 ab 14.7±2.1 cd 15.3±3.5 d 21.7±2.1 d 34.3±5.5 bcd 63.7±5.5 bc Sodium nitrate 40.3±2.5 ab 14.3±2.5 cd 16.0±1.0 d 19.5±0.7 de 31.0±9.6 b-e 61.0±3.6 c Calcium nitrate 25.7±4.9 d 11.0±1.0 d 12.7±0.6 d 17.3±0.6 de 9.3±0.6 g 24.7±0.6 de L-glutamic acid 21.7±4.7 de 16.7±0.6 cd 17.7±6.4 cd 19.7±2.1 d 21.7±1.5 ef 20.0±2.6 e L-arginine 41.0±2.0 ab 21.0±6.6 c 31.5±13.4 bc 21.7±2.5 d 40.0±2.0 ab 71.0±1.0 ab - 29 -
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Color b) W W W W W W W W W W+SY W W W W W W+SY W W W W W+SY W+SY W W W W W W+SY W W - - - - - W W W W W W W W GB GB GB GB W W W W W W W b): Br; brownish, SY; somewhat Yellowish, Y; Yellowish, W; Whitish - 33 -
2. 목이버섯균류의생화학적특성조사가. 시험방법 cellulolytic 효소의검출을위한최적의배지조성을위해다당류로결합하여염료를기반으로방법을선택하였다. 염료또는염료고분자복합이분해되면투명또는무색 halo를생산한다. 셀룰로오스는일반적으로 cellulolytic 효소를분비곰팡이의검출을위해사용되었다. Trichoderma와 Saccharomyces는각각 cellulolytic 효소생산을위한 positive, negative control로사용되었다. 모든배양은감자한천배지 (Difco) 에 5~7일간 25 에서준비되었다. 기본적인매체는질소와 1.5 % 한천가루로 0.1 % yeast nitrogen base (Difco) 으로구성되었다. 또한, 세가지종류의다당류 carboxymethyl (CM)-cellulose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), Avicel (Fluka, Buches, Switzerland), and D-cellobiose (Sigma-Aldrich) 가추가되었다. 배양후, 각각의플레이트는각곰팡이균총주위의투명또는무색 haloes ( 이하맑은지대로지칭 ) 의직경측정하였다. cellulolytic activitye을감지하는가장좋은염료를선택하려면 chromogenc 염료 ( 콩고레드, 페놀레드, Remazol 브릴리언트블루, 또는 Trypan 블루 ) 의 0.5 % 가 uninoculated 매체를추가되었다. 배양은각 chromogenic 매체로전이하여 5일동안 25 에서배양하였다. 산도의효과를평가하기위해우수한것으로판단 chromogenic 매체가접종따라 4.0-8.0의산도에서준비되었고, 배양은 5일동안 25 에서실시되었다. 나. 시험결과발색반응배지에서의균주간효소분해능력를비교하였다. 투명환은발색반응배지내에고르게분포하여존재하는발색시약에결합된효소의기질이목이버섯균에서분비된세포외효소와반응하여기질이분해되면서나타나기때문에투명환의크기가크면세포외효소분비능력이우수하다고할수있다. 따라서목이버섯균주간에세포외효소분비능력비교평가는균사의접종원으로부터투명환이형성된부분까지길이를측정하여비교하였다. 0~20mm의투명환이보이는균주는효소분비능력이약한균주 (W), 20~50mm의투명환이보이는균주는중도적인효소분해능력을보이는균주 (M), 그리고 50mm 이상의투명환을보이는균주를효소분비능력이강한균주 (S) 로구분하여평가하였다. - 34 -
Table 1. Comparison of chromogenic reaction by Auricularia auricula-judae on media containing different dyes Species Congo Red Phenol Red Remazol Brilliant Blue Trypan Blue Species CM Avi Cel CM Avi Cel CM Avi Cel CM Avi Cel GBAA-01 + + + + + + + + + - - + ASI 6009 + + + + + + - - + - - - ASI 6021 + + + + + + - - - - - - Trichoderma. (positive control) Saccharomyces. (negative control) + + + - - - - - - - - - + + + - - - - - - - - - CMC, Carboxymethyl cellulose; Avi, Avicel; Cel, D-Cellobiose; +, clear zone detection; -, no clear zone detection. - 35 -
Fig. 1. Examples of clear zones formed in media containing D-cellobiose and dye (A, Congo Red; B, Phenol Red; C, Remazol Brilliant Blue; D, Trypan Blue). Top row: after incubation of Trichoderma used as positive control. Bottom row: after incubation of GBAA-01. Arrows indicate clear zones. - 36 -
Fig. 2. Examples of clear zones formed in phs ranging from 4.5 to 8.0. Media contain D-cellobiose and Congo Red as carbon substrate and chromogenic dye, respectively. Top row: before incubation. Bottom row: after incubation of GBAA-01. Arrows indicate clear zones. Fig. 3. Result of chromogenic reaction of GBAA-01on the Congo red containing, ph 7.0 medium incubated at various temperatures. D-cellobiose was used as the carbon substrate. Arrows indicate clear zones. - 37 -
Fig. 4. Clear zone formed on Congo Red-containing, ph 7.0 medium by chromogenic reaction of GBAA-01. Carbon substrates used were Avicel (A), and CM-cellulose (B). Arrows indicate clear zones. - 38 -
3. 톱밥재배에의한목이버섯의자실체생산및계통육성 가. 시험방법 (1) 공시균주 : 시험에사용한공시균주는대구앞산에서채취한목이 (Auricularia auricula-judae; GBAA-01) 로시험을수행하였으며, 균주는 PDA 배지에서계대 배양을하면서재배실험에사용하였다. (2) 배양온도 : 시험에사용한목이 (A. auricula-judae) 의균사생장에적합한온도를조사하기위하여온도별배양실험은 PDA 배지에 7일간배양된균사의선단부위를직경 5 mm의 cork borer로절단하여 PDA 배지에접종한후 10, 15, 20, 25, 30, 35 로각각조정된항온기에 5일간배양한후균사체의직경을조사하였다. (3) 재료의성분분석이화학성분석은 AOAC법에준하여일반성분을대상으로분석하였고 C/N율은농업기술연구소토양이화학분석법 ( 한기학, 1988) 에준하였는데, 전탄수화물은 Tyurin법 ( 개량법 ) 으로전질소는 Kjeldahl법으로 P 2 O 5 는비색법으로 CaO, MgO, K 2 O는원자흡광분석법으로, ph는건조시료 5 g을증류수 25 ml에 30분간침적시킨후 ph-meter (Fisher model-50) 로분석하였다. (4) 배지조제배지재료로는참나무톱밥 (oak sawdust) 90%(v/v), 첨가제로는미강 10% 를사용하였으며, 재료와첨가제를부피비율 (V/V) 로혼합하여배지의수분함량을 65% 로조절한다음, 내열성비닐봉지 ( 부피 2 l) 에 1.4 kg씩충진하고배지중앙에직경 15 mm의구멍을뚫은후마개를닫아 121 에서 90분간고압살균하였다. (5) 균사배양및자실체생육조사고압살균된배지가 15 정도로식은후미리배양된종균을 20 g 정도씩접종하여 20 에배양하면서배양완성일수를조사하였다. 배양이완료된배지는발이를유도하기위하여온도 15~20, 습도 90% 의조건에서발이를유도하면서초발이소요일수를조사하였다. 그후, 온도 15~20, 습도 85% 의조건에서수확기까지생육시킨후자실체를수확하여배지당수량과자실체특성을조사하였다. - 39 -
(6) RAPD에의한 DNA 양상분석교잡체 (hybride) 로부터 DNA를분리하여 Bioneer PCR Premix kit를이용하여 genomic DNA 50 ng 2μl, primer 100 ng 1μl, DDW 7μl를첨가하였다. PCR 증폭반응은 ABI PCR SYSTEM 9700을이용하여처음 DNA의열변성을위하여 94 에서 5분간 1cycle, 그리고 94 에서 1분, 55 에서 1분, 72 에서 2분간으로총 35 cycle 실시하였으며, 최종 DNA의합성은 72 에서 10분으로하였다. 증폭된 PCR 산물은 1 TAE (40 mm Tris; 8.0, 20 mm acetic acid, 1nM EDTA) 완충용액에서 1.5% 의 agarose gel로전기영동한후 1μg / ml ethidium bromide 용액으로염색하여 UV transilluminator상에서나타나는 DNA band를확인하였다. (7) 인공재배자실체의형태학적특징조사자실체의형태와담자포자의미세구조등을관찰하기위하여관공 (Hymenial pore) 은실체현미경 (Olympus SZX9) 을이용하여 40배로관찰하였으며, 담자포자는광학현미경 (Olympus AX70) 을이용하여 400배의배율로관찰하였다. (8) 농가실증시험경상북도농업기술원에서배양완료된자실체형성용배지를 3개농가에서실증시험을수행하였다. 시험장소는고령군쌍림면, 경산시자인면, 대구시학정동농가에서경북농업기술원목이버섯생육시험시험하우스와동일하게버섯자실체의유도및관수등의방법으로 2011년 9월부터 11월에걸쳐수행하였다. 나. 시험결과 (1) 배지재료의이화학성배지재료로사용한참나무톱밥, 미강의이화학적특성을조사한결과, 산도 (ph) 는참나무톱밥 6.0, 미강 6.4로각각분석되었다. T-C는참나무톱밥 46.6%, 미강 52.4% 로나타났고, T-N는참나무톱밥이 0.28%, 미강 0.94% 로나타났다. CaO의경우참나무톱밥 0.92% 으로나타났으며, 미강 0.07% 으로낮게나타났다 (Table 1). - 40 -
Table 1. Chemical compositions of substrates for cultivation of Auricularia auricula-judae Substrate ph (1:5) T-N T-C C/N P 2O 5 K 2O CaO MgO (%) Sawdust 6.0 0.28 46.6 166 0.03 0.10 0.92 0.04 Rice bran 6.4 0.94 52.4 55.8 2.16 1.93 0.07 0.95 (2) 균사생장및자실체생육특성 A. auricula-judae의균사생장최적온도를구명하고자 15 에서 35 까지 5 간격으로처리하여균사를배양한결과 Fig. 1에서와같이 25~30 가배양적온으로나타났다. 이는목이의진탕배양방법으로균사체생산시최적온도가 25~30 라는보고 ( 홍등, 1983) 와유사한경향이었다. 처리의배양소요일수는 31일, 초발이소요일수 15일, 자실체생육일수 18일로나타났다. 수량의경우배지당생체중이 295 g, 건물중이 31 g으로나타났다 (Table 2, Fig. 1, 2). Table 2. Mycelial growth and mushroom production by sawdust bag cultivation of Auricularia auricula-judae strain GBAA-01 Duration of mycelial growth(days) Days for pinhead formation Wt. of fresh individual fruitbody(g) Wt. of dried individual fruitbody(g) Fruiting body Length of Width of Pileus Pileus ( mm ) ( mm ) Thickness of Pileus ( mm ) Wt. of fresh fruitbody(g) 29~32 13~17 6.8±4.2 a) 1.5±0.8 62.9±18.1 41.6±14.1 0.78±0.12 275~350 The sawdust bag medium was 1.4 kg. a): Mean ± standard deviation of ten replicates - 41 -
Fig. 1. Effect of temperature on mycelial growth of Auricularia auricula-judae strain GBAA-01 on PDA medium Fig. 2. Primordia (A) and mature fruiting bodies (B) of Auricularia auricula-judae on sawdust cultivation. - 42 -
배지조성참나무톱밥 90%+ 미강 10% (1.2kg) 참나무톱밥 90%+ 미강 10% (2.4kg) 배양소요일수a) 초발이소요일수자실체생육일수 ( 일 ) b) b) 생체중 건물중 (g) (g) 21 10 18 215 22 25 9 21 572 51 a) 온도 ; 22±1, 습도 ; 50~60%, b) 온도 ; 15±1, 습도 ; 80~90% * 2.4kg 톱밥배지 2.4kg 배지그림. 목이버섯의수확기 1.2kg 배지 - 43 -
6. 현장활용기대효과 손실적요소 (A) 이익적요소 (B) - 인건비 (30% 절감 ) : 1,100천원 10개월 - = 11,000 천원 - 재료비 (40% 절감 ) : 40 10,000장 - = 400 10천원 = 4,000천계 (A) : 0 계 (B): 15,000천원 o 추정수익액 (B-A): 15,000 천원 - 44 -
(3) 목이버섯의우수계통육성시험 균주별배양특성은목C가 PDA 38.3mm, 톱밥배지 89mm로생육이부진한데비해, ASI 16023은 PDA 51.3mm, 톱밥배지 102.3mm로생육이빨랐다. 균주별자실체생육특성은참나무톱밥봉지배지 (2.4kg) 이용재배시목C가배양소요일수 60 일, 초발이소요일수 18일, 자실체생육일수 36일, 생체중 949g 으로우수하였다. 표 1. 균주별균배양및자실체생육특성 균종 PDA 생장정도 톱밥배지생장정도 균사밀도 (mm) (mm) 목B 39.0 96.5 중 목C 38.3 89.8 상 목D 38.7 89.0 상 ASI6009 41.0 99.8 중 ASI6021 40.2 99.3 중 ASI6023 51.3 102.3 중 ASI6033 50.4 100.3 중 * 25 (8일차), 25 (26일차), 2.4kg봉지 - 45 -
표 2. 균주처리별균배양및자실체생육특성 배양소요일수 a) 균종 ( 일 ) 초발이소요일수자실체 b) 생육일수 b) ( 일 ) ( 일 ) 생체중 (g) 목B 63 21 36 903 목C 60 18 36 949 목D 59 21 36 834 ASI6009 57 25 36 262 ASI6021 58 22 36 645 ASI6023 59 16 36 775 ASI6033 60 15 36 572 a) 온도 ; 20±1, 습도 ; 50~60%, b) 온도 ; 15±1, 습도 ; 80~90% - 46 -
그림. 목이버섯담자포자형태 ( 200) (4) 농가실증시험 경상북도농업기술원에서배양완료된자실체형성용배지를 3개농가에서실증시험을수행하였다. 시험장소는고령군쌍림면, 경산시자인면, 대구시학정동농가에서경북농업기술원목이버섯생육시험시험하우스와동일하게버섯자실체의유도및관수등의방법으로 2011년 9월부터 11월에걸쳐수행한결과, 초발이소요일수 16~17일, 자실체생육일수 34~37일, 생체중 585~645g으로지역적인차이는나타나지않았다. 표. 지역별목이버섯자실체생육특성초발이소요일수자실체 지역 b) 생육일수 b) ( 일 ) ( 일 ) 생체중 건물중 (g) (g) 고령군 17 37 585 61 경산시 16 35 610 58 대구시 16 34 645 67 a) 온도 ; 20±1, 습도 ; 50~60%, b) 온도 ; 15±1, 습도 ; 80~90% - 47 -
1. 구분 : 품종육성 2. 육성내력 가. 균주수집 : 2007~2010 나. 특성검정 2007~2008 : 배양및재배적특성조사. 2008~2010 : 자실체발생균주선발시험. 2009~2010 : 우수균주농가실증시험 다. 육성기관 : 경상북도농업기술원농업환경연구과 1) 농촌진흥청 2) 경북대학교 3) 라. 육성자 : 조우식 1), 최성용 1), 유영복 2), 석순자 2), 정희영 3), 박승춘 3) 3. 주요특성가. 균사배양최적온도는 25~30 로 30 에서균사생장이가장양호하며자실체발생및생육온도는 15~25. 나. 접종후약 1개월간배양을실시한후, 매몰작업을실시해야함. 다. 자실체의형태는종형 ~ 귀형이며, 중생형으로발생함. 라. 단일개체중은자실체크기가중형 ( 장경 271mm, 두께 2.3mm ) 이어서조직은젤라틴질이다. 참나무톱밥에서자실체발생이양호하고자실체중량도높음. 마. 발생작업후, 9~10일이후부터자실체의발생이시작함. 바. 배지별균사생육에서는 PDA, MEA배지가양호함. 사. 참나무톱밥봉지재배에서수량및품질우수. 4. 적응지역 : 전국 5. 재배상유의점가. 참나무에서균사활착과균사생육이양호함. 나. 재배용배지살균시배지수분을 65% 내외로조절하여살균하는것이유리함. 다. 이식작업시상품성향상을위해서는늦어도 5월전또는 9월이후에매몰하여여름철고온기의생장정지를피해야함. 라. 재배사습도는 80~90% 이상으로유지하며지면의습도를이용하는것이유리함. 마. 자실체생육시공중습도를유지해야하므로습도조절이가능한시설재배사에서실시해야함 6. 보완을요하는특성 7. 시험성적 - 48 -
가. 선발균주의배양적특성 배지별균사생장특성 ( 배양온도 25, 배양기간 : 21일, 단위 : cm) W : white ASI6005( 목이 1 호 ) ASI6033 균사생장 (PDA, 25, 16 일 ) 온도별균사생장특성 ( 공시배지 : PDA, 배양기간 : 16 일, 단위 : mm) 균주구분 10 15 20 25 30 35 ASI6005 ASI6033 균사생장 5.0 10.3 19.3 34.0 45.7 6.3 균사색택 W W W W W W 균사생장 5. 12.3 19.0 81.0 49.3 50.7 균사색택 W W W W W W - 49 -
균총형태특성및최적 ph(pda, 25, 15일배양 ) 나. 원목배양및자실체형성특성 참나무톱밥배지의배양완성소요일수 (2.4kg, 20 ) a) + : poor, ++ : ordinary, +++ : good, ++++ : very good b) - : 오염없음, + : 5% 미만, ++ : 10% 미만, +++ : 15% 미만, ++++ : 20% 미만 자실체발생및생육특성 a) 원목배지이식후첫자실체발생소요기간 b) 원목매몰후배양원목의 50% 에서자실체가발생하는소요기간 자실체병해저항성 푸른곰팡이병, 세균성병저항성 ( 자연발생정도 ): 0( 무발생 ), 1( 병반면적율 1% 미만 ), 3(1-10%), 5(11-30%), 7(30-50%), 9(50% 이상 ) - 50 -
자실체의형태적특성 자실체의색도조사 자실체의경도 자실체의개체특성 - 51 -
그림. 자실체의개체특성 8. 육성경과 - 52 -
육성계보 : 2007 년부터수행한목이버섯류의인공재배법개발연구수행중에서 경북지역채집균주와분양받은균주중에서균사생장과자실체발생이양호한목 이버섯균주를계통선발하여육성. 9. 종자확보량 가. 균주증식용시험관 10 개를 5 에서보관중이며, 수시로대량증식가능. 10. 대체품종 : 없음. 11. 기타참고사항 가. 품종명칭추천안및명명사유 - 53 -
목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의식품ㆍ약리활성분 석과식품소재화 제 1 장 연구개발과제의개요 1) 연구개발의목적 - 목이버섯은각종요리에감초처럼사용되는식품버섯으로연구시작전에는대부분수입에의존하였으나최근에는국내에서많이재배되는종이되었다. 목이버섯은식품버섯으로분말가루가유일하게변비증상의개선효과라는고시형기능성식품소재로식약청에등록되어있는버섯이다. 안전성이확보된버섯에대한식품및약리활성분석을실시하여목이버섯의활용가치를높이고국내버섯농가에게그결과를제공하는것이목적이다. - 식품버섯으로변비을위한된장및분말된장 2) 필요성및범위 ( 제1세부과제 ): 목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의품종육성ᆞ대량재배시스템확립 새로운식용버섯의대량생산재배기술보급으로농가의소득증대 목이버섯의분류학적위치구명 수집목이버섯자실체특성조사를통한계통화및육성모본화 목표품종특성에적합한모본선발및육성을통한구별성확보. 대량생산을위한최적배지개발 최적재배용기의개발 적정발이환경구명 ( 제2세부과제 ): 목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의식품ᆞ약리활성분석및식품소재화 목이버섯추출법에따른다기능성약리활성에대한 DB화구축 ( 목이버섯처리별및추출법에따른식품ᆞ약리활성 ( 영양성분, 항암, 항균및항산화 ) 탐색 ) 목이버섯추출별에대한제제화에따른약리활성의검증 ( 목이버섯추출별에따른실험동물에서식품ᆞ약리활성및독성시험 ) 목이버섯의다용도제형개발 ( 목이버섯의추출액의발효물에대한식품소재화 ) 목이버섯의저장안정성및제형별용해속도조절예측 산업화를위한목이버섯추출액의대량추출 / 분리 / 정제공정확립, 목이버섯및 - 54 -
추출액의농약잔류분석법및멜라민분석에의한품질관리설정 ( 목이버섯의농약잔류분석, 멜라민분석을실시하고자하였으나국내에서재배되는목이버섯의경우는멜라민오염의근원이없는관계로농약의잔류분석만실시하였다. 목이버섯을이용한다기능성 food의개발 목이버섯의상품에대한산업화시스템의확립 ( 목이버섯, 목이버섯추출액및발효액의시제품 ) 제 2 장국내외기술개발현황 연구수행기관연구개발의내용연구개발성과의활용현황 경북농업기술원 목이버섯톱밥봉지인공재배기술개발 (2008.11.) 영농활용, 보도자료등활용 농촌진흥청목이 1 호품종육성 (1987 년 ) - Chang, S. T. 중국에서의목이버섯원목재배연구 (1982 년 ) - Vilela, L. C. 필리핀에서목이버섯톱밥재배 - - 55 -
제 3 장 연구개발수행내용및결과 제 1 절목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의식품 ᆞ 약 리활성분석과식품소재화 목이버섯의약리활성을구명하고식품소재화의가능성을확인하기위하여항암활성과항염증효과에대하여실시하였다. 그외시험은계획에따라추가적인보완의방법으로실시를하였다. 목이버섯은일반적으로가장많이요리에사용되는버섯이지만약리활성이강한약용버섯이라고할수있다. 목이버섯은흐르레기라고도하는데자연상태에서는여름에서가을까지활엽수의죽은나무에 3~12cm의자실체로서로달라붙어불규칙한덩어리로자란다. 수분이있으면묵처럼흐물흐물해진다. 특히건조시키면연골질로되고물을먹으면다시원형으로된다. 형태는귀모양을이루고있다. 중국요리에널리쓰이고있으며최근에는한국전통음식에도많이사용되고있다. 또한목이버섯의분말은변비예방및치료를위한기능성식품으로등록이되어있다. 이러한점에착안하여본연구에서는목이버섯을이용한식품소재의개발과약리활성에대하여집중적으로연구하였다. 본연구에서는목이버섯의약리활성과식품소재화를중점으로연구되었다. 약리활성은목이버섯추출액, 목이버섯의추출액중여러가지분획추출액그리고식품소재화대한연구를실시하였다. 또한추가적으로식품의소재화를위해서시험계획서상에없는추가적인연구도보완하여탄력적인연구로수행을실시하였다. 특히연차별평가에따라중요도를조정하여실험을실시하였다. 본연구는연차별그리고연구의흐름에따라다음과같이진행을하였다. 1) 목이버섯의 70% 에탄올추출액을 1차원료로하여함암스크린닝균주인 P388D1과 sarcoma 180 cells로항암활성을실시하였다. Baisiomycetes는항암활성, 면역활성, 항심혈관질환, 항바이러스, 항균작용그리고항기생충작용등다양한약리작용알려져있다. 이중항암활성은버섯류에서가장많이알려진약리작용이다 (Wasser and Weis, 1999). 따라서본연구에서도 carbohydrates, protein 그리고 minerals (Ca, P and Fe) 등이풍부한목이버섯에대하여항암활성을주요목표약리작용으로삼았다. 목이버섯역시 polysaccharide가많은것으로알려졌다. 이다당류는 rhamnose, xylose 그리고 glucose와더적은양의 mannose, galactose 그리고 arabinose가있으며그외 uronic acids, sulfate groups, N 그리고 ash (Chen et al., 2008) 및활성성분인 beta (1-3) 그리고 (1-6) D glucans이많이포함되어있는것으로알려져있다. 목이버섯의약리작용으로는 antitumor activity, anticoagulant, anti-lipidemic, anti-cholesterol, 그리고 - 56 -
antiplatelet aggregation (Chen et al., 2008; Misaki et al., 1981; Yoon et al., 2003) 가보고되어있다. 그러나분획별추출용매에따른약리활성은많이알려져 있지않다. 2) Dichloromethane 분획층의항염증활성에대하여 RAW264.7 cells에서측정을하였다. 목이버섯은식용버섯으로약리활성이많이알려져있다. 식용버섯이므로안전성이높을것으로예상이되고새로운치료약물로써가능성이매우높을것으로예측하고있다 (Misaki et al., 1981). 식용버섯이항암활성이있다는것은여러보고에서알려져있다. 식용버섯의열수추출물이 Sarcoma 180을 Swiss albino mice에이식한후에항암활성을보고하였다 (Ikekawa., 1969; Misaki et al., 1981). 그외 hypoglycemic 효과, anti-diabetic 효과 (Yuan, 1998). 또한 anticoagulant와 platelet aggregation이조사되었다 (Yoona et al., 2003; Francia., 1999). 그러나, 우리가알기로는항염증에대한목이버섯추출액의보고는이보고서가처음이다. 염증반응은모든질병의시초가되는기전이다. 건강을유지하기위해서는항염증을제거하여여한다. 항염증을보기위해서는 pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukins (ILs), cyclooxygenase (COX), 그리고 inducible nitric oxide synthase (inos) 을주로표식자로관찰을한다 (Bonizzi and Karin, 2004; Verma et al., 2010; Duffield, 2003). 이러한 pro-inflammatory mediators에대한 gene은항염증시작과유지에중요하게나타난다. 항염증에중요한 nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) 은 COXdfp 주로작용하고최근에는 COX-2 inhibitors를사용하여부작용을줄인다 (Chowdhury et al., 2009). 본연구에서는 dichloromethane 추출액에대하여 RAW 264.7 cells를이용해서 NO, cytokine IL-6, TNF-α 그리고 IL-1β pro-inflammatory markers에대한변화를측정하였다. 3) 목이버섯추출액과약용식물그리고약용버섯의추출액과항암활성을비교하였다. 항암제의발견에서약용식물은안전성의차원에서매력적인자원이다. 이들자원에서얻어진항암성분으로는 vinblastine, vincristine, camptothecin derivatives, topotecan, irinotecan, etoposide 그리고 paclitaxel이임상에이용이되고있다. 한편, 약용버섯역시오랫동안식용으로이용하여왔다. 최근에많은연구가들은약용버섯의생리활성에지대한관심을갖고오고있다. Basidiomycetes는항암활성이많이알려져있다. Basidiomycetes에는 Agaricus, Pleurotus, Lentinus, Ganoderma, Grifola, Volvariella, Auricularia 그리고 Tremella 속이산업체에관심을받고있다. 본보고서에는 100 wild plants, Auricularia auricula-judae, Phellinus gilvus 그리고 Ganoderma lucidum extracts에대하여 P388D1 세포주를이용하여비교실험을실시하였다. - 57 -
4) 사람유래의세포주를이용하여 dichloromethane 분획층의항암활성에대하여실시하였고 GC-MS 분석을통하여항암활성에대하여연구하였다. Bronchoalveolar tumor는악성종양이다. 이암은폐암에서 80% 에해당되고예후가불량하다 (Giaccone, 2002; Langer, 2004). 그리고위암은 4번째로흔한암으로초기에발견되지못하고 3기혹은 4기에발견이되면예후가좋지못하다 (Parkin et al., 2005). 특히위암은한국에서가장흔하다 (Kim et al., 2010; Yamamoto, 2001). 특히폐와위의초기진단은매우어렵고생존율이 1년이상이되지를못한다 (Janku et al., 2010). 따라서더효과적이고안전한치료법이요구된다. 식물과약용버섯추출액은초기에암예방에효과적이라고보고되고있다 (Lee et al., 2009 Wasser, 2002). 본연구에서는여러유기용매분획물에대하여항암활성을측정하였다. 이연구에서우리는 ethyl acetate, butanol, dichloromethane, ethanol 그리고 water fractions을 70% ethanol extracts에서얻어 NCI H358M, SNU1 cell에대하여항암활성즉 tumor progression genes (Bcl-2 그리고 CD147), tumor suppressor genes (Bax 그리고 P53) 을 RT-PCR 분석을실시하였다. 그리고가장강력한 dichloromethane 층에대하여 GC-MS analysis을실시하였다. 5) 식품소재화을위하여위탁연구를통하여참여기업체와함께목이버섯의된장제조법, 목이버섯분말된장제조법, 목이버섯된장의약리활성에대하여연구를하였으며상품화연구를위하여각종인증실험을함께실시를하였다. 목이버섯은약용버섯이아니므로식품소재화및소비활성화를위하여다양한상품화연구가필요하다. 된장은우리의일상식탁에서빼놓을수없는중요한식품이며, 한국인이가장선호하는정통발효식품이다. 역사적으로오래전부터우리식생활에이용되어온한국의재래식된장은대두의발효로부터생성되는독특한맛과냄새를가지고있으며, 숙성중에원료에함유된아미노산화합물과당에의해생성된갈변물질은강한항산화력을가진다. 또한, 타조미식품과는달리단백질뿐만아니라아미노산, 유기산, 미네랄및비타민류를풍부히함유하여조미목적이외에도된장그자체로서훌륭한영양원이되고있다. 된장은콩을이용한발효식품이므로콩이가지고있는생리활성이된장에도존재하고있으므로최근된장의기능성에관한연구기증가되고있다. 된장은원료인콩이가지는영양성분이외에도인체의건강증진을위한생리활성물질이라고알려진식이섬유, 인지질, 아이소플라본 (isoflavones: genistein, daidzein, etc.), 페놀화합물 (phenolic acids), trypsin inhibitor, maillard 반응산물, globulin, peptide 등의성분이들어있어혈관계질환 ( 동맥경화 ), 신장질환, 심장병, 당뇨병예방효과, 노인성치매예방효과, 항암효과 ( 유방암, 대장암, 폐암등 ), 골다공증억제등의성인병예방효과가있음이발표되었다. 이외에도된장이미생물에의한발효과정중기능성펩타이드등의생리활성물질을생성하여혈압상승 - 58 -
억제효과및지질대사개선효과, 항돌연변이성및항암성, 항균작용등을나타내는것으로알려져있다. 특히, 된장의항암효과는된장을끓일경우에도효과가살아있는것으로나타났고, 실험예로발암물질을투여하여쥐를암에걸리도록한후, 전통조리법인된장찌개에서된장을먹인결과, 된장을먹이지않은쥐보다암조직의무게가 80% 이상감소하였다는결과가보고되고있다. 최근된장의효능이입증되고있음에도불구하고, 여성의경제활동참여증가와핵가족화와같은빠른도시화의진행, 식품의편의성증대등에따라가정에서전통식된장을담그는비율은감소되고있으며, 된장의섭취또한감소하고있는추세로, 최근에는공장에서제조되는개량식된장의생산량이증대되고있다. 따라서, 전통된장을현대인의기호에맞게변형시키고, 여러가지기능성소재를첨가하여그기능성을향상시키는연구와개발이요구되고있다. 버섯은고급식품이며건강식품으로경제성장과소득수준의향상에따라그수요가증가하고있다. 그중목이버섯은세계적으로널리분포되어있고, 특히한국, 중국, 일본등지에서는다량의야생버섯이발견되고있다. 목이의종류는크게나누어서목이목 (Auriculariales) 목이과 (Auriculariaceae) 목이속 (Auricularia) 에속하는목이 (Auricularia auricula) 와털목이 (Auricularia polytricha) 가있고, 흰목이목 (Tremellales) 흰목이과 (Tremellaceae) 흰목이속 (Tremella) 에속하는흰목이 (Tremella fuciformis) 가있다. 이들은각종활엽수의고사목이나반고사목에서생장하고있으며, 버섯의모양이사람의귀와같아서중국에서는목이 ( 木耳 ), 우리나라에서도목이또는흐르레기, 일본에서는해파리또는기쿠라케 ( キクラケ ) 라고하며, 서구에서는 ear mushroom이라고도한다. 이중에서목이는보통흑목이라고하며, 중국에서는검정귀버섯으로불리는데, 이것이대량으로재배되고있다. 이버섯은다른버섯보다맛과씹는촉감이좋아서널리애용되고있다. 목이버섯의주요기능으로는영양분공급에의한자양기능, 사람으로하여금식욕을자극하는기능, 그리고인체의건강상태를조절하는조절기능을가진다. 목이버섯은버섯중에서도항종양억제율이매우높은것으로알려져있으며, 오장을좋아지게하고, 이질과하혈을멎게해준다. 또한목이버섯은혈액을정화시켜피부미용과빈혈, 고혈압, 동맥경화와같은성인병등에도움을주며, 천연젤라틴을다량함유하고있어, 배설을촉진시켜변비에도좋은효과를가진다. 본연구에서는된장의기능성및부가가치를향상시키고, 기능성과맛을증진시킨된장개발을위하여목이버섯분말을첨가하여발효숙성시킨된장을제조하여된장의성분변화정도와관능적특성을조사하였다. 본연구에서는된장의기능성및부가가치를향상시키고, 기능성과맛을증진시 킨된장개발을위하여목이버섯분말을첨가하여발효숙성시킨된장을제조하여 - 59 -
제조및대량판매를목적으로하는 100% 국산원료만을사용하여된장의성분 변화정도와관능적특성, 이화학적특성, 항암테스트등을중점연구하였다. 제 2 절재료및방법 1. P388D1 과 sarcoma 180 세포주에서목이버섯에탄올추출액으로부터추출용 매에따른항암할성의비교시험 가. 사용시약 (Chemicals/reagents). RPMI 1640 medium, fetal bovine serum (FBS), L-glutamine (2 mm), penicillin (100 i.u/ml) and streptomycin (10 mg/ml), dimethyl sulfoxide (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), trypan blue (TB), sulphorhodamine B (SRB), 50% trichloroacetic acid (TCA), 1% acetic acid, 10 mm unbuffered tris Base (PH 10.5) 그리고 doxorubicin은 Sigma-Aldrich Chemical Co. (St Louis, MO, U.S.A.) 에서구입하였다. 그외시험에사용한시약은 analytical grade로사용하였다. 나. 목이버섯의준비본실험에사용한목이버섯은경상북도농업기술원에서공급받아사용하였다. 목이버섯의항암활성, 항산화활성, 항염증활성등을비교하고자버섯을건조하여분쇄한후 70% Ethanol과 1:50의비율로혼합하여 85 에서 5시간추출한후감압농축하였다. 이후 chloroform, ethyl acetate, butanol을통하여분획추출후 5 μm filterpaper 을통하여여과한후감압농축하여샘플로사용하였다. 목이버섯의일관성을확보하기위하여목이버섯을분쇄기로분말화하여각각의목이버섯분말로부터 3 군데에서 1 g를각각취해경북대학교공동실습관으로부터 Elemental Analyzer(FISONS, EA 1110) 를지원받아 carbon(c), oxygen(o), hydrogen(h), 그리고 nitrogen(n) 을정량분석하여비교하였다. 중금속은 elementary analyzer와 ICP로분석하였다. 무기성분의비교 분석을위하여건식법으로전처리과정은목이버섯을건조분말로만든다음각각의시료 0.2~0.3 g를 Teflon vessel 용기에취하여 HNO3( 고순도, Merck사 GR Grade) 5 ml을가한후마개를연상태로 100~150 에서가열하였다. 이과정을통해산을완전히날려보낸다음여기에다시 HNO3 3 ml과 HCl 0.5 ml을취하여마개를닫고가압상태로 100 부근에서하루정도가열하였다. 용기를완전히식힌다음마개를열고시료가완전히산에녹은것을확인한다음마개를연상태에서산이 1 ml정도남을때까지다시가열하였다. 증류수로희석 ( 100) 하여 ICP 분석기 (Jobin-Yvon, JY 38 Plus, France) 를이용해 ICP-AES으로분석하였다. - 60 -
Table 1-1. General elementary analysis of Auricularia auricula-judae Nitrogen Carbon Hydrogen Sulphur 2.27% 40.19% 6.02% 0% Table 1-2. Heavy metal analysis of Auricularia auricula-judae Cd Pb Zn Fe Ca K 0 ppm 0 ppm 942.63 ppm 177.56 ppm 15905.73 ppm 6204.66 ppm 다. Auricularia auricula-judae 추출액의준비. 건조된 Auricularia auricula-judae를 70% ethanol(etoh) 로 100ºC에서 6시간동안추출하였다. 상층액은여과지 (70 mm, Advantec, Toyo Roshi Kaisha Ltd, Japan) 를이용하여여과하고진공농축기 (Buchi Water Bath B-480) 로 70ºC에서감압농축하였다. 감압농축한에탄올농축액은 Fig 1에도시한방법에따라 Soxhlet extractor를이용하여연속적으로분획를실시하였다 (Figure 1-1). 이때이용한분획용매는 dichloromethane(dcm), ethyl acetate(etoac), butanol(buoh), 그리고 water(dw) 를이용하여분획실시하여농축및건조를하였다. Figure 1-1. Schematic diagram of fractionations of Auricularia auricula-judae ethanol extracts. EtOH, DCM, EtOAc and BuOH are stand for ethanol, dichloromethane, ethyl acetate and butanol, respectively. - 61 -
다. 세포배양. 본실험에서사용된 sarcoma 180과 P388D1의두개의확립된마우스유래종양세포주로한국세포주은행 (KOREAN CELL LINE BANK) 에서분양받았다. 종양세포주의배양및유지를위한배지는 RPMI 1640을이용하였으며 fetal bovine serum(fbs) 10% 를첨가하고, penicillin과 streptomycin이각각 10,000 units/ ml와 10 mg / ml섞인배양액으로 tissue culture flask 25cm 2 를사용하여 37, 5% CO 2 세포배양기에서배양하였다. 라. Determination of cell viability by MTT and SRB assay. 두마우스유래종양세포에대하여목이버섯의여러용매추출액을 1, 0.3, 0.1, 0.03 and 0.01 mg/ml의농도로만든후에양성대조군 DOX의세포성장정도를 sulforhodamine(srb) B(Kim 등, 1996) 와 microtetrazolium(mtt) assay(mosmann 등, 1983) 을약간변형하여다음과같이시행하였다. 우선 SRB 법은두종양세포수가각 well당 1만개가되도록 96-well plate에접종한후 24 시간동안배양하고각시험물질을접종하여 48시간동안추가배양하였다. 각종양세포에 50% trichloroacetic acid(tca) 를추가하여 4 및 2시간동안고정을실시하였고, 증류수에 5회수세하여고정액을제거하였다. 종양세포에 0.4% sulforhodamine B(SIGMA) 를이용하여 30분동안실온에염색을실시한후 Tris base(10 mm, ph 10.5) 를추가하여생존한종양세포에만염색된염색액을녹여내었다. MTT법은 well당세포수 5천개가되도록접종하고 SRB법과는달리배양전에미리각시험물질을접종하였다. 접종후 4일동안배양을실시하였다. 배양이종료된후 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(mtt, SIGMA, USA) 용액을 well 당 50 μl씩가하여 4시간동안더배양하였고, 배양이끝난후각 well에서주의깊게배지를제거하였다. 다음은 DMSO(dimethylsulphoxide) 을 well 당 150 μl를가하여 formazan crystal을녹여내었다. SRB 및 MTT법에서염색된 cell plate 들은 microplate reader(versamaxtm, Molecular Devices, USA) 를이용하여 490 nm에서그흡광도를측정하였다. 종양세포들에대한시험물질의효과를평가하기위하여세포수의측정은시험물질을처치한 well의흡광도를시험물질을처치하지않은음성대조군 well의흡광도로나누어 % 로나타내었다. 통계분석은 SAS statistical package(release 8.1 SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA) 를이용 - 62 -
하여 ANOVA 를실시하고그유의수준은 P 0.05 로하였다. The inhibition of tumor cell proliferation was calculated using the following Formula: Inhibition rate (%) = {1- (OD value of sample/od value of control)} Ⅹ 100 IC 50 concentrations required to inhibit growth by 50% were calculated from survival curves using the Bliss method. 마. In vivo tumor model and treatment. 7주령웅성 BALB/c mice((charles River Technology)) 를 ( 주 ) 오리엔트로부터구입하였다. 몸무게는 22-24 g이었고실험동물실내부는 20-25ºC로 12시간명암이유지되는동시에상대습도는 55±10% 로유지되었다. Sarcoma 180 세포주 ( 한국세포주은행 ) 를 RPMI 배지에서배양한후이식한암동물모델이이용되었다. 모든동물실험의절차는경북대학교실험동물윤리위원회의승인을받았다. 1 주간동물사육실에서적응시킨후실험에사용하였다. Sarcoma 180 cells (2x106 cells/0.2 ml/mouse) 는 saline (0.85% NaCl) 에희석하여피하주사를실시하였다. 접종 6일째에눈에보이는암덩어리를관찰할수가있었다. 실험동물은 3그룹으로구분하고각그룹당 6마리로구성되었다. 1 그룹은정상대조군으로암세포의접종이없었으며 2 그룹은음성대조군으로 0.85% saline을경구투여하였다. 3그룹은 dichloromethane fraction (DCM) (100 mg/kg b.w., p.o.) 으로시험물질투여후 7일뒤에암의크기및존재유무를확인하였다. Doxorubicin (3 mg/kg b.w., i.p.) 은양성대조군으로복강내접종을실시하였다. 투여 7일후에모든 mice는살처분하였으며 tumor mass를측정하고암성장의억제와암덩어리의크기를 per cent (%) 로계산하였다. 암덩어리의부피는다음과같은식으로계산하였다 (Lee et al., 2003). Inhibition of tumor growth (%) = (1-T/C) x 100 %, where T is the tumor growth of treated groups and C is the control mice (1). Tumor Volume (cm3) = 4/3π(a2b)/2, where a is the short diameter (mm2) and b is the long diameter (mm2) (2) 바. Calculation of splenic index. 비장은정상투여군과암을갖고있는 mice를희생하여즉시무게를측정하였다. 결과는몸무게당비장의무게로 spleen index (mg/g body weight) 로표시한다 (Lee et al., 2003). - 63 -
사. Statistical analysis. 모든수치는 mean ± S.D. 로표시하고통계분석은 the one way analysis of variance (ANOVA) 로실시하였고 SAS program를사용하였다. GraphPad Prism program은 IC50 values를얻기위해사용되었다. 통계학적차이는 P 0.05수준에서유의성유무를판단하였다. 2. RAW264.7 세포에서목이버섯의디클로르메탄추출액의항염증작용 가. 세포배양마우스대식세포인 Murine macrophage RAW 264.7 cell은한국세포주은행 (KCLB 40071, Korean Cell Line Bank, Seoul, South Korea) 에서분양을받아사용하였다. 배지는 Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) 으로 10% FBS, 1% L-glutamine, 그리고 100 IU/ml penicillin-100 μg/ml streptomycin 이포함되어있으며 5% CO2 humidified air가공급되는 37 C 배양기에서실시하였다. 나. Nitric oxide (NO assay) 의측정 RAW 264.7 cells (2 10 5 cells/ml) 는 LPS (1 μg/ml) 로처리한군과처리하지않은군으로설정하고목이버섯의 DCM 추출액을 (10, 30 and 100 μ g/ml) 을 24시간동안반응을시켰다. NO을측정하기위하여 100 μl를 96 well flat bottom plate에분주를하였다. 그리고 100 μl의 Griess reagent를각 well 에넣고실온에서빛을차단한채반응을시킨다. 그리고 Optical density (OD) 값을 540 nm에서 VERSA max microplate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA. USA) 를이용하여측정하였다. NO의양을각시료에서측정하였다. 정확한수치는정량표준곡선을 sodium nitrite로 0에서 100 μm까지를 cell culture 배지로만들어서작성하였다. 자세한방법은다음과같이실시를하였다. - 64 -
1) Preparation of regents 1 Griess Regent A : Sulfanilamide solution : 5% 의 H3PO4 를이용하여 1% Sulfanilamide solution을준비한다. 2 Griess Regent B : NED(N-1-Naphthylethylenediamine) solution : DDW를이용하여 0.1% NED solution을준비한다. 2) Cell culture Raw 264.7 cell을 3 cm Diskplate에 DMEM 배지를 3ml 넣고 18 시간배양한다. 3) Sample 및 LPS 처리배양된 Raw 264.7 cell에 Sample과 0.1 mg/ml의 LPS를 30 ul를처리하여 12 시간추가배양한다. 4) 상층액분리 NO 측정을위해상층액 1ml을 1.5ml E-tube에옮겨담는다. 5) 세포부유 MTT 측정을위해 Diskplate 바닥에붙어있는 Cell을남아있는상층액을이용하여피펫팅하여부유시킨다. 6) NO 측정 1 96 well plate를준비하여측정할구획을설정한다. - A 구획은 Standard curve를그리기위하여 NO를단계별로희석한다. - B 구획은 NO 원액을단계별 (2배) 희석을하기위하여 DDW를 100 ul씩분주한다. - C 구획은 NO 원액을 200 ul분주하여이중 100 ul를취하여 b 열의 DDW 100ul와혼합하여 1/2 희석한다. 이와같은작업을 g 열까지반복하여단계별 2배희석한다. - 65 -
- 마지막 h 열은 NO가혼합되지않은 DDW의상태로남겨두며 g 열에서혼합후 200 ul 중 100 ul는제거한다. 2 LPS을처리한 cell과비처리 cell을구분하여분주한다. : 보통각 sample에대하여 3회반복분주를하며최소 2회반복분주를하도록한다. 3 Multi pipet을이용하여시료가있는모든 well에 regent A solution을 50 ul 씩분주한다. 4 Multi pipet을이용하여시료가있는모든 well에 regent B solution을 50 ul 씩분주하며, cap을덮고빛이닿지않도록차단하여 10분간방치한다. 5 540 nm에서흡광도를측정한다. 다. Enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA) 를이용한사이토카인의측정 RAW 264.7 cells (2 10 5 cells/ml) 는 LPS (1 μg/ml) 로처리한군과처리하지않은군으로설정하고목이버섯의 DCM 추출액을 (10, 30 and 100 μg/ml) 을 24시간동안반응을시켰다. 반응후에세포배양액을모은후사이토카인을측정하였다. 세포배양액에서 IL-1β의농도는제조사의지세에따라서 ELISA commercial kits (Invitrogen, Camerillo, CA. USA) 로실시된다. 라. RT-PCR에의한 mrna의사이토카인의측정 (RT-PCR) mrna 발현을 RAW 264.7 cells에서측정하기위하여 LPS (1 μg/ml) 을목이버섯의 dichloromethane 추출액이전처리되어있는것과전처리되지않은세포주에서검사하였다. dcm 추출액의농도는 10, 30 그리고 100 μg/ml이었다. 총 RNA는 Trizol reagent (Invirogen, CA,USA) 를이용하여실시를하였다. 분리된총 RNA는 oligo (dt)15primer와배양을하였고그런다음 thermal cycler (Mycycler, BIO-RAD) 를실시하였다. PCR amplification은 PCR primers를이용하여실시를하였고 primer는 Sense(S) CAGGATGAGGACATGAG-CACC, Antisense (AS) CTCTGCAGACTCAAA-CTCCAC for IL-1β, (S) GTACTCCA-GAAGACCAGAGG, (AS) TGCTGGTGACAAC-CACGGCC for IL-6, (S) TTAACCTA-CGCGCTGAGTTG,(AS) - 66 -
CCTGTAGCCCACGR-CGRAGC for TNF-α, and (S) ATGC- TCCTGCTTGAGTATGT, (AS) GGAGGAAGAG-GATGCGGCAGT for β -actin (as a housekeeping gene) 를포함하고있다. PCR reaction은 IL-1β, IL-6, TNF-α 그리고 β-actin이검출하고자하였다. 반응조건은 denaturation at 95 Ι for 1 min에 30회, annealing at 55 for 45 sec 그리고 extension at 72 for 5 sec로 thermal cycler (Mycycler, BIO-RAD, USA) 와 AccuPower PCR Premix (BioNEER, Dageon, Korea) 를사용하였다. 방법은 manufacture's instruction에준하였다. RT-PCR 반응물은 1% TAE agarose gel로분리하여 ethidium bromide로염색을실시하였다. EAGLE-EYE TM (Stratagene, La. Jolla, CA, USA) 으로확인하였다. 마. 통계학적인분석 Statistical analysis 모든수치는 means ± SEM로나타내었고 One-way analysis of variance (ANOVA) 로통계분석을실시하였으며 Student's t-test (version 9.1, SAS, NC, USA) 로분석을하였다. 통계학적인유의성에대한차이점은 p < 0.05 level에서실시를하였다. 3. 목이버섯추출액, 약용버섯그리고약용식물과항암비교시험 가. 목이버섯과약용식물추출액의준비실험전에마른목이버섯, 마른진흙버섯, 영지버섯 (A. auricula-judae, P. gilvus, G. lucidum) 을입자크기 0.2-0.5 mm로분말화하였다. 분말화된 5 g의시료를 70% ethanol solvent (solid to liquid ratio of 1/50 w/v) 로관류시키면서 10 0 에서 6 시간동안열수추출하였다. 열수추출하는동안, 상층액은필터 (70 mm, Advantec, Toyo Roshi Kaisha Ltd, Japan) 를이용하여여과하였다. 여과약은 boiling bottle로이동하여 water bath (Buchi Water Bath B-480) 에서 70% ethanol 추출액으로 70 에서진공농축을실시하였다. 이때농축기기는 Buchi Rotavapor R-114로 100 rpm그리고 Eyela CCA-1111 (Tokyo Rikakikai Co. Ltd, made in China) 로실시하였다. 농축액을분말화하기위하여 vacuum concentrator (BioTron, BioTron Inc., Korea) 로약 50 에서건조화시켰다. 실험시에분말화는멸균생리식염수에녹여서 0.2 um filter로실시를하였다. 필터액들은분주하여 stock solution으로사용하였다. 항암활성을목이버섯추출액과야생식물추출액을비교하였다. 100 종류의야생식물추출액은 methanol 추출액으로 Plant Resource Center, Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology (KRIBB), Korea. 에서분양을받아서사용하였다. - 67 -
나. Cell Culture 시험에사용된세포주는 P388D1 macrophage cell, Sarcoma 180 cell, Human NSCLC NCI H358 cell (Bronchioalveolar) 그리고 SNU1 cell (Gastric carcinoma) lines이었다. 이세포주는 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea) 에서구입하였다. 세포주는 RPMI-1640 medium으로배양하였고배지에는 10% FBS, L-glutamine (2 mm), penicillin (100 i.u./ml) 그리고 streptomycin (10 mg/ml) 이포함된다. 배양된세포들은 37 에서배양하고배양기는 humidified atmosphere로 5% CO 2 가공급되었다 다. Determination of cell viability by MTT assay MTT가 formozan으로미토콘드리아의환원은신속한 colorimetric assay로실시를아래와같이실시를하였다. 이는세포의호흡과세포의생존율을알수있는방법이다. 실험의방법은 P388D1 cells(1 105 cells/well) 를 flat-bottomed 96-well plates에서배양을하고각각의추출액을 1 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.03 mg/ml 그리고 0.01 mg/ml에서실시한다. A. auricula-judae와 100 plant 추출액은 72 시간동안 5% CO2 배양기 37 에서배양하였다. 양성대조군약물로 doxorubicin을 10 μg/ml, 1 μg/ml 그리고 0.1 μg/ml의농도에서항암활성을실시하였다. MTT법은 well당세포수 5천개가되도록접종하고 SRB법과는달리배양전에미리각시험물질을접종하였다. 접종후 4일동안배양을실시하였다. 배양이종료된후 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide(mtt, SIGMA, USA) 용액을 well 당 50 μl씩가하여 4시간동안더배양하였고, 배양이끝난후각 well에서주의깊게배지를제거하였다. 다음은 DMSO(dimethylsulphoxide) 을 well 당 150 μl를가하여 formazan crystal을녹여내었다. SRB 및 MTT법에서염색된 cell plate 들은 microplate reader(versamaxtm, Molecular Devices, USA) 를이용하여 490 nm에서그흡광도를측정하였다. 종양세포들에대한시험물질의효과를평가하기위하여세포수의측정은시험물질을처치한 well의흡광도를시험물질을처치하지않은음성대조군 well의흡광도로나누어 % 로나타내었다. 통계분석은 SAS statistical package(release 8.1 SAS Institute Inc., Cary, North Carolina, USA) 를이용하여 ANOVA를실시하고그유의수준은 P 0.05로하였다. Viability of cells (%) = (OD value of sample/od value of control) 100 (I) Inhibition rate (%) = {1- (OD value of sample/od value of control)} 100 (II) - 68 -
라. 통계학적인분석모든수치는 mean±s.d. 로나타내였고통계학적인분석은 one way analysis of variance (ANOVA) 를실시하였다. 비선형분석 (nonlinear regression analysis) 은 GraphPad Prism 5 program (GraphPad Software, Inc., U.S.A) 으로 IC50 값을얻었다. 통계학적인유의성에대한차이점은 p < 0.05 level에서실시를하였다. 4. Auricularia auricula-judae 70% ethanol extracts 로부터분리된 dichloromethane fraction 의항암활성및항산화작용 가. Carbohydrate 측정. 목이버섯의 70% ethanolic extract 의당측정을 Brix 로 측정하였다. Brix 측정은 Pocket refractometer PAL-1 (ATAGO, Japan) 로실 시를하였다. 나. 단백질의측정. 단백질은 Pierce BCA Protein Assay Kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) 오측정을하였다. 다. 세포배양. 세포주는사람유래의 NSCLC NCI H358 (bronchioalveolar) cells 과 SNU1 cells (Gastric carcinoma) 를 Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea) 에서분양을받았다. 이들세포주는 RPMI-1640 배지를사용하였다. 사용된배지는 10% FBS, L-glutamine (2 mm), penicillin (100 i.u. /ml) 그리고 streptomycin (10 mg/ml) 이포함되었다. 배양조건은 37 C의 5% CO2 배양기에서진행하였다. 라. MTT assay 항암활성. 세포의생존은 Mosmann (1983) 의방법으로실시를하였다. NCI H358과 SNU1 cells (1 10 5 cells/well) 는 96-well plate를이용하였고 1, 0.3, 0.1, 0.03 그리고 0.01 mg/ml의여러유기용매분획물을갖고실시를하였다. 한편분리된성분인 gibberellic acid (G) 와 diazane (D) 도 doxorubicin (1, 0.1 and 0.01 g/ml) 과함께비교하여항암활성을측정하였다. MTT의방법은상기에기술한방법으로실시를하였다. 마. Gas Chromatography Coupled Mass Spectroscopy analysis. G목이버섯추출액에포함되어있는신규성분을확인하기위하여성분분석을하였다. 특히활성성분이많이포함되어있는디클로르메탄분획물에대하여집중적인분석을실시하였다 (Gas Chromatography Coupled Mass Spectroscopy (GCanalysis was performed by Kyungpook National University Center For Scientific Instruments. GC-MS was carried out using a HP (Hewlett-Packard) 6890-69 -
Plus GC gas chromatograph with (MSD) HP 5973 MSD mass selective detector). 시료는 HPLC-grade dichloromethane으로 1:1000(v/v) 으로희석하여측정하였다. 시료는 1ml를 HP-5 column으로주입하였다. GC oven program 은 50 C에서 4 분동안그리고 280 C까지 4 C/min로올렸다. 그리고마지막온도는 2분동안유지하였다. He(99.99%) 의속도는분당 0.7 ml로올렸다. 정량분석은피크면적으로실시를하였다. 바. RNA extraction과 mrna expressions of tumor genes by PCR. 총 RNA 을세포배양후에 Trizol Reagent (BioNEER, Korea) 를사용하여추출하였다. 분리된 RNA는 oligo (dt)15 primer와함께배양하였다. 그리고난후에 reverse transcription이 AccuPower RT- Premix (BioNEER, Korea) 에의해진행되었다. 기기는 thermal cycler (2720 Thermal Cycler, Applied Biosystems, U.S.A.) 를이용하였다. Apoptosis 분석을위하여 4 human apoptosis primers로는 Bax, Bcl-2, P53 그리고 CD147를 PCR amplification를실시하였다. β -actin은 housekeeping gene으로사용하였다. Primers는 Table 4-1에나타내었다. Table 4-1. PCR primers used in the gene expression studies. Gene Primers Accession No. β-actin (S) CTGTCTGGCGGCACCACCA, X00351.1 (AS) GCAACTAAGTCATAGTCCGC Bax (S) AAGCTGAGCGAGTGTCTCAAGCGC, L 22473 (AS) TCCCGCCACAAAGATGGTCACG Bcl-2 (S)AGATGTCCAGCCAGCTGCACCTGAC, M 13994 (AS)AGATAGGCACCCAGGGTGATGCAAGCT P53 (S) AAGACCTGCCCTGTG, NM_000546.4 (AS) TGACGCACACCTATTGCAAG CD147 (S) CCATGCTGGTCTGCAAGTCAG, AB085790 (AS) CCGTTCATGAGGGCCTTGTC Bax, Bcl-2, P53, CD147 그리고 β-actin에대한반응조건은다음과같다. An initial denaturations at 95 C for 5 min (Bcl-2, Bax and β-actin), 94 C for 5 min (P53) and 94 C for 1 min (CD147). The amplification conditions were: denaturation at 95 C for 30 s, annealing at 66 C for 30 s and enlongation at 72 C for 30 s with 40 cycles for Bcl-2, denaturation at 95 C for 30 s, annealing at 64 C for 45 s and elongation at 72 C for 30 s with 35 cycles for Bax, denaturation at 94-70 -
C for 30 s, annealing at 62 C for 45 s and elengation at 72 C for 30 s with 40 cycles for P53, denaturation at 97 C for 20 s, annealing at 64 C for 20 s and elongation at 72 C for 20 s with 30 cycles for CD147 and denaturation at 95 C for 45 s, annealing at 55 C for 45 s and elongation at 72 C for 45 s with 30 cyclesfor β-actin. Finally all additional extension steps at 72 C for 10 min were done for all. PCR amplifications은 thermal cycler (GeneAmp PCR system 9700, Applied Biosystems, U.S.A.) 와 AccuPower PCR Premix (BioNEER, Daegeon, Korea) 로제조사의지시에따라실행되었다. RT-PCR products는 2 % TAE agarose gel로분석되었다. 염색은 ethidium bromide로실시되고 EAGLE-EYE TM (Startagene, La. Jolla, CA, USA) 로분석하였다. 사. 항산화작용 (Antioxidant activity). DPPH (2,2-diphenylpicrylhydrazyl) free radicals는 Chang et al. (2011) 과 Hwang et al. (2001) 방법을변환하여실시하였다. 간략하게방법을기술하면시험시료 10 μl (DCM at 10, 3, 1, 0.3 and 0.1 mg/ml) 혹은 standard (ascorbic acid) 에 200 μl의 DPPH in methanol (100 μm) 을 96-well microplate (SPL, Suwon, Korea) 에첨가하였다. 처리된 plate는 37 C에 30 min동안반응후에 optical density (OD) 를 517 nm에서 VERSA max microplate reader (Molecular Devices Corp, Sunnyvale, CA, U.S.A.) 를이용하여측정하였다. Scavenging activity은다음과같은식으로계산하였다. Inhibition (I) % = (1-(Sd-Sm)/C)) X 100% where Sd is the OD of sample with DPPH, Sm is the OD of sample with methanol, and C is the OD of vehicle with DPPH. The IC 50 value 은 50% scavenging of DPPH free radicals 의농도이다. 이것은 Graphpad Prism program 으로계산하였다. 항산화능력은 antioxidant activity index (AAI) 로다음과같이계산하였다. AAI = final concentration of DPPH (mg/ml)/ic50 (mg/ml) Thus, the AAI of sample fraction is classified as poor antioxidant (> 0.5), moderate antioxidant (0.5-1.0), strong antioxidant (1.0-2.0) and very strong antioxidant (< 2.0) (Ruch et al., 1984). 아. Statistical analysis. 모든수치는 mean±s.d. 로나타내였고통계학적인분석 - 71 -
은 one way analysis of variance (ANOVA) 를실시하였다. 비선형분석 (nonlinear regression analysis) 은 GraphPad Prism 5 program (GraphPad Software, Inc., U.S.A) 으로 IC50 값을얻었다. 통계학적인유의성에대한차이점은 p < 0.05 level에서실시를하였다. Nonlinear regression analysis (GraphPad Prism 5 program, GraphPad Software, Inc., U.S.A) 으로 IC50 values를구하였다. 2-6. 목이버섯추출물에대한단회경구독성시험 목이버섯의추출액혹은분획층에대한생리활성이확인됨에따라서 Lead optimization toxicology의차원에서목이버섯의 1차추출액인에탄올추출액의단회경구독성시험을다음과같이실시를하였다. 실험동물은 5주령 Sprague-Dawley 계통의특정병원균부재 (specific pathogen free) 랫트 ( 오리엔트바이오, 대구 ) 로, 시험군은암컷과수컷각 5 마리씩대조군과투여군으로정하였다. 이동물들은인수시그리고적응기간동안일반증상의이상이관찰되지않았다. 사육조건은온도 22±2, 상대습도 55±10%, 조명시간 12 시간 ( 오전6시 오후 6시 ) 및조도 150 300 Lux로설정한뒤수행하고, 방사선조사로멸균된실험동물용고형사료 ( 효창싸이언스 ) 와정수시스템을이용한물 (Tap water) 을자유섭취하도록하였다 ( 식약청동물실험시설등록제228 호, 경북대학교약리 생리학동물사육실 ). 투여용량의설정은목이버섯에탄올추출액을멸균생리식염수에 0, 625, 1,250, 2,500, 5,000 mg/kg 투여량으로조정하였다. 대조군은생리식염수를투여하였으며, 랫트는시료투여 12시간전에절식시키고 3 ml/kg으로 1회경구투여한후 14일동안관찰하였다. 관찰및검사항목은식품의약품안전청의독성시험기준및 OECD test guideline 420(TG 420) 에따라실시하였다. 임상증상관찰은모든실험동물에투여당일날에투여후 6시간동안매시간마다관찰하였으며, 다음날부터 14일까지는 1일 1회씩동물의일반상태의변화, 중독증상의발현및사망유무를관찰하였다. 시험에사용된모든실험동물에대하여시험물질투여일, 투여후 3일, 7일, 14일째에체중을측정하였다. 시험종료후실험동물을이산화탄소로마취하여복대동물절단방법으로치사시킨다음외관및내부장기의이상유무를육안적으로관찰하였다. 본시험결과는평균값과표준편차로표기하였으며, 통계학적분석은 SAS system(9.1) 을이용하였다. 측정항목중단회경구투여독성시험중체중결과에대하여 one-way analysis of variance (ANOVA) 검정법을사용하였고, 이때 p-value가 0.05 이하일경우유의한것으로판정하였다. 단회경구투여독성시험에서사망동물이관찰되지않아반수치사량 (LD 50 ) 의산출을위한통계는실시하지않았다. - 72 -
2-8. 3T3-L1 세포주에서지질저하제에대한효능검정 질환모델동물을이용한당뇨및지질저하제에대한효능검정에앞서, 전지방세포를이용하여각각의목이버섯추출물에대한스크리닝을실시하였다. 전지방세포는마우스유래섬유아세포인 3T3-L1 세포주 (KCLB NO.10092.1) 를사용하였다. 3T3-L1 세포를 24 well plate에 5 10 3 cells/ml로분주하여 10% 우혈청을첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(dmem) 에배양하였다. 세포가충분하게자란뒤 2일후 (day 0) 에 10% fetal bovine serum(fbs) 를첨가한 DMEM 배지에세포분화유도물질인 0.5 mm isobutylmethylxanthine(ibmx), 1 μm dexamethasone, 1 μg/ml insulin을첨가하여 2일동안배양하였다. 그후 10% FBS와 1 μg/ml insulin을첨가한 DMEM으로배양하였다. 에탄올과물로추출한목이버섯추출물을 3, 30, 300 μg/ml 농도로조절한후분화전과정동안배지에첨가하였다. 첨가후배양 8일째에세포를 phosphate-buffered saline(pbs) 로두번세척하고, 실온에서 2 시간동안 0.6% Oil Red O solution 으로염색하였다. 그런다음증류수로세척한후이소프로판올로용출시켜 540 nm 에서흡광도를측정하였다. 3T3-L1에대한시험물질의효능을평가하기위한분화율의측정은시험물질을처리한 well의흡광도를시험물질로처치하지않은음성대조군 well의흡광도로나누어 % 로나타내었다. 그외에 glycerol-3-phosphate dehydrogenase(gpdh) 활성및 triglyceride 측정은 kit (Takara, Japen; Zenbio, Japen) 를사용하였다. 2-9. 질환모델동물을이용한당뇨및지질저하제에대한효능검정 6주령의 SD rat 수컷을구입하여 1주간순화시켰다. 시험은 7주령부터실시되었으며, 양성대조군을제외한모든랫트에당뇨유발약물인 STZ(streptozotocin, 50 mg/kg BW) 를 0.1 mol/citrate buffer(ph 4.5) 에녹여복강주사하였다. 복강주사후 48시간이후에공복혈당을측정하여 300 mg/dl 이상의혈당수치가나온랫트를 Auricularia auricula-judae ethanol extract 원액을투여하는시험군 ( 목이추출액군, n=6), 3배의 Auricularia auricula-judae ethanol extract 희석액시험군 ( 추출액 x3 희석, n=6), 10배의 Auricularia auricula-judae ethanol extract 희석액시험군 ( 추출액 x10 희석, n=6), 정상대조군 (n=6) 과음성대조군 ( 당뇨유도실험군, n=6) 으로구분하였다. 목이버섯추출액의투여는정상사료에위에서제시한용량으로사료를제조하여 30일간사료내투여하였다. 당내당성시험은 12시간절식후에 Glucose를 5g/kg으로투여전 60분에미정맥에서채혈하고, 투여후 30, 60, 120, 180, 그리고 300분에채혈하여혈당측정기를사용하여혈당을측정한다. 일주일마다채혈하여혈청을분리한후혈당, 혈청 cholesterol, 혈 - 73 -
청 triglyceride, 혈청 urea 그리고혈청 insulin levels 을측정하였다. 5. 목이버섯의식품소재화 5-1. 목이된장제조법최초의연구계획서에따라서목이버섯의활용성을증대시키기위한일환으로 1 차년도시제품연구를동시에시도하였다. 목이버섯은항종양억제율이매우높은것으로알려져있으며, 오장을좋아지게하고, 이질과하혈을멎게해준다. 또한목이버섯은혈액을정화시켜피부미용과빈혈, 고혈압, 동맥경화와같은성인병등에도움을주며, 천연젤라틴을다량함유하고있어, 배설을촉진시켜변비에도좋은효과를가진다. 특히천연젤라틴은변비에탁월한효과가있으므로시장에서상품화되지않은목이된장을마켓팅분석에의거 ( 시장성, 보편성, 기술성 ) 하여상품화하는것으로하였다. 본연구에서는된장의기능성및부가가치를향상시키고, 기능성과맛을증진시킨된장개발을위하여목이버섯분말을첨가하여발효숙성시킨된장을제조하여된장의성분변화정도와관능적특성을조사하였다. 대두를선별하여세척하고침지하여증자하고냉각시킨다. 여기에종균을접종한후, 파쇄, 성형하여발효하여메주를얻어장을담그고숙성시켜장뜨기를한다. 일정기간이지난후, 된장과간장을얻어, 목이버섯분말 1% 와간장 9% 를혼합하여숙성후, 된장과배합하고한번더숙성하여제품화하였다. 가. 된장의원료 1). 대두대두는된장에풍부한단백질을공급하고된장제조시각종효소의작용에의하여 peptide와아미노산으로분해되어향기생성에중요한역할을한다. 또한된장의지방질도대두에서유래되며, lipase의작용을받아 glycerine과지방산으로분해되어된장의향미생성에관여하므로된장의주원료로사용하였다. 2) 곡류 ( 쌀 ) 전분질이가수분해되어당분의단맛을생성하며본연구에서는쌀을주원료로이용하였다. 쌀은발효시킬때, 자기소화되어쌀전분은환원당으로, 단백질은 peptide를거쳐아미노산으로, 지방은지방산과글리세린으로된다. 이러한분해생성물은미생물의영양원이되고향미생성에관여하므로주원료로사용하였다. 3) 소금소금의품질규격은 NaCl이 95% 이상되어야하고, 나머지 5% 의불순물중, 수분을제외한무기물중에서 Fe이나 Cu 등은된장성분의산화, 특히유지의산화와산화적갈변에영향을미친다. 본연구에서는정제소금을사용하였다. - 74 -
나. 된장제조방법 대두를선별하여세척하고침지하여증자하고냉각시켰다. 여기에종균을접종한후, 파쇄, 성형하여발효하여메주를얻어장을담그고숙성시켜장뜨기를하였다. 일정기간이지난후, 된장과간장을얻어, 목이버섯분말 1% 와간장 9% 를혼합하여숙성후, 된장과배합하고한번더숙성하여제품화하였다. 다. 목이된장의제조및성분분석 1) 점조도된장의점조도는된장을일정량의물로희석하여상등액만을취해레오미터시스템 (Rheometer System)(HAAKE RheoStress 1, Germany) 에스핀들 (spindle)(rotor DG43 DIN 53544 Titan) 을장착하여측정용컵 DG43(measuring cup DG43) 을사용하여측정하였다. 점조도값은변형속도 (shear rate)(1/s) 와변형압력 (shear stress)(pa) 으로나타내어점조도가높아짐에따라층밀림변형력이높아지는효과를측정하였다. 측정온도 20 에서전단속도는 1~100 s -1 의범위로유동특성을알아보았고, 점조도지수와유동지수값은파워로우모델 (Power law model)(τ=ar b ) 로측정하였다. 2) 혈전용해효소혈전용해능측정시료는된장 2 g을 0.1M 인산완충용액 (phosphate buffer)(ph 7.5) 8 ml에혼합한후원심분리하여얻은상등액을조효소액으로사용하였다. 혈전용해효소활성은피브린플레이트법 (fibrin plate method) 의일종인아스트럽및뮬러츠법 (Astrup and Mullertz method) 을사용하여측정하였다. 피브린플레이트 (Fibrin plate) 는 0.5% 피브리노겐 (fibrinogen) 을 0.067M 인산화나트륨완충용액 (sodium phosphate buffer)(ph 7.4) 에용해시켜서직경 9cm인페트리접시 (petri dish) 에 10mL을가하였다. 여기에 0.067M 인산화나트륨완충용액 (sodium phosphate buffer) 에용해된트롬빈 (thrombin)(100 NIH/mL) 0.1 ml 를가하고신속하게혼합하고균일한평판을제조한후실온에서 30분방치하여사용하였다. 피브린플레이트 (Fibrin plate) 에시료점적위치를표시하고배양상등액 ( 조효소액 ) 을 20μl씩각표시한위치에점적하여 37 항온기에서 2시간반응시킨후용해면적으로효소활성을구하였다. 혈전용해효소의표준곡선을구하기위해서표준플라스민 (plasmin) 용액을 0.6, 1.6, 2.6, 5 unit/ml로되도록트리스-라이신완충용액 (Tris-lysine buffer)(ph 9.0) 으로조제한다음, 피브린플레이트 (fibrin plate) 에 20μl씩가하여형성된용해면적으로부터플라스민 (plasmin) 효소활성의표준곡선을작성하였다. 배양액중의혈전용해효소는표준곡선과비교하여플라스민단위 (plasmin unit) 로환산한것 - 75 -
이며, 아래식을이용하여혈전용해효소활성을계산하였다. < 식 1> 3) 타이로신함량된장의펩타이드생성정도를측정하기위하여 Folin phenol 시약을이용하여 tyrosine 함량을측정하였다. 된장을증류수로 5배희석하여추출한시료액 0.7 ml에 0.44 M TCA (trichloroacetic acid) 0.7 ml을첨가하여 37 에서 30분간반응시킨다음, 15,000 rpm에서 10분동안원심분리하여침전물을제거하였다. 회수된상등액 1 ml에 0.55 M Na 2 CO 3 2.5 ml와 Folin phenol 0.5 ml을차례로넣고혼합한후 37 항온수조에서 30분간반응시켰다. 상온에서냉각시킨후반응액의흡광도를흡광도로 660 nm에서측정하였다. 4) 프로테아제활성된장 5 g에 0.02M phosphate buffer(ph 7.0) 95 ml을첨가한뒤실온에서진탕후원심분리 (15000 rpm, 15분 ) 하여상등액으로부터효소액을조제한다음효소활성을측정하였다. Protease의활성도는 Anson의방법을변형하여측정하였다. 기질로는 0.6% 의카제인용액 0.35 ml과효소액 0.35 ml를 e-tube에넣고항온수조에서반응 (37, 10분 ) 시킨다음 0.44 M TCA 용액 0.7 ml을넣어반응을정지시킨후 37 에서 30분간정치시켰다. 이반응액을원심분리 (15,000rpm, 15분 ) 한후여액 1 ml에 0.55 M Na 2 CO 3 2.5 ml과 3배희석된 Folin reagent 0.5 ml을넣고 37 에서 30분간반응시킨후 660 nm에서흡광도를측정하였다. 이반응조건하에서 1분간에 tyrosine 1 μg을유리시키는효소량을 1 unit로하였다. 5) 관능평가 10명의훈련된패널을대상으로 60일간저장한된장의관능특성을평가하였다. 된장의평가항목은색, 맛의특성강도와전체적기호도에대해 9점채점법으로평가하였다. 각항목에대한특성강도는없다 (1점) 에서강도가증가함에따라대단히강하다 (9점), 전체적기호도는대단히싫다 (1점), 보통이다 (5점), 대단히좋다 (9점) 로하여평가하였다. - 76 -
6. 목이버섯된장판매용시제품의생리활성실시가. 목이된장의제조대두를선별하여세척하고침지하여증자하고냉각시킨다. 여기에종균을접종한후, 파쇄, 성형하여발효하여메주를얻어장을담그고숙성시켜장뜨기를한다. 일정기간이지난후, 된장과간장을얻어, 목이버섯분말 1% 와간장 9% 를혼합하여숙성후, 된장과배합하고한번더숙성하여시제품화하였다. 경북고령소재알알이식품사를통한 OEM 대량생산을실시하였으며제품의중량은시장성에맞게 1차년도 ( 주 ) 대자연B&T에서시제품으로생산한 500g 용량에서 900g으로변경하여식약청보고를의무화하고생산하였다. 또한국산대두등의농산물원료의가격급등으로인한제품원가의상승에따른영업판매의애로사항이있어, 제품의고급화를추구하고자아웃박스를제작및개별포장으로변경하였다. 나. 목이버섯첨가발효후목이된장의비교목이버섯첨가유무에의해생산된된장의이화학적효능평가와생리활성 ( 항염증및항암효능 ) 평가를통해목이된장의기능성을비교하였다. 효능평가를위해된장 40 g을 200 ml (200 mg/ml) 증류수에풀어 90 에서 1시간추출되었으며각된장추출물은원추출액, filter paper(whatman No.2, 8μm ) 를사용하여여과한여과액, 여과한시료를원심분리 (4, 3000rpm, 10min) 하여얻은상등액을여과한 (25cs, 0.45um, 10ml 실린지 ) 한여과액으로준비하였다. 시료의준비는다음과같다. 된장 O ( 목이버섯첨가된장시료 ) 된장 X ( 목이버섯무첨가된장시료 ) 추출여과 filter 추출여과 filter 다. 이화학적평가 당도는여과한시료와 filteration 되어진시료를당도계 (Pocket refractometer) 를이용하여 3회반복측정하였다. ph는원추출시료와여과한시료를 ph meter를이용하여 3회반복측정하였다. 색도는여과되어진시료를 colorimeter( 분광측색계 ) 를이용하여 3회반복측정하였다. 갈색도는여과된시료를 UV/Vis spectrophotometer( 분광광도계 ) 를이용하여 420nm에서 3회반복하여갈색도를측정하였다. Toatl polyphenol contents 측정은여과액을 1/10 희석 (20 mg/ml) 한액을시료로하여 Folin-ciocal법을이용하여 Total polyphenol contents를측정하였으며, 지표물질로써 Tannic acid를사용하였다. - 77 -
다. 생리활성의평가항산화능비교를위하여전자공여능측정을실시하였다. 여과액 (200mg/ml) 을 1/10 희석 (20mg/ml) 으로희석한액을시료로하여 DPPH법을이용하여항산화능을알아보았다. 항암및항염증효능평가추출물을 200, 20, 2, 0.2, 0.02 mg/ml 농도구간으로희석하고및여과한시료를항암및항염증효능평가분석을위해사용하였다. 항암효능평가는 MTT 및 SRB test를통하여세포독성측정으로신장암, 자궁암, 위암및대장암세포주에대하여항암효능평가를비교하였다. 항염증효능평가는 Raw 264.7 cell에대하여세포독성확인실험을통해선별되어진 2 mg/ml 농도의시료를이용하여 Nitric oxide 생산저해능확인을통해항염증효능평가를하였다. 라. 목이된장저장성시험시료를실험실진열대의실온 (25~26 ) 과항온기 (35, 40 ) 에각각보관후 30일경과시아래의관능검사, 이화학검사및미생물항목을점검하였다.( 항온기실험은미생물의최적생육조건을맞추어미생물발생최소기간을알기위함 ) 실험항목은관능적항목 ( 성상, 이미, 이취, 이물 ) 과미생물적항목 ( 대장균군, 세균수 ), 이화학적항목 ( 수분 ) 실험을통해저장테스트를하였다. 목이된장에대한일반성분검사, 대장균, 바실러스세레우스균검사는공인성적검사기관인계명대학교전통미생물자원연구소에의뢰하여정확한품질검사를실시하였다. 관능검사는패널요원은 20명이상으로하여가장좋거나강한것은 5점, 약하거나싫은것은 1점으로하여 5점척도법으로설문지를작성하여결과를평가분석하였다. 7. 목이버섯함유분말청국장 가. 특성분석을위해사용되어진시제품및시험시료 Fig 1. 과같은포장으로 15g/pack 으로시생산되어진 목이버섯첨가분말형청국장 시제품을이용하여이화학적효능평가와 in vitro 항암효능평가를수행하였다. 이를통해생산되어진시제품분말청국장의품질특성과기능성을조사하고자하였다. - 78 -
Fig. 1. 분말청국장시제품 2) 시험시료시험에사용된목이버섯시료는경기도평택시에위치한버섯중앙회 ( 주 ) 로부터구입하여사용하였다. 시제품의품질특성및효능을평가하기위하여청국장분말 5g 을 100ml(50mg/ml) 증류수에용해하여 90 에서 1시간추출후원심분리 (Eppendorf centrifuge 5810R, Germany)(20, 4000rpm, 30min) 를통해얻어진상등액을 filteration(toyo Roshi, Cellulose Acetate 0.45μm, 25mm(CS) Syringe Filters, Japan) 하였다. 시제품으로부터최종적으로 filteration 후확보한액상시료를특성및효능평가를위한시료로써사용하였다. 또한 15g/pack 규격으로시생산되어진 목이버섯첨가분말형청국장 시제품을사용하여본시제품의저장성및유통기한설정실험에사용하였다. - 79 -
나. 시제품의물성분석및이화학적특성분석을위한시험방법 1) 수분분말청국장시제품의수분은수분측정기 (Sartorius Mechatronics, Germany) 를이용하여 3회반복측정하였다. 2) 입도분말청국장시제품의입도는 Isopropylalcohol(Merck, Germany) 에분말을용해시킨후입도분석기 (BECKMAN COULTER, LS 13 320 Series Laser Diffraction Particle Size Analyzers, USA) 를이용하여 3회반복측정하였다. 3) 색도분말청국장시제품의색도는 Colorimeter(Color Techno System.co.ltd, Japan) 를이용하여 3회반복측정하였다. 4) 붕해도국가공인식품시험분석전문기관인계명대학교전통미생물자원개발및산업화연구센터에의뢰하여조사되어졌다. - 80 -
나. 시제품의기능성성분함량분석방법 1) Total polyphenol contents 측정 Folin-ciocal법을이용하여 Total polyphenol contents를측정하였다. 지표물질로써 Tannic acid(sigma, USA) 를사용하여정량곡선을작성하였으며, 정량곡선범위내에서확인되어지는농도의시험시료를이용하여분말청국장의 total polyphenol contents를정량 (mg/g) 하였다. 2) Total flavonoid contents 측정 AlCl 3 법을이용하여 Total flavonoid contents를측정하였다. 지표물질로써 Catechin(Sigma, USA) 를사용하여정량곡선을작성하였으며, 정량곡선범위내에서확인되어지는농도의시험시료를이용하여분말청국장의 total flavonoid contents를정량 (mg/g) 하였다. 3) 전자공여능측정 1/10 단계희석을통하여시험시료를 50mg/ml, 5mg/ml, 0.5mg/ml 농도로준비하여 DPPH법을이용하여전자공여능측정을통한항산화력을확인하였다. 지표물질로써 L-ascorbic acid(sigma, USA) 를사용하여정량곡선을작성하였으며, 정량곡선범위내에서확인되어지는농도의시험시료를이용하여분말청국장의 L-ascorbic acid에상응되는항산화력 (%) 을대조군과대비하여조사하였다. 4) Superoxide anion radical 소거능측정 1/10 단계희석을통하여시험시료를 50mg/ml, 5mg/ml, 0.5mg/ml 농도로준비하여 NBT법을이용하여인체에유해한산소독성에대한방어능으로써 Superoxide anion radical 소거능 (%) 을대조군과대비하여조사하였다. 5) 아질산염소거능측정 1/10 단계희석을통하여시험시료를 50mg/ml, 5mg/ml, 0.5mg/ml 농도로준비하여 Griess 법을이용하여식품섭취등에의해유도되어지는발암성물질생성저해능인아질산염소거능 (%) 을대조군과대비하여조사하였다. 다. 항암 in vitro 효능평가 시험시료를 10, 2, 0.2, 0.02, 0.002mg/ml 농도구간으로희석및 filteration 하 여신장암, 자궁암, 위암, 대장암, 간암세포주에대한항암효능평가분석을위해 - 81 -
사용하였다. MTT((3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium b romide)) assay 및 SRB(sulforhodamine B) assay를통한대조군대비세포의생존및생육능 (%) 평가를통하여시험되어진시료의암세포생존및생육억제능확인 ( 세포독성평가 ) 으로항암효능평가를하였으며, 10 4 Cell 에해당되는각세포주를대상으로실험하였다. 라. 유통기한설정실험지표유통기한설정실험은식품의약품안전청에서제시한 식품, 식품첨가물및건강기능식품의유통기한설정기준 에따라실험지표가설정되었으며식품의약품안전청에서고시한 식품공전 및 건강기능식품의기준및규격고시전문 _ 기준규격 에따른실험법으로수행되어졌다. 또한 Table 1. 같은가속실험조건을통하여시제품의유통기한을예측및설정하였다. Table 1. 시제품의가속실험에의한유통기한설정시험조건 설정저장조건 구분 유통온도 온도상대습도시험기간 측정기간 (6 구간측정 ) 0 일 상온유통제품 15-25 대조구 ( 유통온도 ): 25 실험구 : 25, 30, 45 75% 120 일 (4 개월 ) 15일 30일 60일 90일 120 일 1) 미생물실험 식품의약품안전청 식품, 식품첨가물및건강기능식품의유통기한설정기준 에근거하여시제품 ( 장류 ) 에해당되는미생물실험은 Bacillus cereus와대장균군대상이며다음과같은방법으로시험되어졌다. 시제품분말시료를단계별로멸균수에희석한다음, MYP 한천배지 (Mannitol egg Yolk Polymixin Agar, Oxoid, England) 에 1ml씩도말하여 30 에서 24시간배양한후 Bacillus cereus 의심집 - 82 -
락을의미하는분홍색집락 (Fig. 2) 을선별및개수하였으며, 선별되어진의심집락은 1차적으로그람염색을통해확인되어졌으며그람양성균으로판별되는균주는 2 차적으로 API KIT(Biomerieux, France) 를이용하여 manual과분석프로그램을통해확인시험되어졌다. 대장균군은시제품분말시료를단계별로멸균수에희석한다음, 데스옥시콜레이트유당한천배지 (Desoxycholae Lactose Agar, BD, USA) 에 1ml씩도말하여 35 에서 24시간배양한후대장균군의심집락을의미하는암적색의집락 (Fig. 3) 을확인하였다. Fig. 7-2. MYP 배지를통해확인되어지는 Bacillus cereus Fig. 3. 데스옥시콜레이트유당한천배지를통해확인되어지는대장균군 2) 이화학분석식품의약품안전청 식품, 식품첨가물및건강기능식품의유통기한설정기준 에근거하여시제품 ( 장류 ) 에해당되는이화학적지표는수분, 총질소, 아미노산성질소가대상이며다음과같은방법으로시험및조사되어졌다. (1) 수분분말청국장시제품의수분함량은수분측정기 (Sartorius Mechatronics, Germany) 를이용하여 3회반복측정으로조사되어졌다. (2) 총질소국가공인식품시험분석전문기관인계명대학교전통미생물자원개발및산업화연구센터에의뢰하여조사되어졌다. (3) 아미노산성질소국가공인식품시험분석전문기관인계명대학교전통미생물자원개발및산업화연구센터에의뢰하여조사되어졌다. - 83 -
3) 관능적분석시제품에대한성상시험은 식품공전 제10. 일반시험법 9. 일반시험법, 9.1 성상 ( 관능시험 ) 에제시된시험법에따라다음과같은 4항목 ( 색깔, 풍미, 조직감, 외관 ) 을감지하여 5점척도법에의한관능평가로측정및조사하였다. (1) 색깔 1 색깔이양호한것은 5점으로한다. 2 색깔이대체로양호한것은그정도에따라 4점또는 3점으로한다. 3 색깔이나쁜것은 2점으로한다. 4 색깔이현저히나쁜것은 1점으로한다. (2) 풍미 1 풍미가양호한것은 5점으로한다. 2 풍미가대체로양호한것은그정도에따라 4점또는 3점으로한다. 3 풍미가나쁜것은 2점으로한다. 4 풍미가현저히나쁘거나이미 이취가있는것은 1점으로한다. (3) 조직감 1 조직감이양호한것은 5점으로한다. 2 조직감이대체로양호한것은그정도에따라 4점또는 3점으로한다. 3 조직감이나쁜것은 2점으로한다. 4 조직감이현저히나쁜것은 1점으로한다. (4) 외관 1 병충해를입은흔적및불가식부분제거, 제품의균질및성형상태와포장상태등외형이양호한것은 5점으로한다. 2 제품의제조 가공상태및외형이비교적양호한것은그정도에따라 4점또는 3점으로한다. 3 제품의제조 가공상태및외형이나쁜것은 2점으로한다. 4 제품의제조 가공상태및외형이현저히나쁜것은 1점으로한다. - 84 -
제 3 절결과및고찰 1. P388D1 과 sarcoma 180 세포주에서목이버섯에탄올추출액으로부터추출용 매에따른항암할성의비교시험 가. MTT와 SRB assay에의한항암활성암세포주인 sarcom180와 P338-D1의표준균주를한국세포주은행 (KOREAN CELL LINE BANK) 에서분양받아, RPMI1640(10% FBS, 100 unit/ml-100 mg/ml penicillin and streptomycin) 를이용하여 tissue culture flask(25 cm2) 를사용하여 37 에서 5% CO 2 배양기에서배양하였다. 항암활성은 MTT assay, SRB assay방법을이용하여측정하였다. 목이버섯분획추출물의항암활성여부를확인하기위하여추출물들을 1 mg/ml과 0.3 mg/ml, 0.01 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.001 mg/ml 로농도를조정하여항암활성을측정하였다. 양성대조군으로실제항암치료에사용되고있는약물인 doxorubicin을사용하여항암활성을비교하였다. EtOAc, BuOH, DCM, EtOH 그리고 water 분획추출물에대하여 70% ethanol extract을 P388D1와 sarcoma 180 cells에농도별로처리하여 MTT 및 SRB assay를통해확인한결과, 각각의분획추출물은 P388D1와 sarcoma 180 cells 에대하여용량-의존적으로유의적인항암할성을보였다 (p<0.05)(fig. 1-2, Fig. 1-3). - 85 -
Figure 1-2. Anti-tumor activity of solvent fractions on P388D1 cells; A. Ethyl acetate (EtOAc), B. Butanol (BuOH), C. Dichloromethane (DCM), D. Ethanol (EtOH) and E. Water fractions of Auricularia auricula-judae ethanol extract at the various concentrations (0.3 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.03 mg/ml and 0.01 mg/ml) and F. Doxorubicin as a positive control at different concentrations (1 µg/ml, 0.1 µg/ml and 0.01 µg/ml) on P388D1 cell by MTT assay. All values are presented as percentages of the results from control, and are expressed as mean ± SD of three independent (triplicate wells) experiments and the different alphabet superscripts differ significantly at P<0.05. - 86 -
Fig. 1-3. Anti-tumor activity of solvent fractions on sarcoma 180 cells; A. ethyl acetate (EtOAc), B. butanol (BuOH), C. dichloromethane (DCM), D. ethanol (EtOH) and E. Water of ethanol extract from Auricularia auricula-judae at the various concentrations (0.3 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.03 mg/ml and 0.01 mg/ml) and F. Doxorubicin as a positive control at different concentrations (1 µg/ml, 0.1 µg/ml and 0.01 µg/ml) on Sarcoma 180 cell line by MTT assay. All values are presented as percentages of the results from control, and are expressed as mean ±SD of three independent (triplicate wells) experiments and the different alphabet superscripts differ significantly at P<0.05. 분획물중에서 1 mg/ml 의농도에서 P388D1 cells 에대하여 MTT 법과 SRB 법으 로측정한결과 DCM 분획추출물이가장항암활성이뛰어났으며그뒤를따라서 BuOH 층, EtOH 층, EtOAc 층그리고 water 층으로보여주었다. (Table 1-1). - 87 -
Table 1-1. Comparative estimation of inhibitory activities solvent fractions of A. auricula-judae extract between MTT and SRB assays, Solvent Fractions (1 mg/ml) P388D1 cells Sarcoma 180 cells MTT assay SRB assay MTT assay SRB assay 46.01 ± 2.12 *# BuOH 48.13 ± 3.16 # 51.17 ± 2.07 # 65.74 ± 2.44 67.53 ± 1.30 # DCM 53.95 ± 7.67 # 51.71 ± 3.71 # 73.97 ± 1.11 72.67 ± 2.47 # EtOH 46.57 ± 6.32 47.42 ± 6.33 65.71 ± 9.14 59.67 ± 1.97 Water 37.23 ± 0.87 37.93 ± 1.70 64.48 ± 3.51 58.39 ± 4.59 Dox (1 µg/ml) 44.33 ± 9.11 46.04 ± 2.76 72.54 ± 0.26 72.81 ± 2.09 All values are presented as percentages of the results from control, and are expressed as mean ± SD of three independent (triplicate wells) experiments, * is expressed assignificant different that compared to MTT values with SRB values of the respective fraction in same cell line (1 mg/ml) at P<0.05 and # is expressed as significant differences of solvent fractions than water fraction in same cell line. EtOAc, ethyl acetate; BuOH, butanol; DCM, dichloromethane; EtOH, ethanol; Dox, doxorubicin (positive control). 하지만 sarcoma 180 cells에서는다르게나타났다. DCM fraction은 EtOAc층, BuOH층, EtOH층그리고 water 층으로나타났다 (Table 1). 항암활성의비교를위해항암억제정도를 IC 50 values를계산하여 Table 2에나타내었다. 가장낮은 IC 50 값은 P388D1 세포주에서 water fraction을처리하였을때, 28.2 µg/ml로나타났고 sarcoma 180 세포주에서 DCM 층을처리하였을때, 94.2 µg/ml로나타났다. 양성대조군인 doxorubicin은 P388D1과 sarcoma 180 세포주에서 100 ng/ml 과 95 ng/ml의각각보여주었다 (Table 1-2). Table 1-2. IC50 values of different solvent fractions of Auricularia auricula-judae extr act on tumor cell lines Fractions of Auricularia auricula-judae (µg/ml) Doxorubicin Cell lines EtOAc BuOH DCM EtOH Water (ng/ml) P388D1 143.80 94.62 38.32 44.03 28.19 100.00 Sarcoma 180 108.90 134.10 94.20 133.00 102.30 95.00 Data are presented as IC50 values by MTT assay from three independent experiments, performed in triplicate on tumor cell lines, obtained by nonlinear regression using the GRAPHPAD Prism program. EtOAc, ethyl acetate; BuOH, butanol; DCM, dichloromethane; EtOH, ethanol; Dox, doxorubicin (positive control). - 88 -
나. 실험동물에서 dichloromethane (DCM) fraction의항암활성. 실험동물인 BALB/c mice이의배복쪽가랑이사이에 sarcoma cells을 1x10 6 /ml 피하주사하여암을유발하였다. 그후, dichloromethane (DCM) fraction 100 mg/kg b.w( 시험물질처리군 n=6), doxorubicin 3 mg/kg b.w( 양성대조군 n=6), 생리식염수 ( 음성대조군 n=6) 을경구투여하였을때, DCM 투여군에서가장좋은항암활성을보여주었다. DCM 분획추출물 (P<0.05) 을투여하였을경우항암크기는대조구의그것과비교시줄어들었으며 (Fig. 1-4A). 암크기가 76.13% 까지감소하였다 (Fig. 1-4B). Fig. 1-4. In vivo antitumor effects of DCM (dichloromethane) fraction from 70% ethanolic A. auricula-judae extract on tumor volume (A) and inhibition of tumor volume (B) of sarcoma 180 solid tumor-bearing BALB/c mice. All values are presented as cm 3 (A) and % (B) and are expressed as mean ± SD. * superscripts differ significantly at P<0.05 compared to control. 이러한결과는양성재조군인 doxorubicin과 DCM 투여군이비슷한크기로감소하였다. 한편양성대조군과 DCM fraction은음성대조군과비교시 33.33% 가지그크기가감소하였다 (Table 1-3). 시험군사이에서체중변화의차이는나타나지않았다. 다. 비장지수 (Spleen Index). Splenomegaly( 비장거대증 ) 은 sarcoma 180 solid tumor-bearing mice 에서나타났다 (Figure not shown). - 89 -
Fig. 1-5. Effect of dichloromethane (DCM) fraction from 70% ethanolic A. auricula-judaeextract on spleen on sarcoma 180 solid tumor-bearing mice and non-tumor-bearing mice without DCM. All values are presented as mg/g body weight of mice and are expressed as mean ± SD. The different alphabet superscripts differ significantly at P<0.05. 비장지수는암이발생되지않은군과처치되지않은군보다유의성있게높은수치 를보였다 (Fig 1-5). 비장의크기는대략 6 배, 3 배, 그리고 3 배정도로나타났다. 비장지수수치는정상군 ( 비처치군 ) 과비교시 6 배 ( 음성대조군 ), 3 배 ( 양성대조군 ) 그리고 3 배 ( 디클로르메탄투여군 ) 보다유의성있는수치를보였다. Table 1-3. Effect of dichloromethane (DCM) fraction from 70% ethanolic A. auricula-judae extract on sarcoma 180 solid tumor in BALB/c mice Body weight Tumor weight Inhibition rate Complete Groups (g) (g) (%) regression Control 26.00 ± 1.27 1.89 ± 0.15 00.00 0/6 Doxorubicin 26.67 ± 1.63 0.96 ± 0.76 49.23 2/6 DCM 27.5 ± 1.38 1.08 ± 0.84 42.62 2/6 Each value is presented as mean ± S.D. (n=6/group). Control (0.85% saline), doxorubicin (Positive control, 3 mg/kg body weight), DCM (dichloromethane fraction, 100 mg/kg body weight). 다양한항암활성은목이버섯의추출액성분인다당체혹은여러성분에의하여다양한분획추출물인다양한기전에의하여발생한다. 화학적으로변환된버섯ᄅ의다당채는강력한항암활성을보여준다. 그러나용해성및알카리비용해성인목이버섯의 β-glucan은강력한항암활성을보였다. 그러나원래의알칼리비용해성인 β-glucan은 inhibitory effect가없는것으로알려졌다 (Misaki et al., 1981). - 90 -
이들용매추출액의결과는다른버섯추출물의항암활성과유사한결과들을보여주었다 (Jagetia and Rao, 2006; Song et al., 2008; Wang et al., 2008). 유기용매별분획추출물에의해관찰되는세포독성의차이점은식물추출물의유기용매에따라서활성성분의차이점에의한것으로생각된다. 그러나두개의세포주에서나타나는항암활성의차이점은같은용매에서도나타나는데기전에의한차이로생각된다. 이러한결과가나타내는것은추출물의세포독성은추출물과추출액에의존하고또한세포주에따라서다르게나타나는것을보여준다 (Ait Mbarek et al., 2007). 가장강력한세포독성은목이버섯의 DCM 층에의해서관찰되고 guduchi의 DCM 층에서의그것과유사한결과이다 (Jagetia and Rao, 2006). 그리고이러한항암활성은디른유기용매층과비교시월등하다. Livistona chinensis R.Br, 의 70% 에탄얼층으로추출한추출액에서에틸아세테이트층으로분획시에 VEGF protein 분비와연관이되어있다. 그리고 Flk-1 mrna와 protein의억제로나타내었다 (Wang et al., 2008). 게다가 P388 세포주와 Sarcoma 180 세포주에서목이버섯 70% 에탄올추출액에서분리한유기용매별분획물은용량-의존적인항암활성을보였다. MTT법과 SRB 법에대한항암활성의처이점은 Henriksson 등은 (Henriksson et al., 2006) 은없다고보고하였다. 그러나본실험에서이두가지시험법에서에틸아세테이트분혹물에서는차이점을보였으나그이유는아직불분명하다. 비장은조혈작용을하는중요한기관이다. 이장기에는과립백혈구, 단핵구, 림파구와비과립백혈구모두포함되어있다. 이것은마유스에서 humoral immunity의중요한역할을한다. 비장거대증과암이발생한마우스의높은비장지수는 paraneoplastic syndromes에기인하는것으로알려져있고암의존재하에서 splenic cytokines과 humoral factors에양향을받는것으로알려져있다 (Yoneda et al., 1991.). 결론적으로본연구에서는목이버섯 70% 에탄올추출액에서분리한각종용매추출물에대한목이버섯추출액이 P388D1과 sarcoma 180 tumor 세포주에대하여억제효과를보였다. 이러한억제효과는용량-의존적으로나타났으나 MTT와 SRB 법에의하여확인되었다. IC50 values를기준으로 DCM solvent fraction에서 sarcoma 180 cells in vitro와마우스실험에서나타났다. 한편높은비장지수와비장거대증이암발생의마우스에서보여주었다. - 91 -
2. 목이버섯 70% 에탄올추출액에서분리된디클로르메탄분획추출물의 항염증작용 염증반응은정상적인생리상태에서중요한역할을한다. 그러나암과같은악성발생을유도하는힘으로서인식된다. Medicinal plant와이것들로부터얻은생산품은수세기동안에상처치유, 부종그리고류마티스성관절염을치료하는데수세기동안사용되었다 (Abrham et al., 2010). 그러나몇가지전통적으로사용된약초와상관없이, 이것들의약리효과즉면역활성값은약리효과는많이알려져있지않다. 본연구에서목이버섯의항염증활성연구를처음으로 A. auricula-judae 70% 추출액에서추출한디클로르메탄층의분획물에서처음으로 RAW 264.7 cells를이용하여처음으로발표하였다. 목이버섯추출액에서분리된디클로르메탄분리층의항염증역할을이해하기위하여, 양성대조약물로 RW264.7 cells에 LPS를처리하여염증억제정도를관찰하였다. 처음으로목이버섯추출액으로부터분리한디쿨로르메탄분혹물을처리하였을경우 LPS에서유도되는 NO 생성의억제를관찰할수가있었다. 염증정도를확인하기위하여몇가지사이토커인의발현유무를 LPS를처리한것과목이버섯의디클로르메탄층으로처리한결과 TNF-α와 IFN-γ 발현억제를확인하였다. 특히 NO 발생은급성및만성염증반응에참여하는것으로알려져있다 (Murakami et al., 2003; Hyun et al., 2004, ; Kiemer et al.,2002; Numata et al., 1998). 이러한 NO는 LPS 처리시많은발생이있으며 L-arginine으로부터 nitric oxide synthase (inos) 에의해서생성된다. 그래서 NO production을억제하면주요 inflammatory 및 infectious diseases을치료할수있다고제안되었다 (Boucher et al.., 1999; Albina and Reichner, 1998; Zhang and Ghosh, 2000). 본연구에서는목이버섯추출액과약용식물추출물에대하여 NO production의억제효과를 LPS-stimulated RAW 264.7 cells에서확인하였다. 그결과를 Fig. 2-1에나타내었다. 디클로메탄층은 LPS-induced NO production을 10 μg/ml에서용량-의존적으로유의성있게억제하였다 (p<0.05). 지금까지알려지기를, 목이버섯에서디클로르메탄층이 NO 생성억제효과는처음보고하는것이다. 높은용량에서는대조군과비교시 NO 생성을 73.5% 까지억제하였다 (p<0.01). - 92 -
Fig 2-1. Inhibition of nitric oxide production measured as nitrite in the cell free culture supernatants of LPS (1 lg/ml) challenged RAW 264.7 murinemacrophages. NO concentration in the culture supernatant was determined by Griess assay using sodium nitrite standard curve. Data are presented as means ± SD from three sets of independent experiments. * p < 0.05 represent significant difference compared with cells treated with LPS alone. a p < 0.05represent significant difference compared with control group. 염증성사이토카인인 IL-6, TNF-α, 그리고 IL-1β는내인성발열인자로작용한다 (Wu et al., 2008). 이러한사이토카인은 LPS 처리시증가하였으나디클로르메탄으로처리시모두현저하게억제하는경향을보였다. 이연구에서보여주는것은 (Fig. 2-2) 목이버섯의클로르메탄층은염증반응을개선시킬수가있다. 게다가목이버섯의다클로르메탄층은확실하게 IL-6의발현을억제하지는못하였다. 이러한 IL-6의불완전한억제의이유는더연구가되어야한다. - 93 -
Fig 2-2. Inhibition of LPS induced cytokine mrna expression in RAW 264.7 murine macrophages.total RNA was extracted and RT PCR was done to check the expression level of IL-6, TNF-α and IL-1β mrna. DME (Dichloro Methane Ethyl extract), Con (Control). Figure is representative of two independent experiments. 단백질차원에서 IL-1β 는용량의존적으로 mrna 수준과용량 - 의존적으로비례 하여증가하였다 (Fig. 2-3). - 94 -
Fig 2-3. Inhibition of IL-1βproduction measured with ELISA in the cell free culture supernatants of LPS (1 lg/ml) challenged RAW 264.7 murine macrophages. IL-1β concentration in the culture supernatant was determined by ELISA using standard curve. Data are presented as means ± SD from three sets of independent experiments. * p < 0.05 represent significant difference compared with cells treated with LPS alone. a p < 0.05 represent significant difference compared with control group. 결론적으로, 목이버섯의디클로르메탄층은 NO, IL-6, TNF-α 그리고 IL-1β의발현을억제하여염증반응을억제시킬수있으며메카니즘에대한연구는더진행이되어야할것으로생각되고본연구범위에벗어나므로추후에연구하기로결정하였다. 3. Comparative antitumor activity of Auricularia auricula-judae extracts against tumor cells in vitro ( 목이버섯과약용식물에서의항암활성의비교 ) 상기의시험에서항암활성을검토한결과최근항암효과가많이알려진마른진흙버섯, 영지버섯그리고 100 가지약용식물추출을비교하여그가치를입증하고자하였다. 목이버섯은식용버섯으로오래전부터애용되어왔다 (8, 9). 영양학적으로 100g에 293.1 Kcal 이고 64.82% carbohydrate, 9.69% proteins, 1.22% fat 그리고 7.87% ash로이루어져있다 (10). 최근들어, 목이버섯추출액들이의학적으로많이무목을받고있다. 약리활성으로 hypoglycemic(11), liver damage 예방 (12), 항응고작용 (13), 항보체작용 (14), hypolipidemic( 저지방혈증 ), antioxidant(16, 17) 그리고허혈예방 (18) 이보고되고있다. 전보고에의하면 Auricularia auricula-judae aqueous extract의항암작용을동물에서보고하였다 - 95 -
(19). 본연구에서버섯과약용식물의추출액에대한항암활성을비교하여산업적가치가있는지에대한내용을비교하였다. 아직까지버섯류와약용식물사이에항암활성의정도를비교한내용은없기때문에본연구에서실시를하였다. 또한 P. gilvus, 와 G. lucidum 70% extracts를 A. auricula-judae 70% extract와함께같은농도에서비교를하였다. 예비선별과정을기초로목이버섯의 70% 에탄올추출액과 100가지한귝고유의약용식물을갖고 MTT법으로항암활성을비교하였다. 이때이용한암세포주는표준균주인 P388D1 macrophage를갖고실시를하였다. A. auricula-judae 70% ethanol과 100 plant extracts의항암활성을 Table 3-1에나타내었다. Table 1에서보여주는것처럼, A. auricula-judae extract의평균항암활성은 42.21% 를보였다. 그결과 A. auricula-judae extract가 plant extracts (Morus bombycis for. Kase, Draba nemorosa var hebecarpa and Lotus corniculatus var. japonicas except Sedum oryzifolium) 보다항암활성이높았다 (Table 3-1 and Figure 3-1). TABLE 3-1. Anti-tumor screening of 100 Korean wild plants and Auricularia extracts on P388D1 macrophage tumor cells (1 mg/ml). Sameple Name Anti-tumor Anti-tumor Sameple Name activity (%) activity (%) Ardisia japonica 24.26 ±1.30 Potentilla discolor 14.20 ± 1.20 Astilbe koreana 16.84 ±1.20 Potentilla nivea 15.24 ± 1.03 Centaurea cyanus 14.23 ±1.01 Prunus salicina var. columnalis 23.37 ± 1.52 Draba nemorosa var. 28.98±3.63 ab hebecarpa Rheum undulatum 18.28 ± 1.03 Evodia daniellii 27.04 ±1.31 Robinia pseudo-accacia 33.54 ± 1.05 Juniperus rigida 14.93 ±1.23 Sciadopitys verticillata 25.76 ± 2.01 Lotus corniculatus var. 30.64±3.29 ab.japonicus Sedum oryzifolium 35.99±3.93 bc Magnolia obovata 17.02 ±1.32 Spinacia oleracea 18.73 ± 1.23 Mallotus japonicus 20.13 ±1.37 Ulmus davidiana var. japonica 15.99 ± 0.98 Morus bombycis for. kase 27.26±1.15 a Vitis amurensis 29.28 ± 1.31 Paulownia coreana 13.27 ±1.20 Auricularia auricula-judae 42.21±4.09 c - 96 -
Philadelphus schrenckii 17.65 ±1.05 Doxorubicin * 36.35 ±1.89 Phlomis umbrosa 22.30 ±0.96 Note. Data are expressed as mean ± SD. Values with different superscript letters differed significantly among selected plant and mushroom extracts at P<0.05. FIGURE 3-1. Cytotoxicity of P388D1 macrophage tumor cells by administration plant and mushroom extracts (1 mg/ml) and doxorubicin (1 µg/ml) for 48 h. (A) Control, (B) Doxorubicin, (C) Morus bombycis for. kase, (D) Draba nemorosa, (E) Sedum oryzifolium, (F) Lotus corniculatus var. japonicus, (G) Auricularia auricula-judae. 부가적으로 Auricularia auricula-judae 70% 에탄올추출액과 Phellinus gilvus과 Ganoderma lucidum 버섯추출액을이용하였다. 목이버섯의물과 70% 에탄올비교항암활성추출액은 Figure 3-2에나타내었다. - 97 -
FIGURE 3-2. Cytotoxic effects of water extract (AAW) and 70% ethanol extract (AAE) from A.auricula-judae, Phellinus gilvus (PGE) and Ganoderma lucidum (GLE) extracts (1 mg/ml) and doxorubicin (1 µg/ml) on P388D1 macrophage tumor cells. Mean values ±SD from triplicate separated experiments are shown. Different alphabets are differed significantly at P<0.05. Auricularia auricula-judae 70% 목이버섯 ethanol 추출액과 Phellinus gilvus 그리고 Ganoderma lucidum extracts은 4.5, 4.0 그리고 3.5 배더큰 Auricularia auricula-judae hot water extract보다더큰항암활성을보여주었다. Auricularia auricula-judae 70% ethanol, Phellinus gilvus 그리고 Ganoderma lucidum extracts의효능을차이점을보여주지않았다 (P<0.05). 용량 -의존적인항암활성은 plant extracts, Auricularia auricula-judae 70% ethanol extract를보여주어 IC50 values를계산하였다 (Figure 3-3). - 98 -
FIGURE 3-3. Dose-dependent antitumor effects of plants and mushroom extracts on P388D1 macrophage like cell line in vitro. A, B, C, D, E and F stand for Morus bombycis for. Kase, Draba nemorosa var. hebecarpa, Sedum oryzifolium, Lotus corniculatus var. japonicus, Auricularia auricula-judae extracts and doxorubicin respectively. Concentrations of samples are mg/ml. Mean values ± SD from triplicate separated experiments are shown and different alphabets in the same figure are differed significantly at P<0.05among different concentrations. Morus bombycis의 IC 50 values를구하였다. 그결과 Kase, Draba nemorosa var. hebecarpa, Sedum oryzifolium, Lotus corniculatus var. japonicas는 2.5, 2.0, 1.45 그리고 1.53 배가 Auricularia auricula-judae extracts의그것보다각각크다. 추출액의세포독성은용량-의존적으로유의성있게증가하였다 (P<0.05). 또한 A. auricula-judae 70% ethanol extract의 sarcoma 180, human NSCLC NCI H358 (bronchoalveolar) 그리고 SNU 1 (gastric carcinoma) cell lines에대하여독소루비신과비교하여시험관내에서항암활성을 Figure 3-4에나타내었다. - 99 -
FIGURE 3-4. Cytotoxic effects of 70% ethanol extract from A. auricula-judae on different tumor cells. Mean values ±SD from triplicate separated experiments are shown. * differ significant at P<0.05 on same tumor cell line among 70% AAE (1 mg/ml) and doxorubicin (1 µg/ml). 70% ethanol extract은세포주에따라서다양한항암활성을나타내었고큰차이는보이지않았다. 따라서목이버섯의추출액에는당당류외에항암성분이포함되어있는것을확인할수가있었다 (20). 전세계적으로암은남성및여성에서발생하는질병중죽음을일으키는질병이다. 오늘날은호르몬치료, 방사성치료및화학요법그리고외과적수술이암치료를하는방법들이다. 그러나이러한치료법이암을치료하는완전한방법들은아니다 (21). 그결과로써, 식물로부터항암물질을찾는연구는 1950년초부터시작되었다. 그리고알칼로이드를포함한항암제들이개발되었다. 이러한연구결과는많은임상적인항암물질이동정되었다. 이러한항암물에는 taxenes와 camptothecins를포함하여항암할성을보여주었다 (1). 목이버섯의항암활성은열수추출액과 70% 에탄올추출액사이에서상당하게다양했다. 열수추출액은에탄올및다른유기용매추출액과비교시항암활성이크지않았다. 하지만목이버섯의 70% 에탄올추출액은다른식물추출액보다더강력한항암활성을보여주었다. 한편 70% 에탄올추출액은 Phellinus gilvus, Ganoderma lucidum extracts 보다더강한항암활성을보여주었으나통계적인유의성은보여주지않았다 (P<0.05). Ganoderma lucidum 추출액은 human myeloid leukemia (HL-60) cells에서 44.8% 로세포성장을억제하였다. 그리고다른세포주에는 2.0% 에서 82.5% 까지시험관내에서세포성장을억제한다는보고가있었다 (22). 한편마른진흙버섯인 Phellinus gilvus는용량의존적으로 B16F10 melanoma cells 에서시험관및동물실험에서항암효과가보고되어있다 (23). 이것은추출동안에항암활성의성분의변환으로나타난것이추측되어진다. 70% ethanolic Auricularia auricula-judae extract에서수용성 β-glucan이항암효과가있다고보고되었다 - 100 -
(24). 그러나 alkali-insoluble β-glucan은항암활성이없는것으로알려졌으나변환된 β-glucan은강력한항암활성을보인다고알려졌다 (19). 목이버섯의경우열수추출물은 42.6% 까지고형암에서항암활성이있는것으로보고되었다 (25). 따라서본실험에서는 70% 에탄올추출액보다는용매에의해부분정제되거나순수분리정제되어질경우강력한항암활성을보일것으로추측되므로본연구에서는여러추출용매로분획추출을실시하여항암활성을비교하였다. Lotus corniculatus extract는 1차항암선별과정에서항암활성을보였다. 그이유는이버섯의추출액은 kaempferol과 quercetin이포함되어있기때문인것으로알려졌다 (26). Kaemferol은 apoptosis를 glioblastoma cells에서 oxidative stress를통해서일어나는것을보여주었다 (27). 하지만 quercetin은 NK cell-mediated lysis를암세포주에서보였고 connexin 43을증가하였다. 이단백질은암세포주의성장을억제하였다 (21, 28). Morus bombycis for. Kase는 in vitro 검사에서항암활성이보고되었다. Prenylated flavonoids, benzofurans 그리고다른 phenolic compound들은 Morus sp. 에서분리되었고 cytotoxic substances로 tumor growth을억제하였다. 이러한억제는 COX-1, COX-2, NO production 그리고 HIF1의 down-regulation에의해서일어나는것으로보고되었다 (29). Draba nemorosa var hebecarpa, Sedum oryzifolium, Robinia pseudo-accacia, Sciadopitys verticillata 그리고 Evodia daniellii에대한생리활성에관한보고가없는관계로본고에는더이상논의할수없었다. 결론적으로 Auricularia auricula-judae mushroom이항암활성이존재하는혹은 antitumor candidate로가능성이있는지를 100 Korean plant extracts와비교검토하였다. Auricularia auricula-judae, Phellinus gilvus 그리고 Ganoderma lucidum extracts의항암활성은비슷하였다. 국내자생식물의추출액과 Auricularia auricula-judae 70% ethanol extracts (IC50, 0.72 mg/ml) 과비교시 Morus bombycis for. Kase (IC50, 1.81 mg/ml), Draba nemorosa var hebecarpa (IC50, 1.49 mg/ml), Sedum oryzifolium (IC50, 1.05 mg/ml) 그리고 Lotus corniculatus var. japonicas (IC50, 1.10 mg/ml) 보다더강력한항암활성을보여주었다. 또한 Auricularia auricula-judae extract 은 65.71%, 69.76% 그리고 68.01% 의암세포성장억제를 sarcoma 180, NCI H358 그리고 SNU 1 cell에서보여주었다. 본연구의결과는 Auricularia auricula-judae extract 는새로은항암활성소재의가능성을보여주었다. 4. NCI H358 세포주와 SNU 1 세포주에서 A 항암활성및황산화작용측정 4-1. 70% 목이버섯추출액의당과단백질농도의측정 Brix 와 BCA 단백질측정법으로당과단백질을측정하였다. 70% 에탄올추출액은 당을함유하고있음을알았다. 당의함량은 74.12% 로나타났다. 하지만단백질은 - 101 -
4.17% 였다. 자실체는탄수화물과단백질이많이포함되어있고단백질에는라이신과루신이많이포함되어있는것으로알려져있다 (Fan et al., 2007). 열수목이버섯추출액에서는탄수화물이 42.5% 함유되어있는것으로알려져있다 (Chen et al., 2008). 이러한결과는 70% 에탄올추출액이열수추출물보다많은더많은탄수화물을추출되는것을보여주었다. 4-2. 목이버섯추출액의 NCI H358 세포주와 SNU 1 세포주에서항암활성비교시 험 70% 에탄올추출액에서분리된 EtOAc, BuOH, DCM, ETOH 그리고 water 분혹물에대한 bronchoalveolar (NCI H358) 그리고 gastric (SNU 1) tumor cell lines에서항암활성을측정한결과를 IC 50 values으로구하여 Figure 4-1과 4-2 에각각나타내었다. 대조약물은독소루비신을사용하였다. 유기용매별항암활성은농도-반응에따른황암활성을보였다 (P<0.05). 디클로르메탄층은가장높은항암활성을보였다. 수층은 NCI H358에서그리고 ethanol fraction은 SNU 1 세포주에서가장낮은항암활성을보였다. 용매추출별항암활성을비교시 DCM > BuOH > ETOH > EtOAc > Water 순으로 NCI H358 cells에서항암활성을보여주었다. 그리고 DCM > BuOH > EtOAc >Water > ETOH 순으로 SNU1 cells에서보여주었다. 이러한항암활성은한성분에의해서나타나는결과가아니라여러성분이여러기전에의해서나타나는것으로생각되었다. 4-3. 디클로르메탄분획물의 GC-MS 분석 Dichloromethane fraction은다른유기용매의분획물보다강력한항암활성을보여주었다. 따라서이디클로르메탄분획물에대하여성분분석을 GC-MS로분석하였다. 그결과를 Table 4-2에나타내었다. 분석결과주요성분은 5, 11, 17, 23-tetrakis (1,1-dimethyl)-28-methoxypentacyclo (65.84%) 그리고 diazane (6.17%) 이었다. 이때 retention time은 42.54 min과 1.47 min으로각각보여주었다. 이들성분가운데 diazane 그리고 gibberellic acid는 antitumor active를갖는것으로보고되어있다 (Chen et al., 2009 Emanuel et al., 1976). 하지만 2,4-di-tert-butylphenol 그리고 n-hentriacontane는 antioxidant properties를갖고있는것으로알려져있다 (Olubunmi et al., 2010; Yoon et al., 2006). 목이버섯의디클로르메탄층에서이러한성분의보고는처음으로밝혔다. 본연구에서는 DCM fraction, diazane 그리고 gibberellic acid 에대하여항암 - 102 -
활성을비교하였다. 그결과를 Table 4-3에나타내었다. Diazane, gibberellicr, 그리고디클로르메탄층의 IC50 values를비교하였을경우, dichloromethane fraction이가장좋은항암활성을보였다. 특히 gibberellic acid가이들중에서 human tumor cell lines에대해서가장낮은항암활성을보였다. 이러한결과는디클로르메탄층에다른항암활성성분이포함되어있다는것을의미한다. Diazane는 S-phase를 cell division에서억제하는것으로알려졌고 DNA synthesizing cells를감소시킨다. 그리고 DNA synthesis은 30-50% 감소하는것으로보고되어있다 (Goncharovaet al., 1980; Shamaev et al., 1981). 그리고 diazane은암세포의성장을억제하고백혈병을갖고있는동물의수명을증가시키는것으로알려져있다 (Emanuel et al., 1976). Gibberellic acid는 human cancer cell lines에서강한항암활성을보였고이것들의 IC 50 values은 0.13 μg/ml에서 100 μg/ml으로보고되어있다 (Chen et al., 2009; Zhang et al., 2012 ). Diazane 그리고 gibberellic acid는 DCM fraction과비교되었다. 그러나 DCM 분획층이가장강한항암효과를보인다는것을보고하였다 (Reza et al., 2011). 에틸아세테이트층과에탄올층은 NCI H358 cell lines에서더강한항암활성을보였다. Paecilomyces japonica 에탄올층은 cell cycle progression을 G1-arrest를통해서억제하여 phosphorylation을차단하는결과로나타난다. 그리고 ethyl acetate extract는 apoptosis를 mitochondria-dependent apoptotic signaling pathway를나타나게한다 (Song et al., 2007). Livistona chinensis R.Br의에틸아세테이트층은강력한항암활성을갖고있다. 그리고항암기전은 VEGF protein secretion를억제하고 Flk-1 mrna 그리고 protein 발현을억제한다 (Wang et al., 2008). IC 50 values에으의하면 doxorubicin이 SNU1 cell 그리고 NCI H358 cell lines에서항암활성을보였다. 이러한항암활성은목이버섯분획층보다높은활성이었다. 그러나이러한강한항암활성에도불구하고독성이높아임상에오랫동안사용하면부작용이나타난다 (Kluza et al., 2004). 특히, Gibberellic acid는 apoptosis를유도할것으로추측된다. 그이유는 α, β-unsaturated ketone units 가 gibberellic acids의 A-ring 그리고 D-ring이 topoisomerase-i activity 억제하여 apoptosis를유도하는것으로알려져있다 (Chen et al., 2009). 위의결과로부터 gibberellic acid가포함되어있는디클로르메탄분획층은 apoptosis를유도할것이다는가설이가능하다. 본연구에서는이에대한연구를추가로실시하였다. 4-4. 항암원성유전자의 mrna 발현 Apoptosis는 Bcl-2, P53, Bax 그리고 CD147 genes의 mrna를측정하는데이들유전자들은 apoptosis의조절에서중요한역할을한다. 분자혹은생화학적인기전을이해하기위하여, DCM 층에대해서 NCI H358 그리고 SNU 1 cells에서 - 103 -
apoptosis를구명하였다. 이를위해우리는 Bax와 Bcl-2 유전자의발현을 RT-PCR로측정을하였다. DCM 층은시험한세포주모두에서 Bcl-2의 down-regulation을보였다. 특히 CD147 expression이 butanol 층과 water 층처리후에 SNU1 cell에서보여주었다 (Fig. 4-4A, B). 암세포주의증식은 P53의과발현에의해서 SNU 1 세포주 (Figure 4A, B) 그리고 NCI H358 세포주 (Figure 3A, B) 에서억제되었다. 하지만 Bax의과발현이 doxorubicin, EtOH, DCM, BuOH 그리고 water fractions으로 NCI H358 cell line에처리시억제되었다 (Figure 3A, B). 이러한결과는수용성 β-d-glucan이목이버섯의 70% ethanol extract에서 Sarcoma-180 tumor cell의 Bax의 up-regulation과 Bcl-2의 down-regulation (Ma et al., 2010) 에의한 apoptosis라는것과일치는결과였다. P53는 apoptosis를 growth arrest에의해서나타난다. 아것은 cell cycle progress의억제가 cyclin-dependent kinase와 G1 arrest의비활성화때문이다. Apoptosis는또한 p53이과발현에의해서도일어난다 (Polyak et al., 1996). P53는 KILLER/DR5 expression 그리고 degradationof FLICE-inhibitor protein (FLIP) 의증가에의해서시초될수있다. 이두단백질은 apoptotic signaling을유도한다 (Fukazawa et al., 2001). Bcl-2의감소는 apoptosis를발생시킨다. 이러한발생은 caspase를활성하는 cytochrome c의위치이동과방출에기인한다. 그래서 apoptotic process가시작한다 (Kluck et al., 1997). 4-5. Antioxidant activity Dichloromethane (DCM) fraction의항산화활성은상기한 DPPH assay로실시를하였다. Figure 4-5에서보여주는것처럼, DCM fraction이가장강한항산화활성을보여주었다. 자유라디칼의소거능이 10.02% 에서 73.31% 까지 0.1에서 10 mg/ml에서보여주었다. DCM fraction의 IC50은 31.75 g/ml 그리고 antioxidant activity index (AAI) 는 1.24를보여주었다. 버섯에서 antioxidant activity index는전에보고된것과유사하였다 (Ruch et al., 1984). 목이버섯에서도다당류가 DPPH radical-scavenging activity가매우높다는것을보여주었다 (Fan et al., 2007). 그리고분리정제된목이버섯의수용성다당류가강력한항산화활성을보유하고있다는것을보고되었다 (Zhang et al., 2011). 결론적으로항암작용에서모든유기용매층은농도-의존적인활성을보여주었다. 5,11,17,23-tetrakis (1,1-dimethyl)-28-methoxypentacyclo [19.3.1.1 (3,7).1 (65.85%) 과 diazane (6.17%) 의항암활성은크지않았으나 apoptosis을유도하는것으로나타났다. 모든유기용매중에서디클로르메탄층이가장큰항암활성을보였다. Diazane과 gibberellic acid는 Bcl-2를억제하고 P53활성을증가시켰다. 또한디클로르메탄층은높은항산화활성을보였다. - 104 -
Table 4-2. GC-MS analysis of dichloromethane fraction from 70% ethanol extract of A. auricula-judae. Compounds Retention time (min.) Area (%) Functions References Diazane 1.47 6.17 Antitumor Emanuel et al, 1976 2-Mercaptobenzoic acid 2,4-Di-tert-butylphen ol n-hentriacontane 9.0 2.47 Preservatives of vaccine, immunoglobulins and ophthalmic Gonçalo, et al., 1992; solution and analgesic, Fadeyi et al., 2004 antipyretic, anti-inflammatory and cytotoxic 14.88 3.29 Antioxidant Yoon et al., 2006 Diuretics, anti-inflammatory, Rizvi et al., 1985 28.78 2.47 Antioxidant and probably Olubunmi et al., 2010. antitumor n-hexacosane 29.88 2.88 Unknown ----- hydroxyindoline 30.87 2.47 Unknown ----- N-ethoxycarbonyl-3- n-heptacosane 30.95 3.29 Unknown ----- Gibberellin A3 31.74 1.65 Strong antitumor of its Chen et al., 2009; Zhang derivatives et al., 2012 n-eicosane 31.97 2.47 Antiseptic and antimicrobial Härtner et al., 2009 activities of n-eicosane derivatives 5-Acetamido-4,7-diox o-4,7-dihydrobenzofu razan 32.96 1.24 Unknown ----- S i l a n e, 1, 4 - p h e n y l e n e b i s 35.82 2.88 Unknown ----- [trimethy- Floridanine 38.94 2.88 spasmolytic and hypotensive properties Litvinchuk et al., 1979 5,11,17,23-tetrakis (1,1-dimethyl)-28-me thoxypentacyclo/sodi um ionophore X 42.54 65.84 Na + measurement in blood Jayakannan et al., 2011-105 -
Table 4-3. IC50 values of diazane and gibberellic acid on human tumor cell lines. Cell lines IC 50 values (g/ml) Diazane gibberellic acid NCI H358 117.8 812.3 SNU1 85.2 1065.0 Data are presented as IC50values by MTT assay from three independent experiments, performed in triplicate on tumor cell lines, obtained by nonlinear regression using the GRAPHPAD Prism program. Figure 1. Percentages of inhibition by solvent fractions of 70% ethanolic Auricularia auricula-judae extract and doxorubicin was used as a positive control on NCI H358 cell line by MTT assay. All values are presented as percentages of the results from control, and are expressed as mean ± standard deviation (SD) of three independent (triplicate wells) experiments, different letters are significantly different within various concentrations at P<0.05 and showedthe dose-dependent decreasing manner of anti-tumor activity. - 106 -
Figure 2. Percentages of inhibition by solvent fractions of 70% ethanolic Auricularia auricula-judae extract and doxorubicin was used as a positive control on SNU1 cell line by MTT assay. All values are presented as percentages of the results from control, and are expressed as mean ± standard deviation (SD) of three independent (triplicate wells) experiments, different letters are significantly different within various concentrations at P<0.05 and showedthe dose-dependent decreasing manner of anti-tumor activity. - 107 -
Figure 3. mrna expression of Bcl-2, Bax, P53 and CD147 in NCI H358 cells with different solvent fractions of 70% ethanol extract from Auricularia auricula-judae, gibberellic acid and diazane (1 mg/ml). (A) Electrophoresis of PCR products in an agarosegel (2.0%). (B) The mrna foldsinduction of Bcl-2, Bax, P53 and CD147 in NCI H358 to β-actin mrna levels. Values are mean ± SD of three independent experiments. *is expressed as significant different that compared to control (PBS) at P<0.05. 1. Control (PBS), 2. doxorubicin (dox), 3. ethanol fraction (EtOH), 4. dichloromethane fraction (DCM), 5. ethyl acetate fraction (EtOAc), 6. butanol fraction (BuOH), 7. water fraction, 8. gibberellic acid (G) and 9. Diazane (D) respectively. - 108 -
Figure 4. mrna expression of Bcl-2, Bax, P53 and CD147 in SNU1 cells with different solvent fractions of 70% ethanol extract from Auricularia auricula-judae, gibberellic acid and diazane (1 mg/ml). (A) Electrophoresis of PCR products in an agarose gel (2.0%). (B) The mrna folds induction of Bcl-2, Bax, P53 and CD147 in SNU1 to β-actin mrna levels. Values are mean of three independent experiments ± SD. *is expressed as significant different that compared to control (PBS) at P<0.05. 1. Control (PBS), 2. doxorubicin (dox), 3. ethanol fraction (EtOH),4. dichloromethane fraction (DCM), 5. ethyl acetate fraction (EtOAc), 6. butanol fraction (BuOH), 7. water fraction, 8. gibberellic acid (G), and 9. Diazane (D) respectively. - 109 -
Figure 5. DPPH free radical scavenging activity of dichloromethane fraction from Auricularia auricula-judae 70% ethanol extract was spectrophotometrically measured at 517 nm using DPPH assay. All values are presented as inhibition percentages of the results from control, and are expressed as mean ± standard deviation (SD) of three independent (triplicate wells) experiments, different letters are significantly different within various concentrations at P<0.05 and showed the dose-dependent decreasing manner of anti-tumor activity. 2-5. 목이버섯추출별미백효능비교시험 목이버섯추출물에대한다양한다기능성바이오소재의개발일환으로연구계획서에준하여미백효능시험을실시하였다. 1차년도시험의결과에따라서물리화학적특성이다른두개의분획구인 dichloromethane 분획층과 water 분획층을추출시간에따라비교하여실시하였다. - 110 -
Fig 10. Tyrosinase inhibitory activity (%) of water(we) and dicrloromethane extact(de). Fig 10에서보여주는것처럼추출시간에따른타이로신생성억제율 (%) 시험에서추출 6시간에는 water 분획층그리고추출 20시간에는 dichloromethane 분획층이타이로신생성억제율이높음을확인할수있었다. 이러한결과로특성이독특한목이버섯의추출액은화장품의기능성소재에응용이가능하다는것을확인할수있었다. 3차년도에는원안의계획서에는없었지만추가적인실험을보완하여다기능성바이오소재확보차원에서주관기관과상의하여추가적인연구를추진하고자한다. 2-7. 단회경구투여독성시험 치사율및임상증상 : 여러농도의 Auricularia auricula-judae ethanol extract 를랫트에경구투여시모든시험군에서 14일동안 Auricularia auricula-judae ethanol extract 투여로사망한랫트는관찰되지않았다 (Table 1). 시험물질에의한독성증상과특이적임상소견도나타나지않았다 (Table 2). 위의결과를통해, Auricularia auricula-judae ethanol extract를랫트에단회경구투여하였을때 LD50값은암컷과수컷모두에서 5,000 mg/kg 이상임을알수있었다. 그러나체중은 Auricularia auricula-judae ethanol extract의용량이증가할수록대조군에비하여감소하는경향을보였다. - 111 -
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체중변화및체온변화 : 시험기간동안체중의변화를관찰한결과, 모든시험군의체중이정상적으로증가하였다 (Table 3). 체온변화에서도대조군과시험군에서유의적인이상체온은나타나지않았으며, 시험군간의유의적인이상체온도없었다 (Table 4). - 114 -
사료섭취량및음수량변화 : 0, 625, 1,250, 2,500, 5,000 mg/kg의 Auricularia auricula-judae ethanol extract를랫트에경구투여한후, 투여일로부터시험기간인 14일동안매일사료량및음수량의변화를관찰한결과, 모든시험군의암, 수동물에서정상적인사료섭취량과음수량을보였다. 또한, 대조군과비교시유의성있는섭취변화는관찰되지않았으며, Auricularia auricula-judae ethanol extract의농도에따른유의적인차이가발견되지않았다. 부검및장기무게는 14일동안의시험기간종료후, 내부장기에대하여육안적병변을관찰한결과이상소견이발견되지않았다. 또한, 간, 신장, 비장의무게를관찰한결과, 유의적인변화가관찰되지않았다 (Table 5, Table 6). 2-8. 3T3-L1 세포주에서지질저하제에대한효능검정 질환모델동물을이용한당뇨및지질저하제에대한효능검정에앞서, 전지방 세포를이용하여각각의목이버섯추출물에대한스크리닝을실시하였다. 그림 8-1에서보는것처럼전지방세포가지방세포로분화되는과정을 0.6% Oil Red O solution을이용하여염색한사진이다. 대조군은전지방세포에서지방세포로변화하는분화유도물질을처리한군으로붉은색으로염색된데비하여, 분화유도물질이없는 fibroblast의경우거의염색이되지않은것을확인할수있었다. 마우스유래섬유아세포인 3T3-L1 세포주 (KCLB No. 10092.1) 에서 GPDH 활성을측정해본결과, 분화된대조군과비교시분화되지않은 fibroblast 및 anti-lipidemic drug인 fenofibrate, 목이버섯에탄올과물추출물을처리하였을때유의적으로감소한다는것을알수있었다. Fenofibrate는 0.1-10 μg/ml, 목이버섯에탄올및물추출물은 3-300 μg/ml로농도의존적인 GPDH 활성의감소를보여비슷한수준의 GPDH 활성감소를보였다. 3T3-L1 세포에목이버섯에 - 115 -
탄올추출물과물추출물을처리하였을때, 농도-의존적으로 triglyceride의축적되는양이감소한다는것을알수있었다. 특히목이버섯물추출물 300 mg/ml 농도에서약 55% 의 triglyceride의축적양이감소하였으며, 이는 Fenofibrate 10 μ g/ml 농도에서의 triglyceride의축적양감소와유사하였다. - 116 -
그림 8-1. Effects of 70% ethanol extract from Auricularia auricula-judae (Ethanol/EtOH) and its dichloromethane extract(dcm) on the differentiation and adipogenesis of 3T3-L1 cells. Cells (differentiation and induction medium) treated with 0.1% DMSO was used as controls, while cells (without differentiation and induction medium) treated with 0.1% DMSO was used as fibroblast. (a) On day 8, intracellular lipids were stained with Oil Red O at 10 g/ml (fenofibrate) and 300 g/ml (DCM and ethanol). (b) Synthesis of triglyceride (TG) in differentiated 3T3-L1 cells. (c) Release of glycerol in differentiated 3T3-L1 cells. (d) GPDH activity in differentiated 3T3-L1 cells. F. Fenofibrate at 10, 1 and 0.1 g/ml, DCM. Dichloromethane extract at 300, 30 and 3 g/ml, E. Ethanol extract of Auriculariaauricula-judae at 300, 30 and 3g/ml. All values are expressed as mean±sd of three independent experiments and the different alphabet differ significantly at P<0.05 by ANOVA. 2-8. 질환모델동물을이용한지질저하효과에대한효능검정 2차년도당뇨유발뒤에지질저하능력의효과를측정하여그가능성을보였다. 그러나당뇨유발뒤에나타나는복잡한양상의실험으로정확한지질감소효과에대한결과를알기어렵기때문에고지질사료를투여한후목이버섯의효과를관찰하였다. 그결과다음과같다. - 117 -
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70% 목이버섯추출액 (AAE) 을 8 주동안마우스에투여한결과 1% AAE 투여를하 였을때항지질효과를확실하게보여주었다. - 119 -
2-9. 목이버섯추출액의발효전과후의항함및항혈전활성의비교시험 목이버섯의활용가능성을증대하기위한일환으로연구계획에따라서목이버섯추출액무첨가 (0%), 1% 그리고 3% 을첨가한후에홍국균 3% 접종하여 48시간배양하였다. 그결과목이버섯추출액의무첨가와첨가한후의발효전과발효후의차이점으로항암작용과항혈전작용의증가를보여주었다. 그러나 NO의생성은변화를보이지않았다. 5. 목이버섯의추출액의발효물에대한식품소재화 1. 생리활성물질분석목이버섯함량에따른된장을제조하여, 목이버섯된장의점조도및생리활성물질을분석한결과는아래와같다. 전체적으로모든구간에서생리활성물질이생성되는것으로나타났으며 표 1, 특히목이버섯분말을 1.0% 첨가한된장의점조도값이가장높았고, 혈전용해효소활성도 33.54% 로높게나타났다 그림 1. 또한타이로신및프로테아제활성도목이버섯분말을 1.0% 첨가했을때, 각각 115.47, 85.31 mg% 로다른구간 - 120 -
에비해높은값을나타내었다. 이는목이버섯에함유되어있는점질성다당류및다양한기능성성분으로인해된장이발효됨에따라더많은효소가생성되고, 기능성물질이증가하는것으로사료된다. 반면, 목이버섯분말을 2.0% 첨가하였을때는목이버섯분말을 1.0% 첨가하였을때보다, 타이로신함량만높았을뿐, 다른활성들은목이버섯을 1.0% 첨가한것보다낮은것으로나타났다. 목이버섯된장을 1.5% 이상첨가하면된장의색이아주검게변하여기호도가낮아질우려가있어, 목이버섯된장제조에있어목이버섯을 1.0% 수준으로첨가하는것이경제적, 영양학적측면및기호도면에서가장좋은것으로판단하였다. 타이로신함량에서 1.0% 수준에서 115.47% 와 1.5% 수준에서 89.27% 는시험측정치에서편차가심하여유의성이없게나왔다. 1차년도에서는제조중심의상품화에초첨을두어연구가진행이되었으나, 2차년도에서는분석중심과버섯사용의증가에초점을맞추어진행을연구를진행하고자한다. 타이로신함량에대한편차및발효에대한일반식품성분분석을 2차년도에집중연구하고자함. 표 1 목이버섯분말함량에따른된장의분석결과 목이버섯분말함량 점조도 혈전용해효소 타이로신함량 프로테아제활성 (%) (Pa s n ) (%) (mg%) (unit/g) 대조군 0.56 26.99 78.67 13.05 0.5 0.32 29.82 73.93 8.11 1.0 0.57 33.54 115.47 185.31 1.5 0.27 31.09 89.27 15.96 2.0 0.35 27.27 185.13 22.29-121 -
2. 관능평가 그림 1 목이버섯첨가량에따른혈전용해능변화 상표등록출원목이버섯분말의함량에따른된장의관능특성을평가한결과는 표 2 와같다. 목이버섯분말의첨가량이증가함에따라목이버섯의고유한검은빛깔로인해된장의색이점점진하게 ( 검게 ) 보이는것으로나타났다. 단맛, 짠맛, 쓴맛의경우, 패널들은목이버섯분말을첨가한된장이단맛, 짠맛, 쓴맛이각각덜한것으로평가하였다. 반면에, 구수한맛은목이버섯분말의첨가량이증가할수록강한것으로평가되었다. 전체적으로목이버섯분말첨가에따른된장의맛의변화는크지않았으나, 1.0% 의목이버섯분말을첨가하였을때전반적인기호도가가장높게나타났다. 이에최종상품화한목이버섯된장의목이버섯분말함량은 1.0% 로하였다. - 122 -
표 2 목이버섯분말함량에따른된장의관능평가 3-1. 당도목이버섯이첨가되지않은된장에서여과전당도는 6.03, 여과후당도는 6.07이고목이첨가된장의여과액의당도는 6.20보다는값이낮지만값의차이는크지않게나타났다. - 123 -
3-2. ph 그림에서보는바와같이추출한값이목이버섯무첨가된장 ( 된장 X) 는 6.07, 목이버섯첨가된장 ( 된장 O) 는 6.06이고, 목이버섯무첨가된장의여과액값은 6.10, 목이버섯첨가된장은 6.08로 ph 값의차이는거의없었지만추출값이여과값보다는낮게나타났다. 3-3. 색도명도 L값은된장 X는 -6.63, 된장 O는 -6.64로조금어둡게나타났고, 적색도인 a값은된장 X는 1.35, 된장O는 1.16, 황색도 b값은된장 X는 -0.62, 된장 O는 -0.68로된장 X와 O 사이의값차이는서로비슷한값은나타냈다. - 124 -
3-4. 갈색도 갈색도는 filter 한것만사용하여 420 nm 에서측정하였다. 그결과된장 X 는 1.04, 된장 O 는 1.28 로목이첨가된장시료에서갈색도가더높게나타났다. 5. Total polyphenol contents 20 mg/ml의된장시료를사용하여 total polyphenol contents 를측정하였다. 그결과, 된장 X의여과는 5.7mg/g, filter는 5.6mg/g였고, 된장 O의경우여과는 5.8mg/g, filter는 5.7mg/g로나타났다. 된장 X가된장 O에비해 polyphenol값이낮게나타났지만목이버섯첨가유무에따른 total polyphenol contects 의유의적차이는나타나지않았다. 6. DPPH 20 mg/ml 의된장시료를사용하여 DPPH 법을이용한항산화능을측정한결과, EDA 값은된장 X 여과는 9.28%, filter 는 8.34% 였고, 된장 O 의경우여과는 - 125 -
11.95%, filter 는 7.61% 로나타났다. 하지만목이버섯첨가유무에따른항산화능 은유의적차이를나타내지못하였다. 7. 항암활성시험 목이버섯첨가후된장에서항암활성의변화를 4 가자암세포주에서항암활성을비 교하였다. 7-1) MTT test 1 신장암신장암세포 (A-498 cell) 에서세포증식변화율은된장 X는 2 mg/ml까지증가하다가점차감소하였고, 된장 O의경우는 0.2 mg/ml에서감소하다가 2 mg/ml에서다시증가, 그리고 20mg/ml부터다시감소하기시작하였다. 2 자궁암자궁암세포주 (Hela cell) 의경우, 된장 O는감소하다가 2 mg/ml에서세포증식율이증가, 다시점차감소하였고, 된장 X는저농도에서고농도로갈수록감소하는것을알수있다. - 126 -
3 위암위암세포주 (SNU 719 cell) 은된장 X는 20mg/ml까지점점감소하다가 200mg/ml에서급격히세포증식율이떨어졌고, 된장 O는 20 mg/ml까지는증식률에변화가거의없었다가 200mg/ml에서된장 X와마찬가지로증식률이급격히감소하였다. 4 대장암대장암세포 (SW480 cell) 의경우, 된장 X, O 둘모두저농도에서부터감소하다가 2mg/ml에서잠시증가하다다시증식률이감소하였고, 200 mg/ml에서는급격히감소하였다. - 127 -
7-2) SRB test 1 신장암 SRB 측정결과신장암에서는된장 X, O 둘모두 0.2mg/ml까지증가하다가 2mg/ml에서감소, 20mg/ml에서다시증가하다가 200mg/ml에서다시감소하는경향을보였으나, 된장 X가 O보다세포증식변화율이높았다. 2 자궁암자궁암의경우에는된장 X는 20 mg/ml까지는세포증식율이증가하다가 200 mg/ml에서감소하였고, 된장 O는저농도에서고농도로갈수록증식률이감소하였지만값이차이는크지않았다. 3 위암 위암에서는된장 X, O 둘모두 0.2mg/ml 까지세포증식률이증가하다가점차감소하는 경향을보였다. - 128 -
4 대장암 대장암은된장 X, O 모두저농도에서고농도로갈수록증식률이감소하였다. 최종적으로신장암세포에대한항암효능결과, MTT test에서 200 mg/ml의두된장시료를첨가한결과세포독성을나타냈으며, 두시료간에유의적차이는보이지않았다. SRB test에서의세포증식억제능은확인되지않았다. 자궁암세포에대한항암효능결과 MTT test에서 20 mg/ml의두된장시료를첨가한결과세포독성을나타냈으며, 200 mg/ml 농도시료처리시목이버섯이첨가되어진된장시료가더높은세포독성을나타내었다. SRB test에서도 200 mg/ml 시료처리목이버섯첨가되어진된장시료에서세포증식억제능을나타냈다. 위암세포에대한항암효능결과 MTT test에서 20 mg/ml 농도에서목이버섯을첨가하지않은된장에서세포독성을나타냈으며 200 mg/ml 농도에서는두된장시료모두세포독성을나타내었으며목이버섯을첨가하지않은된장에서좀더높은세포독성을나타냈다. SRB test에서는 200 mg/ml 농도에서두된장시료모두세포증식억제능이확인되었으며목이버섯첨가된장에서좀더높은증식억제능을보였다. 대장암세포에대한항암효능결과 MTT test에서 20 mg/ml 농도에서목이버섯을첨가하지않은된장에서세포독성을나타냈으며, 200 mg/ml 농도에서는두된장시료모두세포독성을나타내었으나유의적차이는나타나지않았다. SRB test에서는두시료모두 200 mg/ml 농도에서세포증식억제능을나타냈으며목이버섯첨가된장에서좀더높은증식억제능을보였다. 결론적으로이번시험의결과발효된장자체가항암활성이있음이확인되었으 - 129 -
며, 특히중요한관찰로목이버섯첨가는항암활성에변화를줄수있는데이러한 효과를갖기위해서는 3% 의목이버섯첨가수준에서 10% 까지의수준으로높이고, 한편목이버섯추출액에대한소재의첨가또한고려를하여야한다. - 130 -
8. 항염증시험 목이버섯첨가유무에따른시제품의된장에서항염증효능차이는유의적결과 를나타내지못하였다. - 131 -
9. 저장성시험 보존성실험을통해본연의맛과상품적가치가유지되는유통기한을설정하기위 한가속성시험 1) 실험방법 a. 시료 : 표준제품으로시험생산된제품 b. 실험기간 : 2010년 04월 02일 ~ 2011년 02월 01일 (10개월) c. 장소 : 전진바이오팜 ( 주 ) 부설연구소실험실 d. 검사방법시료를실험실진열대의실온 (25~26 ) 과항온기 (35, 40 ) 에각각보관후 30일경과시아래의관능검사와미생물항목을점검하였다. ( 항온기실험은미생물의최적생육조건을맞추어미생물발생최소기간을알기위함 ) e. 평가항목관능적항목 ( 성상, 이미, 이취, 이물 ) 미생물학적항목 ( 바실러스균, 세균수 ) 이화학적항목 ( 수분 ) 2) 실험결과 실험결과 10 개월이상경과하여도관능적인부분이나이화학적, 미생물학적항 - 132 -
목에서제품본연의맛과상품적가치가변화가없으므로유통기한을 16 개월으로 설정하였다. 항목 관능적항목미생물학적항목이화학적항목 경과일 성상 이미 이취 이물 바실러스군 세균수 수분 한도규격 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 100이하 /m l 10.0 % 이하 1개월 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 0 적합 2개월 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 0 적합 3개월 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 0 적합 4개월 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 0 적합 5개월 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 0 적합 6개월 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 0 적합 7개월 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 0 적합 8개월 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 0 적합 9개월 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 0 적합 10개월 10.0 10.0 10.0 불검출 불검출 0 적합 10. 제품에대한일반성분검사, 대장균, 바실러스세레우스균검사 제품을공인성적검사기관인계명대학교전통미생물자원연구소에의뢰한결과 는다음과같이대장균류 (g 당 20,000 이하기준 / 장류기준 ) 에대한판정은음성으 로적합하며일반성분검사에대한결과는다음과같다 - 133 -
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11. 관능검사 패널요원은 20 명이상으로하여가장좋거나강한것은 5 점, 약하거나싫은것 은 1 점으로하여 5 점척도법으로설문지를작성하여결과를평가분석한결과는 다음과같다. - 135 -
2. 목이버섯된장의제품제작 (900g) 완제품된장사진 < 국내산목이된장의디자인패키지작업 > 라벨 포장박스 - 136 -
1. 물성및이화학적특성분석 가. 물성분석 1) 수분, 입도, 색도 시제품의수분을측정한결과 5.38% 였고, 입도는 137.5um로써결과되어졌다. 수분함량 5-3% 범위의식품은미생물생육이저해될수있으며건조분말형식품규격은수분함량이 5% 이하로결과되어진시제품의수분함량은이를만족시킬수있는결과다. 또한 137 um의입도는개발되어진본시제품의높은용해성을수치적으로나타냈다. 또한색도를측정한결과, 청국장분말시제품의명도 L 값은 63.19였으며, 적색도인 a값은 4.83, 황색도 b값은 28.73으로제품의가시적특성을측정되어졌다.(Table 2.) Table 2. 분말청국장의수분, 입도, 색도 수분 (%) 입도 (um) 색도 L a b 1 5.92 146.2 63.09 4.85 28.78 2 5.13 136.7 63.26 4.79 28.39 3 5.10 129.6 63.23 4.85 29.02 Average 5.38 137.5 63.19 4.83 28.73 STD 0.47 8.33 0.10 0.04 0.32-137 -
2) 붕해도 국가공인식품시험분석전문기관인계명대학교전통미생물자원개발및산업화연 구센터에붕해도를의뢰한결과, 식품으로이용하기에적합하다고확인되었다. Fig. 4. 분말청국장시제품의붕해도 - 138 -
나. 이화화적효능평가법에따른생리활성물질함량분석 1) Total polyphenol 과 Total flavonoid 함량분석 식품내존재하며항산화, 항염증, 항암등의유익성을나타내며인체유용한기능성지표성분으로서총칭되는 total polyphenol 및 total flavonoid 함량을이화학적평가방법으로정량하였다. Tannic acid를지표물질로사용하여준비되어진시료의 Total polyphenol 함량측정결과, 15.68mg/g로써정량되었다. 또한 Catechin을지표물질로사용하여준비되어진시료의 Total flavonoid 함량측정결과, 0.22mg/g 로써정량되었다. Total polyphenol 함량중 Total flavonoid가차지하는함량은약 1.4% 로확인되어졌다. Table 3. 분말청국장의 total polyphenol 와 total flavonoid contents Total polyphenol contents Total flavonoid contents 기능성성분함량 (mg/g) 15.68±0.04 0.22±0.15 2) 전자공여능, 아질산염소거기능, Superoxide anion radical 소거능 시제품의식품으로써유익한항산화활성을측정하고자 DPPH법에의하여전자공여능 (EDA,%) 을 50mg/ml 농도의시료를사용하여확인하였다. 그결과 50mg/ml에서대조군에대비하여확인된항산화능은 61.96% 로써이는지표물질로써사용되어진 L-ascorbic acid의 322.45uM 농도의효능에해당되는것을확인하였다. Superoxide anion radical 소거능을통해세포에유해한활성산소로부터생체를보호하는항산화능을나타내는지알아보고자 Nitroblue tetrazolium(nbt) 환원방법을이용하여조사하였다. 50mg/ml 농도의시료를사용하여대조군과대비확인한결과, 33.92% 활성을나타내는것을확인하였다. 식품의가공및저장등에첨가제로사용되어독소생성억제와산패방지제등으로 - 139 -
이용되거나식품내의상재성분으로인체에유해적인아질산염에대한시제품의아질산염소거능을 50mg/ml 농도의시료를사용하여확인하였다. 대조군과대비하여 ph 1.2, 3.0, 4.2 및 6.0에서반응시켜확인한결과, ph 1.2에서 72.73%, ph 3.0에서 57.91%, ph 4.2에서 24.93%, ph 6.0에서 2.09% 로나타났다. 시험되어진 4개의 ph 구간에서의시제품의아질산염소거능은반응 ph 조건에따라서차이가나타났으며낮은 ph 일수록아질산염소거활성이높은것을확인하였고 ph 6.0에서는활성이거의없는것을알수있다. 인체의위액과조건이비슷한 ph 1.2-3.0에서상대적으로활성이높은것으로보아시제품의유익한아질산염소거능을확인할수있었다. Table 4. 분말청국장의전자공여능, Superoxide anion radical 소거능, 아질산염소거능 Tested function Value(% in 50mg/ml ) 전자공여능 (EDA) 61.96±0.51 Superoxide anion radical 소거능 33.92±1.15 ph 1.2 72.73±2.31 아질산염소거능 ph 3.0 57.91±3.54 ph 4.2 24.93±2.23 ph 6.0 2.09±2.45 : L-ascorbic acid 322.45 um 농도에상응된효능 - 140 -
2. 시제품의항암 in vitro 효능평가 가. MTT assay 에의한항암 in vitro 효능평가 시제품의항암효능평가를위하여사용되어진세포주는신장암, 자궁암, 위암, 대장암, 간암총 5종류의암세포주를사용하였다. 먼저 MTT assay를통해생존이유지되어진세포의미토콘드리아를염색함으로써각암세포주에대한시제품의세포독성및생존저해능을평가하여시제품의함암능을확인하고자하였으며 Table 5. 와같은시료농도조건에서그결과를확인하였다. 신장암 (A-498), 자궁암 (Hela), 대장암 (SW 480) 세포주를대상으로실험한결과, 처리되어진시료에농도의존적인세포독성을나타내어 cell viability가감소하는것을볼수있었으며위암세포주 (SNU 719) 는시험되어진농도처리조건에의존적인세포독성을나타내진않았다. 시료 10mg/ml 농도처리조건을기준으로각세포주의세포독성을비교해보았을때대장암 > 위암 > 자궁암 > 신장암순으로의높은세포독성을결과하였다. 신장암, 자궁암, 위암세포주를대상으로시험시2-10mg/ml 농도에서 IC 50 에해당되는결과가예상되어졌으며특히대장암세포주는약 2mg/ml 시료농도로 IC 50 을나타낼수있었다. 간암세포주 (Hep3B) 에서는시제품의세포생존저해능이확인되지않았다.(Table 4, Fig. 5) - 141 -
Table 5. MTT assay 에의한시제품의 5 종암세포주에대한함암효능평가 MTT assy Tested cell (target cancer) A-498 () Final concentration of treatd samples (mg/ml) 0.002 0.02 0.2 2 10 84.49 ±6.86 81.46 ±3.18 71.43 ±10.81 67.04 ±6.29 34.71 ±1.36 cell viability (%) Hela () SNU 719 ( ) SW 480 () 84.61 ±18.51 93.44 ±3.21 77.42 ±0.56 94.72 ±6.91 99.87 ±1.85 74.39 ±5.37 66.57 ±3.94 86.61 ±6.52 65.81 ±3.32 60.99 ±8.74 87.10 ±7.94 55.44 ±2.69 19.48 ±0.34 17.39 ±1.91 13.59 ±0.38 Hep3B ( ) 126.69 ±2.66 113.65 ±3.40 109.04 ±0.35 116.85 ±1.33 102.53 ±1.43-142 -
Fig. 5. MTT assay 에의한시제품의 5 종암세포주에대한함암효능평가 - 143 -
나. SRB assay 에의한항암 in vitro 효능평가 세포단백질을염색함으로써세포증식도를측정하는 SRB assay를통해각암세포주에대한시제품의세포독성및증식저해능을평가하여시제품의함암능을확인하고자하였으며 Table 6. 와같은시료농도조건에서그결과를확인하였다. 신장암 (A-498), 대장암 (SW 480) 세포주를대상으로실험한결과, 처리되어진시료에농도의존적인세포독성을나타내어 cell viability가감소하는것을볼수있었으며자궁암 (Hela), 위암 (SNU 719), 간암 (Hep3B) 세포주들에서는시험되어진농도처리조건에의존적인세포독성을나타내진않았으며특히간암세포주에서의세포증식저해능이가장미약하였다. 시료 10mg/ml 농도처리조건을기준으로각세포주의새포생육저해능을비교해보았을때대장암 > 신장암 > 위암, 자궁암 > 간암순으로의높은세포독성을결과하였다. 신장암, 자궁암, 위암, 대장암세포주를대상으로시험시 2-10mg/ml 농도처리로 IC50에해당되는증식저해능결과가예상되어졌다.(Table 5, Fig. 6) Table 6. SRB assay 에의한시제품의 5 종암세포주에대한함암효능평가 MTT assy Tested cell (target cancer) A-498 ( 신장암 ) Final concentration of treated samples (mg/ml) 0.002 0.02 0.2 2 10 96.05 ±14.73 99.77 ±2.91 92.62 ±9.92 74.21 ±0.81 21.95 ±1.89 cell viability (%) Hela ( 자궁암 ) SNU 719 ( 위암 ) SW 480 ( 대장암 ) 97.56 ±3.76 110.47 ±29.07 93.35 ±3.29 98.70 ±3.19 112.88 ±24.88 94.21 ±2.82 98.76 ±3.49 116.38 ±23.17 95.55 ±1.55 97.45 ±3.39 117.17 ±21.33 85.54 ±2.29 32.14 ±1.72 31.89 ±6.84 18.56 ±0.75 Hep3B ( 간암 ) 99.61 ±0.99 89.58 ±4.85 92.68 ±3.70 104.60 ±0.53 78.55 ±4.48-144 -
Fig. 6. SRB assay 에의한시제품의 5 종암세포주에대한함암효능평가 - 145 -
다. in vitro assay 에의한시제품의항암효능 5종류의암세포를대상으로 MTT assay에의해확인되어진시제품의세포생존저해능과 SRB assay에의해확인되어진시제품의세포증식저해능결과를최종적으로살펴보면두종류 assay 모두에서신장암세포주과대장암세포주에농도의존적으로세포독성이결과되어졌으며이를통해시제품의신장암과대장암에대한항암효능을확인하였다. 세포증식저해보다세포생존저해에대한독성이좀더우월하게결과되어졌으나시제품이신장암과대장암세포주의생존과증식모두에저해능을나타내는것으로사료되며이두저해능은시제품 2-10mg/ml 농도범위에서 IC 50 을나타내는것을확인할수있었다. 자궁암세포주와위암세포주에대해서는처리되어진시제품의농도조건에의존적인세포독성은 MTT assay로확인하였으나 SRB assay에서는확인되지않았으며이는시제품이자궁암세포주와위암세포주의세포증식저해보다세포생존저해에대한독성이더욱우위적으로나타나는것으로사료되었다. 하지만시제품 2-10mg/ml 농도범위에서자궁암과위암세포주의생존및증식에대한저해능 IC 50 이나타남을확인하였다. 시험되어진간암세포주에대한시제품의세포독성시험결과 MTT assay를통한세포생존저해능은확인되지않았으며, SRB assay를통한세포증식저해능은시험되어진다른 4종의암세포주에서결과되어진수치에비해긍정적결과가큰차를나타내는낮은세포증식억제능을보였다. 시험되어진시제품시료는간암세포주에대해서는항암효능을나타낸다고보기어려운것으로사료된다. 두가지방법에의한 in vitro 항암효능평가를토대로시험되어진 5종의암세포주에대한시제품의항암효능우위성은대장암 > 신장암 > 자궁암, 위암순으로나타낼수있다. - 146 -
Table 7. MTT 와 SRB assay 에의한시제품의항암효능평가결과 Targeted cancer Assay Final concetration of treatd samples (mg/ml) Control 0.002 0.02 0.2 2 10 신장암 MTT 100 SRB 100 84.49 ±6.86 96.05 ±14.73 81.46 ±3.18 99.77 ±2.91 71.43 ±10.81 92.62 ±9.92 67.04 ±6.29 74.21 ±0.81 34.71 ±1.36 21.95 ±1.89 자궁암 MTT 100 SRB 100 84.61 ±18.51 97.56 ±3.76 94.72 ±6.91 98.70 ±3.19 66.57 ±3.94 98.76 ±3.49 60.99 ±8.74 97.45 ±3.39 19.48 ±0.34 32.14 ±1.72 위암 MTT 100 SRB 100 93.44 ±3.21 110.47 ±29.07 99.87 ±1.85 112.88 ±24.88 86.61 ±6.52 116.38 ±23.17 87.10 ±7.94 117.17 ±21.33 17.39 ±1.91 31.89 ±6.84 대장암 MTT 100 SRB 100 77.42 ±0.56 93.35 ±3.29 74.39 ±5.37 94.21 ±2.82 65.81 ±3.32 95.55 ±1.55 55.44 ±2.69 85.54 ±2.29 13.59 ±0.38 18.56 ±0.75 간암 MTT 100 SRB 100 126.69 ±2.66 99.61 ±0.99 113.65 ±3.40 89.58 ±4.85 109.04 ±0.35 92.68 ±3.70 116.85 ±1.33 104.60 ±0.53 102.53 ±1.43 78.55 ±4.48 * : 농도의존적으로결과되어진 cell viability value(%) * Red word : IC50E 이하 cell vaibility value(%) - 147 -
3. 유통기한설정실험지표 시제품의유통기한설정을위하여가속실험법을계획및수행하였으며시험기간조건은 0, 15, 30, 60, 90, 120일로총 6구간으로설정하였으며시험온도조건은 25, 30, 45 로총 3구간으로설정하였으며이때 25 를대조구로써사용하였다. 가. 미생물지표 1) Bacillus cereus 10배단계회석에의해준비되어진시제품시료가도말되어진 MYP 배지를배양한뒤배지색깔변화관찰을통해 Bacillus cereus로의심가능한집락을개수및선별하였으며, 1차적인그람염색법을통해그람양성균주를선별후, 선별되어진균주는 2차적으로 API KIT를이용하여타겟되는균주인 Bacillus cereus 임을확인시험하였다. 정확한균주동정결과를얻고자 API KIT를이용한확인시험은배양조건을 24시간과 48시간배양으로정하여두조건모두에서결과되는 kit 양상을분석하여균을동정하였으며그결과, 장류에서음성으로결과되어져야하는 Bacillus cereus 균주는시험되어진모든조건에서검출되지않았다. Table 8. 유통기한시험기간중 API kit 를통해동정되어진시제품내균주 Days Time 24hr 48hr Bacillus cereus 검출유무 0 Bacillus smithii Bacillus smithii 불검출 15 Bacillus firmus Bacillus smithii Bacillus firmus Bacillus smithii 불검출 30 Bacillus firmus Bacillus smithii 불검출 60 - - 불검출 90 Bacillus firmus Geobacillus stearothermophilus 불검출 120 - - 불검출 - 148 -
Fig. 7. MYP 한천배지를통한 Bacillus cereus 유무확인시험 (0 Days) Fig. 8. API KIT assay 24hr 배양 (0 Days) Fig. 9. API KIT assay 48hr 배양 (0 Days) - 149 -
Fig. 10. MYP 한천배지를통한 Bacillus cereus 유무확인시험 (15 Days) Fig. 11. API KIT assay 24hr 배양 (15 Days) Fig. 12. API KIT assay 48hr 배양 (15 Days) - 150 -
Fig. 13. MYP 한천배지를통한 Bacillus cereus 유무확인시험 (30 Days) Fig. 14. API KIT assay 24hr 배양 (30 Days) Fig. 15. API KIT assay 48hr 배양 (30 Days) - 151 -
Fig. 16. MYP 한천배지를통한 Bacillus cereus 유무확인시험 (60 Days) - 152 -
Fig. 17. MYP 한천배지를통한 Bacillus cereus 유무확인시험 (90 Days) Fig. 18. API KIT assay24hr 배양 (90 Days) Fig. 19. API KIT assay 48hr 배양 (90 Days) - 153 -
Fig. 20. MYP 한천배지를통한 Bacillus cereus 유무확인시험 (120 Days) 2) 대장균군 10배단계회석에의해준비되어진시제품시료가도말되어진데옥시콜레이트유당한천배지를배양한뒤형성되는콜로니색깔관찰을통해대장균군의심가능집락을확인하였다. 정확한결과를얻고자 24시간과 48시간두가지배양시간을조건으로하여결과를확인하였으며그결과, 시험되어진모든조건에서의시제품에서위해요소균주인대장균군의집락은확인되지않았으며온도가높아질수록데옥시콜레이트유당한천배지에형성되는집락수가줄어드는것이관찰되었으며 30일이후 45 조건에서시험되어진시제품에서는이선택배지에서균집락이형성되지않았다. - 154 -
Table 9. 대장균군검출유무 1X -1X -2X -3X 0 Days - - - - 25 - - - - 15 Days 30 - - - - 45 - - - - 25 - - - - 30 Days 30 - - - - 45 - - - - 25 - - - - 60 Days 30 - - - - 45 - - - - 25 - - - - 90 Days 30 - - - - 45 - - - - 25 - - - - 120 Days -: 불검출 +: 검출 30 - - - - 45 - - - - - 155 -
Fig. 21. DOC 한천배지를통한대장균군유무확인시험 (0 Days) Fig. 22. DOC 한천배지를통한대장균군유무확인시험 (15 Days) - 156 -
Fig. 23. DOC 한천배지를통한대장균군유무확인시험 (30 Days) Fig. 24. DOC 한천배지를통한대장균군유무확인시험 (60 Days) - 157 -
Fig. 25. DOC 한천배지를통한대장균군유무확인시험 (90 Days) Fig. 26. DOC 한천배지를통한대장균군유무확인시험 (120 Days) - 158 -
나. 이화학성분지표 1) 수분유통기한설정기간별시제품의수분함량을측정한결과, 시험되어진세온도조건모두시간에따라수분함량이감소하였으며 25 와 30 에서보관되어진시제품의수분은미량감소한반면, 45 에보관및시험되어진시제품의수분은다른두온도보다급격한감소를보였다. Fig. 27. 시간별에따른온도별수분변화 Table 10. 시간별에따른온도별수분변화 (%L) 25 30 45 0 Days 5.38±0.47 a 5.38±0.47 a 5.38±0.47 a 15 Days 5.01±0.2 ab 4.64±0.03 b 4.55±0.06 b 30 Days 4.90±0.18 bc 4.88±0.36 b 4.12±0.25 b 60 Days 4.52±0.21 cd 4.71±0.08 b 3.19±0.40 c 90 Days 4.79±0.15 bc 4.57±0.06 b 2.79±0.08 c 120 Days 4.29±0.14 d 4.59±0.09 b 1.87±0.09 d - 159 -
2) 총질소총질소함량은맛과영량을결정하는콩단백질에서유래된몸에좋은여러종류의아미노산함량을나타내는척도로높을수록식품내아미노산함량이높다는것을의미한다. 식품공전의장류식품의기준및규격에따르면총질소 (w/v%) 는 0.8% 이상이어야한다고고시되어있다. 전문기관에의뢰하여조사되어진시제품의유통기한설정조건내총질소는 Tabel 11. 에서보는바와같이시간, 온도에상관없이평균 6.7% 로제품규격에적합한결과를보였다. Table 11. 시간별에따른온도별총질소변화 (%) 25 30 45 0 Days 6.7 6.7 6.7 15 Days 6.6 6.6 6.7 30 Days 6.6 6.7 6.7 60 Days 6.7 6.7 6.8 90 Days 6.6 6.7 6.9 120 Days 6.7 6.7 6.9 3) 아미노산성질소청국장의저장중콩단백질이분해되어생성된아미노산은청국장의구수한맛에기여하며, 이때아미노산성질소함량이증가하게됨으로써아미노산성질소는장류맛의지표는물론저장중장류제품의변화와보관기관설정지표로써사용된다. 전문기관에의뢰하여조사되어진시제품의유통기한설정조건내아미노산성질소는최초 426mg% 함량이던것이저장시간과온도가증가함에따라비례적으로최고 762-790mg% 까지증가하였으나저장 60일째이후부터는그함량변화증감이크게나타나최종시험기간인 120일째에는최초함량보다더욱감소되어맛에기여하는아미노산에변화를예측할수있었다. - 160 -
Table 12. 시간별에따른온도별아미노산성질소변화 (mg%) 25 30 45 0 Days 426 426 426 15 Days 724 727 749 30 Days 762 772 790 60 Days 504 520 538 90 Days 776 798 812 120 Days 389 361 323 Fig. 28. 분말청국장시제품의총질소, 아미노산성질소함량 (0 Days) Fig. 29. 분말청국장시제품의총질소, 아미노산성질소함량 (15 Days) - 161 -
Fig. 30. 분말청국장시제품의총질소, 아미노산성질소함량 (30 Days) Fig. 31. 분말청국장시제품의총질소, 아미노산성질소함량 (60 Days) Fig. 32. 분말청국장시제품의총질소, 아미노산성질소함량 (90 Days) - 162 -
Fig. 33. 분말청국장시제품의총질소, 아미노산성질소함량 (120Days) 다. 관능적지표 ( 성상검사 ) 시제품의색상은 25 와 30 조건에서는시간에의존적으로큰변화를보이지않았으나 45 에서보관되어진시제품은다른온도조건에비해시간에의존적으로짙어진것을확인할수있었다. 시제품의풍미는온도가높아질수록구수함의정도가진해졌고, 시간의경과와온도별에따라촉각으로판별되어지는조직감의차이는크게없었다. 그러나 60일째부터 45 시료가겉포장이벌어져있는등외관적으로시제품의포장상태가양호하지않았으며, 120일째에는 45 시료뿐만아니라 25 와 30 시료역시겉포장이벌어져있는등외관적으로시제품의포장상태가양호하지않았다. - 163 -
Fig. 34. 시간별, 온도별조건에따른시제품 - 164 -
Table 13. 시간별에따른온도별관능검사 (*) () 0 Days 5 5 5 5 5 25 5 5 5 5 5 15 Days 30 5 5 5 5 5 45 5 4 5 5 4.75 25 5 5 5 5 5 30 Days 30 4 5 5 5 4.75 45 4 4 5 5 4.5 25 4 4 5 4 4.25 60 Days 30 4 4 5 4 4.25 45 3 3 5 3 3.5 25 4 4 5 4 4.25 90 Days 30 4 4 5 4 4.25 45 3 3 5 2 3.25 25 4 4 5 3 4 120 Days 30 4 4 5 3 4 45 3 3 4 2 3 *: 제품색상변화의미 - 165 -
라. 최종유통기한설정결과식품위생법시행규칙 제45조제1항제 3호에따른 식품등의유통기한설정기준 에따라상기의유통기한설정시험결과에근거하여유통기한을예측하여다음과같이나타내었다. 제품의특성 1. 제품명 : " 목이버섯이첨가된분말형청국장 2. 대상식품의특성 유형또는품목 : 장류 성상 : 분말 사용원료 : 목이버섯, 청국장 제조 가공공정 : 건조분말 포장재질, 포장방법, 포장단위 : 폴리에틸렌, 질소충전, 15g/Pack 보존및유통온도 : 상온 3. 품질관리 4. 지표 ( 실험항목 ) - 미생물적지표 : Bacillus cereus, 대장균군 - 이화학적성분 : 수분, 총질소, 아미노산성질소 - 관능적지표 : 성상 - 166 -
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예측제품명 목이버섯첨가분말형청국장 식품유형 장류 ( 청국장 ) 품질지표 바실러스세레우스, 대장균군, 수분, 총질소, 아미노산성질소, 성상 측정기간 Bacillus cereus 대장균군 0 Days 불검출 불검출 15 Days 불검출 불검출 30 Days 불검출 불검출 60 Days 불검출 불검출 90 Days 불검출 불검출 120 Days 불검출 불검출 (%L) 측정기간 25 30 45 0 Days 5.38±0.47 a 5.38±0.47 a 5.38±0.47 a 15 Days 5.01±0.20 ab 4.64±0.03 b 4.55±0.06 b 30 Days 4.90±0.18 ab 4.88±0.36 b 4.12±0.25 b 60 Days 4.52±0.21 b 4.71±0.08 b 3.19±0.40 c 90 Days 4.79±0.15 b 4.57±0.06 b 2.79±0.08 c 120 Days 4.29±0.14 d 4.59±0.09 b 1.87±0.09 d - 168 -
(%) 25 30 45 0 Days 6.7 6.7 6.7 15 Days 6.6 6.6 6.7 30 Days 6.6 6.7 6.7 60 Days 6.7 6.7 6.8 90 Days 6.6 6.7 6.9 120 Days 6.7 6.7 6.9 (mg%) 25 30 45 0 Days 426 426 426 15 Days 724 727 749 30 Days 762 772 790 60 Days 504 520 538 90 Days 776 798 812 120 Days 389 361 323-169 -
() () 0 Days 5 5 5 5 5 25 5 5 5 5 5 15 Days 30 Days 60 Days 90 Days 120 Days 30 5 5 5 5 5 45 5 4 5 5 4.75 25 5 5 5 5 5 30 4 5 5 5 4.75 45 4 4 5 5 4.5 25 4 4 5 4 4.25 30 4 4 5 4 4.25 45 3 3 5 3 3.5 25 4 4 5 4 4.25 30 4 4 5 4 4.25 45 3 3 5 2 3.25 25 4 4 5 3 4 30 4 4 5 3 4 45 3 3 4 2 3 온도 ( ) Slope(K) Intercept(A0) R 2 25-0.2174 5.1955 0.8785 30-0.1395 5.0392 0.6991 45-0.8168 5.0794 0.9864 온도 ( ) Slope(K) Intercept(A0) R 2 25-0.0453 1.6485 0.8812 30-0.0283 1.6155 0.7052 45-0.2458 1.6678 0.9904-170 -
온도 ( ) Slope(K) Intercept(A0) R 2 25 0.0063 6.6389 0.1777 30 0.0105 6.6649 0.3974 45 0.0610 6.6764 0.9570 온도 ( ) Slope(K) Intercept(A0) R 2 25 0.0009 1.8929 0.1777 30 0.0015 1.8968 0.3974 45 0.0089 1.8986 0.9570 온도 ( ) Slope(K) Intercept(A0) R 2 25-21.1157 633.7859 0.1839 30-24.7157 643.9192 0.2015 45-33.5157 664.9859 0.2498 온도 ( ) Slope(K) Intercept(A0) R 2 25-0.04310 6.4280 0.2139 30-0.05491 6.4489 0.2515 45-0.07803 6.4482 0.3176 온도 ( ) Slope(K) Intercept(A0) R 2 25-0.2842 5.0807 0.9410 30-0.2421 4.9236 0.9634 45-0.5631 5.0271 0.9641 온도 ( ) Slope(K) Intercept(A0) R 2 25-0.0628 1.6279 0.9443 30-0.0541 1.5957 0.9666 45-0.1429 1.6257 0.9730-171 -
차수 최초함량-품질규격 연간변화속도상수 유통기한 ( 개월 ) 1 0.6199 0.3694 20.1 차수 최초함량-품질규격 연간변화속도상수 유통기한 ( 개월 ) 1 2.1253 0.0113 2256.9 차수 최초함량-품질규격 연간변화속도상수 유통기한 ( 개월 ) 1 0.0909 0.0751 12.1 차수 최초함량-품질규격 연간변화속도상수 유통기한 ( 개월 ) 1 0.5108 0.3929 13.0-172 -
l l 시험항목바실러스세레우스 허용한계 ( 단위 ) 불검출 (CFU/ml) 예상유통기한산정유통기한비고 ( 개월 ) ( 개월 ) 12개월 12개월식품공전 대장균군 불검출 (CFU/ml) 12 개월 12 개월식품공전 수분 3-5(%L) 12 개월 19 개월식품공전 장류규격총질소 0.8이상 (%) 12개월 적용아미노산성 426 12개월 12개월 - 질소 (mg/%) 3 관능검사 12개월 10개월식품공전 (score) l - 173 -
마. 시제품제품성 식품위생법시행규칙 제45조제 1항제3호에따른 식품등의유통기한설정기준 과식약청에서제공한 식품의유통기한설정실험가이드라인 에따라목이버섯이첨가되어진분말형청국장시제품의유통기한설정실험결과최종 2개월의유통기한이결과되었다. 미생물학적측면에서의시험되어진시제품의안전성과이화학적성분측면에서수분및총질소함량은목표한 12개월유통기한에근접할수있는시험결과를확인할수있었다. 하지만식품으로써가장중요시되어야하는것은맛으로써청국장의특성이되는구수한맛의과학적지표로사용되는아미노산성질소항목에서 2개월의품질유지가가능한유통기한이결과되었다. 본사업에서우수한항산화능과항암활성을가지며분말제형으로개발되어진목이버섯첨가분말형청국장은식품으로써저장안전성은물론질적우수성을나타낼수있도록추가적인시제품포장공정등의관련시제품제작과정을보완및수정을통해성공적인제품화및산업화가가능할것이다. Ⅳ. 디자인및최종제품 제 4 장 목표달성도및관련분야에의기여도 목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의식품ㆍ약리활성분석과식품소재화 * 연도별연구목표및평가착안점에입각한연구개발목표의달성도및관련분야의기술 발전에의기여도등을기술 제 5 장 연구개발성과및성과활용계획 목이버섯 (Auricularia auricula-judae) 의식품ㆍ약리활성분석과식품소재화 * 실용화 산업화계획 ( 기술실시등 ) * 교육 지도 홍보등기술확산계획등 * 특허, 품종, 논문등지식재산권확보계획등 * 추가연구, 타연구에활용계획등 * 연구기획사업등사업별특성에따라목차는변경가능함 - 174 -
- 175 -
제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 1 절. 평가의착안점및기준 구분 1 차년도 2 차년도 연도세부연구개발목표가중치평가의착안점및기준 목이버섯균주수집및유연관계분석및현미경적특성분석 2009 최적배지개발 목이버섯수집균주의생육특성조사 3 차년도 2011 최종평가 목이버섯약리활성에따른최적화시험 -국내외균주수집, DNA분석과생리형태특성구명 20% -유연관계분석및현미경적특성분석 -선발육종에위한목이버섯생육재배시험 : 수집및분양계통 10여종. 20% -배지재료의이화학적, 물리적특성조사 30% - 생산된균주별자실체의특성조사 20% - 약리활성에따른최적추출법을확립 ( 항암, 항산화, 항균, 미백기능 ) - 특허출원 목이버섯의가공제품의 10% -시작품제작개발 우량모균주의교배에의 -모균주특성검정, 교배조합검정, 우량균주 40% 한품종육성획득, 자실체특성조사 최적발이환경구명 10% -배지개발: 최적배지조합, 대체배지개발 -최적온도, 습도구명으로발이조건확립 2010 최적배지및접종법 10% -고체종균과액체종균비교 처리별및추출법에따른 -논문투고및출판 3건 20% 약리활성 -특허출원 추출액을이용한가공시 20% -상표등록및디자인출원제품의개발 신품종의육성및품종등 -신품종의 DNA분석과배양및재배특성 20% 록구명 -농가실증시험: 3개소이상지역, 생산력검정, 농가실증시험및보급 20% 경제성검증, 최적재배시설구명. -유통을위한자실체의최적건조방법구명 : 목이버섯건조법구명 20% 열풍건조, 동결건조, 원적외건조, 건조기, 자연건조 ( 양건, 음건 ) 등 질환모델동물에서효능 -목이버섯추출액과발효물의지질억제능의 10% 측정효과시험 -논문출판 2건 목이버섯의식품소재화 10% -추출액과발효액의상품화 목이버섯의잔류농약허용 -4개농약 (Gamma HCH, Guazatin, 20% 기준의설정 Glufosinate ammonium, glyphosphate) 목이버섯신품종육성및 -목이버섯우수신품종육성및안전생산체 20% 대량생산기술개발계구축 농가실증시험등을통한 -농가실증시험, 경제성분석, 농가보급, 수출 40% 신속한보급 ( 수입대체효과 ) etc. 농약잔류허용기준법의설 10% -4종의농약에대한목이버섯의 MRL 설정정 추출액과발효액의제조 10% -발효조건의설정및특허출원조건의설정 목이버섯의식품소재화 20% -마트, 휴게소, 인터넷등에판매실시및가공식품의개발 - 176 -
제 5 장연구개발성과및성과활용계획 1. 사업화정보 No. 사업화명제품명업체명비고목이버섯 ( 건조자연영농조합법 1 목이버섯농가재배경북경산시품, 생물 ) 인한마음영농조합 2 목이버섯농가재배목이버섯경북경주시법인 2. 교육및지도활용 No. 교육명 교재명 주요내용 활용년도 1 경북농업마이스터대경북농업마이스터대목이버섯재배기술학 ( 버섯과정 ) 학등버섯교육 2009 2 새로운목이버섯재배기술 과학영농 목이버섯재배기술 2009 3 버섯종균실기교육 버섯종균실습 종균, 살균등 2010 4 농업계고등학교전문기술교육 버섯실습 배지제조, 접종등 2010 5 산림비지니스아카데산림비지니스아카데목이버섯등 ( 안동, 미미영덕, 영주, 경주 ) 2011 3. 정책활용 No. 정책명 주관부처 내용 활용년도 1 농촌진흥청영농활용 농촌진흥청 목이버섯톱밥재배기술개발 2009 2 농촌진흥청영농활용 농촌진흥청 목이버섯의단목재배법 2010 3 농촌진흥청영농활용 농촌진흥청 목이버섯톱밥배지이용대량재배개발 2010 4 농작물신품종목이버섯우량신품종육농촌진흥청직무육성성 2010-177 -
4. 타연구개발사업에의활용 No. 연구사업명 연구제목 연구자 활용년도 1 경기도농업기술원목이버섯연중대량생경기도농업기술원자체과제산기술개발김정한 2011 2 농촌진흥청공동연목이버섯표준재배법전북농업기술원구사업 ( 지역특화과개발및가공제품개유영진제 ) 발연구 2012 5. 특허 No. 출원명 출원자명 종류 출원년도 1 대자연의목이흑된장 장승희등 상표 2010 2 대자연의목이된장 장승희등 상표 2010 3 톱밥봉지배지버섯재배용 대나무목침종균 조우식등실용신안 2012 6. 논문 No. 논문명주저자학술지명 1 2 3 4 Development of Detection Methods for Cellulolytic Activity of Auricularia auriculajudae Fruit-body Production of Auricularia auricular-judae by Sawdust Cultivation Optimization of culture media of Mycoplasma hyopneumoniae by a response methodology Pharmacodynamics surface of florfenicol alone and in combination with amoxicillin or cefuroxime ahainst pathogenic bacteria of fish origin Jo W-S Mycobiolog y 활용 년도 SCI 구분 2010 비 SC I 국내 외 국내 조우식한국균학회 2010 박승춘 Journal of Veterinary Science 박승춘 Korean J Vet Res 2010 SCI 2010 비 SC I - 178 -
No. 논문명주저자학술지명 5 6 7 8 9 10 11 발효옻추출물의생리활성및 단회경구투여독성시험 Mechanism of macrophase activation induced by β -glucan produced from Paenibacillus JB115 Anti-inflammatory polymyxa activity of dichloromethane extract of auricula-judae Auricularia in RAW264.7 cells Pharmacokinetics of a F l o r f e n i c o l - T y l o s i n Combination Intravenous after and Intramuscular Administration to Beagle Dogs Allometric Scaling of Orbifloxacin Disposition in Nine Mammal Species: A Retrospective Analysis Role of JAK2/STAT Signaling in Pneumococcal EstA Protein-Induced Inflammatory Response in RAW 264.7 Macrophages. Inflammatory responses to Mycoplasma hyopneumoniae in murine alveolar macrophage cell lines. 최명진 Zhi-Q iang Chang Dereje Damte Eun- Young KIM 대한수의학 회지 Biochemica l and Biophysical R e s e a r c h Communica tions Toxicologi c a l Research J Vet Med Sci 활용 년도 SCI 구분 국내 외 2010 2009 SCI 국외 2011 비 SC I 국외 2011 SCI 국외 박승춘 2011 SCI 국외 박승춘 M i c r o b Pathog. 2011 SCI 국외 박승춘 N Z Vet J. 2011 SCI 국외 - 179 -
No. 논문명 주저자 학술지명 SCANDINA 12 13 14 V I A N C o m p a r a t i v e JOURNAL pharmacokinetics of O F orbifloxacin following a 박승춘 LABORAT single intravenous or oral O R Y administration to healthy A N I M A L and diabetic rats. SCIENCE. 2011, Comparative antitumor activity of different solvent Md. Toxicologi fractions from Auricularia Ahsan c a l auricula-judae ethanol ur Research extract in P388D1 and Reza sarcoma 180 cells Mutant prevention concentration and phenotypic and molecular Veterinary basis of fluoroquinolone Dereje Microbiolo resistance in clinical Damte gy isolates and in vitro-selected mutants of Escherichia coli from dogs 활용 년도 SCI 구분 국내 외 2011 2011 비 SC I 국내 2012 SCI 국외 - 180 -
7. 국내및국제학술회의 No. 발표자발표제목일시장소 1 Md.Ahanu r Reza 2 Md.Ahanu r Reza 3 최명진 4 박승춘 5 장승희 6 조우식 7 조우식 8 9 Md.Ahanu r Reza Md.Ahanu r Reza In vitro antitumor activity of solvent fractions from ethanol extract of Auricular auricular-judae on tumor cell lines In vitro antitumor activity of solvent fractions from ethanol extract of Auricular auricular-judae on tumor cell lines Effects of Fermented Rhus Verniciflua Extract on Atopic Dermatitis in DNCB-induced BALB/c Mice Immunomodulatory Activities and Sub-acute Toxicity of a Novel Beta-glucan from Paenibacillus Polymyxa JB115 in rats Hepatoprotective effect of Yerba Mate (Ilex Paraguariensis) extract against carbon tetrachloride-induced liver damage in rats Morphological Characteristics of Auricularia auricula-judae and Auricularia polytricha Mushrooms Characterization of cultural conditions and antitumor activity of culinary-medicinal mushroom Auricularia auricular-judae Antitumor activity of dichloromethane fraction separated from Auricularia auricula-judae 70% ethanol extracts against human bronchioalveolar and gastr Suppressive effects of 70% ethanolic Auricularia auricula-judae extract in adipogenesis and lipogenesis on 3T3-L1 preadipocytes. 2010.11 경주 2010.10 제천 2010.06 서울 2010.06 서울 2010.06 서울 2010.10 서울 2011.10 크로아티아 2011.11 안성 2011.11 안성 10 조우식 목이버섯류 ( A u r i c u l a r i a auricula-judae) 의배양특성및약리활성 2011.11 안성 - 181 -
8. 홍보실적 No. 홍보유형 매체명 제목 일시 1 월간잡지 월간새농사 목이버섯인공재배성공 2009.05.14 2 중앙일간지산림신문, 경주에서동아시아버섯대회, 연합통신, 유치지방TV 대구KBS 2010.11.09 3 중앙전문지 산림신문 경북산림비즈니스아카데미, 임업인력양성 2011.11.10 4 지방일간지 매일신문 경북산림비즈니스아카데미, 임업인력양성! 2011.11.09 5 지방TV 대구KBS, 2012 IBC 세계인명사전에대구TBC 등재 2011.03.22 6 지방일간지 매일신문 대구시, 2013년도농림사업 2011.03.30 7 지방TV방내년도농업, 산림 23개대구KBS 송사업확정 2011.04.01 9. 전시회등참여 No. 유형 행사명칭 전시품목 장소 일시 1 전시회 버섯류 2011경북농업대 ( 목이버섯축전등 ) 구미 2011 버섯박람회및산 2 전시회 업배가방안심포 서울 2010 지엄 3 전시회 버섯박람회. 심포지엄 버섯실물등 서울 2011 4 전시회 ' 한국의버섯 ' 품평회 서울 2009 10. 연구인력양성 No. 인력양성명년도인력양성대상수비고 1 경북대학교현장실습교육과정 2009 2 2 경북대학교현장실습교육과정 2010 3 3 경북대학교현장실습교육과정 2011 3 4 경북대대학원박사 ( 예정 ) 2012 1 수의학과 - 182 -
11. 기타활용실적 ( 수상실적등 ) No. 수상명칭년도내용 1 세계인명사전등재 ( 마르퀴즈 ) 2009 2 세계인명사전등재 2010 2010 Edition of Who's Who in the World 등재영국캐임브리지국제인명센터 IBC(International Biographical Center)2010 년 21 세기탁월 한지식인 2,000명 3 세계인명사전등재 ( 마르퀴즈 ) 2010 2011 Edition of Who's Who in the World 등재 4 우수논문발표상 2011 한국버섯학회추계학술대회 5 과학의날포상 2011 과학의날포상 ( 국무총리 ) - 국립과학관, 과천 (2011.4.21) 6 세계인명사전등재 (IBC) 2012 세계인명사전등재 (IBC) - 183 -
제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 1 절공무국외여행개요 1. 여행국 : 크로아티아 ( 자그레브 ) 2. 출장목적 제 6 회국제약용버섯학회참석 ᆞ 구두발표. 버섯연구의국제동향파악, 연구정보수입 3. 출장인원 : 1 명 경북농업기술원지방농업연구사조우식 참석인원 : 300 여명 4. 출장기간 : 2011. 9. 24~10. 2.(9 일간 ) 5. 주요업무수행사항 제 6 회국제약용버섯학회참석 ᆞ 발표 6. 보고서작성자 : 지방농업연구사조우식 여행일정 - 184 -
주요업무수행사항 1. 제 6 회국제약용버섯학회참석 ᆞ 발표 기간 : 2011. 9. 24~ 10. 2. 장소 : 크로아티아자그레브 제 6 회국제약용버섯학회발표내용 가. 기조강연 - 약용버섯류연구의미래전망과연구방향 (Dr. P. Wasser, 이스라엘 ) 등 18건발표. - 약용버섯류의상업화방안 (Ivan Jakopovich, 크로아티아 ) - 약용버섯의축산업에이용가능성 (Omon, 미국 ) 나. 구두발표 1) 버섯분류, 생태, 유전자 - 팽이버섯류의유전자형분석과산업화전망 ( 공원식, 한국 ) - 야생구름버섯의유연관계분석과생물활성 (Stajic M) - 야생느타리버섯의재배기술과항미생물제제물의생산 (L.I.Sudirman) - 크로아티아의검정송로버섯신종보고 (R. Bozac, 크로아티아 ) 2) 영양적특성, 의약적효과 - 약용버섯제재화를통한 HIV 감염치료 (Holliday, 미국 ) - 양송이버섯, 표고버섯, 잎새버섯추출물 α-defensins 의내병활성 (S. Kuvibidila) - 양생영지버섯류의추출물의약리활성 (Vikineswary, 러시아 ) - 꼿송이버섯추출물의면역활성효과 ( 신현재, 한국 ) - 외생균근류의 Polyamine (Sarjsrs, 독일 ) 3) 재배기술, 약용버섯생산물이용 - 인도에서의약용버섯류의생산, 현재, 미래연구방향 (B.L.Dhar) - 목이버섯류의균사생장및자실체의특성 ( 조우식, 한국 ) - 액체배양기술에의한약용버섯류의지속적재배기술 (M.Petre, 슬로베니아 ) - 체코느타리버섯류재배기술 (C.Jaramillo) - 185 -
4) 생리, 생화학, 유전학 - 약용버섯 (Lentinus polychrous) 에의한해바라기씨리그닌의생분해 (Manurakchinakorn, 태국 ) - 약용버섯류에의한 kelp( 갈조류 ) 잔유물의생물학적변화 (Yan P-S, 말레이시아 ) - 표고버섯류의새로운생리활성물질 (M.A.L.Amazonas) - 버섯과건강 : 아프리카에서의약용버섯의가능성 (K.E.Mshigeni, 탄자니아 ) - 영지버섯추출물다당류의항암효과 (A.V. Shnyreva) - 광처리에의한버섯류의비타민 D 증가효과 (Saad. A, 미국 ) 국내버섯연구에도입할사항 - 균근성버섯의실용화 ( 인공재배, 약리효과, 가공제품화등 ) - 버섯산물의축산업에활용성제고. - 버섯의기능성ᆞ약리적효과분석, 검증 - 신종약용버섯의재배및육종기술. - 재배, 가공, 판매, 수출을병행하는경영시스템도입. - 버섯재배를관광농원화사업으로운영. 2. 문헌수집 etc. The 6th Meeting of International Medicinal Mushroom. 2011. 120p. 학술교류인사 1. S.P.Wasser. 이스라엘하이파대학교수. 2. D.V.Griensven. 네덜란드버섯연구소연구원. 3. F.Pohleven. 슬로베니아류블레냐대학교수. 4. L.Z.Qiang. 중국식품수출 : 식용균분야부국장. 5. Ivan Jakopovich. 크로아티아기업가 ( 버섯무역 ) - 186 -
사진으로본국제약용버섯학회 ( 크로아티아 ) 접수대 개막식 포스터세션 야생버섯전시 버섯시장 구두발표장면 - 187 -