Polymer(Korea), Vol. 39, No. 5, pp. 727-732 (2015) http://dx.doi.org/10.7317/pk.2015.39.5.727 ISSN 0379-153X(Print) ISSN 2234-8077(Online) 시스타민코어폴리아미도아민덴드리머에펩티드와감마아미노부티르산의도입을통한새로운유전자전달체연구 박혜원 유광식 송수정 최준식 충남대학교자연과학대학생화학과 (2015 년 2 월 6 일접수, 2015 년 3 월 17 일수정, 2015 년 3 월 25 일채택 ) Conjugation of Peptide to Cystamine Core Polyamidoamine with γ-aminobutyric Acid for Gene Delivery Hye Won Park, Gwang Sig Yu, Su Jeong Song, and Joon Sig Choi Department of Biochemistry, Chungnam National University, Gung-dong 220, Yuseong-gu, Daejeon 305-764, Korea (Received February 6, 2015; Revised March 17, 2015; Accepted March 25, 2015) 초록 : 유전자전달체가운데비바이러스성전달체인 PAMAM 덴드리머의일종인 cpamam G4 를사용하여분자의표면에 GABA 와히스티딘, 아르기닌을도입해새로운유전자전달체를합성하였다. cpamam G4-GABA-HR 최종합성물은핵자기공명분광기를이용해합성률을확인하였다. 전기영동을이용하여폴리머와 pdna 간의결합력을확인하였고, 폴리머와 DNA 의복합체에환원제를처리하여폴리머의 pdna 방출능력을확인하였다. 나노입자분석기와원자력현미경을이용하여 pdna 와폴리머복합체의크기와모양을분석하였다. HeLa 세포주를이용한 WST-1 assay 를통해폴리머의세포독성을확인하였고, 동일한세포주를이용한 luciferase assay 를통해유전자전달효율성을확인하였다. Abstract: Polyamidoamine (PAMAM) dendrimer are well known non-viral vectors for gene delivery application. Especially, PAMAM conjugated with amino acids have enhanced cell uptake capability and low cytotoxicity compared to other non-viral, vectors. Moreover cystamine core PAMAM has an ability to degrade inside low ph of endosome leading to ease release of biomolecules. In present work, we designed γ-amino butyric acid (GABA), histidine, arginine modified cystamine core PAMAM. GABA has four carbon chains that plays a role as flexible linkers, hence easy interaction with cell membrane. cpamam-gaba-hr synthesis was confirmed by 1 H NMR. We performed gel retardation assay, DNA release phenomenon of cystamine core PAMAM using DTT. We measured size of polyplex by DLS and AFM. Cytotoxicity was examined by WST-1 assay and transfection efficiency was confirmed using reporter plasmid in HeLa cells. Keywords: cationic polymer, PAMAM dendrimer, transfection, amino acid. 서 유전자치료란유전자발현체계를통해서생체내질병부위에치료용외부유전자를전달하고형질발현시켜유전적결함을치료하는치료법이다. 손상되었거나문제가발생한유전자는새롭게도입된유전자에의해대체된다. 새로운유전자는정상적인단백질또는치료용단백질을발현함으로써질병을치료할수있게된다. 1-3 유전자치료는유전자자체로는세포내에존재하는많은방해요소들에의해쉽게분해되어유전자전달이쉽지않기 론 To whom correspondence should be addressed. E-mail: joonsig@cnu.ac.kr 2015 The Polymer Society of Korea. All rights reserved. 때문에유전자전달체를필요로한다. 유전자전달체는치료용외부유전자를세포내로도입시킬수있는물질로, 바이러스성전달체와비바이러스성전달체로나뉜다. 바이러스성전달체는렌티바이러스, 아데노바이러스와같은바이러스를이용하는것으로, 유전자전달효율성은높지만독성이강해임상에적용했을때면역반응을일으켜부작용발생이높은등안전성에대한문제점이제기되고있다. 반면, 비바이러스성전달체는덴드리머, 양이온성리포좀과같은고분자물질을이용하는것으로, 4-9 유전자전달효율성은다소떨어지지만독성과면역반응에따른부작용발생의가능성도낮아바이러스성전달체가갖는문제점에비해훨씬안전하여최근활발한연구가이뤄지고있다. 10 본연구에서주목한비바이러스성전달체인디에틸렌코어 727
728 박혜원 유광식 송수정 최준식 폴리아미도아민 (polyamidoamine, PAMAM) 분자는잘알려진양이온성덴드리머이다. PAMAM 분자의구조는내부사슬이나뭇가지의모양으로연결되어있으며, 둥근공모양의삼차원구조로가장바깥쪽은 64 개의아민기로이뤄져있다. 이로인해양이온성 PAMAM 덴드리머의표면은 DNA 의음이온성과정전기적인인력으로쉽게결합하여복합체를형성한다. 이러한 PAMAM 분자는다른종류의비바이러스성전달체에비해상대적으로낮은독성과우수한유전자전달효율성을가진것으로알려져있다. 11-13 본연구에서는다른유형의 PAMAM 덴드리머인시스타민코어폴리아미도아민 4 차 (cystamine core polyamidoamine generation4, cpamam G4) 분자를사용하였다. 이분자는디에틸렌코어인 PAMAM 분자와는달리디설피드코어로되어있어세포내로유입되었을때글루타치온 (glutathione, GSH) 과같은환원제로인해쉽게분해되어세포질내로의유전자방출을용이하게한다 (Figure 1). 14 여기에다양한기능성을부여하기위해 cpamam 최외각의아민기에감마아미노부티르산 (γ-aminobutyric acid, GABA) 과아미노산인히스티딘, 아르기닌을순서대로도입하였다. 먼저, GABA 는 4 개의탄소사슬을갖고있어구조적유연성을증가시켜히스티딘, 아르기닌단위에유연성을부여해효과를극대화시킬수있다. 15 히스티딘 (Histidine, H) 은세포내유입과정을통해생성된엔도좀에서높은양성자스펀지효과를나타내는것으로알려져있다. 엔도좀막의용해를향상시켜유전자가세포질로이동하는데도움을줄수있다. 16 아르기닌 (arginine, R) 은양이온성을부여해세포침투성을높이는물질로잘알려져있다. 이를표면에도입시킴으로써유전자전달체는치 Figure 1. Structure of cystamine core polyamidoamine generation 4(cPAMAM G4). 료가필요한세포에잘침투하여원활한세포내유입을가능하게한다. 17,18 cpamam G4 덴드리머를기반으로한새로운유전자전달체 cpamam G4-GABA-HR 고분자는액체상펩티드합성법을통하여합성하였으며 ¹H NMR 을통해합성률을확인하였다. 전기영동을이용하여 DNA 와고분자의복합체형성과, 환원제에의한 DNA 의방출이원활하게이뤄짐을확인하였다. 이를바탕으로 dynamic light scattering(dls) 와 atomic force microscope(afm) 을통해복합체의크기와모양을측정하였다. 합성된폴리머의농도에따른세포독성을확인하기위하여 WST assay 를수행하였으며 luciferase assay 를이용한유전자발현정도의측정을통해유전자전달효율성을확인하였다. 실 시약및재료. Cystamine core polyamidoamine generation 4 (cpamam G4) 와 N,N-dimethylformamide(DMF), triisopropylsilan(tis), trifluoroacetic acid(tfa), N,N-diisopropylethylamine(DIPEA), DL-dithiothreitol(DTT), piperidine, 25 kda polyethylenimine(pei25kd), ethidium bromide(etbr) 는 Sigma aldrich(seoul, Korea) 에서구매하였다. Fmoc-Arg(pbf)-OH와 N-hydroxybenzotriazole(HOBt), 2- (1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium(HBTU) 는 Anaspec(San Jose, USA) 에서구매하였고, Fmoc-γ-Abu-OH와 Fmoc-His(Trt)-OH는 Novabiochem(San Diego, USA) 에서구매하였다. Fetal bovin serum(fbs) 와 dulbecco's phosphatebuffered saline(dpbs), dulbecco s modified eagle's medium (DMEM), 100X antibiotic-antimycotic agent는 Gibco (Gaithersburg, MD, USA) 에서구매하였다. Diethyl ether는 JUNSEI(Tokyo, Japan) 에서구매하였고, Micro BCA TM Protein assay kit는 Thermo scientific(ma, USA) 에서구매하였다. Ez-Cytox reagent는 Daeil Lab Service(Seoul, Korea) 에서구매하였다. cpamam G4-GABA-HR의합성. cpamam G4-GABA- HR 폴리머의합성은액체상펩티드합성법을이용하여수행하였다. cpamam G4와 Fmoc-γ-Abu-OH, HOBt, HBTU, DIPEA는 1:4:4:4:8의몰비율로 DMF에서 16시간이상상온반응으로합성하였다. 합성후, 차가운디에틸에테르에합성물을침전하였다. GABA의보호기인 Fmoc은피페리딘용액 ( 피페리딘 :DMF=30%:70%) 을이용하여상온에서 1시간 30분동안제거하였다. 제거후, 차가운디에틸에테르에다시침전하였다. 위와같은방법으로 Fmoc-His(Trt)-OH와 Fmoc- Arg(Pbf)-OH를 HOBt, HBTU, DIPEA와동일한몰비율로앞선합성물과함께 DMF에서 16시간이상반응시키고 Fmoc 보호기를제거해침전하였다. 히스티딘의 Trt, 아르기닌의 Pbf 험 폴리머, 제 39 권제 5 호, 2015 년
시스타민코어폴리아미도아민덴드리머에펩티드와감마아미노부티르산의도입을통한새로운유전자전달체연구 729 Figure 2. Synthesis of cpamam G4-GABA-HR. 보호기는 TFA 용액 (TFA:TIS:D.W=95%:2.5%:2.5%) 으로상온에서 6시간동안반응시켜침전하였다. 합성물은 24시간이상투석 (MWCO 3500) 하여순도를높였다. 투석후동결건조하여 cpamam G4-GABA-HR의최종합성물을얻었다 (Figure 2). 전기영동을이용한 cpamam G4-GABA-HR와플라스미드 DNA의 Complex Test. 폴리머와 pdna(pcn-luc) 의중량비에따른결합력을알아보기위해전기영동을수행하였다. HEPES buffer(125 mm HEPES, ph 7.4) 상에서폴리머와 pdna는 1:1, 2:1, 4:1, 8:1의중량비로준비한후, 30분동안 complex한다. 0.7% agarose에 EtBr 0.5 µg/µl를처리하여 100 V에서 30분동안전기영동하였다. 전기영동을이용한플라스미드 DNA의 Release Test. cpamam G4-GABA-HR와 plasmid DNA(pCN-luc) 결합체에환원제를처리했을때폴리머에결합되어있던 pdna가원활하게방출되는지알아보기위해 pdna release test를수행하였다. HEPES buffer 상에서폴리머, pdna의 complex test와동일한조건으로 complex하여준비하였다. 그다음, 환원제인 DTT 25 mm을 complex한시료에처리한후 30분동안반응시킨다. 0.7% agarose에 EtBr 0.5 µg/µl를처리하여 100 V에서 30분동안전기영동하였다. 나노입자분석기를이용한폴리머의크기측정. 폴리머와 pdna는 HEPES buffer 상에서 4:1의중량비로준비한후, 30분동안 complex한후 ELS-Z(Otusuka electronics, Otsuka, Japan) 로폴리머의입자크기를측정하였다. 원자력현미경을이용한폴리머입자의모양과크기측정. 나노입자분석기를이용한폴리머의크기측정과같은방법으로시료를준비하여유리판에떨어트려 2시간동안천천히상온에서말린후입자의모양과크기를측정하였다. 세포독성실험. cpamam G4-GABA-HR의농도에따른 세포독성을알아보기위해 WST assay 를수행하였다. 세포는 human epithelial carcinoma 세포인 HeLa 세포주를이용하였다. 96 well plate 에 10 만개 /well 의세포를 37 o C, 5% CO 2 에서배양한다. 대조물질로는 PEI25kD, PAMAM G4, cpamam G4 를사용했으며, 대조물질과 cpamam G4- GABA-HR 용액을배양한세포에각각적절한농도별로처리한후, 37 o C 에서 24 시간동안배양하였다. 각 well 에는 10 µl 의 Ez-Cytox reagent(daeil lab service, Seoul, Korea) 을처리하여다시 37 o C 에서 2 시간배양하였다. ELIZA (VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 로 450 nm 에서흡광도를측정하였다. 유전자전달효율실험. cpamam G4-GABA-HR 의세포내유전자전달효율성을알아보기위해 Human epithelial carcinoma 세포인 HeLa 세포주를이용하였다. 24 well plate 에 20 만 /well 세포를 37 o C, 5% CO 2 에서 24 시간동안배양한다. 대조물질로사용한 PEI25kD 는 pdna(pcn-luc) 와중량비 2:1 로준비하고 PAMAM G4, cpamam G4 은 pdna 와중량비 4:1 로준비하였다. cpamam G4-GABA-HR 는 pdna 와중량비 4:1, 8:1, 12:1, 16:1 로준비하여 30 분동안 complex 하였다. 각 well 에준비한 complex 시료를처리하여 37 o C, 5% CO 2 에서 24 시간동안배양하였다. 24 시간후상층의배양액을제거하고, reporter lysis buffer(promega) 를처리하여 30 분동안반응하였다. 각각의상층액에 luciferin agent(promega) 를처리하여 Lumat LB 9507(Berthold Technology, Bad Wildbad, Germany) 로광도를측정하였다. 발현된단백질의정량은 Micro BCA TM Protein Assay(Pierce, Rockford, IL, USA) 를사용하여 2 시간반응후, ELIZA(VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 로 570 nm 에서흡광도를측정하였다. 결과및토론 cpamam G4-GABA-HR 의합성확인. 액체상펩티드합성법을이용하여 cpamam G4-GABA-HR 를합성하였다. 합성후정제하여수득한폴리머의합성을입증하기위해 400 MHz 의핵자기공명분광기를이용하였다. 먼저, cpamam G4 는 2.24 ppm 값을갖는것을확인하였다. GABA 는 1.61 과 1.90 ppm 값을갖는것을확인하였고, 히스티딘은 3.66, 6.80, 7.59 ppm 값을, 아르기닌은 1.45 과 4.32 ppm 값을갖는것을확인하였다. 이결과를통해 cpamam G4 의 ppm 값인 2.24 를기준으로하여합성률을계산한결과, GABA 와히스티딘, 아르기닌모두 99% 이상의합성률을갖는것을확인할수있었다 (Figure 3). 전기영동을이용한 cpamam G4-GABA-HR 와플라스미드 DNA 의 Complex Test. cpamam G4-GABA-HR 폴리 Polymer(Korea), Vol. 39, No. 5, 2015
730 박혜원 유광식 송수정 최준식 Figure 3. 1 H-nuclear magnetic resonance spectroscopy ( 1 H NMR) result of cpamam G4-GABA-HR. Figure 5. Agarose gel plasmid DNA release test result of cpamam G4-GABA-HR and plasmid DNA polyplex. Plasmid DNA only (Con), weight ratio of polymer:dna = 2:1 (Lane 1), 4:1 (Lane 2), 8:1 (Lane 3). Figure 4. Agarose gel retardation assay result of cpamam G4- GABA-HR and plasmid DNA polyplex. Plasmid DNA only (Con), weight ratio of polymer:dna = 1:1 (Lane 1), 2:1 (Lane 2), 4:1 (Lane 3), 8:1 (Lane 4). 머가 pdna(pcn-luc) 와결합체를형성하는지확인하기위하여전기영동을이용한 complex test 를수행하였다. 폴리머와 pdna 는 1:1, 2:1, 4:1, 8:1( 중량비 ) 로준비하여 complex 를형성하도록 30 분동안반응하였다. 그결과, 중량비 2:1 부터서서히 complex 를이루는것을확인할수있었고, 대조군대비 Lane 3 의중량비 4:1 부터완벽한결합체를이루는것을확인할수있었다 (Figure 4). 전기영동을이용한플라스미드 DNA 의 Release Test. cpamam G4-GABA-HR, pdna(pcn-luc) 결합체가실제로환원제에의해분해되어폴리머에결합되어있는 pdna 을방출하는지확인하기위해전기영동을이용한 pdna release test 를수행하였다. 폴리머와 pdna 는 complex test 에서복합체를형성하기시작하는 2:1 과완벽한복합체를형성한 4:1, Figure 6. Dynamic light scattering measurement result of cpamam G4-GABA-HR and plasmid DNA polyplex (weight ratio of polymer:dna = 4:1). 8:1( 중량비 ) 로준비하여 complex 를형성하도록반응시켰다. 그다음, cpamam 의디설피드결합이분해될수있도록환원제인 DTT 25 mm 을처리하였다. 그결과, complex test 에서복합체를형성하기시작했던 2:1 조건과완벽한복합체를형성했던 4:1 모두대조군대비거의유사한정도의 pdna 가방출됨을확인할수있었고, 8:1 조건에서는방출된 pdna 의양이다소감소하는결과를확인하였다 (Figure 5). 나노입자분석기를이용한복합체의크기측정. Complex test 와 release test 를통해완벽히결합하기시작하고대조군대비거의동일한양의 pdna 를방출하였던폴리머 :pdna= 4:1( 중량비 ) 복합체의크기를확인하기위해나노입자분석기를이용하였다. 그결과, 폴리머와 pdna 복합체는평균 228 nm 의크기를갖는나노크기의입자임을확인할수있었다. 1000 nm 이상의크기를갖는 pdna 가운반체와정전기적으로결합하였을때, 효과적으로응축된다는것또한알 폴리머, 제 39 권제 5 호, 2015 년
시스타민코어폴리아미도아민덴드리머에펩티드와감마아미노부티르산의도입을통한새로운유전자전달체연구 731 수있었다 (Figure 6). 폴리머입자의모양과크기확인을위한원자력현미경실험. Complex test 를통해확인한폴리머, pdna 복합체의모양을확인하기위해서원자력현미경을이용한복합체입자모양을측정하였다. 복합체는완벽히결합하기시작하며대조군대비거의동일한양의 pdna 를방출하였던폴리머 : pdna=4:1( 중량비 ) 로준비하여 complex 를형성하도록 30 분동안반응시켰다. Glass 에떨어트려 2 시간동안천천히상온에서말린후측정하였다. 그결과평균 100~200 nm 의동그란구형의입자임을확인할수있었다 (Figure 7). 세포독성실험. cpamam G4-GABA-HR 의농도에따른세포독성정도를알아보기위해 HeLa 세포주를이용한 WST assay 를수행하였다. 대조물질인 PEI25kD, cpamam G4 와 cpamam G4-GABA-HR 는각각 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2 µg/ µl 로준비하여세포에농도별로처리하였다. Ez-Cytox reagent(daeil lab service, Seoul, Korea) 를더해 ELIZA (VERSAmax, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 로흡광도를측정하였다. 그결과, 세포독성이매우강하다고알려진 PEI25kD 는매우높은세포독성을보임을확인하였다. cpamam G4 의경우, 농도가증가할수록 PEI25kD 보다는비교적낮은세포독성을갖는것을확인할수있었다. cpamam G4-GABA-HR 의경우, 농도가증가할수록세포독성이조금씩증가하지만 PEI25kD 와비교했을때현저히낮은독성을보였다. 이러한결과를통해 cpamam G4 에 GABA-HR 을도입함으로써세포독성이낮아지는것을확인할수있었다 (Figure 8). 유전자전달효율실험. cpamam G4-GABA-HR 의세포내유전자전달효율성을알아보기위해 luciferase assay 와 BCA assay 를수행하였다. 세포독성실험과마찬가지로 HeLa 세포주를이용하였다. 대조물질로는 PEI25kD( 폴리머 :pdna =2:1, 중량비 ), PAMAMG4, cpamam G4( 폴리머 :pdna= 4:1, 중량비 ) 로준비하였고, cpamam G4-GABA-HR( 폴리머 :pdna=4:1, 8:1, 12:1, 16:1, 중량비 ) 로준비해세포에처리하였다. Lumat LB 9507(Berthold Technology, Bad Wildbad, Germany) 로 luciferin 을이용해광도를측정한결과, 유전자전달효율이매우높다고알려진 PEI25kD 는예상대로높은효율을보였다. cpamam G4-GABA-HR 의경우, 폴리머 :pdna=12:1( 중량 Figure 8. Cytotoxicity assay result of cpamam G4-GABA-HR in HeLa cells. Figure 7. Atomic force microscopy result of cpamam G4-GABA- HR and plasmid DNA polyplex (weight ratio of polymer:dna = 4:1). Figure 9. Luciferase assay result of cpamam G4-GABA-HR in HeLa cells at each of weight ratio. Data are shown as mean±standard deviation (n=3). ***p<0.001. Polymer(Korea), Vol. 39, No. 5, 2015
732 박혜원 유광식 송수정 최준식 비 ) 까지는복합체의폴리머질량이증가할수록유전자전달효율도증가하는경향을보였으며중량비 16:1 부터는유전자전달효율이더이상증가하지않는것으로나타났다. 선행연구에따르면, PAMAM G3 와시스타민코어 PAMAM G3 의경우중량비증가에따른유전자전달효율의유의미한증가가없었다. 19 cpamam G4-GABA-HR 의경우, 폴리머 : pdna=12:1 에서가장높은수준의유전자발현효율성을갖는것을확인할수있었다. 또한폴리머의비율이증가할수록양이온성이증가하여더욱효율적으로 pdna 와결합하고그에따라유전자의발현효율도증가하지만, 폴리머의양이 16:1 중량비가되더라도그효율은더증가하지않고비슷한수준을나타냄을확인할수있었다. 따라서 cpamam G4- GABA-HR 와 pdna 의중량비 12:1 이가장적절한조건의비율이며 cpamam G4 에 GABA 와히스티딘, 아르기닌 unit 을도입함으로써향상된유전자전달및발현효율을갖게됨을알수있었다 (Figure 9). 결 액체상펩티드합성법을통해비바이러스성전달체의일종인 PAMAM 덴드리머를기반으로새로운유전자전달체인나노크기의 cpamam G4-GABA-HR 폴리머를제조하였다. PAMAM 덴드리머분자는유전자를세포로운반할수있는훌륭한유전자전달체로알려져있다. 그중, cpamam 은 PAMAM 의일종으로써 pdna 와정전기적인력을통해결합한다. 유전자전달체는주로내포작용의원리로세포내부로들어간다고알려져있는데, 본연구에서도입한 GABA 는긴탄소사슬을가지고있어히스티딘, 아르기닌 unit 에유연성을부여하고아르기닌은세포막침투성을높여세포막함입후히스티딘의완충작용에의해엔도좀의불안을가중시켜세포내에서의엔도좀탈출을도울수있게된다. 합성한 cpamam G4-GABA-HR 은핵자기공명분광기를통해성공적으로합성되었음을확인할수있었다. 폴리머와 pdna 의 complex test 와환원제에의한 pdna release test 를통해 cpamam G4-GABA-HR 폴리머는유전자와잘결합하고환원제에의해분해되어 pdna 를방출하는기능을갖는것을알수있었다. 나노입자분석기와원자력현미경실험을통해폴리머와 pdna 의복합체입자는둥근공모양이고크기는평균 200 nm 의입자임을확인할수있었다. Human epithelial carcinoma 세포인 HeLa 세포주를이용해합성된폴리머의농도별독성과유전자전달효율을확인한결과, 대조물질인 PEI25kD 와비교했을때 cpamam G4 에 GABA-HR 을도입함으로써세포에미치는독성이현저히낮아짐을확인할수있었다. 이를통해 PEI25kD 와비슷한수 론 준의높은유전자전달효율을갖는것을확인할수있었다. 과거, 일부희귀유전질환에만국한되어있던유전자치료는최근종양과심혈관질환, 후천성면역결핍증의치료에도적용되고있다. cpamam G4 를이용한생체적합한새로운유전자전달체의개발을통해다기능성유전자전달시스템의구축과많은질병에대한유전자치료가가능할수있을것으로기대한다. 감사의글 : 이연구는 2014 충남대학교학술연구비에의해지원되었음. 참고문헌 1. T. Friedmann, Trends Biotechnol., 11, 156 (1993). 2. R. C. Rao and D. N. Zacks, Dev. Ophthalmol., 53, 167 (2014). 3. T. Zhang, Curr. Drug Deliv., 11, 233 (2014). 4. R. J. Cristiano, Front. Biosci., 3, D1161 (1998). 5. N. Nayerossadat, T. Maedeh, and P. Ali, Adv. Biomed. Res., 1, 27 (2012). 6. T. B. Lentz, S. J. Gray, and R. J. Samulski, Neurobiol. Dis., 48, 179 (2012). 7. J. Hewinson, J. F. R. Paton, and S. Kasparov, Methods Mol. Biol., 998, 65 (2013). 8. T. Dutta, N. K. Jain, N. A. J. McMillan, and H. S. Parekh, Nanomedicine, 6, 25 (2010). 9. M. R. Almofti, H. Harashima, Y. Shinohara, A. Almofti, Y. Baba, and H. Kiwada, Arch. Biochem. Biophys., 410, 246 (2003). 10. Y. Hattori and Y. Maitani, Curr. Drug Deliv., 2, 243 (2005). 11. A. R. Menjoge, R. M. Kannan, and D. A. Tomalia, Drug Discov. Today, 15, 171 (2010). 12. N. Malik, R. Wiwattanapatapee, R. Klopsch, K. Lorenz, H. Frey, J. W. Weener, E. W. Meijer, W. Paulus, and R. Duncan, J. Contr. Rel., 65, 133 (2000). 13. M. L. Patil, M. Zhang, S. Betigeri, O. Taratula, H. He, and T. Minko, Bioconjug. Chem., 19, 1396 (2008). 14. H. Neumann and R. A. Smith, Arch. Biochem. Biophys., 122, 354 (1967). 15. G. S. Yu, H. N. Yu, Y. H. Choe, S. J. Son, T. H. Ha, and J. S. Choi, Bull. Korean Chem. Soc., 32, 651 (2011). 16. A. K. Varkouhi, M. Scholte, G. Storm, and H. J. Haisma, J. Contr. Rel., 151, 220 (2011). 17. I. Nakase, M. Niwa, T. Takeuchi, K. Sonomura, N. Kawabata, Y. Koike, M. Takehashi, S. Tanaka, K. Ueda, J. C. Simpson, A. T. Jones, Y. Sugiura, and S. Futaki, Mol. Ther., 10, 1011 (2004). 18. J. R. Maiolo, M. Ferrer, and E. A. Ottinger, Biochim. Biophys. Acta, 1712, 161 (2005). 19. G. S. Yu, Y. M. Bae, J. Y. Kim, J. Han, K. S. Ko, and J. S. Choi, Macromol. Res., 20, 1156 (2012). 폴리머, 제 39 권제 5 호, 2015 년