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신영 공
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Haengdang-dong, Seongdong-gu, Seoul 133-791, Korea E-mail: minhyung@hanyang.ac.kr 1. 서론 유전자치료는치료유전자를세포안으로전달하여질병을치료하는방법을말한다. 현재혈우병등의유전병이외에도암, 심장병등다양한후천적질병에유전자치료를적용하기위하여많은연구가진행되고있다. 유전자치료는크게다음과같이분류될수있다.

1 Polymer Science and Technology Vol. 23, No, 3 특집 유전자클로닝기법에의한유전자전달체의생산 Production of Gene Carriers Using Gene Cloning Technology 오빛나 이민형 Binna Oh Minhyung Lee Department of Bioengineering, College of Engineering, Hanyang University 17 Haengdang-dong, Seongdong-gu, Seoul , Korea minhyung@hanyang.ac.kr 1. 서론 유전자치료는치료유전자를세포안으로전달하여질병을치료하는방법을말한다. 현재혈우병등의유전병이외에도암, 심장병등다양한후천적질병에유전자치료를적용하기위하여많은연구가진행되고있다. 유전자치료는크게다음과같이분류될수있다. 1) 치료유전자를세포안으로전달하여치료단백질을발현시키는방법, 2) 변이된유전자를정상유전자로바꾸거나정상적으로작동하도록바꿔주는방법, 3) 특정유전자의발현을조절할수있는유전자를이용하여원하는유전자를활성화시키거나억제시키는방법, 4) 질병을유발하는유전자를억제하는방법등이있다. 이러한치료목적을달성하기위해서는인체에무해하고, 효율이우수한유전자전달체가개발이되어야한다. 유전자전달체는바이러스성전달체와비바이러스성전달체, 크게두그룹으로대별된다. 1 바이러스성전달체는바이러스의감염및세포내이동기전을이용하므로, 가장효율적인유전자전달체로사용되고있으나대량생산에어려움이있고생산비용이많이드는단점을가지고있다. 바이러스성전달체는그종류에따라각기다른특성을가지고있다. 아데노바이러스벡터등은세포내로의유전자전달효율이높은장점을가진반면면역반응을유발하여오랜시간동안투여하기에는어려움을가지고있으며, 레트로바이러스벡터등은장기간에걸친유전자발현효과를얻을수있으나, 바이러스가감염세포내염색체에삽입되어돌연변이를유발하고, 암을유발할수있는단점을가지고있다. 비바이러스성전달체는면역반응에서상대적으로안전하고, 반복투여가가능하다. 또한, 전달체의대량생산이가능하며비용이적게드는등의장점을가지고있다. 그러나바이러스성전달체에비해서세포내전달효율이떨어지는단점을가지고있다. 2 이러한비바이러스성전달체종류로는양이온성리포좀과고분자등이있다. 1 이들리포좀및고분자들은유전자와고분자전달체가복합체를형성함으로써분해효소들로부터유전자를보호하고, 복합체의표면이양전하가되도록하여음전하를띠는세포표면으로효과적으로접근하도록하는이점을가지고있다. 현재유전자전달을위해연구되고있는다양한고분자전달체중에서, 많은연구자들은펩타이드를유전자전달체로서사용하기위하여많은노력을하고있다. 3 오빛나 2011 건국대학교생명과학과 ( 학사 ) 2011-현재한양대학교생명공학과 ( 석사과정 ) 이민형 1992 서울대학교화학과 ( 학사 ) 1994 서울대학교화학과 ( 석사 ) 1999 서울대학교화학과 ( 박사 ) 유타대학교약대박사후연구원 유타대학교약대연구조교수 인하대학교의대전임강사 2005-현재 한양대학교생명공학과조교수 / 부교수 Vol. 23, No

특집 유전자클로닝기법에의한유전자전달체의생산 양이온성펩타이드를유전자전달체로서사용할경우다음과같은장점을가지고있다. 첫째, 펩타이드전달체의경우핵산과전기적인력을통하여복합체를형성하고, 핵산을응축하여작은크기의입자를만들어낼수있다. 둘째, 펩타이드전달체에수용체특이적리간드를접합하면, 수용체에특이적으로결합하여수용체특이적엔도사이토시스를통해효율적으로유전자를세포내로전달할수있다.

2 특집 유전자클로닝기법에의한유전자전달체의생산 양이온성펩타이드를유전자전달체로서사용할경우다음과같은장점을가지고있다. 첫째, 펩타이드전달체의경우핵산과전기적인력을통하여복합체를형성하고, 핵산을응축하여작은크기의입자를만들어낼수있다. 둘째, 펩타이드전달체에수용체특이적리간드를접합하면, 수용체에특이적으로결합하여수용체특이적엔도사이토시스를통해효율적으로유전자를세포내로전달할수있다. 4-6 셋째, protein transduction domain(ptd) 로부터유래한펩타이드서열은핵산-전달체복합체가엔도좀에서라이소좀으로가는경로를통해복합체가분해되는것으로부터벗어날수있도록하여유전자전달효율을높인다. 7,8 넷째, Simian virus 40(SV40) large T antigen 등에서유래한짧은 nuclear localization signal(nls) 펩타이드는핵산-전달체복합체를핵으로이동시켜유전자가더많이발현되도록유도하는장점을가지고있다. 9,10 짧은펩타이드는화학적합성을통하여쉽게대량으로생산될수있다. 그러나유전자전달에사용되는펩타이드중몇몇종류는핵단백질에서유래한펩타이드로서아미노산의수가 100개가넘는긴펩타이드로구성되어있다. 이러한긴펩타이드의경우는화학적합성이어려우므로, 생물학적방법을통하여생산이가능하다. 이논문에서는이러한펩타이드유전자전달체에대하여기술하고, 더불어유전자클로닝기법을이용하여이들을생산하는방법을실례를들어설명하고자한다. 2. 유전자클로닝기법을이용하여생산된유전자전달용펩타이드 유전자클로닝기법을이용하여생산된유전자전달용펩타이드에는 high mobility group box-1 A box(hmgb- 1A), high mobility group box-2(hmgb-2), histone 등이있는데이들모두세포핵에서유래된내인성단백질들이다. 내인성단백질을유전자전달체로사용하게되면다음과같은장점이있다. 첫째, 세포핵유래의내인성단백 그림 1. HMGB-1, HMGB-2, HMGB-1A 의구조. 질들은핵안에서 DNA와결합하여 chromatin 구조를형성하는단백질들이다. 따라서, 양이온성단백질의특징인 arginine과 lysine을높은비율로가지고있다. 11 이러한양이온성에기인하여전달될핵산과안정된복합체를형성할수있다. 둘째, 세포유래단백질로서, 합성고분자에비해독성이적을뿐만아니라면역반응을유발하지않는다. 셋째, DNA 재조합기술을이용하여타겟단백질에융합단백질또는기능성펩타이드를접합하여효율이개선된유전자전달체를만들어낼수있다. 넷째, 핵으로부터유래한핵단백질들은자체적으로 NLS를가지고있다. 따라서, 세포핵내전달효율을높임으로서유전자발현을증가시킬수있다. 이러한유전자전달용펩타이드의각각의특징은다음과같다. 2.1 High Mobility Group Box-1 High mobility group box-1(hmgb-1) 은핵과세포질에많이들어있는 non-histone 단백질로서 3개의도메인으로구성되어있다. 12 HMGB-1은 chromatin 구조를형성하는단백질로알려져왔을뿐만아니라, 특정유전자들에서 transcription factor 들의결합을조절하여유전자의발현을조절하는역할을수행하는것으로도알려졌다. 13 또한, 세포밖으로 HMGB-1이분비되었을경우에는, proinflammatory cytokine으로작용하여염증반응을유발시키는것으로알려졌다. 14 HMGB-1은패혈증, 류마티스등의염증성질병에서염증을유발하는주된인자로확인되었으며, 뇌졸중, 심근허혈등의허혈성질병에서도염증반응을유발하는인자로알려졌다 특히, 허혈성질병에서는괴사된세포로부터유출된 HMGB-1이 Toll-like receptor(tlr) 및 receptor for advanced glycation end product(rage) 에결합하여, 염증반응을유도한다. 19 HMGB-1의 3개의도메인은양전하를갖고있는 A box 와 B box 그리고, 음전하를갖고있는 c-말단이다 ( 그림 1). 특히, c-말단부분은다수의 aspartate를갖고있어음전하를띈다. 이 3개의도메인중양전하를띄고있는 A box와 B box는음전하를띄고있는핵산과전기적상호작용을통해핵산 / 전달체복합체를형성할수있다. 그러나, c-말단부분은음전하를띄고있는다수의 aspartate를갖고있어핵산의결합을방해할수있다. 따라서 HMGB-1을유전자전달체로이용하기위해서는 c-말단부분을제거할필요가있다. 이렇게 c-말단을제거하여만들어진 HMGB-1 box A and B(HMGB-1AB) 는플라스미드 DNA와안정한복합체를형성할수있었으며, poly-l-lysine과유사한유 290 고분자과학과기술 Polymer Science and Technology

3 오빛나 이민형 전자전달효율을보였다. 20 HMGB-1은세포밖에서 pro-inflammatory cytokine 으로작용하는문제점이있다. HMGB-1의수용체결합부위는 B box에존재하고있으며, B box는염증을유발하는기능을가지고있다. 그러므로 B box를제거한 HMGB-1 을생산하면, 염증유발의문제를피할수있다. 실제로 B box를제거한 HMGB-1 A box(hmgb-1a) 는 wild-type 의 HMGB-1의염증유발기능을억제하여항염증효과를가지는것으로보고되었다. 21 이러한기능때문에 HMGB- 1A를뇌졸중등의치료단백질로도사용이가능함이제시되었다. 22 그러므로 HMGB-1A는유전자전달기능뿐만아니라항염증효과를지닌다기능성펩타이드로이용될수있다. 본연구실에서는 HMGB-1A를유전자재조합방법을이용하여생산하였으며, 이를이용하여대식세포에서 TNF-α의분비를억제할수있음을확인하였다. 23 또한, HMGB-1A는 DNA나 sirna 등의핵산과결합하여, 세포내로전달할수있음을확인하였다. HMGB-1A는 87개의아미노산으로구성된펩타이드로서, 18개의양이온성아미노산과 10개의음이온성아미노산을포함하고있다. 따라서, 순수전하는 +8로서, 비슷한크기의 PLL보다훨씬작은양전하를가지고있다. HMGB- 1A는 HMG box의일반적인특징을가지고있는데, double strand DNA와안정된결합을하며이러한 DNA와 HMG box간의결합구조는 x-ray crystallography를통하여밝혀져있다. 24 HMGB-1A는 DNA의 minor groove 쪽으로주로결합하며, 이결합은전기적결합이외에도, HMGB-1A 내의소수성아미노산과 DNA의 base 간의소수성결합을포함하고있다. 본연구실에서는추가적으로 PTD인 TAT를 HMGB-1A에연결하여, DNA 재조합법으로 TAT-HMGB-1A를생산하였다. TAT-HMGB-1A는유전자를좀더효율적으로세포안으로전달할수있어서, 유전자전달의효율을개선할수있다. 25 이렇듯유전자재조합기술을통하여다양한기능성펩타이드를 HMGB-1A에연결할수있는데, 본연구실에서는 artery wall binding peptide(awbp) 또는 VEGF receptor binding peptide(vrbp) 가연결된 HMGB-1A를제조하였다. 4,6 AWBP-HMGB-1A는혈관내피세포에높은효율로유전자를전달하였으며, VRBP-HMGB-1A는허혈성혈관내피세포에정상혈관내피세포로보다높은효율로유전자를전달하였다. 이렇듯유전자재조합방법을이용하여이러한특정리간드를붙여서클로닝을함으로써, 복잡한서열의펩타이드도효율적으로생산할수있다. 2.2 HMGB-2 HMGB-2도 HMGB-1과유사한구조를가지고있다 ( 그림 1). A box 와 B box, 그리고음전하를가지고있는 acidic c-말단부분이다. HMGB2를유전자전달체로서이용하기위하여유전자클로닝기법을통해 HMGB-2의 A box, B box(1번 ~186번아미노산 ) 부분을발현하여정제하였다. 26 이 HMGB-2186은 DNA에결합하여안정된복합체를형성할수있으며, 이복합체는세포표면과의높은정전기적친화성을가지고있어, 유전자전달체로서의기본능력을충족하였다. HMGB-2186은기본적으로 lipofectamine보다우수한유전자전달효율을보여준다. HMGB-1 과마찬가지로, PTD인 TAT를유전자재조합을통하여 HMGB-2에접합하였을때, 세포내로의이입효과가증가하여유전자전달효율을개선할수있었다. HMGB-2도 HMGB-1과유사하게 A box와 B box에 NLS 부분을포함하고있다. 그러나 SV40 large T antigen에서유래된 NLS 를추가로 HMGB-2186에연결한융합펩타이드를제조하였을때, NLS-HMGB-2186은더높은유전자전달효율을보였다. 이것은 HMGB-2 내의 NLS 단독으로는세포내전달능력이충분하지않고, 추가적인 NLS를통해서핵으로의유전자전달을보다촉진할수있다는것을의미하기도한다. 이외에도 importin-β-binding domain(ibb) 를융합한펩타이드를제조하였을때도, 유전자전달효율을증가시킴이확인되었다. 이유전자전달효율의개선은엔도사이토시스의효율개선과는관계가없고, 주로핵으로의유전자전달효율이개선된것에기인한다. 그러나 SV40 large T antigen과 IBB는다수의 lysine과 arginine을가지고있어서, HMGB-2186의양이온성을강화시키는효과도있다. 따라서, DNA와의복합체가보다안정화되는효과를가짐으로써유전자전달능력을증진시킬가능성도있다. 2.3 Histone H1 Histone H1은 inter-nucleosome DNA 결합단백질로서, 유전자전달을위한전달체로관심을받아왔다. Histone H1은 DNA에결합하여안정된복합체를형성하고핵산분해효소로부터 DNA를보호할수있다. 11,27 또한, CaCl 2 및클로로퀸의존재하에서세포내로이입된 histone H1/ DNA 복합체는핵으로의유전자전달효과를증진시킬수있었다. 그러나 histone H1만으로는충분한유전자전달효과를얻기는어려웠는데, 이러한이유에서 H1을유전자클로닝기법을이용하여변형하려는시도들이있었다. 특히, histone H1의 c-말단부분이 DNA를응축시키는역할 Vol. 23, No

4 특집 유전자클로닝기법에의한유전자전달체의생산 을하며, 이러한능력이세포내전달효율을높인다. 28 여기에 SV40 large T antigen NLS를융합한펩타이드를결합한 histone H1은본래의 H1의유전자전달효율을개선하였다. 또한, 다른연구에서는 human linker histone H1.4를 DNA 재조합법을이용하여여러조각으로나누어발현하고정제하여, 그중에유전자전달효율이높은조각을스크리닝하였다. 29 그중에 277~657번아미노산으로구성된 H1.4F 조각이가장우수한효과를보여주었으며, 이것은 lipofectamine보다우수한유전자전달효율을가지고있다. 뿐만아니라 H1.4F는 DNA 외에도 sirna 전달에서도우수한효과를보여주어유전자전달분야에서다양한응용성을보여주었다 유전자클로닝을통한유전자전달용펩타이드생산유전자전달용펩타이드는유전자클로닝기법을이용하여생산해낼수있으며, 다음 3단계로이루어진다 : 1) 목적유전자 cdna 클로닝및발현벡터의제조, 2) 펩타이드과발현조건의확립및과발현된펩타이드의정제, 3) 정제된펩타이드의특성확인. 여기서는본연구실에서개발한 HMGB-1A의생산과정을예를들어설명하고자한다. 3.1 목적유전자 cdna 클로닝및발현벡터의제조먼저제조하고자하는펩타이드에발현할수있는 cdna를확보하여야한다. 목적 cdna의확보는 cdna 라이브러리스크리닝등을통하여할수있으나, 이미염기서열정보를알고있는 cdna는 reverse transcriptionpolymerase chain reaction(rt-pcr) 을통하여간단히확보할수있다. 본연구실에서는 HMGB-1AB cdna를확보하기위하여 mrna에해당하는특정 primer를이용하여 RT-PCR을수행하였다. RT-PCR은 human embryonic kidney 293(HEK293) 세포에서얻어진 total RNA를 template로이용하여수행되었다. 사용된 primer의서열은다음과같다. Forward primer: 5 -CCGGAATTCATGG GCAAAGGAGATCCTAAG-3, backward primer: 5 -CCC AAGCTTGATGTAGGTTTTCATTTCTCTTTC-3. 유전자클로닝의편의성을위하여, EcoRI과 HinDIII 자리 ( 밑줄 ) 를각각의 primer에도입하였다. RT-PCR 결과얻어진약 500 bp의 cdna 조각을 pet21a 벡터의 EcoRI과 HinDIII 자리에삽입한후, pet21a-hmgb1ab를제조하였다. pet21a-hmgb1ab는 DNA sequencing을실시하여얻어진 cdna를염기서열을확인하였다. 이 HMGB- 1AB cdna는 A box와 B box를모두포함한것으로서, 유전자전달효과가 PLL보다우수하였다. 앞서설명한바와같이 B box는염증을유발할수있는도메인으로서유전자전달체로서의안전성에문제가있다. 따라서, 본연구실에서는 A box만을얻기위하여, PCR을실시하였다. 이때사용된 primer는다음과같은염기서열을가지고있다. Forward primer: 5 -CCGGAATTCATGGGCAAAG GAGATCCTAAG-3, backward primer: 5 -CCCAAGCTT TTTTGTCTCCCCTTTGGG-3. Forward primer 는앞서사용된 forward primer와동일하며, 유전자클로닝의편의성을위하여 EcoRI과 HinDIII 자리 ( 밑줄 ) 를각각의 primer에도입하였다. PCR결과얻어진 DNA 조각은단백질발현벡터인 pet21a에삽입되었다 ( 그림 2). 발현벡터는목적펩타이드의발현후, affinity chromatography를통하여정제를하기위해, 적절한 ligand가융합단백질로발현되도록구성되어있다. pet21a는발현되는펩타이드의 c-말단에 6개의 histidine이목적단백질에융합단백질로서발현되도록구성되어있다. 따라서, 펩타이드의발현이시작되는 start codon에서부터 c-말단의 histidine들이적절히발현될수있도록, cdna 삽입되는위치를검토하여 reading frame이유지되도록해야한다. 제조된발현벡터는 DNA sequencing을통하여, cdna가정확한염기서열을가지고있는지반드시확인하여 mutant가발현되지않도록주의해야한다. 3.2 펩타이드과발현조건의확립및펩타이드의정제제작된 pet21a-hmgb-1a는펩타이드의발현을위하여 Escherichia coli BL21에주입한다. pet21a는 lac operon HinDIII 그림 2. HMGB-1A 발현벡터. 292 고분자과학과기술 Polymer Science and Technology

오빛나 이민형 에의해서단백질의발현이조절된다. 따라서, 배지내박테리아밀도를적절한정도까지배양하고, 이후 IPTG를배양액에가하여, lac operon을활성화시켜펩타이드의과발현을유도한다. 각펩타이드의발현은박테리아밀도, IPTG의농도, 박테리아배양온도, 시간등여러조건에따라효율이달라진다. 따라서, 펩타이드의최적화된발현조건을찾기위하여위의조건들을스크리닝하여야한다.

5 오빛나 이민형 에의해서단백질의발현이조절된다. 따라서, 배지내박테리아밀도를적절한정도까지배양하고, 이후 IPTG를배양액에가하여, lac operon을활성화시켜펩타이드의과발현을유도한다. 각펩타이드의발현은박테리아밀도, IPTG의농도, 박테리아배양온도, 시간등여러조건에따라효율이달라진다. 따라서, 펩타이드의최적화된발현조건을찾기위하여위의조건들을스크리닝하여야한다. pet21a- HMGB- 1A의최적화된발현을위하여, 박테리아는 optical density(260 nm) 까지배양하였으며, 이후 500 mm의농도로 IPTG를첨가하였다. 이후, 37 C에서 6시간동안배양하여펩타이드의과발현을유도하였다. 배양후에박테리아는적절한완충용액속에서 sonication을이용, 세포막을파괴하여세포내단백질을용출한다. 유전자전달용펩타이드는양이온성아미노산을가진친수성펩타이드이므로, 주로침전되지않고수용액상에존재하는경향성이있다. 따라서, 다른단백질보다높은수득율로생산, 정제될가능성이높다. HMGB-1A의정제를위하여, 본연구실에서는 3단계의 chromatography를실시하였다 ( 그림 3). 각각 affinity chromatography, cationic exchange chromatography, polymixin B chromatography이다. Affinity chromatography는 nickel chelate resin을이용하는데, 목표펩타이드의 c-말단에존재하는 6-histidine 에결합하여단백질을분리한다. Resin에결합한단백질은 imidazole gradient나 NaCl gradient를이용하여용출한다. HMGB-1A는 150 mm imidazole 용액을이용하여용출하였다. 일반적으로유전자전달을위한펩타이드는 HMGB-1A와같이양이온성을띠고있는경우가많다. 이경우정제과정에서박테리아 DNA와펩타이드가결합된상태로분리되는경우도있다. 그러나 HMGB-1A에결합된박테리아 DNA는 HMGB-1A의유전자결합력을약화시키고, CpG motif에의한면역반응유발등많은문제를야기할수있으므로, 반드시제거되어야한다. 그러므로 affinity chromatography 단계에서 urea 등을이용하여, denature 조건에서단백질을정제하는것이유리하다. 많은경우, affinity chromatography 만으로높은순도의단백질을얻을수있다. 그러나 HMGB-1A의경우일부다른단백질이같이정제되므로, 두번째 chromatography 를실시하였다. HMGB-1A의양이온성에근거하여, CM sepharose cationic exchange chromatography를실시하였다. NaCl gradient를이용하여 resin에결합된단백 질을분리하였으며 HMGB-1A는 450 mm NaCl 용액으로용출되었다. 의료용으로이용되는펩타이드의경우는특히 endotoxin 의오염을주의하여야한다. 박테리아에서발현된단백질들은 endotoxin의오염가능성이높으므로, 이를제거하기위한단계가포함되어야한다. HMGB-1A의경우는유전자전달체일뿐아니라, 그자체로항염증효과를가지는펩타이드이다. 따라서소량의 endotoxin도항염증효과를교란하여문제를일으킬수있기때문에 endotoxin의제거는매우중요하다. 특히, 이연구에서개발된 HMGB-1A 는직접뇌졸증동물모델에서항염증효과를통하여뇌경색의완화에도이용되었다. 그러므로 HMGB-1A의생산그림 3. HMGB-1A 의정제과정. Vol. 23, No

특집 유전자클로닝기법에의한유전자전달체의생산 에서 endotoxin의제거는매우중요하다고할수있다. 이를위하여 polymixin B chromatography를실시하여 endotoxin 을제거하였다. 최종적으로 polymixin B column에서순수한물로펩타이드를용출하였다. 3.

Gel retardation assay는 DNA의음전하가결합된양이온성분자에의해가려지므로, DNA의이동성이 gel electrophoresis에서감소하게된다. 결국 gel의출발점에서 DNA가전혀이동하지않게되는데, 이러한특성을이용하여 DNA와펩타이드의결합능력을평가한다 ( 그림 5).

이외에도 dynamic light scattering을통하여복합체의크기를측정하기도하며, 각종전자현미경을이용하여복합체의형태를관찰하기도한다. HMGB-1A는플라스미드의전달및 sirna의전달등에응용되었고, 또한 HMGB-1A의펩타이드고유의특성을이용하여뇌졸중동물모델에서치료효과를얻는데이용되었다.

6 특집 유전자클로닝기법에의한유전자전달체의생산 에서 endotoxin의제거는매우중요하다고할수있다. 이를위하여 polymixin B chromatography를실시하여 endotoxin 을제거하였다. 최종적으로 polymixin B column에서순수한물로펩타이드를용출하였다. 3.3 정제된펩타이드의특성확인및응용정제된펩타이드는 SDS-PAGE를실시하여단백질의순도및정제정도를확인한다 ( 그림 4). 이후펩타이드의유전자전달능력검증은일반양이온성고분자와동일한방법으로실시한다. DNA와 HMGB-1A의결합능력은 gel retardation assay, heparin competition assay 등을이용하여평가한다. Gel retardation assay는 DNA의음전하가결합된양이온성분자에의해가려지므로, DNA의이동성이 gel electrophoresis에서감소하게된다. 결국 gel의출발점에서 DNA가전혀이동하지않게되는데, 이러한특성을이용하여 DNA와펩타이드의결합능력을평가한다 ( 그림 5). Heparin competition assay는 DNA와펩타이드의복합체에음전하를갖고있는 heparin을가하여실시하는데, heparin의가해진양이증가함에따라점차 DNA를대신하여펩타이드에결합하게된다. 이경우분리된 DNA가전기영동상에서점차큰이동성을가지게된다. 이외에도 dynamic light scattering을통하여복합체의크기를측정하기도하며, 각종전자현미경을이용하여복합체의형태를관찰하기도한다. HMGB-1A는플라스미드의전달및 sirna의전달등에응용되었고, 또한 HMGB-1A의펩타이드고유의특성을이용하여뇌졸중동물모델에서치료효과를얻는데이용되었다. 기존의연구에서두개의 HMG box 단백질은 20 bp 정도의 double strand DNA에결합한다는것이알려져있다. 24 이크기는 sirna의크기와매우유사하며, sirna와안정된복합체를형성하여효과적으로전달할가능성이있다. 실제로 HMGB-1A는플라스미드보다는 sirna의전달에더좋은효과를보여주었다. HMGB-1A의플라스미드전달효과는 PLL과유사하나, polyethylenimine (PEI, 분자량 25k) 보다는훨씬낮다. 반면에 sirna의전달에서는 PEI와유사한결과를보여주었다. 그러나독성평가에서는 HMGB-1A는세포에아무런독성을보여주지않았다 ( 그림 6). 반면, PLL과 PEI는높은독성을가지고있으므로, HMGB-1A와같은세포유래의펩타이드의안전성을보여준다고할수있다. 4. 결론및향후전망 기존의비바이러스성전달체는주로합성고분자및리포좀이주종을이루고있다. 펩타이드전달체도기본적으로화학적합성이가능한작은크기의펩타이드를주로전 그림 5. Gel retardation assay: sirna/hmgb-1a 복합체는 ethidium bromide 가들어있는 3% agarose gel 에서분석되었다. 고정된양의 sirna 에무게비를달리하여 HMGB-1A 를추가하였다. 20 분간상온에서방치하여복합체형성을유도한후, agarose gel 에서전기영동을통하여분석하였다. - M: Molecular weight marker - Lane 1: IPTG induction 후박테리아로부터나온 crude lystes - Lane 2: Nickel chelate affinity chromatography 에의해서정제된 HMGB-1A - Lane 3: Cationic exchange chromatography 에의해서정제된 HMGB-1A 그림 4. 정제된 HMGB-1A 의 SDS-PAGE 분석. 그림 6. Cytotoxicity assay: HMGB1 A 와 TAT-HMGB-1A 의독성을측정하기위해서 MTT assay 를수행하였다. 그결과 HMGB -1A 와 TAT-HMGB-1A 는 Raw264.7 cell 에서독성을보이지않았으나 PLL 은높은독성을보였다. 294 고분자과학과기술 Polymer Science and Technology

7 오빛나 이민형 달체로서사용해왔다. 핵단백질과같이세포유래의단백질들은 DNA와의결합능력및높은안전성에도불구하고화학적합성이어려워유전자전달에널리이용되지않았다. 유전자클로닝기법은이러한단백질의대량생산을가능하게한다. 이렇듯유전자클로닝기법에의해생산된세포유래의유전자전달용펩타이드들은그자체로 DNA 와결합하여유전자를전달하는데이용될수있을뿐만아니라, NLS 등을포함하고있는특성때문에다른고분자및리포좀과연계하여이들의유전자전달효율을개선하는데에도이용될수있다. 30 유전자클로닝기법을이용한유전자전달용펩타이드의생산방법은여전히몇가지단점을가진다. 유전자클로닝기법에의한유전자전달용펩타이드의생산방법은화학적합성방법보다길고복잡한과정을거친다. 또한, 순수펩타이드결합으로만연결되는단순한일자형구조만가능하다는것과아미노산이아닌다른그룹들이연결되지못한다는것은유전자클로닝기법의한계이다. 그러나일단생산방법이잘정립되면, 유전자전달용펩타이드를경제적으로대량생산을할수있는방법을확보할수있게될뿐만아니라, DNA 재조합을통하여다양한리간드및기능성펩타이드를연결한융합단백질을쉽게만들어낼수있다. 이와같이유전자클로닝기법은다양하고복잡한기능의유전자전달용펩타이드의생산을가능하게한다. 따라서, 유전자클로닝기법은앞으로의지속적연구를통하여보다기능이개선된유전자전달용펩타이드의개발에기여할것으로기대된다. 참고문헌 1. H. C. Kang, M. Lee, and Y. H. Bae, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr., 15, 317 (2005). 2. M. Lee and S. W. Kim, Pharm. News, 9, 407 (2002). 3. S. Abes et al., Biochem. Soc. Trans., 35, 53 (2007). 4. J. S. Han, K. Kim, and M. Lee, J. Cell. Biochem., 107, 163 (2009). 5. N. Ma et al., Mol. Ther., 9, 270 (2004). 6. J. S. Han et al., J. Cell. Biochem., 110, 1094 (2010). 7. H. Hashida et al., Br. J. Cancer, 90, 1252 (2004). 8. L. Hyndman et al., J. Control. Release, 99, 435 (2004). 9. R. Cartier and R. Reszka, Hum. Gene Ther., 9, 157 (2002). 10. M. Keller et al., Chembiochem, 4, 286 (2003). 11. M. Kaouass, R. Beaulieu, and D. Balicki, J. Control. Release, 113, 245 (2006). 12. J. O. Thomas, Biochem. Soc. Trans., 29, 395 (2001). 13. Y. S. Ji, Q. Xu, and J.F. Schmedtje, Jr., Circ. Res., 83, 295 (1998). 14. U. Andersson et al., J. Leukoc. Biol., 72, 1084 (2002). 15. L. Ulloa and K.J. Tracey, Trends Mol. Med., 11, 56 (2005). 16. R. Pullerits et al., Arthritis Rheum., 48, 1693 (2003). 17. J. B. Kim et al., J. Neurosci., 26, 6413 (2006). 18. T. Kitahara et al., Cardiovasc. Res., 80, 40 (2008). 19. M. A. van Zoelen et al., Shock, 29, 441 (2008). 20. K. Kim et al., Enzyme Microbial. Technol., 43, 410 (2008). 21. R. Kokkola et al., Arthritis Rheum., 48, 2052 (2003). 22. Y. C. Jin et al., Biomaterials, 32, 899 (2011). 23. S. Lee et al., J. Cell. Biochem., 113, 122 (2012). 24. K. Stott et al., J. Mol. Biol., 360, 90 (2006). 25. K. Kim et al., Biotechnol. Lett., 30, 1331 (2008). 26. A. Sloots and W.S. Wels, FEBS J., 272, 4221 (2005). 27. M. Bottger et al., Arch. Geschwulstforsch., 60, 265 (1990). 28. J. D. Fritz et al., Hum. Gene Ther., 7, 1395 (1996). 29. I. Puebla et al., J. Biotechnol., 105, 215 (2003). 30. Y. Shen et al., Int. J. Pharm., 375, 140 (2009). Vol. 23, No

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