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금석 운
5 years ago
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1 Polymer(Korea), Vol. 31, No. 6, pp , 7 저분자량수용성키토산이분급화된유전자전달체의제조및특성 장민자ㆍ김동곤ㆍ정영일ㆍ장미경 ㆍ나재운 순천대학교나노고분자공학과 (7년 9월 4일접수, 7년 1월 17일채택 ) Preparation and Characterization of Low Molecular Weight Water Soluble Chitosan Gene Carrier Fractioned according to Molecular Weight Min-Ja Jang, Dong-Gon Kim, Young-Il Jeong, Mi-kyeong Jang, and Jae-Woon Nah Department of Nano Polymer Science and Engineering, Sunchon National University, Suncheon, Jeonnam , Korea (Received September 4, 7; Accepted October 17, 7) 초록 : 다양한분자량을가진저분자량수용성키토산을얻기위해젖산염이결합되어있는키토산올리고당을한외여과막장치를이용하여분리하였고, 새로운염제거법으로유리아민기를가진 LMWSC 를제조하였다. 젖산염이제거된 LMWSC 의특성과탈아세틸화도가적외선분광기 (Infrared spectroscopy, IR) 및핵자기공명장치 ( 1 H- Nuclear Magnetic Resonance, 1 H-NMR) 에의해확인되었다. 분자량을나타내는다분산지수 (PDI) 는 로비교적좁은분자량분포를나타내었다. 유전자전달체로서의가능성을확인하기위하여, 성공적으로분자량에따라분리된키토산올리고당과염이제거된 LMWSC 의유전자전이효율이 293T cell 을이용하여확인하였다. 또한유전자전이효율을향상시키기위해제조된 LMWSC 유도체가 Balb/C mice 를이용하여평가되었다. Abstract: To obtain low molecular weight water soluble chitosan (LMWSC) with various molecular weights, chitosan oligosaccharides (COS) with lactic acid was separated by using ultrafilteration technique and LMWSC with a free amine group was prepared by the novel salts-removal method. The characterization of LMWSC removed the lactic acid and degree of deacetylation (DDA) were identified by FT-IR and 1 H-NMR spectra. Polydispersity index (PDI) was , which indicates a relatively molecular weight distribution. To identify the potential as a gene carrier, we confirmed the transfection efficiency of COS fractioned according to molecular weight successfully and the salt-removed LMWSC using 293T cell. Also, LMWSC derivatives prepared for improvement transfection efficiency were evaluated using Balb/C mice. Keywords: low molecular-weight water soluble chitosan(lmwsc), chitosan oligosaccharides(cos), gene carrier, transfection. 서 최근질병의치료를위한유망한치료전략으로써유전자치료가많은관심을끌고있다. 이것은유전적인결핍이나조절되지않는세포분화와같은비정상적인세포의기능을멈추게하거나생물학적활성물질을생산함으로써다양한종류의질병을치료하는중요한기회를제공하기때문이다. 1 그러나아직까지유전자의실제응용에있어서는체액내의불안정성, 원하는세포에대한비특이성, DNA 분해효소에의한분해, 그리고낮은전이효율등여러가지문제에의해제한을받고있다. 이러한문제들을극복하기위해서는효과적이고안전한유전자전달체계를개발하는것이다. 일반적으로유전자전달체는바이러스성벡터와비바이러스성벡터를포함하고있으며, 현재까지바이러스성벡터가세포에유전자를전달하는가장효과적인방 론 To whom correspondence should be addressed. jmk8856@hanmail.net, jwnah@sunchon.ac.kr 법이지만, 인체내안전성에대한문제점으로인해비바이러스성벡터에대한연구로대체되고있는실정에있다. 비바이러스성벡터는세포내독성이없고, 비면역성, 그리고재현성같은많은장점을가지고있다. 2 비바이러스성벡터로주로사용되는라이포좀운반체 3-5 및양이온성고분자는 6,7 낮은비용과안전하다는그들의장점으로인해최근 1년간폭넓게연구되어져왔다. in vitro 에서라이포좀유전자전달체가높은전이효율을나타내는것으로알려져있지만, 일부라이포좀유전자전달체는수용액상에서불안정하고혈액내에서응집이된다는문제점을가지고있다. 그리고 poly-l-lysine(pll) 과 8-1 polyethylenimine(pei) 을포함한양이온성고분자는플라스미드 DNA 와복합체를형성할수있고, 전이효율을향상시키며또한 DNA 분해효소로부터 DNA 를보호한다는장점을가지고있으나, 인체내세포독성과생체적합성같은문제점이여전히남아있다. 이러한문제점을극복하기위해많은연구자들에의해사용되어지고있는키토 555

2 556 장민자 ᆞ 김동곤 ᆞ 정영일 ᆞ 장미경 ᆞ 나재운 산은음전하를띠는 DNA 와양전하를띠는키토산의아민기가이온결합을형성함으로이를유전자전달체에도입시킬수있다는장점을가지고있다. 11,12 키틴의탈아세틸화반응을통하여얻어지는키토산은생체재료로서가장폭넓게이용되는천연다당류중의하나이다. 키토산의주사슬은 D-glucosamine 과 N-acetyl-D-glucosamine 의두가지성분으로이루어져있으며, 이러한두요소는 b-1,4-linking 에의하여결합되어있다. 구조적으로키토산은셀룰로오스와매우유사하며 C-2 위치의수산기 (-OH) 가아민기 (-NH 2 ) 로바뀐형태를하고있다. 13 생체고분자로서키토산은생분해성, 무독성, 생체적합성등의우수한특성을가지고있으며, 이러한우수한특성으로인하여약물전달체또는생체의료용재료로서많은응용이시도되고있다. 현재시판되는키토산은생물학적방법으로제조한것으로분해과정에서사용한염이제대로제거되지않기때문에대부분염형태의키토산을시판하고있는현실이다. 사용되어지는염의형태로는염산, 젖산, 초산등다양한유ᆞ 무기산등이사용되고있으나실질적으로가장많이이용되는것은염산으로, 이는키토산제조에있어서가장큰기술적과제로남아있었다. 소비자연맹등의소비자단체에서도이러한문제점을파종산물인키토산에잔존염산이남아있을수있는여지가있으나이러한염의제거가미약하여 1 년에는언론을통해각제조사의키토산에포함되어진잔존염의문제를제기한바있다. 그러나아직도이러한잔존염제거에관한기술을적용한제품은출시되지않아항시문제점으로남아있는상황이다. 또한유전자전달체로서키토산의응용은낮은용해도로인해제한되어왔으며, 이문제를해결하기위해염을도입했으나그결과아민기의양전하가감소함으로써효과적인유전자전달체로서의특성을나타내지못한실정이었다. 이러한키토산의단점을극복하기위해본연구실에서는유리아민기를가진저분자량수용성키토산 (LMWSC) 을제조했으며, 그특성은이미분광학적평가에의해확인되었다. 18 따라서본연구에서는증류수에대한높은용해도를위해젖산염이결합되어있는키토산올리고당 (chitosan oligosaccharide, COS) 을한외여과막을이용하여분자량별로분리한다음염제거법을통해유리아민기를가진 LMWSC 을제조한후, 유전자전이효율성에영향을주는요소중의하나인분자량에따른효과를확인함으로써 LMWSC 의유전자전달체로서의우수성을밝히고자하였다. 또한이전의연구에서유전자전달체로서의가능성을확인한 LMWSC 의유도체로서특정조직을표적할수있는기능성기를가진유전자전달체로서 LMWSC-AWBP 19 그리고 LMWSC-Ch(cholesterol) 를 이용하여 in vivo 에서의유전자전이효율을측정함으로써독성이없는안전한유전자전달체로서의가능성을확인하였다. 실 재료. 젖산염키토산올리고당 (COS) 은 ( 주 ) 키토라이프 ( 서울, 한국 ) 에서제공받아사용하였다. Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA), 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide(mtt), 그리고 Dulbecco's modified Eagle's medium(dmem) 은 Sigma사 (St. Louis, MO) 에서구입하였으며, Ethidium bromide(etbr), 아가로즈는 Promega사 (Madison, WI) 험 에서구입하였다. Fetal bovine serum(fbs) 은 Hyclone사에서구입하였으며, 인간배아신장세포인 293T 와자궁암세포인 HeLa 는 American Type Culture Collection(ATCC) 에서분양받아배양하였다. 녹색형광단백질 (green fluorescence protein, GFP) 을발현하는 pegfp-n1 과 pcmv-luciferase 플라스미드 DNA 는 BD Biosciences Clontech (Palo Alto, CA) 에서구입하였으며, 대장균을통해증폭시킨플라스미드 DNA 를분리하기위하여 Qiagen Maxi prep kit(qiagen, Chatsworth, CA) 를사용하였다. in vivo 실험을위하여 Balb/c mice( g, 5 weeks) 는 Damul Science, Co. 에서구입하였으며, 기타시약들은 1급시약을정제하지않고사용하였다. 다양한분자량을가진 LMWSC 의제조. 다양한분자량의 COS 를 1 3, 3 1, 1 3 KDa 범위의한외여과막을통해각각분리한후, 인산염완충용액에용해시켜적당량의트리알킬아민으로반응시킨후아세톤으로처리한다음원심분리기를이용하여수회세척과정을거친후감압건조하였다. 건조된 1차생성물을묽은염산으로처리하여다시아세톤으로세척하고최종으로건조된생성물을 activated carbon과이온교환수지를이용하여최종의정제과정을거친후동결건조함으로써다양한분자량을갖는 LMWSC 를제조하였다. LMWSC 의특성분석. 위의과정을통하여제조된 LMWSC 의구조와물리화학적특성은 FT-IR(Shimadzu, FT-IR 87, Japan) 및 NMR( 1 H-NMR and 13 C-NMR)(Bruker, Germany, Avance 4 FT-NMR, 4 MHz) 을이용하여정성및정량적으로분석하였다. 또한광산란검출계가도입된겔투과크로마토그래피 (gel permeation chromatography, GPC-MALS, Wyott, USA) 를이용하여절대분자량값과분자량분포및분포도 (polydispersity index, PDI) 를구하였다. DNA-LMWSC 복합체형성및특성분석. DNA와 LMWSC 복합체는멸균수와 LMWSC 를넣은뒤 DNA 를첨가해서전체부피를 μl로맞추고, 3초가량교반한후 3분간 4 에방치해둠으로써 1:4에서 1:16 의무게비로제조하였다. 복합체형성확인을위해.8% 아가로즈젤을이용한전기영동실험을수행하였다. 복합체의크기는동적광산란측정장치 (dynamic light scattering, DLS, Otsuka Electronics Co. Japan) 를이용하여측정하였으며또한복합체의표면형태는투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM, JEOLJEM- FX-II) 을이용하여측정하였다. in vitro, 세포유전자전이실험. 배양된 293T 세포를 24 well 세포배양 plate에한 well당 개의세포를 ph 7.4 배지에분주시킨후 24 시간동안인큐베이터에서배양하여세포를안정되게부착시켰다. 기존배지를제거하고 ph 6.2로낮춘배지 35 μl 를떨어뜨린후플라스미드 DNA 인 pegfp-n1 과다양한분자량의 LMWSC 를무게비 1:1, 1:, 1:3, 1:4 에서복합체를형성시킨후 plate 에떨어뜨리고 4시간뒤에배지를제거했다. 다시정상 ph 7.4 의배지를넣고주기적으로형광현미경을이용하여관찰하였다. in vivo, 유전자전이실험. 이전의연구에서제조된 LMWSC 의유도체로서동맥벽결합펩타이드 (AWBP) 가도입된 LMWSC-AWBP ( ug) 와콜레스테롤이도입된 LMWSC-Ch(Cholesterol) 폴리머, 제 31 권제 6 호, 7 년

3 저분자량수용성키토산이분급화된유전자전달체의제조및특성 557 ( ug) 가 pcmv-gfp 그리고 pcmv-luciferase 4 ug과각각혼합되어복합체를형성하였고, GFP와 luciferase 활성을측정하기위하여 Balb/c 마우스에정맥주사하였다. 복합체를주사한 2 일후, GFP 활성은항-GFP- 항체를이용하여 immunohistochemistry 21 방법으로간, 폐, 비장, 그리고신장의각조직에서측정되었으며, 음성 (negative) 의대조군 (control) 으로서플라스미드로처리한것과처리하지않은마우스를, 양성 (positive) 의대조군으로 GFP- expressing transgenic Balb/c 마우스를각각사용하였다. Luciferase 활성은복합체형성후장기에주입시킨다음각각 2일과 7일후에 luciferase 를분리하여기질과의반응으로나오는발광강도를측정하였다. 대조군으로플라스미드 DNA 로처리된마우스를사용하였다. 세포독성실험. DNA-LMWSC 복합체의세포독성은 HEK 293T와 HeLa cell을사용하였고, MTT 분석을통하여수행하였다. 96 well 세포배양 plate 의한 well 에약 개의세포를분주한후 24시간동안인큐베이터에서배양하여세포를안정되게부착시켰다. plate 의세포배양액을제거한후신선한배지 9 μl를넣고, 다양한비의 LMWSC 로형성된플라스미드복합체용액 (.5 mg/ml in PBS ph 7.4 ) 1 μl 을떨어뜨린후 2일동안인큐베이터에서배양하였다. LMWSC 용액을제거하고 MTT 용액과배지를 1:3의비율로섞어서한 well 당 4 μl 씩떨어뜨리고 2시간동안배양한후, MTT 용액을제거하고세포내의미토콘드리아활성에의해생성된 formazan 결정을 1 μl의 DMSO를이용하여 녹여내었다. 세포의생존율은 DMSO 로녹여낸용액을 57 nm에서의흡광도를측정하고다음의식을이용하여계산하였다. [(OD 57, sample -OD 57, blank ) 세포생존율 = (OD57, control -OD 57, blank )] 1 결과및토론 효율적인질병의치료를위한약물전달체나유전자전달체로서키토산은인체내에서안전하고생체내에서분해됨으로써매우가능성있는생체재료중의하나이다. 일반적으로고분자량의키토산을저분자량으로분해하기위해사용되는효소분해법은염을포함한산수용액에고분자량의키토산을용해하게된다. 이의결과로키토산의아민기에강하게염이붙어있게되는데, 이키토산은생체재료로는효율적이지못하다는문제점을가지고있다. 따라서본연구에서는젖산염이붙어있는 COS 를한외여과막을이용하여다양한분자량으로분급화한다음각각의 COS 를염제거법을통해다양한분자량의 LMWSC 를제조하였다. 또한효율적인유전자전달을위해이전의연구에서제조된유전자전달체를이용하여 in vitro 와 in vivo 에서의유전자전이효율을측정하였다. 다양한분자량을가진 LMWSC 제조및특성분석. 한외여과막을이용하여분자량별로분급화된 COS 와이를이용하여염이제거 The protons of lactic acid The protons of lactic acid 173 cm -1 COS9K COS9K COS6K COS6K COS3K COS3K D 2 O ppm LMWSC9K LMWSC9K LMWSC6K LMWSC6K H-3,4,5,6,6 Amide I Amide II LMWSC3K LMWSC3K H-2 D 2 O Figure 1. FT-IR spectra of COS and LMWSC ppm Figure 2. 1 H-NMR spectra of COS and LMWSC. Polymer(Korea), Vol. 31, No. 6, 7

4 558 장민자 ᆞ 김동곤 ᆞ 정영일 ᆞ 장미경 ᆞ 나재운 된 LMWSC 의구조적확인을위하여 FT-IR 과 NMR 을측정하였다. Figure 1에확인할수있듯이염제거방법을통해얻어진 LMWSC는 173 cm -1 부근에서나타나는젖산염피크가사라지고 165과 155 cm -1 부근에서키토산의특성피크인아마이드기와아민기가현저하게분리되어나타남으로써유리아민기를가진 LMWSC 가제조되었음을확인하였다. 또한 Figure 2 와 Figure 3에나타낸 1 H-NMR과 13 C-NMR 스펙트럼에서도알수있듯이각각 1 ppm 과 ppm 에서나타나는젖산염피크가사라졌음을확인함으로써젖산염이제거된 LMWSC 가성공적으로제조되었음을확인하였다. LMWSC 의분자량및분포를확인하기위하여 GPC 를측정하였으며, 결과는 Figure 4에나타내었다. 젖산염이제거됨으로인해 COS 에비해 LMWSC 의머무름시간 (retention time) 이조금느리게나타남으로써분자량이 The carbon of lactic acid COS 9K The carbon of lactic acid CH 3 COO- CH 3 COO- 낮아졌음을알수있었으며, LMWSC 의분자량은약 3, 6, 9 KDa 로나타났으며, 다분산도 (PDI) 값은 1.279~1.499로비교적단일한분자량분포를가짐을확인하였다. 1 H-NMR 스펙스럼및 GPC 데이터를이용하여측정된분자량, 탈아세틸화도, 그리고다분산도에대한결과를 Table 1에나타내었다. DNA-LMWSC 복합체형성및특성분석. COS 및 LMWSC와 DNA 에의해형성된복합체를확인하기위해전기영동실험을수행하였으며결과는 Figure 5에나타내었다. COS 는 DNA 와의무게비 1:8 이상에서복합체가형성되었으나, LMWSC 의경우 1: 4에서복합체가형성되었다. 이는 LMWSC 의 2번탄소위치에유리아민기가존재하므로염이강하게붙어있는 COS 에비해훨씬강한양전하를띠게되고따라서 LMWSC 가낮은무게비에서도복합체를형성할수있기때문으로사료된다. 복합체의입자크기는유전자를체내에효율적으로전달하는데있어중요한요인이되며, 본연구에서제조된유전자전달체의입자크기및형태를측정한결과는 Figure 6에나타내었다. 복합체의크기는 nm COS 6K COS 3k COS 6k COS 9k LMWSC 3k LMWSC 6k LMWSC 9k COS 3K ppm LMWSC 9K Figure 4. Gel permeation chromatograph of COS and LMWSC. DNA 1:4 1:8 1:12 1:16 1:4 1:8 1:12 1:16 LMWSC 6K LMWSC 3K ppm Figure C-NMR spectra of COS and LMWSC. DNA/LMWSC complex DNA/COS complex Figure 5. Gel retardation of LMWSC/DNA & COS/DNA complexes. Table 1. Characterization Results of COS and LMWSC M n b M w b PDI b (Polydispersity(M w /M n )) DDA c (Degree of Deacetylation) COS 3K a ± % COS 6K ± % COS 9K ± % LMWSC 3K ± % LMWSC 6K ± % LMWSC 9K ± % a fraction 1 3kDa. b calculated from GPC. c alculated from 1 H-NMR data. 폴리머, 제 31 권제 6 호, 7 년

저분자량수용성키토산이분급화된유전자전달체의제조및특성 559 3 131.±29. 193.1±38.2 25 3 Intensity(a.u.) 15 1 Intensity(a.u.) 1 5 1 1 1 1 Complex size(nm) (a) 1 1 1 1 Complex size(nm) (b) (c) Figure 6.

로단일한형태의입자크기분포를나타내고있음을알수있으며, 또한구형의매끄러운입자형태를투과전자현미경이미지를통해확인하였다. in vitro, 세포유전자전이실험. 제조되어진 COS 및 LMWSC 가유전자전달체로서응용가능성이있는지를확인하기위하여 DNA 와각각무게비 1:1부터 1:4 까지복합체를형성시킨후유전자전이실험을실시하였으며, 그결과를 Figure 7에나타내었다.

5 저분자량수용성키토산이분급화된유전자전달체의제조및특성 ± ± Intensity(a.u.) 15 1 Intensity(a.u.) Complex size(nm) (a) Complex size(nm) (b) (c) Figure 6. Particle size distribution of DNA/LMWSC(9 KDa) complex (a), DNA/COS(9 KDa) complex (b), and TEM image (c) of DNA/LMWSC complex. Figure 7. Transfection of COS/LMWSC-DNA complex to 293T cell. 로단일한형태의입자크기분포를나타내고있음을알수있으며, 또한구형의매끄러운입자형태를투과전자현미경이미지를통해확인하였다. in vitro, 세포유전자전이실험. 제조되어진 COS 및 LMWSC 가유전자전달체로서응용가능성이있는지를확인하기위하여 DNA 와각각무게비 1:1부터 1:4 까지복합체를형성시킨후유전자전이실험을실시하였으며, 그결과를 Figure 7에나타내었다. 유전자전이효율은녹색형광단백질 (GFP) 을발현하는 pegfp-n1 플라스미드 DNA 를사용하였으며, 유전자발현정도는형광현미경으로관찰을하였다. 그림에서알수있듯이이틀이지난후분자량 6K 의 LMWSC 와 DNA 복합체를사용한세포에서많은형광을관찰할수있었다. 그렇지만시간이지날수록분자량이높은 9K에서더많은형광을관찰할수있었으나, 이는인체내에주사했을때혈액내에서효소에의해분해가되므로장기간에걸친관찰은의미가없는것으로써 3일이후의결과는고려하지않았다. 분자량이낮은 3K 의경우유전자전이효율이매우낮은것으로나타났으며이는분자량이 3K인 LMWSC 의경우분자량이작아서빨리분해가일어나며, 이로써 DNA 가효소에의해분해가일어났기때문인것으로사료된다. 또한분자량 9K의경우는분자량이크기때문에 LMWSC/DNA 복합체의크기가커지므로세포내로의흡수가늦게일어나고따라서 DNA 가 LMWSC 로부터방출되는데시간이오래걸려나타난결과라고할수있다. 이로써유전자전달체에서분자량은높은전이효율을나타내는데아주중요한요소가됨을확인할수있었으며, COS 와 LMWSC 의전이효율을비교했을경우결과적으로유리아민기를가진 LMWSC 의전이효율이더우수함을확인할수있었다. in vivo, 유전자발현효율. 염이제거된유리아민기를가진 LMWSC 는다른기능성기로의개질이용이하다는장점을가지고있다. 따라서본연구팀에의해이미제조되어유전자전달체로서의가능성을높이평가받은 LMWSC-AWBP(A) 와 LMWSC-Ch(B) 를이용하여 in vivo 실험을수행하여유전자발현효율을측정하였다. LMWSC 에기능성기가도입된유도체는특정조직을표적할수있는유전자전달체로서, LMWSC-AWBP 의경우동맥벽과특이적으로결합할수있으며, 콜레스테롤 (Ch) 이결합된 LMWSC-Ch 의경우저밀도지방단백질수용체에의해엔도사이토시스메커니즘으로세포내에도입될수있는특성을가진전달체이다. 본실험에서는 LMWSC- AWBP 그리고 LMWSC-Ch와 pcmv-gfp, pcmv-luciferase 로각각복합체를형성한다음 Balb/c 마우스에주사하였다. 일정시 Polymer(Korea), Vol. 31, No. 6, 7

56 장민자 ᆞ 김동곤 ᆞ 정영일 ᆞ 장미경 ᆞ 나재운 간이지난후마우스의각장기로부터 GFP 와 luciferase 활성을측정하였다.

이결과를바탕으로효율이높은 LMWSC-Ch 의 luciferase 활성을측정하기위하여위와동일한방법으로마우스에주사한후각장기에대한발현효율을측정한결과 (Figure 9)

이는간세포주변에저밀도지방단백질수용체가풍부하게존재하여엔도사이토시스메커니즘에의해많은양의 pcmv-luciferase/ LMWSC-Ch 복합체가흡수되었음을알수있었다.

Figure 1에서는다양한분자량으로제조되어진 LMWSC 가유전자전달체로서가능성이있는지를평가하기위하여 MTT 분석을실시하여세포내독성을확인하였다.

Figure 9. In vivo luciferase expression by LMWSC-Ch gene delivery.

6 56 장민자 ᆞ 김동곤 ᆞ 정영일 ᆞ 장미경 ᆞ 나재운 간이지난후마우스의각장기로부터 GFP 와 luciferase 활성을측정하였다. Figure 8의결과로부터저밀도지방단백질수용체와결합할수있는기능성기를가진유전자전달체로서 LMWSC-Ch 가 LMWSC-AWBP 또는플라스미드와비교했을때특히간과신장에서더욱높은 GFP 발현효율을나타냈음을확인할수있었다. 이결과를바탕으로효율이높은 LMWSC-Ch 의 luciferase 활성을측정하기위하여위와동일한방법으로마우스에주사한후각장기에대한발현효율을측정한결과 (Figure 9) 대조군인플라스미드를주사한마우스에비해간에서훨씬더많은효율을나타내었다. Figure 8. In vivo GFP expression by LMWSC-AWBP(A) and LMWSC-Ch(B) gene delivery. 이는간세포주변에저밀도지방단백질수용체가풍부하게존재하여엔도사이토시스메커니즘에의해많은양의 pcmv-luciferase/ LMWSC-Ch 복합체가흡수되었음을알수있었다. 그러나 7일후에는어느장기에서도거의 luciferase 발현이되지않았음을확인하였는데, 이것은본실험에서제조한유전자전달체는 7일이상이경과된후에는모두분해가되어체외로빠져나가기때문인것으로사료된다. 세포독성실험. Figure 1에서는다양한분자량으로제조되어진 LMWSC 가유전자전달체로서가능성이있는지를평가하기위하여 MTT 분석을실시하여세포내독성을확인하였다. 293T 및 HeLa 세포주를이용하여세포독성실험을실시한결과, DNA 와의무게비 Luciferase(RLU/mg protein) Liver Lung Spleen Kidney Figure 9. In vivo luciferase expression by LMWSC-Ch gene delivery Control DNA 1:8 1:16 1:32 1:5 Control DNA 1:8 1:16 1:32 1:5 (a) Control DNA 1:8 1:16 1:32 1:5 Control DNA 1:8 1:16 1:32 1:5 (b) Figure 1. Cytotoxicity of LMWSC/DNA complex (a) & COS/ DNA complex (b) by MTT assay. 폴리머, 제 31 권제 6 호, 7 년

7 저분자량수용성키토산이분급화된유전자전달체의제조및특성 561 1:8부터 1:5 까지모두세포생존율이 1% 에가까웠으며이로써어떠한세포내독성도나타나지않음을확인할수있었다. 따라서유전자전달체로서의응용가능성이있음을확인하였다. 결 본연구에서는한외여과막장치를이용하여 1~3, 3 1, 그리고 1 3 KDa 의다양한분자량범위를가진 COS 를제조하였고그특성을분석하였다. 이 COS 를새로운염제거법을사용하여염을제거함으로써성공적으로 3, 6, 그리고 9 KDa 의분자량을가진 LMWSC 를제조하였으며특성을분석하였다. 유전자전달체에도입하기위해먼저 DNA 와의응축능력을전기영동실험으로확인한결과 LMWSC 의경우 DNA 와무게비 1:4 이상에서복합체가형성됨을확인할수있었다. 복합체의입자또한 nm 이하의크기를나타냄으로써생체의료용에응용함에있어아주적합하며, 구형의형태를지님을확인하였다. 유전자전이효율을평가하기위해녹색형광단백질을발현시키는플라스미드 DNA 를사용한결과, 분자량이 6 K인 LMWSC 의발현효율이가장높게나타남을확인함으로써유전자전달체에효과적인분자량을확인할수있었다. 세포내독성을확인하기위하여 MTT 분석을수행하였으며아무런독성도나타나지않음을확인하였다. 또한특정조직을표적할수있는기능성기를가진 LMWSC 유도체의 in vivo 에서의발현효율을측정한결과저밀도지방단백질수용체와결합할수있는기능기를가진 LMWSC- Ch 가가장높은효율을나타내었으며, 이로써 LMWSC 및그유도체는유전자전달체로서의가능성이있는비바이러스성벡터로고려되어질수있음을확인하였다. 감사의글 : 본연구는한국산학협동재단, 순천대학교공대학술재단및한국여성공학기술인협회 7 WATCH 21 프로그램의지원을받아수행하였습니다. 론 참고문헌 1. L. Huang, M. C. Hung, and E. Wagner, Nonviral vectors for gene therapy, Academic Press, New York, M. Lee and S. W. Kim, Pharmaceut. Res., 22, 1 (5). 3. M. Ruponen, Y. Herruala, and A. Urtti, Biochimica et Biophysica Acta, 1415, 331 (1999). 4. K. Y. Lee, I. C. Kwon, Y. H. Kim, W. H. Jo, and S. Y. Jeong, J. Control. Release, 51, 213 (1998). 5. D. H. Seo, B. C. Shin, and M. S. Kim, Polymer(Korea), 29, 277 (5). 6. J. H. Felgner, R. Kumar, and C. N. Sridhar, J. Bio. Chem., 269, 255 (1994). 7. J. S. Kim, A. Maruyama, T. Akaike, and S. W. Kim, J. Control. Release, 47, 51 (1997). 8. G. Y. Wu and C. H. Wu, Biochemistry, 27, 887 (1988). 9. G. Y. Wu and C. H. Wu, J. Bio. Chem., 262, 4429 (1987). 1. G. Y. Wu, J. M. Wilson, F. Shalaby, M. Grossman, D. A. Shafritz, and C. H. Wu, J. Bio. Chem., 266,14338 (1991). 11. K. Kunath, A. V. Harpe, D. Fisher, and T. Kissel, J. Control. Release, 88, 159 (3). 12. T. Reschel, C. Konak, D. Oupicky, L. W. Seymour, and K. Ulbrich, J. Control. Release, 81, 1 (2). 13. R. Hejazi and M. Amiji, J. Control. Release, 89, 151 (3). 14. M. Thanou, J. C. Verhoef, and H. E. Junginger, Adv. Drug Deliver. Rev., 52, 117 (1). 15. K. Ogawa, T. Yui, and K. Okuyama, Int. J. Bio. Macromol., 34, 1 (4). 16. W. G. Liu, X. Zhang, S. J. Sun, G. J. Sun, K. D. Yao, D. C. Liang, G. Guo, and J. Y. Zhang, Bioconjugate Chem., 14, 782 (3). 17. Y. H. Kim, S. H. Gihm, C. R. Park, K. Y. Lee, T. W. Kim, I. C. Kwon, H. Chung, and S. Y. Jeong, Bioconjugate Chem., 12, 932 (1). 18. J. W. Nah and M. K. Jang, J. Polym. Sci.; Part A: Polym. Chem., 4, 3796 (2). 19. C. Choi, M. K. Jang, and J. W. Nah, Polymer(Korea), 3, 279 (6).. C. Choi, D. G. Kim, M. J. Jang, T. H. Kim, M. K. Jang, and J. W. Nah, J. Appl. Polym. Sci., 12, 3545 (6). 21. M. Huisinga, K. Failing, and M. Reinacher, Vet. Immunol. Immunop., 118, 21 (7). Polymer(Korea), Vol. 31, No. 6, 7

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를