Printed in the Republic of Korea 갈조류지충이로부터분리한 3 개의 Norisoprenoids 화합물 박기의 김유아 정현아 이희정 안종웅 이범종 서영완 * 한국해양대학교해양과학부 한국해양대학교해양과학기술연구소 인제대학교화학과 (2004. 1. 26 접수 ) Three Norisoprenoids from the Brown Alga Sargassum thunbergii Ki Eui Park, You Ah Kim, Hyun Ah Jung, Hee Jung Lee, Jong-Woong Ahn, Burm-Jong Lee, and Youngwan Seo* Devision of Ocean Science, Korea Martime University, Busan 606-791, Korea Research Institute of Marine Science and Technology (RIMST), Korea Martime University, Busan 606-791, Korea Department of Chemistry, Inje University, Gimhae 621-749, Korea (Received January 26, 2004) 요약. 우리나라연안에널리분포하고있는지충이로부터 3개의 norisoprenoid 화합물들인 (+)-epiloliolide (1), (-)-loliolide (2), apo-9'-fucoxanthinone (3) 을칼럼크로마토그래피와역상 HPLC를사용하여분리 정제하였다. 이들분리한화합물 1, 2 및 3은갈조류인지충이로부터처음분리되어보고하는것이다. 특히화합물 1은비록육상식물에서분리된바있으나, 해양생물로부터는처음분리되어보고하는것이다. 분리된화합물의구조는 1 H COSY, NOESY, HMQC 그리고 HMBC와같은이차원적인 NMR 분광학적인실험을이용하여문헌치와비교하여확인하였다. 주제어 : 갈조류, 지충이, 노르이소프레노이드 ABSTRACT. From Sargassum thunbergii which is widely distributed in coastal area of Korea, three norisoprenoids, (+)-epiloliolide (1), (-)-loliolide (2), and apo-9'-fucoxanthinone (3) were isolated by using column chromatography and reverse-phase HPLC. Compound 1, 2 and 3 were for the first time isolated from the Brown Alga Sargassum thunbergii. Particularly, Compound 1 was for the first time isolated the marine organism although it was reported from the terrestrial plant. Their structures have been determined by extensive 2-D NMR experiments such as 1 H COSY, NOESY, HMQC, and HMBC and by comparison with the reported data in the literature. Keywords: Brown Alga, Sargassum thunbergii, Norisoprenoid 서론갈조식물 (Phaeophyta) 모자반과 (Sargassaceae) 에속하는지충이 (Sargassum thunbergii) 는우리나라전연안에서흔히볼수있는해조류로서조간대하부에서뚜렷한군락을이루고있다. 어린식물은흔히사료로사용되고있으나크게주목받지못하고있던해조류로서이생물에대한화학적인연구는매우드물어이등에 의한지충이를이용한중금속의흡착제를개발, 1 2종류의 glyceroglycolipids 분리, 2 추출물분획에대한약간의생리활성도에대한보고가거의전부이다. 3,4 그러므로본연구에서는최근다양한해조류의산업적이용을위해이루어지고있는신규기능성물질개발에부응하여우리나라전해안에걸쳐풍부하게자생하고있는지충이로부터다양한화합물을분리하고자하였다. -394-
지충이에서분리된 Norisoprenoids 395 실험방법시약및기기 Column packing materials은 RP 18 (YMC-GEL ODS- A, 12 nm, S-75 µm) 을사용하였으며, TLC plate는 RP 18 F254s(Merck) 를사용하였으며, spray reagent는 5% H2SO4를사용하였다. 추출및분획, column chromatography 에사용한모든용매는 1급시약을사용하였다. Varian RI detector와 high performed liquid chromatography (HPLC, Dionex P580) 을사용하여화합물을정제 분리하였다. 사용한 HPLC column은 YMC pack ODS-A (250 10 mm, S 5 µm, 12 mm) 을사용하였고 quard column(7.5 4.6 mm, Alltech) 을사용하였다. 선광도는 CH2Cl2 용매로 polarimeter(atago, POLAX-2L) 를사용하여측정하였다. 분리한화합물의구조를동정하기위하여 Varian NMR 300 spectrometer를사용하였으며 NMR 측정시용매는 CD3OD와 CDCl3(Cambridge Isotope Laboratories, Inc., USA, deuterium degree 99.8%) 를사용하였다. 해조시료실험에사용한지충이는 2002년 10월부산기장에서직접채집하였으며응달에서건조한후추출하기전까지 25 o C에서보관하였다가추출할때는잘게잘라서사용하였다. 지충이의추출물및각분획물제조채집한지충이는 CH2Cl2:acetone(1:1, v/v) 용매로 2 회추출하고난이후 MeOH로 2회추출하여각각 29.382 g과 23.011 g의추출물을얻었으며 1/2을덜어 vial에보관하였다. CH2Cl2:acetone 추출물과 MeOH 추출물을 1:1로혼합한조추출물 24.9382 g을극성순서에따라순차적으로분획하여 n-hexane, 15% MeOH, n-buoh, H2O fractions을얻었으며감압농축기 (EYELA, N-N series) 를사용하여농축하여각각 3.602 g, 8.783 g, 1.240 g, 8.054 g을얻었다. 화합물의분리지충이의 15% MeOH fraction의 1/2(4.32 g, w/w) 을덜어 RP flash column chromatography를실행하여각각 50% (rfc 1, 223.8 mg), 40% (rfc 2, 62.8 mg), 30% (rfc 3, 93.0 mg), 20% (rfc 4, 194.9 mg), 10% aqueous MeOH (rfc 5, 634.0 mg) subfraction과 100% MeOH (rfc 6, 1.586 g) 그리고 100% EtOAc fraction (rfc 7, 1.323 g) 을얻었다. 그중 rfc 2 fraction을 1/2 (37.3 mg, w/w) 을덜어 43% aqueous MeOH 용매로역상 HPLC하여 14개의 subfractions (rfc2-1~14) 을얻었으며, 그중 subfraction 4 (rfc2-4, 9.0 mg) 와 5 (rfc2-4, 5.2 mg) 를 NMR 측정한결과각각 (+)-epiloliolide (1) 와 (-)-loliolide (2) 로구조를확인할수있었다. 또한 rfc 3 fraction의 1/2 (93.0 mg, w/w) 을덜어 38% aqueous MeOH 용매로 HPLC하여 11개의 subfractions (rfc3-1~11) 을얻었으며, 그중 subfraction 8 (rfc3-8, 5.8 mg) 을 NMR 측정하여구조분석한결과, apo-9'-fucoxanthinone (3) 임을확인할수있었다. (6S,7aS)-6-hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7atetrahydrobenzofuran-2(4H)-one, (+)-Epiloliolide (1). 22 a colorless gum; [α] D +82.5 (c 0.01, CHCl3); LRFABMS m/z (C11H16O3 + H) + 197; 1 H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.26 (3H, s, H-10), 1.31 (3H, s, H-9), 1.33 (1H, t, J = 12.1 Hz, H-5), 1.51 (1H, t, J = 11.8 Hz, H-7), 1.58 (3H, s, H-8), 1.583 (s, OH), 2.00 (1H, ddd, J = 2.2, 4.2 and 11.7 Hz, H-5), 2.53 (1H, ddd, J = 2.2, 4.2 and 11.2 Hz, H-7), 4.12 (1H, tt, J = 4.1 and 12.3 Hz, H- 6), 5.70 (1H, s, H-3); 1 H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 1.28 (3H, s, axial, H-10), 1.28 (1H, dd, J = 9.8 and 9.8 Hz, H-5), 1.31 (3H, s, H-9), 1.42 (1H, dd, J = 11.7 and 11.7 Hz, H-7), 1.59 (3H, s, axial, H-8), 2.00 (1H, ddd, J = 2.2, 4.3 and 13.0 Hz, H-5), 2.46 (ddd, J = 2.2, 3.9 and 11.7 Hz, H-7), 4.09 (1H, m, H-6), 5.77 (1H, s, H-3); 13 C-NMR (75.5 MHz, CD3OD) δ: 25.34 (C-10), 25.82 (C-9), 30.33 (C-8), 36.18 (C-4), 49.81 (C-7), 50.69 (C-5), 65.21 (C-6), 88.49 (C-7a), 113.59 (C-3), 173.77 (C-2), 183.67 (C-3a). (6S,7aS)-6-hydroxy-4,4,7a-trimethyl-5,6,7,7a-tetrahydrobenzofuran-2(4H)-one, (-)-Loliolide (2). a colorless 22 gum; [α] D -100.5 (c 0.01, CHCl3); LRFABMS m/z (C11H16O3 + H) + 197; 1 H-NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 1.27 (3H, s, H-9), 1.47 (3H, s, H-8), 1.52 (dd, J = 13.7 and 3.9 Hz, H-7), 1.76 (dd, J = 13.7 and 4.1 Hz, H-5), 1.78 (3H, s, H-10), 1.98 (dt, J = 2.4 and 14.0 Hz, H-7), 2.54 (dt, J = 2.8 and 14.0 Hz, H-5), 4.30 (m, H-6), 5.69 (s, H-3); 1 H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ: 1.26 (3H, s, H-9), 1.47 (3H, s, axial, H-8), 1.50 (1H, dd, J = 14.3
396 박기의 김유아 정현아 이희정 안종웅 이범종 서영완 and 3.6 Hz, H-7), 1.75 (1H, dd, J = 13.8 and 3.9 Hz, H-5), 1.78 (3H, s, equatorial, H-10), 2.01 (dt, J = 14.3 and 2.6 Hz, axial, H-7), 2.48 (1H, dt, J = 13.8 and 2.6 Hz, axial, H-5), 4.30 (1H, brq, J = 3.4 Hz, H-6), 5.67 (1H, s, H-3); 13 C-NMR (75.5 MHz, CD3OD) δ: 26.86 (C-10), 26.36 (C-9), 30.57 (C-8), 36.00 (C-4), 45.42 (C-7), 47.03 (C-5), 66.28 (C-6), 87.13 (C-7a), 112.36 (C-3), 172.15 (C-2), 183.00 (C-3a). (3R)-4-[(2R,4S)-4-acetoxy-2-hydroxy-2,6,6-trimethylcyclohexylidene]but-3-en-2-one, apo-9'-fucoxanthinone (3). a colorless gum; negative FABMS m/z (C15H22O4- H) 265; 1 H-NMR (300 MHz, CD 3OD) δ: 1.16 (3H, s, H-12), 1.43 (6H, s, H-11 and 13), 1.44 (1H, m, H-2a), 1.52 (dd, J = 12.9 and 11.3 Hz, H-4b), 2.03 (1H, m, H-2b), 2.04 (3H, s, H-15), 2.18 (3H, s, H-10), 2.33 (ddd, J = 2.2, 4.4 and 13.1 Hz, H-4a), 5.37 (1H, tt, J = 11.4 and 4.3 Hz, H-3), 5.86 (1H, s, H-8); 13 C-NMR (75.5 MHz, CD 3OD) δ: 21.42 (C-15), 26.49 (C-10), 28.99 (C-11), 30.87 (C-13), 31.68 (C-12), 36.08 (C-1), 45.02 (C-2), 45.07 (C-4), 67.44 (C-3), 72.02 (C-5), 100.83 (C-8), 118.33 (C-6), 170.25 (C-14), 197.87 (C-9), 209.27 (C-7). 결과및고찰 지충이 15% aqueous MeOH fraction을 RP-18 column chromatography와역상 HPLC를수행하여 3개의화합물을분리하였으며분리한화합물은각각 CD 3OD를용매로하여 NOESY, HMQC 그리고 HMBC와같은이차원적인 NMR 실험방법을통해그구조를확인하였다 (Fig. 1). 지충이로부터분리된 3개의화합물은이미분리된물질의문헌치와비교하여그구조를최종확인하였다. 화합물 1은무색의 gum으로분리되었으며, 1 H NMR (300 MHz, CD 3OD) 측정결과, δ 1.28 (3H, s, axial), 1.31 (3H, s) 그리고 1.59 (3H, s, axial) 에서 3개의 methyl peak와 δ 1.28 (1H, dd, J = 9.8 and 9.8 Hz, H-5), 1.42 (1H, dd, J = 11.7 and 11.7 Hz, H-7), 2.00 (1H, ddd, J = 2.2, 4.3 and 13.0 Hz, H-5), 2.46 (ddd, J = 2.2, 3.9 and 11.7 Hz, H-7), 4.09 (1H, m, H-6) 에서하나의 carbinol proton과그에인접한두개의 methylene peaks 의존재를, δ 5.77 (1H, s, H-3) 에서한개의이중결합 Fig. 1. Structures of isolated compounds from Sargassum thunbergii. 에관여하는 proton peak를확인할수있었다. 또한 13 C NMR (75.5 MHz, CD 3OD) 에서 δ 113.59 (C-3), 173.77 (C-2) 그리고 183.67 (C-3a) 에서 α, β-unsaturated-γlactone group에해당되는특징적인 peak를확인할수있었고 δ 65.21 (C-6) 과 88.49 (C-7a) 에서 oxygenated carbon의 peak가나타나는것으로보아이화합물이 α, β-unsaturated-γ-lactone group과 carbinol carbon과 2개의 methylene carbon 그리고 3개의 tertiary methyl group 으로구성된 2환구조임을추정할수있었다. 특히 NOESY spectrum 결과 (Fig. 2), H-6 (δ 4.12, 1H, tt, J = 4.1 and 12.3 Hz), H-10 (δ 1.26, 3H, s, axial), H-8 (δ 1.59, 3H, s, axial) 이 correlation하고있는것으로보아이화합물이 (+)-(6S,7aS)-epiloliolide 임을추정할수있었다. 화합물 1을문헌치 5,6 와비교하기위하여
지충이에서분리된 Norisoprenoids 397 Fig. 2. NOESY Correlation of key protons for epiloliolide (1). Fig. 3. NOESY Correlation of key protons for loliolide (2). CDCl 3 용매를이용하여다시 1 H-NMR를측정하였으며구조가동일함을재확인할수있었다. 화합물 2 역시무색의 gum으로분리되었으며, 1 H NMR (300 MHz, CD 3OD) 측정결과, 화합물 1과유사한 peak pattern을보이는것으로보아이화합물역시 α,β-unsaturated-γ-lactone group과 carbinol carbon과 2 개의 methylene carbon 그리고 3개의 tertiary methyl group으로구성된 2환구조임을추정할수있었다. 정확한구조를확인하기위해이차원적 NMR 실험을수행하였으며그결과화합물 1과는다른 NOESY correlation을나타내었다 (Fig. 3). 특히화합물 1에서나타났던 H-6 (δ 4.30, 1H, br quin, J = 3.4 Hz) 의 methyl groups [H-10 (δ 1.78, 3H, s, equatorial), H-8 (δ 1.47, 3H, s, axial)] 과의특징적인 correlation은사라진것으로보아, 이화합물은 (-)-(6R,7aS)-loliolide임을추정할수있었다. 화합물 2을문헌치 5-8 와비교하기위하여 CDCl 3 용매를이용하여다시 1 H-NMR를측정하였으며구조가동일함을재확인할수있었다. 화합물 3은무색의 gum으로분리되었으며, 1 H NMR (300 MHz, CD 3OD) 측정결과, δ 1.26 (3H, s, H-9), 1.47 (3H, s, axial, H-8), 1.50 (1H, dd, J = 14.3 and 3.6 Hz, H-7), 1.75 (1H, dd, J = 13.8 and 3.9 Hz, H-5), 1.78 (3H, s, equatorial, H-10) 에서 5개의 methyl group의 peak를확인할수있었으며, δ 5.86 (1H, s, H-8) 에서한개의이중결합에관여하는특징적인 proton peak를확인할수있었다. 또한 13 C NMR (75.5 MHz, CD 3OD) 에서 δ 100.8 (C-8), 209.3 (C-7) 및 118.3 (C-6) 에서특징적인 allene group의존재도확인할수있었고, δ 197.9 (C-9) 과 170.3 (C-14) 에서 carbonyl group의 peak를확인할수있었으며 2개의 methylene peaks (δ 45.2 & 45.1) 를확인할수있었다. 측정치를문헌치9와비교한결과화합물 3의구조가 apo-9'-fucoxanthinone임을확인할수있었다. 화합물 1과 2는육상식물에서몇번발견되었으나해양생물에서는발견된예가매우드물어갈조류 Cystophora moniliformis와해양연체동물에서각각한번분리되었다. 5,7 또한화합물 3은특이한 allene group을가지고있는대사물질로서해양미세조류에서한번분리된경우를제외하고 9 이번에처음으로부산연안에서채집한갈조류지충이에서발견되었다. 이와같이화합물 1, 2 및 3은해양천연물로는매우드물게발견된다고할수있으나이화합물을함유하고있는갈조류인지충이는우리나라연안에풍부하게존재하는종이기때문에이화합물들을손쉽게분리, 정제할수있을것이다. 화합물중 2와 3은각각면역억제활성과세포독성이보고된바있으며 9,10 해양에서드물게발견되는생태학적인특성을감안할때매우흥미있는활성이기대된다. 따라서추후추가적으로다량의화합물을분리한후이들에대한다양한활성을검색할예정이다. 이논문은한국학술진흥재단의지원에의하여연구되었습니다 (KRF-2002-005-C00005). 그리고시료를분류해주신유종수박사님께감사드립니다. 인용문헌 1. Suh, K.H.; Lee, H.S.; Suh, J.H. Bull. Kor. Fisher. Soc., 2000, 33, 60. 2. Son, B.W.; Cho, Y.J.; Kim, N.K.; Choi, H.D. Bull. Kor. Chem. Soc., 1992, 16, 584. 3. Itoh, H; Noda, H.; Amano, H.; Zhuaug, C. Anticancer res., 1993, 13, 2045. 4. Tsukamoto, S; Hirota, H.; Kato, H.; Fusetani, N. Fisher. sci., 1994, 60, 319. 5. Mori K.; Khlebnoikov. Liebigs Ann. Chem., 1993, 77.
398 박기의 김유아 정현아 이희정 안종웅 이범종 서영완 6. Chung, A.K.; Kwon, H.C.; Choi, S.Z.; Min, Y.D.; Lee, S.O.; Lee, W.B.; Yang, M.C.; Lee, K.H.; Nam, J.H.; Kwak, J.H.; Lee, K.R. Kor. J. Pharmacogn., 2002, 33, 81. 7. Ravi, B.N.; Murphy, P.T.; Lidgard, R.O.; Warren, R.G.; Wells, R.J. Aust. J. Chem. 1982, 35, 171. 8. Machida, K.; Kikuchi, M., Phytochem. 1996, 41, 1333. 9. Doi, Y.; Ishibashi, M.; Yamaguchi, N.; Kobayashi, J. J. Nat. Prod. 1995, 58, 1097. 10. Okada, N.; Shirata, K.; Niwano, M.; Koshino, H.; Uramoto, M. Phytochem. 1994, 37, 281.