대한진단검사의학회지 : 제 25 권제 4 호 25 Korean J Lab Med 25; 25: 27-22 진단혈액학 REDQUANT 및 CELLQUANT kit 를이용한 PNH 진단 김경희 한진영 김정만 동아대학교의과대학진단검사의학교실 Diagnosis of Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria (PNH) by the REDQUANT and the CELLQUANT kits Kyeong Hee Kim, M.D., Jin Yeong Han, M.D., and Jeong Man Kim, M.D. Department of Laboratory Medicine, Dong-A University College of Medicine, Busan, Korea Background : Paroximal nocturnal hemoglobinuria (PNH) is a disorder of the pluripotent stem cells resulting in a deficient expression of membrane-bound GPI-anchored proteins in different cell types. We evaluated REDQUANT and CELLQUANT kits (Biocytex, Marseille, France) for PNH test. Methods : Seventy patients with peripheral blood cytopenia and 6 healthy controls were studied. RBCs and were tested for and expression using the REDQUANT and CELLQUANT kits and an Epics XL flow cytometer. According to the manufacturer s instruction, results were interpreted abnormal when more than 3% of cells were deficient in the expression of or, and a test was considered positive for PNH if three of the four markers tested were abnormal. Results : The percentage of / deficient RBCs and was.3/3. and 3.5/., respectively, in the patient group, and./. and.3/9.7, respectively, in the control group. PNH was diagnosed in three patients who had a deficiency in the expression of three or four antigens; two other patients showed a deficiency in two antigens. There were many who had deficiency only: on in 3 patients and controls, and on RBCs in 6 patients and 2 controls. One patient had deficient. Conclusions : The REDQUANT/CELLQUANT kit is a standardized method and does not require normal samples as the control, but one should be cautious in interpreting the results showing expression on. (Korean J Lab Med 25; 25: 27-22) Key Words : Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH, Flow cytometry,,, RED- QUANT, CELLQUANT 서 발작성야간혈색뇨증 (paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, PNH) 은후천적인조혈모세포의클론성질환으로서, 여러계열의 세포에세포막 - 결합 glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored protein 의발현장애를특징으로한다 [-3]. GPI 연결단백질들 접수 : 25년 3월 3일접수번호 : KJLM84 수정본접수 : 25년 5월 25일교신저자 : 한진영우 62-75 부산광역시서구동대신동 3가 동아대학교의과대학진단검사의학교실전화 : 5-24-5323, Fax: 5-255-9366 E-mail: jyhan@dau.ac.kr 론 중 decay accelerating factor (DAF) 인 와 membrane inhibitor of reactive lysis (MIRL) 인 가보체에의한세포의용혈에가장크게관여하는것으로알려져있다 [4, 5]. 이러한세포막의 GPI 연결단백질은유세포분석법을이용하여적혈구나과립구등에서정확하게측정될수있으며, PNH의진단에중요한방법으로이용되어왔다 [6-8]. 그러나이를위해서는환자검체와함께대조군을별도로확보해야하는제한점이있다. 본연구에서는정상과환자군의감별을위해키트내에내장된 precalibrated 를사용하여말초혈액의적혈구와과립구로부터 및 결핍을분석하는 REDQUANT 및 CEL- LQUANT / 키트 (Biocytex, Marseille, France) 의 27
28 김경희 한진영 김정만 유용성에대해조사하였다. 3. 과립구표면항원검사. 환자 대상및방법 REDQUANT 및 CELLQUANT kit의유용성을알아보기위해다양한정도의말초혈구감소증을동반한 7명의환자 (Table ) 와 CBC 검사에서특이사항이없는건강대조군 6명을대상으로하였다. 검체는 EDTA 시험관에채혈된말초혈액을이용하였고, 채혈후 6시간이내검사가이루어지도록하였다. 2. 적혈구표면항원검사 검체는 REDQUANT / 키트 (Biocytex, Marseille, France) 내의설명서대로검사하였다. 키트내에는 와 단클론항체, 항-mouse IgG FITC 시약, 분석을위한 precalibrated bead액과 분석을위한 precalibrated bead 액, 희석액으로구성되어있다. EDTA 시험관에채혈된전혈 L에희석액.5 ml을넣어 vortex 혼합을한다. bead 액 4 L과 bead 액 4 L을각각시험관에넣는다. 두개의시험관에희석된혈액검체 2 L를넣고 단클론항체시약과 단클론항체시약 2 L씩을각각넣어 vortex 혼합을하고실온에 분간둔다. 형광염색을하기위해 precalibrated bead 액, precalibrated bead 액, 그리고검체가든시험관 2개총 4개의시험관에 2 L의항-mouse IgG-FITC 시약을넣고 vortex 혼합후실온암소에 분간둔다. 4개의시험관모두에희석액 2 ml를넣어냉장보관하며 4시간이내유세포분석을하였다. 검체채취부터유세포분석까지총 24시간이넘지않도록하였다. Table. Characteristics of 7 cytopenic patients Age (yr) 45.7±9.9* (range: 8-82) Sex (n) M:F=28: 42 Clinical diagnosis (n) aplastic anemia 6 iron deficiency anemia 4 hemolytic disorder 9 immune thrombocytopenia 7 myelodysplastic syndrome 5 hypocelluar marrow 4 hematologic malignancy 3 cardiac and cerebral disorder 3 other disorders 6 known PNH pancytopenia with erythroid hyperplasia 2 Hb (g/dl) 8.4±2.9 WBC (/ L) 5,32±3,82 Platelet (/ L) 29,5±28,996 *expressed as mean±sd. 검체는 CELLQUANT / 키트 (Biocytex, Marseille, France) 내의설명서대로검사하였다. 키트내에는 와 단클론항체, 항-mouse IgG FITC 시약, precalibrated bead, 희석액, 적혈구용해액, 그리고 saturation액으로구성되어있다. EDTA 시험관에채혈된전혈에있는적혈구를용해하기위해전혈 4 L에미리희석한적혈구용해액 8 ml를섞고실온에 분간둔다. 3 g에서 5분간원심분리한후상층액은버린다. pellet를 2 ml의희석액에부유하여 3 g에서 5분간원심분리한다. 상층액은피펫으로흡인하여버리고, 백혈구 pellet에희석액 L을부유한다. 두개의시험관에 25 L씩부유된백혈구 pellet을나누어담고, 와 단클론항체 25 L씩각각넣어 분간실온에둔다. 또다른시험관에는 vortex로미리잘혼합한 precalibrated bead액 L와 saturation액 25 L을잘섞는다. 와 단클론항체가든두개의검체시험관과 bead가든시험관에항-mouse IgG FITC 시약 25 L씩을각각추가하여실온암소에 분간방치한후희석액 3 ml씩을각각시험관에넣어유세포분석전까지 4 에보관하였고 4시간이내분석을마쳤다. 검체채취부터유세포분석까지총 8시간이넘지않도록하였다. 4. 유세포분석기측정검체는 Coulter Epics XL (Beckman Coulter, Hialeah, FL, USA) 로분석하였다. 데이터들은 SYSTEM II (Beckman Coulter, Hialeah, FL, USA) 소프트웨어를이용하였다. REDQUANT / 검사의경우에는최소,개의 bead 혹은세포를수집하였으며, bead를먼저분석하였다. Forward side scatter (FSC) 와 side scatter (SSC) 를모두 log 증폭한이중 plot에서 bead를 gating을한후 FL에서 FITC 형광 event들이 log 증폭한히스토그램에서보이도록하였다. 최적의분석을위해 FITC PMT 전압은 bead의형광최고치가 log 증폭한가로축의세번째구간에오도록조정하였다. bead에맞추어진설정환경은 bead와적혈구분석에도그대로적용하였다 (Fig. ). CELLQUANT / 검사의분석은 bead 혹은과립구검체당최소 5,개의수집이필요하였다. bead는 FSC와 SSC의이중 plot에서형광 event를수집하고 linear 증폭을하였다. FITC PMT 전압은 bead의형광최고치가 FL 히스토그램에서세번째위치에오도록조정하고, 환자검체의과립구분석시에도그대로적용하였다 (Fig. 2). 5. 데이터판독와 bead의평균형광강도 (mean fluorescence intensity, MFI) 를구하였고, 기하평균으로계산하였다. 와 결
REDQUANT 및 CELLQUANT kit 를이용한 PNH 진단 29 Beads analysis and set up of interpretation cursors Beads analysis and set up of interpretation cursors SS LOG SS (MFI=57.) (MFI=7.9) (MFI=57.5) - - - - - - - FS LOG IgG-FITC/ Analysis of RBCs IgG-FITC/ A FS /59 Analysis of A.2% SS LOG.%.5% SS.% - - FS LOG Fig.. REDQUANT: the upper line (A) shows the analysis of and the lower line (B) shows the analysis of a healthy control. 핍군의퍼센트를구하기위해 cutoff값을설정하였다. 형광히스토그램에서 와 결핍구간을정하였는데최소점경계는히스토그램의가장좌측인첫째채널로하고, 오른쪽최대경계는각 bead의형광강도 (Fluorescence intensity, FI) 로계산되어진값에따라정하였다. 적혈구의경우 cutoff는 FI= bead MFI 이고 cutoff는 FI= bead MFI로계산하고, 과립구 cutoff는 FI= bead MFI이고 cutoff는 FI= bead MFI의계산식에서구하였다. REDQUANT와 CELLQUANT를모두사용한경우적혈구 와 결핍퍼센트, 과립구 와 결핍퍼센트네가지의값을얻을수있고, 결핍된세포구간이 3% 이상일경우양성으로하였다. 4개의항원검사중세개이상에서양성일때 PNH로진단하였다.. 건강인대조군결과 - 결 CBC 검사에서특이사항이없는건강인대조군 6명을대상으로 REDQUANT 및 CELLQUANT kit 검사를실시한결과 결핍분획은적혈구및과립구모두한예도관찰되지않았 지만 결핍분획은적혈구의경우 2 명 ( 각각 3.28% 와 5.42%), 과 - Table 2. Percentages of antigen- in healthy control subjects and cytopenic patients Erythrocyte (mean; range) Granulocyte (mean; range) Control (n=6)...3 9.7 (.-.2) (.-5.4) (.-2.) (.-56.2) Patient (n=7).3 3. 3.5. (.-7.) (.-73.) (.-6.5) (.-96.2) B - - Fig. 2. CELLQUANT: The upper line (A) shows the analysis of and the lower line (B) shows the analysis of a healthy control. 과립구의경우 명 ( 범위 3.45-56.2%) 에서관찰되었다. 적혈구 결핍을보인 2명은과립구 의결핍도동반되었다 (Table 2). 비정상적으로감소된분획을보인경우에히스토그램상두세개의봉우리로나누어지는경우는없었고, 전체적으로봉우리가좌방으로이동하였다. 2. 혈구감소증환자결과 혈구감소증이있는환자 7명중 4항원이모두결핍된경우는 2명이었고, 3항원이결핍된환자는 명이있었다. 2항원이결핍된경우는 2명으로 명은 항원이적혈구와과립구모두에서결핍되었고, 명은과립구내의 와 항원이결핍되었다. 한가지항원의결핍만보인경우는적혈구 의단일결핍은없었고, 적혈구 단일결핍 6명, 과립구 단일결핍 명과립구 단일결핍은 3명에서관찰되었다. 네가지항원중한개만결핍이관찰된경우에는히스토그램상분획의굴곡은관찰되지않고다만히스토그램전체의좌방이동이있었다. 유세포분석기를이용한 GPI 연결단백질검사에서 와 항원을각각분리해서비교해보면 항원이 PNH 클론의유무를확인하는데더특이적이었다. 3. PNH 환자결과 - - FS 3개이상의항원결핍을보여 PNH로진단된환자는 3명이었다. 환자 3은 Ham 검사와 sucrose 검사를통해이미 PNH로진단받은환자로 3개의항원이결핍되었다. 환자 과환자 2는원인모르는혈구감소증환자로골수검사에서적혈구계증식이보였고, 유세포분석에서 4개의항원이모두결핍되어있었다. PNH 경과중에적혈구의용혈이일어나기때문에세환자모두적혈구내의 와 항원의결핍분획은과립구내의항원들보다결핍된정도가적었다. 이들환자의히스토그램에서는항원이정 B
22 김경희 한진영 김정만 RBCs 76 68 76 68 57 5 57 5 76.4% deficient 38 7.% deficient RBCs 34 34.4% deficient RBCs 38 6.5% deficient 34 9 7 9 7 - - Fig. 3. REDQUANT (A) and CELLQUANT (B) flow cytometric analysis for PNH patient. A - - B Table 3. Results of REDQUANT and CELLQUANT kit in PNH patients Case REDQUANT No. (%) (%) 상적으로발현되는분획과감소된분획으로구별이확실한봉우리가두개관찰되었다 (Fig. 3) (Table 3, 4). 고 찰 CELLQUANT (%) (%) 7. 34.4 6.5 76.4 2 5.5 73. 56.9 96.2 3. 2.9 55.5 86.6 Table 4. Clinical and laboratory findings of PNH patients Case Hb WBC Age Sex No. (g/dl) (/ L) Abbreviation: ND, not done. PLT (/ L) PNH는조혈모세포의질환이기때문에적혈구나과립구뿐아니라림프구나혈소판까지이상을보이게된다 [9-3]. PNH를진단하기위한기본적인검사법으로는 Ham 검사와 sucrose lysis 검사가있다. 그러나이러한검사는몇가지제한점이있는데첫째로 PNH에특이성이높지않고, 둘째적혈구에있는단백질의결함만선별할수있다는점그리고수혈후에는검사를실시할수없다는것이다. 그래서유세포분석기를이용하여 GPI 연결단백질의감소를검출하기위한방법들이개발되어왔다 [6-8, 4, 5]. 하지만이러한검사법들은매검사시마다환자검체와함께대조군으로정상인의혈액까지필요로하는번거로움이있을뿐아니라검사실간에결과를비교하기곤란한점이있다. 그래서적혈구내의 와, 과립구내의 와 결핍을모두검출할수있는간단하고빠른검사법이개발되었고상품화되었다. REDQUANT와 CELLQUANT 키트는각각적혈구와과립구에있는 와 를검사함으로한검체에대해모두네가지의결과를얻을수있다. 두키트내에는모두 precalibrated bead가내장되어있어정상세포군과항원이결핍된세포군간의 cutoff 를설정할수있기때문에대조군혈액이따로필요없다. REDQU- ANT / 키트는별다른전처리없이바로검사를실시하면되고, CELLQUANT / 키트는적혈구에서높게발현되는 때문에정확한결과를얻기위해서적혈구용해의단계를하나더거쳐야한다 [6, 6]. 만약적혈구용해가불충분하 reticulocyte (%) sucrose Ham test lysis M:E ratio in marrow Clinical impression 46 M 7.3 4,6 45K ND ND ND :.3 unknown cytopenia 2 35 F 9.5 3,64 8K 4.2 + + :2.2 unknown cytopenia 3 82 M 7.2 2,98 52K 3.8 + + :2.5 known PNH 게되면남아있던적혈구가 단클론항체에흡착되어과립구 와결합해야할항체가없어지게되어비정상적으로 가결핍된과립구분획이증가하게된다. 본연구의대조군에서도 결핍분획의평균이 9.7% 로양성 cutoff 인 3% 를넘었고, 전체 6 명중 명 (68.7%) 에서결핍분획이 3% 를넘는것으로나왔다. Hsi의연구 [7] 에서도과립구의 검사에서 2명의대조군중 9명에서 3.7% 에서 76.7% 까지다양한범위의위양성이관찰되었고, bead의 % 미만이음성분획이되도록 cutoff값을조정하여위양성을 6명까지줄었다고보고하였기때문에적혈구용해가더완전히이루어지도록키트의개선이요구되어지는부분이다. 이미 PNH로진단받고경과관찰중인환자 23명을대상으로본키트로검사한연구에서 [6] 4개의항목중 4개모두양성인경우가 명 (43.5%), 3개항목에서양성인경우 명 (43.5%), 3 명에서는 2개의항목에서만양성이었다. 2개의항목만양성인경우에는세포의종류에관계없이, 의두분획이모두결핍된것으로관찰되었다. 본연구에서는 2개의분획이결핍된경우가두명있었는데한명은적혈구와과립구모두 분획의결핍이관찰되었고, 한명은과립구의 와 분획의결핍이있었다. 전자의경우적혈구히스토그램에서 결핍봉우리가매우적은분획으로관찰되었으나과립구히스토그램에서는단일봉우리만관찰되고히스토그램의좌방이동에의한양성이었다. 임상적으로는항핵항체양성, 직접 Coombs 검사양성인자가면역성용혈성빈혈의증상이있는환자이었다. 후자는재생불량성빈혈의경과관찰중에 PNH 클론이관찰된경우로
REDQUANT 및 CELLQUANT kit 를이용한 PNH 진단 22 과립구히스토그램에서 와 항원이결핍된봉우리가명확하게관찰되었다. PNH를확신하기위해서는 3가지항목에서양성을보여야하지만두가지항목에서양성을보이는경우에도특히적혈구나과립구의종류에관계없이, 두가지분획모두의결핍이관찰되면서히스토그램상의단순한좌방이동에의한감소가아니라독립적으로결핍된분획의봉우리가관찰되는경우에는 PNH클론이존재하는것으로간주하는것이합당할것으로생각된다. De novo PNH와는별개로재생불량성빈혈이나골수형성이상증후군과같은조혈모세포질환에서도 GPI 결핍단백질의결핍이관찰된다 [8-2]. 국내에서도재생불량성빈혈과골수형성이상증후군에서전형적인 PNH처럼 GPI 연결단백질합성과정의첫단계에관여하는 phosphatidyl inositol glycan-class A (PIG-A) 유전자의돌연변이를확인한연구가있었다 [2, 22]. 4명의골수형성이상증후군을조사한한연구 [23] 에서는 % 에서 GPI 연결단백질의결핍이관찰되었다고보고하였다. 재생불량성빈혈의경과를관찰한연구 [24] 에서는 GPI 연결단백질의발현이서로다른그룹이관찰된다고하면서, PNH 클론이없는환자군, 질환의경과중에 PNH 클론이생기는환자군, PNH 클론이지속되거나혹은소실되는환자군등으로다양한임상상이존재한다고하였다. 재생불량성빈혈이나골수형성이상증후군에서 PNH클론이관찰되는경우에는면역치료에대한반응이더좋고 [25], 클론화의정도가적은것으로나타나 [26] 골수부전에있어전체적으로좋은경과를취하는것으로알려져있지만, 재생불량성빈혈에서관찰되는 PNH클론이치료의결과와는상관성이없다는보고 [27] 도있다. 본키트를이용한연구 [6] 에서전형적인 PNH에서는흔히 3개이상의항목에서양성을보이는데반해재생불량성빈혈이나골수형성이상증후군환자를검사한경우에는적혈구나과립구중한종류에만, 의결핍이관찰되어 2개의항목에서만양성을보이는것이흥미로운점이라고하였다. 본연구에서도재생불량성빈혈의경과중에 PNH클론이관찰된예에서는과립구에서만, 의결핍이있었다. Wang 등 [26] 은골수부전을보이는재생불량성빈혈이나골수형성이상증후군에서는 PNH 클론의유무자체가치료방향설정에영향을줄수있기때문에치료전에유세포분석기를이용해서미량으로존재할수있는 PNH클론을확인해야할것이라고하였다. 본연구에서이용한 REDQUANT/CELLQUANT 키트는 precalibrated bead가내재되어있어대조군을필요로하지않는점에서장점이있으나 PNH가아니면서특히 결핍과립구분획이증가되는경우가있어서판독에주의가요구되었다. 그러나정상대조군은한예도키트의정의에따라 PNH로진단된예가없어서위양성은발견되지않았으며 PNH 환자군은간편하게확인할수있었다. 향후골수형성이상증후군, 재생불량성빈혈, 기타원인불명의용혈성빈혈등에도그사용을확대할수있을것으로사료되었다. 요약배경 : PNH는조혈모세포의질환으로서여러계열의세포에세포막결합 GPI-anchored 단백의발현장애를특징으로한다. 상품화된 REDQUANT 및 CELLQUANT 키트 (Biocytex, Marseille, France) 를사용해서 PNH 진단에검토하였다. 방법 : 다양한정도의말초혈구감소증을동반한 7명의환자와건강대조군 6명을대상으로하였다. REDQUANT 및 CEL- LQUANT 키트를사용해서 Coulter Epics XL로분석하였다. 사용지침에따라 및 항원결핍분획이 3% 이상일때양성으로하였고, 네가지항원중세개항원이상이양성이면 PNH로진단하였다. 결과 : / 결핍적혈구 / 과립구분획의평균은환자군과대조군에서각각.3, 3., 3.5,., 그리고.,.,.3, 9.7 이었다. 7명의환자중 4항원및 3항원이결핍되어 PNH로진단가능했던예가각각 2예, 예씩있었고, 두항원이감소된예도 2 예있었다. PNH라고할수는없으나 결핍과립구분획만 3% 이상으로증가된경우도환자군중 3예, 대조군중 예에서관찰되었다. 결핍적혈구도환자군및대조군에서각각 6예와 2예있었고, 결핍과립구도환자군 예에서관찰되었다. 결론 : REDQUANT/CELLQUANT 키트는방법이표준화되어있고대조군을필요로하지않는점에서장점이있으나 PNH 가아니면서특히 결핍과립구분획이증가되는경우가있어서판독에주의가요구된다. 감사검사에많은도움을주신동아대학교의료원진단검사의학과안광섭, 구태헌선생님께깊은감사를드립니다. 참고문헌. Nishimura J, Murakami Y, Kinoshita T. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria: An acquired genetic disease. Am J Hematol 999; 62: 75-82. 2. Hillmen P, Lewis SM, Bessler M, Luzzatto L, Dacie JV. Natural history of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. N Engl J Med 995; 333: 253-8. 3. Nakakuma H. Mechanism of intravascular hemolysis in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH). Am J Hematol 996; 53: 22-9. 4. Parker CJ. Molecular basis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Stem Cells 996; 4: 396-4. 5. Shichishima T and Noji H. A new aspect of the molecular pathogenesis of paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Hematology 22; 7:
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