3 장. 배양배지의성분 1 절. 배지성분 배지는배양하는조직을지탱하고양분을공급해주는역할을하는곳으로, 항상무균상태로 유지되어야한다. 용기내에서배양체를종속영양성으로키우는데필요한영양분과식물생 장조정물질을포함하고있다. 1-1. 물 95% 가물이며물은증류수나탈염수를사용한다. 물에있는불순물은배지의 ph 에영향 을미칠수있기때문에보관은폴리에틸렌병이나 pyrex 유리용기에하는것이좋다. 1-2. 무기영양소 대량원소 (Macronutrient) 질소 (Nitrogen, N) - 식물의성장속도에관여하는원소로써시약은 NH 4NO 3 이다. chloropyll, alkaloids, nucleic acids와일부 hormone, amino acid의구성원소이다. 결핍시에잎이황화되고생육장해혹은지연이일어나고과다할경우죽게된다. 인산 (Phosphorous, P) - Meristem이나생육이왕성한조직에다량함유되어있지만아직그정확한역할은밝혀지지않았다. 주로생체내에서에너지변환, 단백질과핵산의합성에관여하며효소의활성에관여하는것으로생각된다. Potassium phosphate(kh 2 PO 4 ) 나 Sodium phosphate (NaH 2PO 4) 로공급되며결핍시식물체가비정상또는병든것같은증상을나타낸다. 칼륨 (Potassium,K) - 세포분열, 탄수화물, 단백질합성, chloropyll 합성, nitrate 감소에관여하며 Potassium nitrate(kno 3), Potassium phosphate(kh 2PO 4) 그리고 Potassium chloride(kcl) 으로공급된다. 결핍시세포의팽압이없어져서식물체가연약하고비정상적으로되어세균감염에약해진다. 황 (Sulfur, S) - SO - 4 상태로배지에공급되며일부단백질의구성요소로써잎을푸르게하고뿌리의발달을촉진하는역할을한다. 또한부족할경우단백질합성이결핍되는증상이나타난다. 칼슘 (Calcium, Ca) - Calcium chlride (CaCl 2 ) 이나 Calcium nitrate(ca(no 3 ) 2 4H 2 O) 의상태로공급되며 Calcium pectate 세포막의구성요소이다. 세포막의 permeability와관계가있고탄수화물과아미노산의이동을용이하게한다. 또한뿌리의발육을촉진하는작용을한다. 따라서부족시에는뿌리의발육이빈약하여정단부의잎주변이검은색이되고
생장이정지되면서심할경우그부분이괴사할수있다. 마그네슘 (Magnecium, Mg) - chloropyll의주요구성요소이며효소활성물질로써도중요하다. phosphorylation에필요하고식물체내에서자유로이확산된다. 공급되는시약은 Magnesium sulfate (MgSO 4) 이다. 철 (Iron, F) - Ferrous sulfate (FeSO 4 ) 으로공급되며엽록소의전구물질형성에필요하다. 광합성과호흡작용의에너지전환에관여하며식물체내에흡수, 용이하도록하기위하여 Ethylene-diamine tetraacetic acid(edta) 첨가한다. 결핍시에는잎에심한황갈색증상이나타난다. 미량원소 (Micronutrient) Boron, B - 페놀산대산, 리그닌의생합성분열조직에연관되어있으며 RNA합성에필요한 N- 염기의합성과식물체내의당의이동에관여하는것으로추정된다. 결핍시에는뿌리성장이정지되며 H 2PO 4 및기타이온의흡수량이감소된다. 또한결핍하면시토키닌합성이떨어지고세포분열이억제되어핵에서 RNA합성이감소된다. 시약은 Boric acid (H 3BO 3) 형태로배지에첨가한다. Molybdenum (Mo) - 질소대사에관여하며 nitrogen ammonia 전환에관계한다. 효소의구성성분으로철분의보조효소로작용하기도하며 Sodium molybdate (Na 2 MoO 4 2H 2 O) 형태로공급되고결핍되면 NO 3 가독성을나타낸다. Manganese (Mn) - Chloroplast membrane의필수구성요소로써호흡과광합성에관여하며 IAA산화효소의활동이증가하여내생옥신의수준이감소하고 EDTA와결합한 Mn은자연산옥신의산화를촉진시킨다. Mangenese sulfate (MnSO 4) 형태로공급된다. Cobalt (Co) - Vitamin B 12 (C 63H 90N 14O 14 PCo) 의구성요소이며질소고정에필수원소로서착염독성으로부터조직을보호하고구리와철분이온이촉매하여일어나는산화반응을억제하는간접효과가있다. Cobalt chloride (CoCl 2) 에서공급되며에틸렌합성을억제한다. Zinc (Zn) - 일부 enzyme의필수원소로 Chlorophyll 형성, auxin(iaa) 생산에관여하며결핍시에는단백질, 핵산, 엽록소의합성이감소되며증상은절간이짧고잎이작아진다. Zinc sulfate (ZnSO 4) 의시약으로공급된다. Copper (Cu) - Energy conversion에관여하는것으로추측되며리그닌과같은식물의중용한중합체를구성하는페놀화합물과수산화반응에관여한다. 결핍시생육지연, 기형, 뒤틀리고얼룩진잎, tip die- back이일어난다. Cupric sulfate (CuSO 4) 의상태로공급된다.
Chlorine (Cl) - Calcium chloride (CoCl 2) 의형태로공급되며광합성촉진에필수요소이다. 팽압을유지하고유리된원형질체는 Mn +2과함께광합성의광시스템에서산소방출에필요하다. 결핍시잎이시들고황화, 갈변하여고사한다. Iodine (I) - Potassium Iodide (KI) 의형태로공급되지만일부아미노산의구성요소이나배지의필수요소로생각되지는않는다. 1-3. 유기영양소 탄수화물 (Carbohydrate) - 식물체의구성성분중에 95% 를차지하며 Sugar, Starch, Cellulose 형태이다. 이들은 Carbon (C), hydrogen (H), oxygen (O) 이다. 역할은배양체의영양원으로서작용하고또한삼투물질을조절하는데사용한다. 식물체는주요 Sucrose (C12H22O11) 를사용하며이는광합성의간접생산물, 식물조직에많이함유된다. Vitamin B Nositol (C6H12O6) - 일종의 Vitamin B complex로서탄수화물의보조제로취급되며 Chloroplast membrane의구성요소이다. 이는 Pectine과 Hemicellulose의생합성과정에관여하여생장을촉진시킨다. Thiamine (Vitamin B1, C12H17ON4SCl) - 탄수화물대사의필수보조효소로서아미노산의생합성에직접관여하여특히 Citric acid cycle 내의유기산회로에서도움을주는보조효소로작용한다. 어느비타민보다가장많이사용하여왔으며계대배양을계속하면서필요성이더하다. Nicotinic acid (niacin, C6H5O2N) - 식물체의모든부분에분포되어있으며두개의 NAD와 NADP의보조효소의구성원으로발견되었다. 보조효소는수소의전이과정과관계가있다. Niacin은전구물질인트립토판에서합성되며트립토판은 Auxin 중에 IAA의전구물질이기도하다. Pyridoxine (Vitamin B6, C8H11O3N) - 피리독신은피리독살로나타나서인산화작용으로활성인피리독신인산이되며피리독신인산은 decarboxylation과아미노산기의전달반응에서보조효소로작용한다. Pantothenic acid (C9H17O5N) - 지방대사에서 coenzyme이다. Folic acid (C19H19N7O6) : - vitamin B coenzyme으로활동한다. Choline (C5H15O2N) - vitamin B complex 안의 alkaloid이다. Riboflavin (C17H20O6N4) - Vitamin B12 이다. Vitamin H (Biotin, C10H16O3N2S) - 지방대사에서 coenzyme으로활동한다. 생장조절물질
미량으로식물생리활성을조절하는물질로배양식물내에서합성되기도하지만그능력이떨어지기때문에인공적으로합성된것을넣어줘야한다. Auxin, Cytokinins, Gebberellin, ABAs, Ethylene이주로사용되며비율에따라식물체의유도성장이가능하므로굉장히중요하다. 특히, Auxin과 Cytokinin의비율이조직배양에서굉장히중요하다. Auxins - 세포분열없이세포를증대시키고뿌리형성과정단우열현상그리고줄기에서부정아형성에영향을미친다. 대부분 cytokinins과함께다양한식물의성장단계에관여하며뿌리형성시에는 cytokinins의농도가낮고줄기형성시에는 auxon의농도가낮다. 천연 hormone을쓰기도하지만인공적으로합성해서쓰기도한다. 종류는다음과같다. IAA (indoleacetic acid) IBA (indolebutyric acid), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid), NAA (naphthaleneacetic acid), pcpa (para - chlorophenoxyacetic acid), NOA (α-naphthoxyacetic acid), BTOA (2-benzothiazole acetic acid), PIC (picloram), 2,4,5-T (2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid). Cytokinin - 휴면종자및눈의발상을촉진하고측아생장, 잎의확대생장, 세포분열촉진, 분화및형태형성을촉진시키므로조직배양에이용된다. 또한줄기절편신장, 뿌리생장, 부정근형성과노화를저해한다. cytokinin 역시자연적인것과인공적으로합성된 hormone 두가지를사용한다. BA(6-benzyladenine, benzylaminopurine), Kinetin (6-furfurylaminopurine), Zeatin, 2iP (2-isopentyladenine), Thidiazuron (a cytokinin-like substance) Gibberellins - 휴면종자및눈의발아촉진, 줄기신장및잎의확대생장촉진, 기관분화와노화억제에연관이있으며과일생장, 화아형성에관계가있다. 또한 α-amylase 합성을촉진시켜종자의발아를촉진시킨다. Ethylene - 휴면종자및눈의발아촉진, 측아생장억제, 부정근형성촉진, 과일성숙촉진, 노화촉진, 기관탈리유도와관계가있다. Abscisic acid - 종자와눈의발아억제, 뿌리생장억제, 부정근형성촉진, 기관탈피촉진, 겨울에휴면유도 (mrna 생산억제 ), 노화촉진, 기공개폐의조절과연관이있다. Amino acids - 비타민과유사한작용을하는것으로써조직의생장을최대로하기위해서배지에첨가하는것이좋다. 흔히 L-cystein [HSCH2CH(NH2)COOH], Glycine (C2H5O2) 등이사용되며식물체내에서 1차적인유기질소로이용된다. 천연추출물 - 천연추출물로는야자유, 오렌지쥬스, 토마토쥬스, 포도쥬스, 파인애플쥬스, 자작나무즙, 바나나, 맥아추출물및옥수수유등이다. 천연추출물은혼합물의성분을확실히알수없는뿐만아니라품종이나개체별로성분의차이가같은결과를재현하기어렵다. 또한과실의숙기에따라차이가있을뿐만아니라같은성숙도를가진것사이에
서도차이가있다. 1-4. 불활성지지물 - 식물이배양되는고체혹은반고체배지를만들기위해서는불활성지지물이필요하다. 불활성지지물에는 Agar, Agarose, Gelatin, Gellite이있다. Agar - Agarose 전단계로해초 ( 으뭇가사리 ) 에서얻으며 glucose라영양분으로사용되고 0.4%~0.8% 에서배지를반고체로만들어배양체를지지한다. Agarose - agar를더분리한것으로입자가더고우며 Agar보다고급이다. Gelatin - 영양분은없지만값이싸고투명하여현재많이쓰이고있다. Gellite - 고도로정제된교질재료로성형이빠르고순도가높아정교한배양에이용된다. - 불활성지지물은염의형태에따라교질강도를달리한다. 즉, +2가염의첨가가 +1가염의첨가보다교질강도가높다. 1-5. 기타물질 Coconut milk : 난과식물에서는필수이다. Casein hydrolysate Yeast extract : 비타민의천연 sources이다. Activated charcoal( 활성탄 ) : 독성물질을흡착시켜정화해준다. < 활성탄 > < 활성탄배지 > 2 절. 배지조성표 배지의조성은간단하게미량원소와대량원소로구분된다. 대량원소는탄소원과질소원 이며미량원소는생장조절물질과비타민등이다. 다음표는조직배양에서일반적으로 사용되는배지의조성표이다. 미량. 대량원소비타민류한천 (Agar) ph
성분 MS White B5 VW (NH 4) 2SO 4... 134 500 MgSO 4.7H 2O 370 720 250 250 Na 2 SO 4. 200.. KCl. 65.. CaCl 2.2H 2O 440. 150. KNO 3 1900 80 2500 525 Ca(NO 3) 2.4H 2O. 300.. NH 4NO 3 1650... NaH 2 PO 4.H 2 O. 16.5 150. KH 2 PO 4 170.. 150 FeSO 4.7H 2O 27.8... Na-EDTA 37.3..... MnSO 4.4H 2O 22.3 7 10 7.5 ZnSO 4.7H 2O 8.6 3 2. CuSO 4.5H 2O 0.025. 0.025.. Fe 2(SO 4) 3. 2.5... CoCl 2.6H 2 O 0.025. 0.025. KI 0.83 0.75 0.75. H 3BO 3 6.2 1.5 3. Na 2MoO 4.2H 2O 0.25. 0.25. Fe-EDTA.. 40. Ca 3(PO 4) 2.... 200 주석산철.... 28 Sucrose 30g 2g 20g 20g myo-inositol 100. 100. Nicotin Acid 0.5 0.5 1.0. 염산피리독신 0.5 0.1 1.0. 염삼티아민 0.1~1 0.1 10. 판토텐산칼슘. 1.. 글리신 2 3... 염산시스틴. 1.. 한천 10g 5g 9~10g 16g ph 5.7~5.8 5.5 5.5 5.0~5.2