논단 원핵세포의전사조절네트워크재설계 조병관 KAIST 생명과학과및 KAIST Institute for the BioCentury E-mail: bcho@kaist.ac.kr 서론주변환경변화에대한반응등의다양한생물학적과정은때와장소를구별하여일어나는수많은유전자의조화로운발현에의해정확하게조절된다. 유전자발현조절의중요한부분인전사조절분야는그동안많은연구진들에의해개별유전자들의발현과조절기작이밝혀져왔으나근래에는각유전자들의발현조절사이의상호연관성을밝히고자하는연구가집중적으로이루어지고있다. 1,2 이러한맥락에서전사조절과정을시스템차원에서이해하고자하는노력으로전사조절네트워크재설계 (reconstruction of transcriptional regulatory network) 가활발히연구되고있으며전사조절인자 (trans-acting factor) 와상호작용하는전사조절요소 (cis-regulatory element) 의게놈수준프로파일 (genomescale profile) 은원핵세포의전사조절기작의이해및전사조절네트워크를재설계하기위해반드시필요한정보이다. 3,4 원핵세포의전사조절인자로는외부환경에민감하게반응하는전사인자 (transcription factor) 와 RNA 중합효소시그마인자 (σ-factor) 를예로들수있으며전사조절요소로는게놈상의전사인자결합영역과 RNA 중합효소시그마인자를비롯한다양한전사인자가상호작용하는핵심프로모터영역 을대표적인예로들수있다. 5-11 또한, 게놈수준의전사조절관련정보는생명현상을시스템내구성요소간의상호관계와상호작용으로해석하려는시도인시스템생물학 (systems biology) 의주된연구대상이다. 연구기법으로는최근까지 DNA 마이크로어레이를사용하여다양한실험조건하에전사조절인자가결손된원핵세포 ( 혹은과발현된원핵세포 ) 로부터분리된 mrna 를분석하여전사조절인자의게놈수준전사조절네트워크를규명하는 top-down 기법이주로사용되어왔다. 12 하지만이기법의경우간접상호작용에의한전사조절효과를직접상호작용으로부터구별할수없고전사조절요소의서열프로파일을도출하기어렵기때문에이단점을해결할수있는크로마틴면역침전법과 DNA 마이크로어레이혹은차세대염기서열분석기술 (Next-Generation Sequencing, NGS) 이결합된실험기법 (ChIP-chip 혹은 ChIP-seq) 을사용하는 bottom-up 기법이개발되어사용되고있으며 9,13-15 여러실험그룹에서크로마틴면역침전법 (chromatin immunoprecipitation) 에기반한실험기법을사용하여원핵세포의전사조절인자 -전사조절요소의상호작용프로파일을보고하였다. 9-11,16-18 또한, 차세대염기서열분석기술을이용한전사체분석기술 (mrna-seq) 의발달에힘입어게놈수준의새로운유전자탐색및전사시작위치프로 1 분자세포생물학뉴스
Table 차세대염기서열분석기술 [27]. Technology Read length (bp) Gb per run Chemistry Roche/454 GS 330* 0.45 Pyrosequencing Illumina/Solexa GA 75 or 100 18/35 Reversible terminator SOLiD 50 30/50 Sequencing by ligation Polonator 26 12 Sequencing by ligation Helicos 32* 37 Reversible terminator Pacific Biosciences 964* N/A Real-time Ion Torrent N/A N/A Semiconductor technology GS, Genome Sequencer; GA, Genome Analyzer; *Average read-lengths; N/A, not available. 파일등원핵세포로부터다양한유전체및전사체구성성분의측정이용이해져높은분해능으로원핵생물의전사체및전사조절네트워크규명이가능해졌다. 7,19 본논단에서는전사조절인자와상호작용하는전사조절요소의게놈수준프로파일을밝히기위한고속대용량 (high-throughput) 실험기법들을소개하고전사조절네트워크재설계기법의소개와함께향후응용가능성에대해서논의하고자한다. 게놈서열분석 게놈수준에서전사조절요소의조절프로파일을분석하기위해서는우선게놈서열이분석되어야하는데 1977 년처음보고된 1세대서열분석기술인 Sanger 시퀀싱기법이 1990 년대모세관전기영동기술의발달과더불어다양한생물체의게놈서열분석을가능케하였다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov /sites/entrez?db=genomeprj). 20,21 하지만 Sanger 시퀀싱기법은게놈 DNA 조각을 bacterial artificial chromosome (BAC) 이라고불리는벡터라이브러리를구축하여시퀀싱을하게되는데이과정이시퀀싱속도와비용을좌우하게된다. 최근차세대염기서열분석기술 (Next-Generation Sequencing, NGS) 이개발되어상대적으로낮은비용과빠른속도로게놈서열을분석할수있는혁신적인발전이이루어져게놈서열분석뿐만아니라다양한분야에응용되고있다. 22 몇가지의 NGS 플랫폼이보고되었지만주로사용되고 있는상용화된플랫폼으로는 Roche 사의 454 시퀀서, Illumina 사의 Genome Analyzer, ABI 사의 SOLiD 시스템이있다. 23-25 우선, 454 시퀀서의경우는 microfabrication 을통해준비된 picoliter bioreactor 내에존재하는마이크로비드상에서 DNA 중합효소를이용한뉴클레이티드의중합반응시생성되는 pyrophosphate 를 sulfurylaseluciferase 기반의형광기술을이용하여검출함으로써서열을분석하는기술이다. Illumina 사의 Genome Analyzer 의경우는분석하고자하는 DNA 조각에 adaptor 올리고뉴클레오티드를 ligation 시킨후, adaptor 서열과상보적인서열을갖는올리고뉴클레이티드가표면에고정되어있는 glass flow cell 에흘려주어상호간에상보적인결합이일어나게한다. 계속하여 bridge amplification 기술을이용하여분석하고자하는목적 DNA 조각을증폭시킨후, DNA 중합효소를이용하여형광이표지되어있는뉴클레오티드를이용한 DNA 중합반응시검출되는형광으로서열을분석하는기술이다. 마지막으로 ABI사의 SOLiD시스템의경우는 microbead 와 DNA ligase 를이용하는독특한서열분석기술을이용한다. 다른 NGS 플랫폼에비해 454 시퀀서의가장큰장점은시퀀싱되는서열의길이가약 300-400bp 로상대적으로길게얻을수있어게놈서열분석시유리하지만그에반해처리양이낮다는단점이있다 (Table 1). 최근까지 NGS 플랫폼을이용하여 de novo 게놈서열분석이완료된 웹진 12 월 2010 2
논단 원핵생물로는 Pseudomonas syringae, Acinetobacter baylyi, Peudomonas aeruginosa, Geobacter sulfurreducens 등의전체게놈서열이보고되는등큰진전이있음에도불구하고 NGS 플랫폼으로부터얻어지는짧은서열결과로부터전체게놈을어셈블리하는단계는여전히많은연구가필요하다. 22,26-28 게놈수준의전사체분석 DNA 마이크로어레이의발전은다양한환경조건에서원핵생물의전사체의정량적인비교분석을가능케하였다. 더불어전체게놈을일정한길이의올리고뉴클레오티드로나누어설계한 whole-genome tiling 마이크로어레이의출현은게놈수준의유전자구조, alternative transcript, antisense transcript, regulatory RNA 등원핵생물전사체의다양한구성성분의발견을주도하여왔다. 7,29-31 마이크로어레이실험기법은비교적잘정립되어있지만 background noise 와 cross hybridization 등의단점들로인해실험결과의통계적표준화 (normalization) 를필요로한다. 최근들어앞서소개한 NGS 플랫폼을이용하여전사체를분석하는기법인 RNA-seq 기법이개발되었는데이기법을이용하면마이크로어레이의단점들을한번에해결할수있을뿐더러단일뉴클레오티드수준의분해능으로전사체를분석할수있다. 27 하지만, 원핵생물의 mrna 는 3 - 말단에 poly(a)-tail 를갖고있지않아서진핵생물과비교하여볼때세포로부터 mrna 를분리하는것이용이하지않다. 32 즉, 세포내전체 RNA 의 95% 이상을 rrna 와 trna 가차지하고있어서전체 RNA의서열분석을그대로진행할경우, 다량의 nonmrna 서열이얻어지게되어전사체분석에어려움이있다. 33 따라서전체 RNA 로부터 rrna 와 trna 를제거하여 mrna 를상대적으로농축시키는여러기법들이사용되어왔는데최근 rrna 와 trna 처럼 processed RNA 의 5 - 말단 momo-phosphate를특이적으로인식하는 exonuclease 를이용하여 processed RNA 를선택적으로분 해시켜 5 - 말단에 tri-phosphate 기를갖고있는 primary RNA 만을농축시키는기법이개발되어전사시작위치 (transcription start site) 와 RNA 수식위치등다양한전사 체구성성분을분석하는데사용되었다. 8,19 더불어 RNA 농축 기법이 NGS 플랫폼과결합된기법은진핵생물을비롯하여 다양한원핵생물의게놈수준의유전자구조, transcription unit, 전사조절부위, regulatory RNA, antisense transcript, functional RNA 등을분석하는데응용되고있 다. 7,8,19,31,34 전사조절인자 - 전사조절요소상호작용분석기법 원핵생물의전사조절인자 - 전사조절요소의상호작용을분 석하는주된기법은일반적으로전사조절인자에특이적인 항체를이용하여전사조절인자 - 전사조절요소복합체를크 로마틴면역침전 (chromatin immunoprecipitation, ChIP) 시키고전사조절요소를분리하여서열을분석하는방법이 다. 일반적으로전사조절요소의서열을분석하는플랫폼으 로마이크로어레이가사용되면 ChIP-chip, NGS 가사용되 면 ChIP-seq 으로명명되어사용되고있다 (Figure 1). 13,35 크 로마틴면역침전법은크게세단계로나누어볼수있는데첫 째, 주로포름알데히드를사용하여전사조절인자와전사조 절요소를 cross-link 시켜복합체를형성시키는단계, 둘째 sonication 등의물리적인방법으로단편화된전사조절인자-전사조절요소복합체를특정항체를이용하여면역침전 시키는단계, 셋째로는면역침전된복합체로부터전사조절 요소를분리하여서열을분석하는단계이다. 36 면역침전으로 분리된전사조절요소의서열을게놈수준에서분석하기위해 서는앞서언급한대로마이크로어레이혹은 NGS 플랫폼이 사용되는데이때분리된전사조절요소의절대양이부족하기 때문에증폭하는과정을거치게된다. 현재까지몇가지방법 이개발되었는데주로 ligation-mediated PCR 혹은 random 증폭방법이주로사용되고있다. 6,7,9,36,37 이와같은증폭과정은면역침전된전사조절요소영역의특정서열이치 우쳐서증폭되지않도록특별한주의를필요로한다. 더불어 3 분자세포생물학뉴스
igure 전사조절인자 -전사조절요소간의상호작용을측정하기위한크로마틴면역침전법기반의고속대용량실험방법 면역침전을이용한기법을사용함에있어서고려해야할점은사용되는항체의특이성이다. 38 특이적인항체의사용이제한적이거나다수의전사조절인자를다룰때는 epitope tagging 기법을사용하기도한다. 13,39,40 게놈수준의분석플랫폼으로사용되는마이크로어레이는크게세가지종류로나누어볼수있다. 기계적으로 cdna 혹은 PCR 산물을 glass 기판위에 spotting 한종류, 기계적으로올리고뉴클레이오티드를 spotting 한종류와거울기술등을이용하여올리고뉴클레이티드를기판위에서합성시킨종류가있는데현재는마지막기술을기반으로한 wholegenome tiling 마이크로어레이가주로사용되고있다. 비록초기에는면역침전법과마이크로어레이가결합된 ChIPchip 기법이많이사용되었으나현재는 neuron-restrictive silent 인자등의게놈수준상호작용영역을찾아내려는노력으로처음개발된 NGS 플랫폼기반의 ChIP-seq 기법이주로사용되고있다. 이연구들에서는 Illumina 의 Genome Analyzer 를사용하였는데면역침전단계로부터얻어진 DNA 단편들로부터약 30bp 의서열을얻고게놈서열에 mapping, 비교분석하여전사조절인자들과상호작용하는전사조절요소의위치를 peak 형태로얻을수있었다. 35,41 비록게놈내존재하는반복서열등으로인해짧은서열을게놈서열에 mapping 하는단계가다소난해하지만얻을수있는서열의수와분해능을고려할때 ChIP-seq 기법은게놈수준에서전사조절인자와전사조절요소의상호작용을밝히는데 있어서상당히강력한기법이다. 원핵세포전사기구의전사조절상호작용 원핵세포의전사과정은프로모터에특이적으로작용하는 RNA 중합효소 (RNA polymerase) 복합체에의해이루어진다. 일반적으로원핵세포의 RNA 중합효소복합체는 RNA 중합반응을일으키는 core 효소 (α 2 ββ ω) 와프로모터를특이 적으로인식하는시그마인자로이루어져있다. 따라서 RNA 중합효소가전사과정을시작할때시그마인자의도움으로인식하는프로모터의위치와서열을파악하는것은외부환경등에민감하게반응하는원핵세포를전사체수준에서이해하는데매우중요하다. 게놈수준에서프로모터를파악하는것은각유전자의프로모터부위의 DNA 서열이잘보존되어있지않아생물정보학기법을사용하는데한계가있고각각의프로모터를밝히는실험기법은알려져있으나이를게놈수준에서사용하기에는큰어려움이있다. 42,43 따라서항생제의일종인 rifampicin 를이용하여원핵세포의 RNA 중합효소를프로모터부위에고정화시키는원리와 ChIP-chip 기법을이용하여프로모터를게놈수준에서파악하고자하는기법이개발되었다. 6,44 대장균의경우, 지수성장기의세포로부터약 2,000 여개가넘는프로모터가발견되었으며이미알려진프로모터영역뿐만아니라오페론내부혹은유전자의존재가알려지지않은게놈영역에도프로모터의존재가발견되었다. 또한, 약 16% 의 RNA 중합효소의상호작용영역이 웹진 12 월 2010 4
논단 특정조건에서전사가이루어지지않는영역에서도발견되 었는데이결과는아마도 RNA 중합효소가프로모터영역에 상호작용하고있다가특이한환경조건에서전사조절인자의 도움으로전사가시작되는것으로이해되고있다. 6,7 비록 rifampicin 과 ChIP-chip 기법을이용하여다수의프로모터 영역을밝히는연구가있었지만프로모터영역에서외부환 경변화에반응하는 RNA 중합효소상호작용의변화를밝히 는데는한계가있다. 따라서 rifampicin 을처리하지않고 ChIP-chip 실험을진행하여 RNA 중합효소와게놈사이의 상호작용의변화정도를측정하여전사체프로파일과비교하 는 RNA polymeraseomics 가시도되었다. Grainger 등 은 salicylic acid 에반응하는대장균을이용한연구에서 RNA 중합효소와게놈의상호작용변화와전사체의변화를 비교분석하였으며성장정지기에서는 RNA 중합효소가프로모터영역에치우치게상호작용하는것을보일수있었다. 10,11 또한, Cho 등의연구에서는대장균의전사조절인자중하나 인 Lrp 가외부루신의영향에따라특정프로모터영역에서 RNA 중합효소와게놈의상호작용을조절하는현상을게놈 수준에서밝히기도하였다. 9 따라서앞서소개한것처럼전사 조절인자와 RNA 중합효소의게놈수준상호작용프로파일은외부환경에반응하는원핵세포전사체의변화기전을이 해하는데매우중요하다. 일반적으로 RNA 중합효소는특정한프로모터를인식하 는시그마인자의도움이없으면전사과정을시작할수없 다. 45 대장균의경우, 7 가지의시그마인자가밝혀져있는데 지수성장기에주로작용하는 housekeeping 시그마인자인 σ70 을비롯하여성장정지기의 σs, 외부온도변화에반응하는 σh, 다양한외부자극에반응하는 σe, 외부질소원에반응하는 σn, 외부 iron 에반응하는 σfeci 와대장균의 flagella 생성에관여 하는 σf 가있다. RNA 중합효소의경우와마찬가지로시그 마인자의게놈상의상호작용부위프로파일은원핵세포의 프로모터를이해하는데매우중요하다. 예를들어, 앞서언 급된 ChIP-chip 기법을이용하여지수성장기의대장균으로부터약 1300 여개가넘는 σ70 의상호작용영역을찾아낼수있 igure 대장균시그마인자 - 게놈상호작용. (A) RNA 중합효소와 σ 70 의 ChIP-chip 프로파일. (B) σ 70 와 σ 32 프로모터간의겹침현상. 5 분자세포생물학뉴스
었는데 RNA 중합효소의상호작용영역과마찬가지로전사가일어나지않는영역에서도 σ 70 의상호작용영역이발견되었다. 16 이와같은결과를바탕으로원핵세포의전사기작을설명하려는시도가있었는데 Reppas 등은대장균을이용한실험으로부터전사개시후 RNA 중합효소의복합체로부터 σ 70 가빠르게분리되는것을관찰함으로써전사과정중전사가시작된후 elongation 으로전환되는단계가전체전사과정의율속단계라는것을밝힐수있었다 (Figure 2A). 16 지수성장기에주로작용하는 σ 70 이외의대체시그마인자들의상호작용프로파일의경우도다양한외부자극에반응하는원핵세포전사체의변화를이해하는데매우중요하다. 예를들어, 외부온도에반응하는 σ H 의경우는 ChIP-chip 기법을이용한결과로부터약 150 개의프로모터가밝혀졌는데흥미롭게도약 25% 에해당하는프로모터가유전자의내부에서측정되었다 (Figure 2B). 이와같은결과는원핵세포전사체가현재밝혀진내용보다매우복잡하다는것을보여주며 regulatory RNA 을포함한아직밝혀지지않은다양한전사체의구성성분이존재한다는것을간접적으로나타내주고있다. 의학적인측면에서보면, 다양한병원성미생물의경우시그마인자가병원성을일으키는다양한기작에관련이있는것으로보이며이는신약개발혹은새로운백신개발에도움이될것으로예상된다. 46 예를들어, Mycobacterium tuberculosis 의경우게놈서열분석으로부터약 13가지가넘는시그마인자가존재하는것으로예상되는데 mouse model 을이용한연구로부터시그마인자가병원성을나타내는데큰영향을미치는것으로보고되었다. 47 전사조절인자 - 전사조절요소의상호작용 원핵세포를비롯한모든생명체의전사체는특정한외부환경에반응하여매우복잡한전사조절네트워크에의해조절된다. 48 동일한환경자극에의해발현이유도되는유전자의집합을 stimulon 이라하고동일한전사조절인자에의해발현이조절되는유전자의집합을 regulon 이라하며 stimulon 과 regulon 을함께고려하여전사조절네크워크를재설계하 게된다. 일반적으로전사조절인자는게놈의특정영역에결합하여 RNA 중합효소복합체와상호작용하므로써 RNA 중합효소복합체의역할을돕거나방해하여전사과정을조절한다. 49 대장균의경우는약 300 개가넘는전사조절인자의존재가예측되는데이중 35% 정도는활성인자, 43% 는저해인자, 나머지 22% 는활성및저해역할을동시에나타내는인자로알려져있다. 50 특정전사조절인자의 regulon 을규명하기위해서는해당전사조절인자의유전자가제거된세포와야생형세포의전사체를비교분석하는데주로마이크로어레이를이용한유전자발현프로파일을측정하게된다. 이때마이크로어레이를이용한실험의단점은전사조절인자가전사체에미치는직접적인영향과간접적인영향을구별하지못한다는것이다. 반대로크로마틴면역침전법을이용한실험은전사조절인자의게놈상의상호작용영역을측정하므로써직접적인영향만이측정된다. 따라서유전자발현프로파일과크로마틴면역침전법을이용한연구는상호보완적이다. 4 특히 Crp, Fnr, ArcA 와같은글로벌전사조절인자의경우는다양한전사조절인자의유전자발현을직접조절하므로써전사체변화에직접적인영향뿐만아니라간접적인영향도미치게된다. 따라서앞서언급한두가지의게놈수준실험기법을사용하여융합분석을하게되면구체적인전사조절네트워크를재구축할수있다. 9 진핵생물의경우는다양한크로마틴면역침전법기반의연구결과가보고되어있으나원핵생물의경우는제한된수의결과만이보고되어있다. 처음으로크로마틴면역침전법을진핵생물의전사조절인자에응용한연구는 Caulobacter crescentus 의세포주기조절인자인 CtrA 에관한것으로써마이크로어레이를이용한유전자발현프로파일결과로부터는약 140 여개의유전자가영향을받는것으로관찰되었으나 ChIP-chip 결과로부터이중 polar morphogenesis, DNA replication initiation, DNA methylation, cell division, cell wall metabolism 에관련된약 95여개의유전자가 CtrA 의직접적인조절을받는것으로관찰되었다. 51,52 대장균의경우는 MelR, Fnr, Crp, RutR, NsrR, LexA, 웹진 12 월 2010 6
논단 Fis, Lrp 전사조절인자의게놈수준상호작용영역프로파일이 ChIP-chip 실험으로규명되었다. 9-11,17,37,53-55 일반적으로글로벌전사조절인자를결정하는데는세가지기준이사용되는데다른세포내기능을나타내는많은수의유전자군을조절하고다수의로컬전사조절인자를조절하며다른종류의시그마인자와상호작용하여다양한프로모터의활성을조절하는역할을나타내는것이다. 대장균의경우는 7가지의전사조절인자 (Crp, Fnr, IHF, Fis, ArcA, NarL, Lrp) 가전체유전자의약 50% 가넘는수를조절하는것으로알려져있다. 48 예를들어혐기성배양조건에서다양한유전자군을조절하는 Fnr 전사조절인자의경우는 N-말단에존재하는 iron-sulfur cluster 를통하여산소를감지하게된다. 유전자발현프로파일을통해서는약 1000 여개의유전자가 Fnr 의영향을받는것으로측정되었으나 ChIP-chip 실험으로부터약 63여개의상호작용영역만이측정되는것으로미루어보아대부분의유전자가 Fnr 에의해간접적으로전사조절을받는것으로밝혀졌다. 56,57 UV등세포외부의자극에의해활성화되는 LexA 전사조절인자의경우는 ChIP-chip 실험으로부터직접적인조절을받을것으로예상되는유전자중약 36% 가유전자발현프로파일에서는아무런변화가없는것으로나타났는데이와같은결과에대한이유로는특정환경조건하에서해당유전자발현이조절되려면 LexA 와함께다른전사조절인자의역할이필요하거나해당유전자가발현되는환경조건이다르거나진화과정중제거되지못하고남아있는것이거나혹은 LexA 가전사조절인자의역할뿐만아니라게놈의구조를결정하는데관여하는것으로예측되었다. 17,58 Crp 전사조절인자는세포내 camp 의농도에반응하여다양한유전자의발현조절에관여하는것으로알려져있다. 59 유전자발현프로파일분석에서도약 200 여개의프로모터가 Crp 에의해영향을받는것으로예측되었다. 하지만 Grainger 등은 ChIP-chip 기법을이용하여약 68여개의 Crp 전사조절요소를측정하였는데이중 60% 이상의프로모터가새롭게밝혀진유전자군을조절하는전사조절요소이었으며 Crp 가게놈의구조를결정하는인자로써작용할수있 다는의견을제시하였다. 11 다른예로써외부루신의농도에의해반응하는 Lrp 를생각할수있는데 Cho 등은 wholegenome tiling 마이크로어레를이용한 ChIP-chip 실험으로부터약 194 여개의유전자가 Lrp 의직접적인전사조절을받는다는사실을밝혔다. 9 이연구에서는더나아가 Lrp 의상호작용요소를 RNA 중합효소 ChIP-chip 결과및유전자발현프로파일과비교분석하여외부루신농도에반응하는 Lrp 상호작용의기작을 6가지의서로다른조절모티프로나누어설명하였다. 이와유사한게놈수준의연구들이 Helicobacter pylori 유래의 Fur, Bacillus subtilis 유래의 CodY, Spo0A, SpoIIID 등을이용하여수행되었으며각전사조절인자의작용기작및 regulon 을이해할수있었다. 60-63 게놈수준의전사조절네트워크재설계 게놈수준의실험결과를바탕으로한전사조절네트워크의재설계연구는최근들어다양한분자생물학기법의발전에힘입어빠르게성장하고있다. 1 게놈수준의전사조절네트워크를규명하는것은특정한외부환경변화에적응하는전사체의변화를이해하는데매우중요하다. 전사조절네트워크재설계기법은문헌조사, 유전자발현프로파일, ChIP-chip 결과, 프로모터서열등다양한정보를융합분석하여이루어진다. 12,64-69 전사조절네트워크를재설계하기위해서는우선네트워크의구성성분을정의해야한다. 전사조절네트워크는전사조절인자, regulatory RNA, 전사조절요소등최소 3가지형태의 node 와활성과저해의특성을나타내는 edge 로각 node 가연결되어네트워크를구성하게된다. 4 예를들어, 대장균의경우, 완전하지는않지만현재까지밝혀진전사조절정보를모아놓은 RegulonDB 혹은 EcoCyc 과같은데이터베이스로부터각 node 와 edge 를정의하여전사조절네트워크를재설계하였다 (Figure 3). 대장균의전사조절네트워크로얻어진흥미로운결과는게놈수준의네트워크가 feed-forward loop, bi-fan, single-input module, autoregulation loop, multi-component loop, regulator chain motif 등 6가지의기본네트워크모티프로이루어져 7 분자세포생물학뉴스
맺음말 igure 대장균의전사조절네트워크. EcoCyc 데이터베이스를이용하여네트워크그래프기법을이용하여재구축된대장균전사조절네트워크. 왼쪽부터글로벌전사조절인자가네트워크중간에위치한다른전사조절인자를조절하며결국가장오른쪽에위치한해당유전자를조절함. 있으며각각독특한다중 hierarchical 구조를갖는다는것 이다. 68,70 이중 feed-forward loop 와 bi-fan 모티프의경우 는원핵생물의전사조절네트워크를이루는주된모티프이 다. 전사조절네트워크를재설계하는좀더구체적인기법은 주로 directed graph, Boolean network, probabilistic model 등이사용되어왔으나네트워크의시스템적성질등을 관찰하기위해서는 non-biological 네트워크분석혹은 matrix 기법등다양한수학적인방법이사용될수있다. 71 더우기전사조절네트워크는대사경로네트워크와융합되어 세포의표현형을이해하는데유용한융합네트워크로재설계 될수있다. 예를들어, Cho 등에의해재설계된 Lrp 전사조 절네트워크의경우대사경로네트워크와융합해석되어대 장균의루신대사에있어서 Lrp regulon 의생리학적역할을 규명할수있었다. 그러나모델원핵생물인대장균의경우도 전사조절인자와전사조절요소의상호작용에관한정보가부 족하여완전한전사조절네트워크 (topological transcriptional regulatory network) 를재설계하는것은현재는불가능하 며특정환경조건에활성이있는일부전사조절네트워크 (functional transcriptional regulatory network) 만이규 명가능하다. 최근들어유전체학기술의급속한발전에힘입어다양한 DNA 혹은 RNA- 단백질간의상호작용을게놈수준에서측정하는기법이개발되고결과적으로원핵세포의전사과정이나세포기능을이해하는것이가능해지고있다. 현재는크로마틴면역침전법등과결합된차세대서열분석기술의사용이급격히증가하고있으며유전자발현프로파일등전사체의분석에도널리사용되고있다. 이러한급격한기술발전에도불구하고현재까지원핵세포의약 20여가지의전사조절인자만이게놈수준에서분석되었으며대장균의경우전체전사조절인자의갯수가약 300 가지임을감안할때완전한전사조절네트워크를재구성하는것은아직요원해보인다. 또한다양한전사조절인자가활성을나타내는특정환경조건에관한정보와특정전사조절인자에특이적인항체또한부족하다. 이런어려움을극복하기위해서다양한노력들이전개되고있는데한가지예로써단일유전자가결손되어있는세포라이브러리를다양한환경조건에서스크리닝하는고속대용량화학- 유전적프로파일데이터를들수있다. 72,73 원핵세포의전사조절네트워크를완전하게이해하기위해서는 DNA- 단백질상호작용에관한정보들과함께다른종류의유전체정보들도융합분석해야한다. 예를들어, 원핵세포에는다양한종류의 regulatory RNA 들이존재하는데특이적인전사조절인자와상호작용하므로써 posttranscriptional level 에서유전자발현을조절하는것으로규명되고있다. 74-76 또다른예로써는원핵세포의 epigenetic 조절을들수있다. 진핵세포뿐만아니라원핵세포에서도 DNA methylation 은다양한외부환경변화에따라패턴이변하여유전자발현에영향을주게된다. 더불어원핵세포의 methylation 은병원성균주의 virulence 와연관이있는것으로알려져있어새로운의약의개발에중요한목표가될수있다. 77 또한, Crp, Lrp, OxyR 과같은전사조절인자는 DNA methylation 을 block 하여유전자의발현을조절하는것으로알려져있다. 78 이와같이원핵세포의 DNA- 단백질 웹진 12 월 2010 8
논단 혹은 RNA- 단백질상호작용에관한이해는게놈수준의전 사조절네트워크를통해조절되는생명현상의이해와함께 병원균과관련된질병의치료약개발에도기여할것으로기 대된다. 참고문헌 1. Joyce, A.R. & Palsson, B.O. The model organism as a system: integrating 'omics' data sets. Nat Rev Mol Cell Biol 7, 198-210 (2006). 2. Lee, T.I. et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science 298, 799-804 (2002). 3. Ishihama, A. Prokaryotic genome regulation: multifactor promoters, multitarget regulators and hierarchic networks. FEMS Microbiol Rev 34, 628-45 (2010). 4. Cho, B.K., Charusanti, P., Herrgard, M.J. & Palsson, B.O. Microbial regulatory and metabolic networks. Curr Opin Biotechnol 18, 360-4 (2007). 5. Grainger, D.C. & Busby, S.J. Methods for studying global patterns of DNA binding by bacterial transcription factors and RNA polymerase. Biochem Soc Trans 36, 754-7 (2008). 6. Herring, C.D. et al. Immobilization of Escherichia coli RNA polymerase and location of binding sites by use of chromatin immunoprecipitation and microarrays. J Bacteriol 187, 6166-74 (2005). 7. Cho, B.K. et al. The transcription unit architecture of the Escherichia coli genome. Nat Biotechnol 27, 1043-9 (2009). 8. Qiu, Y. et al. Structural and operational complexity of the Geobacter sulfurreducens genome. Genome Res (2010). 9. Cho, B.K., Barrett, C.L., Knight, E.M., Park, Y.S. & Palsson, B.O. Genome-scale reconstruction of the Lrp regulatory network in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 19462-7 (2008). 10. Grainger, D.C., Aiba, H., Hurd, D., Browning, D.F. & Busby, S.J. Transcription factor distribution in Escherichia coli: studies with FNR protein. Nucleic Acids Res 35, 269-78 (2007). 11. Grainger, D.C., Hurd, D., Harrison, M., Holdstock, J. & Busby, S.J. Studies of the distribution of Escherichia coli camp-receptor protein and RNA polymerase along the E. coli chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 17693-8 (2005). 12. Faith, J.J. et al. Large-scale mapping and validation of Escherichia coli transcriptional regulation from a compendium of expression profiles. PLoS Biol 5, e8 (2007). 13. Ren, B. et al. Genome-wide location and function of DNA binding proteins. Science 290, 2306-9 (2000). 14. Valouev, A. et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP- Seq data. Nat Methods (2008). 15. Kharchenko, P.V., Tolstorukov, M.Y. & Park, P.J. Design and analysis of ChIP-seq experiments for DNA-binding proteins. Nat Biotechnol 26, 1351-9 (2008). 16. Reppas, N.B., Wade, J.T., Church, G.M. & Struhl, K. The transition between transcriptional initiation and elongation in E. coli is highly variable and often rate limiting. Mol Cell 24, 747-57 (2006). 17. Wade, J.T., Reppas, N.B., Church, G.M. & Struhl, K. Genomic analysis of LexA binding reveals the permissive nature of the Escherichia coli genome and identifies unconventional target sites. Genes Dev 19, 2619-30 (2005). 18. Wade, J.T. et al. Extensive functional overlap between sigma factors in Escherichia coli. Nat Struct Mol Biol 13, 806-14 (2006). 19. Sharma, C.M. et al. The primary transcriptome of the major human pathogen Helicobacter pylori. Nature 464, 250-5 (2010). 20. Blattner, F.R. et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 277, 1453-74 (1997). 21. Fleischmann, R.D. et al. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus influenzae Rd. Science 269, 496-512 (1995). 22. Nagarajan, H. et al. De Novo assembly of the complete genome of an enhanced electricityproducing variant of Geobacter sulfurreducens using only short reads. PLoS One 5, e10922 (2010). 23. Margulies, M. et al. Genome sequencing in 9 분자세포생물학뉴스
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