동의생리병리학회지제 22 권 6 호 Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(6):1439 1443, 2008 장문석 심경준 김휴영 박은화 고은빛 최봉재 양웅모 임형호 1 이명종 2 박성규 * 경희대학교한의과대학, 1 : 경원대학교한의과대학, 2 : 동국대학교한의과대학 Acute Oral Toxicity of Taeumjowi-tang in SD Rats Mun Seog Chang, Kyung Jun Shim, Hyu Young Kim, Eun Hwa Park, Eun Bit Ko, Bong Jae Choi, Woong Mo Yang, Hyung Ho Lim 1, Myeong Jong Lee 2, Seong Kyu Park* College of Oriental Medicine, Kyung Hee University, 1:College of Oriental Medicine, Kyung Won University, 2:College of Oriental Medicine, Dongguk University The objective of this study was to evaluate the acute toxicity of Taeumjowi-tang in rats. SPF Sprague-Dawley male and female rats were administered orally with Taeumjowi-tang extract of 2,500 mg/kg(low dosage group), and 5,000 mg/kg(high dosage group). We daily examined number of deaths, clinical signs, body weights and gross findings for 14 days. No dead animal and no significant changes of body weights were found during the experimental period. In addition, no differences were found between control and treated groups in clinical signs, hematology, serum biochemistry, and other findings. In conclusion, Taeumjowi-tang extract did not show any toxic effects, and oral LD50 value was over 5,000 mg/kg in SD rats. Key words : Taeumjowi-tang, acute toxicity, rat, oral, LD50 서론 李濟馬의 東醫壽世保元 에처음소개된太陰調胃湯은肝大肺小한생리적장부형국을지니는太陰人의胃脘受寒表寒病에쓰이는대표적인처방이다 1). 태음조위탕은中風虛症, 癱瘓, 口眼喎斜, 黃疸, 喘息, 哮喘, 婦人帶下, 下血, 五淋, 小便不利, 眩暈등의치료에활용되었다 2). 이등 3) 에의하면태음조위탕은유도비만세포의증식과분화를억제하여태음인의비만치료에효과가있음을보고하였다. 송등 4) 은절식요법시행후태음조위탕을투여하여체중과체지방율의감소를보고하였다. 이와같이태음조위탕은太陰人의황달, 傷寒, 時氣頭痛등의치료에활용되어왔으며, 현대적으로는비만에대한치료처방으로활용되고있다 5). 최근체중감소를목적으로 ephedrine을함유한건강보조식품들에대한안정성논란이거세게거론되며, 1994년이후미국식품의약국 (FDA) 에서 ephedrine이함유된건강보조제들의사용제한을건의했으나증거불충분으로기각된사례가있다 6). * 교신저자 : 박성규, 서울시동대문구회기동 1번지경희대학교한의과대학 E-mail : comskp@khu.ac.kr, Tel : 02-961-0330 접수 : 2008/09/11 수정 : 2008/11/01 채택 : 2008/11/11 이에麻黃이주요구성약물로함유되어있는태음조위탕에대한안전성논란이제기되는바, 동물실험을통한독성연구는태음조위탕의안전성에대한근거를확보하며임상활용에서적절한지침을제공할것으로사료된다. 이에본연구에서는한약처방으로사용되는태음조위탕에대한안정성을평가하기위하여, 식품의약품안전청고시의약품등의독성시험기준에준하여 7), 흰쥐에경구로단회투여하여급성독성을평가하여유의한결과를얻었기에보고하는바이다. 재료및방법 1. 시험물질본연구의시험물질인태음조위탕은 ( 주 ) 옴니허브 (Seoul, Korea) 를통하여구입한薏苡仁乾栗各 72 g 蘿葍子 48 g 五味子麥門冬石菖蒲桔梗麻黃各 24 g( 총 312 g) 을혼합하여 round flask에넣고증류수 6,000 ml를가한다음냉각기를부착하여 2 시간동안가열한다음여과지로감압여과한여과액을 rotary vacuum evaporator(eyela, Japan) 를사용하여감압농축한후, 농축액을동결건조하여시험에사용하였으며 8), 수율은 29.8% 로나타났다 (Table 1). - 1439 -
장문석 심경준 김휴영 박은화 고은빛 최봉재 양웅모 임형호 이명종 박성규 Table 1. Composition of Taeumjowi-tang Formulation Pharmaceutical name Scientific name Part used medicinally (g) Coicis semen Coix lachryma-jobi var. mayuen(roman.) Stapf Dried seed 12 Castaneae semen Castanea crenata Siebold et Zuccarini Dried seed 12 Raphani semen Raphanus sativus Linne Dried seed 8 Schizandrae fructus Schizandra chinensis Baill. Dried fruit 4 Liriopis tuber Litiope platyphylla Wang et Tang Dried tuber 4 Acori graminei rhizoma Acorus gramineus Solander Dried rhizome 4 Platycodi radix Platycodon grandiflorum A.(Jacq.) DC. Dried root 4 Ephedrae herba Ephedra sinica Stapf Dried stem 4 2. 시험동물및사육환경 시험구역은경희대학교한의과대학의청정동물실험실에서실시하였으며, 본연구에사용된동물은 SPF( 특정병원체부재 ) Sprague-Dawley계의 5주령된암, 수흰쥐로서중앙실험동물 (Japan) 로부터분양받아온도 23 ± 3, 습도 55 ± 5%, 배기 10-18 회 /h, light/dark 12 h, 조도 150-300 Lux의사육환경에서폴리카보네이트사육상자 (280 W 420 L 170 H mm) 에각각 5마리씩넣어사육하였다. 1주일간의순화사육기간동안에증상관찰등을시행하여정상적인동물만시험에사용하였다. 사료는실험동물용고형사료 (Samyang, Korea) 를자유롭게먹도록하였으며, 물은멸균수도물을자유롭게섭취시켰다. 시험자들은모두고압증기멸균 (121, 20 min) 된작업복, 두건, 마스크및장갑등을착용하고작업을실시하였다 9). 3. 투여량및시험군의구성 실험실환경에서 1주간적응시킨실험동물을대조군과태음조위탕투여군으로나누었으며, 각군은암, 수각각 10마리로하였다. 동물의군분리는다음과같이실시하였다. 우선, 순화기간중건강하다고판정된동물의체중을측정한후구분시켜두었다. 그리고평균체중에가까운개체를각군에 10마리씩균등히들어가도록체중을이용한무작위법을이용하여분배하였다. 동물의개체식별은피모색소마킹법및개체식별카드표시법으로실시하였다. 본시험물질은한약재로서식품의약품안전청의 " 의약품등의독성시험기준 " 에는한계용량에대한기준이없기때문에, 시험물질의투여용량은 OECD Guide Line 10) 과 Principles and Methods of Toxicology 11) 을참조하여예비실험결과와시험물질의용해도등을고려하여고용량군 (5,000 mg/kg), 저용량군 (2,500 mg/kg) 으로대조군을포함하여모두 3 개군으로정하였다. 4. 시험물질의조제및투여경로 투여직전에증류수를용매로하여시험물질을 2,500, 5,000 mg/10 ml/kg으로조제하였다. 대조군 (vehicle control) 의동물에는증류수만을투여하였다. 시험물질은투여전날하룻밤을절식시킨후경구투여용존데 (zonde) 를장착한주사기를이용하여조제시험물질을강제경구투여하였다. 시험물질의투여경로는임상예정경로로서경구투여를선택하였다. 투여당일오전에개 체별로단회투여하였으며투여량은투여당일측정된체중을기준으로투여액량 (10 ml/kg) 을계산하였다. 5. 관찰및검사항목 1) 일반증상및사망동물의관찰시험물질을투여한후매시간마다 6시간동안, 투여다음날부터 14일까지는 1일 1회씩일정시간에투여동물의일반상태, 중독증상및사망유무를대조군과비교관찰하였다. 2) 체중측정및식이효율시험에사용된모든동물에대하여투여당일을 0일로하여투여후매일 2주일간체중을측정하였다. 모든실험동물의식이는자유섭취방법으로공급하였다. 실험기간동안섭취량은매일측정하였고, 체중은 2일간격으로측정하였다. 식이효율 (food efficiency ratio: FER) 은실험시작일부터희생일까지를총실험기간으로하여실험기간동안의체중증가량을실험기간동안의식이섭취량으로나누어산출하였다. FER(%) = weight gain(g/day) / food intake(g/day) x 100 3) 부검소견투여후 14일째모든생존동물을 ether로흡입마취하여개복및복대동맥절단법으로방혈치사시킨다음외관및내부장기의이상유무를육안적으로해부소견을관찰하였다. 4) 혈액및혈액생화학적검사혈액은희생시에 heart puncture방법으로 5 ml을채취하였고, 1 ml은 ethylene-diamine tetraacetic acid(edta) 처리된 blood collection tube(bd vacutainer, USA) 에균등질이되도록잘흔들어 4 에보관해 48시간이내에 complete blood count(cbc) 등을측정하였다. 나머지혈액은생화학적측정을위하여 EDTA free tube에담아 tabletop centrifuge vs-5000n(vision scientific Co., Korea) 3,000 rpm에서 15분간원심분리하여 aspartate aminotransferase(ast), alanine aminotransferase(alt), total cholesterol 수치를측정하였다. 6. 통계처리체중의변화에대한통계학적분석은 one-way analysis of variance test(anova) 검정에의해대조군과시험물질투여군을비교하였고, LD50치는 Pharmacologic Calculating System을이용하여 Litchfield-Wilcoxon법에의하여 95% 신뢰한계내에서결정하였다. 결과 1. 사망동물및임상증상의관찰경구급성독성시험의암수모두시험기간동안대조군을포함한태음조위탕투여군모두에서사망한동물은없었다 (Table 2). 또한모든동물에서시험물질투여후자발적인운동및호흡율의증가등과같은특이할만한임상증상은관찰되지않았으며최종투여일에실시한안구검사에서도특이한안구부 - 1440 -
위의이상소견은관찰되지않았다 (Table 3). 암컷그룹모두에서유의한차이를보이지않았다 (Table 4, 5). Table 2. Mortality in Rats Orally Treated with Taeumjowi-tang Sex Days after treatment Final 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Mortality a) 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 Male 2,500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 5,000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 Female 2,500 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 5,000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0/10 a) Values are expressed as dead number/total number of animals. Table 3. Clinical Signs in Rats Orally treated with Taeumjowi-tang Sex (mg/k) Appear snorml Prone position Signs oervation Decrease oflocomotive activity Decreasedre spirationrate Lacrim ation Death 0 10/10 a) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 Male 2,500 10/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 5,000 10/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0 10/10 a) 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 Female 2,500 10/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 5,000 10/10 0/10 0/1 0/10 0/10 0/10 a) Number of animals with the sign/total number of animals examined. 2. 체중변화및식이효율 시험물질을투여한후 14일동안체중변화를관찰하였을때, 대조군및시험물질투여군에서시간이경과함에따라모두체중증가가관찰되었다. 체중증가율과식이효율은수컷그룹과 Table 4. Weight Gain, Food Intake and Food Efficiency Ratio(FER) of Taeumjowi-tang Treated Male Rats Initial weight (g) Final weight (g) Weight gain (g/day) Food intake (g/day) FER 0 161.9±6.5 279.3±11.3 7.8±0.8 19.4 40.28% 2,500 160.3±9.1 273.6±4.8 7.6±0.4 19.1 39.57% 5,000 162.0±7.8 276.6±5.1 7.6±0.5 19.2 39.84% All values are expressed as maen ± S.D. Table 5. Weight Gain, Food Intake and Food Efficiency Ratio(FER) of Taeumjowi-tang Treated Female Rats Weight gain Foodntae Initial weight(g) Final weight(g) (g/dy) (g/day) FER 0 129.9±11.1 177.0±14.5 3.1±0.5 12.3 25.46% 2,500 128.3±8.3 187.5±12.1 3.9±0.7 13.8 28.63% 5,000 128.9±11.9 192.1±8.3 4.2±0.9 13.2 31.95% All values are expressed as maen ± S.D. 3. 육안적부검소견및장기중량 모든대조군및시험물질투여군에서육안소견상이상이있는개체는관찰되지않았다 (Table 6, 7). 심장, 폐, 비장, 간, 신장, 고환및난소의절대무게와상대무게에대한장기중량측정결과에서대체로대조군과시험물질투여군간의유이성있는차이가나타나지않았다. 다만, 신장을제외한모든장기에서시험물질투여에의한변화는인정되지않았다. 태음조위탕 5.,000 mg/kg 수컷투여군에서신장의절대무게및상대무게가대조군에비해유의하게증가하였다 (p < 0.05, Table 6). Table 6. Weights and -Weight-to-Body-Weight Ratios for Male Rats Orally Treated with Taeumjowi-tang Heart Lung Spleen Liver 0 0.99±0.05 0.36±0.01 1.61±0.31 0.58±0.11 0.55±0.05 0.20±0.01 13.14±0.70 4.70±0.14 2,500 1±0.06 0.36±0.02 1.70±0.20 0.62±0.07 0.56±0.05 0.20±0.02 11.79±0.72 4.31±0.21 5,000 1±0.06 0.36±0.02 1.57±0.18 0.57±0.06 0.57±0.04 0.21±0.01 12.59±1.09 4.55±0.32 Lt-kidney Rt-Kidney Lt-testis Rt-testis 0 1.01±0.04 0.36±0.02 1.03±0.03 0.37±0.01 1.47±0.09 0.53±0.03 1.45±0.05 0.52±0.01 2,500 1.07±0.07 0.39±0.02 1.07±0.06 0.39±0.02 1.48±0.08 0.54±0.03 1.44±0.06 0.53±0.02 5,000 1.08±0.04* 0.39±0.02* 1.09±0.02* 0.40±0.01* 1.56±0.07 0.56±0.02 1.53±0.06 0.55±0.01 All values are expressed as maen ± S.D. weights(absolute weights) and body weights are given in grams; organ-weight-to-body weight ratios(relative weights) are given as organ weight/body weight x 100(mean±S.D.); * Significantly different from the control value(*: p < 0.05). Table 7. Weights and -Weight-to-Body-Weight Ratios for emale Rats Orally Treated with Taeumjowi-tang Heart Lung Spleen Liver 0 0.67±0.07 0.38±0.03 1.27±0.14 0.71±0.04 0.37±0.04 0.21±0.02 6.60±1.00 3.66±0.28 2,500 0.70±0.04 0.37±0.01 1.27±0.05 0.68±0.05 0.43±0.03 0.23±0.00 6.87±0.32 3.67±0.11 5,000 0.74±0.06 0.38±0.03 1.24±0.10 0.63±0.06 0.42±0.04 0.21±0.02 7.20±0.51 3.68±0.24 Lt-kidney Rt-Kidney Lt-testis Rt-testis 0 0.65±0.06 0.29±0.16 0.64±0.05 0.36±0.02 0.03±0.01 0.02±0.00 0.03±0.01 0.02±0.00 2,500 0.71±0.04 0.38±0.01 0.70±0.02 0.38±0.02 0.04±0.01 0.02±0.00 0.03±0.01 0.02±0.00 5,000 0.69±0.01 0.35±0.02 0.70±0.04 0.36±0.02 0.04±0.00 0.02±0.00 0.03±0.01 0.02±0.00 All values are expressed as maen ± S.D. weights(absolute weights) and body weights are given in grams; organ-weight-to-body weight ratios(relative weights) are given as organ weight/body weight x 100(mean±S.D.). - 1441 -
장문석 심경준 김휴영 박은화 고은빛 최봉재 양웅모 임형호 이명종 박성규 4. 혈액학적검사및혈액생화학적검사 혈액학적검사및혈액생화학적검사에대한 WBC, RBC, HB, HCT, ALT, Total cholesterol 수치를측정한결과암수의전투여용량군에서대조군에비해시험물질투여에의한유의성있는변화는인정되지않았으나, 태음조위탕 5.,000 mg/kg 암컷투여군에서 AST 수치가대조군에비해유의하게증가하였다 (p < 0.05, Table 8, 9). Table 8. Levels of Hematological Analysis in Male Rats Orally Treated with Taeumjowi-tang WBC (103/mm 3 ) RBC (106/mm 3 ) HB (g/dl) HCT (%) AST(S) ALT(S) T.Chol(S) (mg/dl) 0 4.8±2.4 6.5±0.2 13.7±0.7 40.1±1.8 111±21 53±5 63±6 2,500 3.6±2.0 6.6±0.3 13.8±0.8 40.7±2.3 82±10 44±4 59±4 5,000 4.4±1.3 6.7±0.3 14.0±0.4 41.4±1.5 102±30 49±3 58±5 All values are expressed as maen ± S.D. WBC, white blood cell count; RBC, red blood cell count; HB, hemoglobin; HCT, hematocrit; AST, Aspartate aminotransferase; ALT, Alanine aminotransferase; T.chol, total cholesterol. Table 9. Levels of Hematological Analysis in Female Rats Orally Treated with Taeumjowi-tang WBC (103/mm 3 ) RBC (106/mm 3 ) HB (g/dl) HCT (%) AST(S) ALT(S) T.Chol(S) (mg/dl) 0 6.9±2.2 6.7±0.3 14.2±0.5 40.9±1.3 96±4 36±4 93±13 2,500 7.9±2.1 6.5±0.2 13.8±0.4 39.7±1.2 112±23 37±5 81±10 5,000 5.0±1.6 6.3±0.5 13.4±0.7 38.8±2.6 130±15* 33±4 82±14 All values are expressed as maen ± S.D. WBC, white blood cell count; RBC, red blood cell count; HB, hemoglobin; HCT, hematocrit; AST, Aspartate aminotransferase; ALT, Alanine aminotransferase; T.chol, total cholesterol; * Significantly different from the control value(*: p < 0.05). 고찰및결론 식품의약품안전청고시제2003-17호의약품등의안전성유효성심사에관한규정중한약서에기재된처방에대하여이미허가또는신고된품목에서사용례를인정할수있는경우에는독성자료의일부또는전부를면제할수있다 12). 여기에서한약서란동의보감, 방약합편, 향약집성방, 경악전서, 의학입문, 제중신편, 광제비급, 동의수세보원, 본초강목, 약성가및한약처방의종류및조제방법에관한규정 ( 보건복지가족부고시제1995-15 호, 1995.03.15제정 ) 으로정한한약조제지침서를말한다 13). 한약서수재품목중부자탕, 대승기탕, 온백원등환자에따라심각한이상반응이우려되는경우와대한약전, 대한약전외한약 ( 생약 ) 규격집이외의한약을사용하는경우에해당되어안전성을저해할우려가있는경우를제외한품목에대해서는안전성, 유효성심사를제외받는규정이명시되어있다 12). 시험물질인태음조위탕은薏苡仁, 乾栗, 蘿菔子, 五味子, 麥門冬, 石菖蒲, 桔梗, 麻黃등의 8종약물로구성되어있으며 1), 동의수세보원에수재된처방이므로식품의약품안전청고시에의거안전성및유효성에대한심사대상에해당하지않는다 12). 그러나 1990년대이후마황에함유된 ephedrine성분의안전성에대한논란과 800여건에이르는부작용사례가미국식품의약국 (FDA) 에서제기되며 14), 마황을포함한한약처방의안전성에대한연구의필요성이대두되고있는실정이다 15). 식품의약품안전청의의약품등의독성시험기준고시에의하면시험동물은 2종이상으로하고최소한 1종에대하여는암, 수모두에서조사하도록명시되어있다 7). 기존의연구중사물탕 16), 팔물탕 17) 등한약서에기재된처방에대하여독성자료의면제기준에의하여암, 수모두를대상으로하지않고수컷에대한독성실험만이보고되기도하였으나, 본연구에서는태음조위탕의안전성을확립하기위하여각군을암, 수흰쥐에대하여각각 10마리로구성하여식품의약품안전청의의약품등의독성시험기준을충실하게준수하였다. 단회투여독성시험의시험결과에는개략의치사량, 일반증상의매일관찰기록, 시험기간중 3회이상의체중측정기록, 관찰기간종료후육안적해부소견, 육안적이상소견이관찰된장기및조직에대하여필요시병리조직학적검사에대한기본사항이포함되어야한다. 본연구에서는단회투여독성시험이기본사항이외에추가적으로체중, 사료섭취량, 혈액학적검사및혈액생화학적검사항목, 병리조직학적검사로서동물의장기무게를측정하여연구의근거를명확하게제시하였다. 본연구에의한태음조위탕의안전성, 유효성검사는차후이루어질한약재및한방처방전반에대한안전성및유효성검사의필수연구항목의시험방법으로서의의가있으리라기대된다. 시험물질인태음조위탕에대한독성을평가하기위해 Sprague-Dawley계흰쥐에단회경구투여한후 14일경과동안시험물질투여에의한사망동물은없었으며, 자발운동저하, 호흡수감소, 유루및복와위등의일반증상, 체중, 사료섭취량, 음수량, 혈액학적검사, 육안적소견, 병리조직학적검사등에서특이한독성병변은관찰되지않았다. 장기무게측정결과중대조군과실험군의심장, 폐, 비장, 간, 신장, 고환및난소의절대무게와상대무게에서, 신장을제외한모든장기에서시험물질투여에의한변화는인정되지않았다. 태음조위탕 5,000 mg/kg 수컷투여군의신장무게가대조군에비해유의하게증가한것으로나타났으나, 암컷그룹에서는시험물질투여에의한신장무게의이상이관찰되지않았다. 태음조위탕 5,000 mg/kg 암컷투여군의 AST 수치도대조군에비해유의하게증가하였으나, 수컷그룹에서는시험물질투여에의한 AST 수치의이상은관찰되지않았다. 따라서단회고용량노출시태음조위탕의신장독성과간독성에대한후속연구가필요하다고사료된다. 이상의결과를종합하여볼때태음조위탕은암수흰쥐를대상으로경구단회투여독성시험결과사망동물, 체중, 사료섭취량, 일반증상, 혈액학적검사, 혈액생화학적검사, 육안적소견, 병리조직학적검사등에서특이한독성병변을동반하는급성독성을나타내지않았고, LD50값은암수흰쥐에서경구투여최고용량인 5,000 mg/kg 이상으로사료된다. 감사의글 본연구는대한한의학회 한약의안전성및유효성확보방안을위한연구 (20071240) 의지원에의해이루어진것임. - 1442 -
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