Journal of Radiation Industry 4 (4) : 319~323 (21) Review Paper 천연식물추출물과감마선이막걸리에서분리한유산균에미치는영향연구 남지영 김재훈 이주운 김진규 * 한국원자력연구원방사선과학연구소 Effects of Natural Plant Extracts and Gamma Rays on Lactobacillus Isolated from Korean Traditional Raw Rice Wine Ji-young Nam, Jae-Hun Kim, Ju-Woon Lee and Jin Kyu Kim* Advanced Radiation Technology Institute, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup 58-185, Korea Abstract - Recently, Korean traditional raw rice wines (RRW) have received attention because they are a nutritious food with health properties. But the rapid deterioration of fermented RRW is one of the serious problems for brewing and marketing in the world beyond Korea. The goal of this study was to develop a way to enhance the quality and to lengthen the period of circulation of the RRW. A lactic acid bacterium was isolated from RRW. It was identified as Lactobacillus fermentum (98%) based on its biochemical properties, and 16S rrna sequence. Treatments of RRW with gamma radiation and green tea extracts reduced the bacterial population except for yeasts and Lactobacillus in the RRW. This result suggested that the natural plant extracts and catechin products can be used as an effective natural storage agent. Key words : Korean traditional raw rice wine (RRW), Natural plant extracts, Catechin, Green tea extracts, Gamma rays 서 알코올도수가높은술을마시게되면금방취하고간에많은부담을주게되지만, 우리나라의전통주인막걸리는알코올도수가상대적으로낮고곡류를이용한발효식품으로서위에부담을주지않을뿐아니라다양한맛과향으로우리나라뿐아니라일본등해외각지에서도인기식품으로급부상하고있다. 막걸리는수천 론 * Corresponding author: Jin Kyu Kim, Tel. +82-63-57-313, Fax. +82-63-57-3139, E-mail. jkkim@kaeri.re.kr 년의오랜전통을지니고있는우리나라의전통알콜성음료로당화와발효공정을통해제조되었고, 특히양조장에서생산되는막걸리는약 8% 의에탄올및단백질, 리보플라빈등을함유하고있으며다양한유용유산균이존재한다 (Yoo 1981; 신등28). 이에국내산막걸리의품질을향상시키는동시에유통기한을연장시키기위한연구의일환으로양조장막걸리를이용하여 probiotic 균주인 Lactobacillus fermentum을분리하였고감마선조사와더불어천연식물추출물, 카테킨등을첨가하여미생물학적변화를관찰하였다. 미국의식품첨가물규정에서는오래전부터식품에보존제로사용해왔거나, 천 319
32 남지영 김재훈 이주운 김진규 연물의추출물을보존제로이용할때는 GRAS (Generally Recognized As Safe) 급으로분류하여특별히규제하지않고있는데유산균은이미오랜기간동안발효식품과함께섭취된건강기능성식품이기때문에 GRAS 균주이다. 특히유산균은발효식품의풍미증강뿐아니라, 유기산에의한 ph 저하와 H 2O 2, CO 2, diacetyl, bacteriocin 등다양한항균물질들을생산하여유해미생물을저해하기때문에식품보존제개발에많은관심이집중되고있다. 현재식품보존을위한방법으로는여러가지물리적방법과화학첨가물을이용하는화학적방법등이있으나, 물리적처리로인한식품질의저하와영양적인손실, 화학보존제사용에대한소비자들의거부감과미생물의내성문제등으로새로운식품보존방법에대한요구가증가하고있다. 이러한문제들을해결할수있는식품보존의방법으로천연물유래의식품보존제에대한개발필요성과함께기존의식품보존방법을보완하거나대체할수있는새로운생물학적보존제의개발이요구되고있다 (Gould 21; 양과장 28). 더불어전세계적으로널리소비되고있는가장대중적인음료인차는매년약 25만 metric ton의건조된차가제조되고있는데이러한양의약 2% 는차가주음료인아시아지역에서소비되고있는녹차 (green tea) 이고, 78% 는주로서양과몇몇아시아국가에서소비되고있는홍차 (black tea) 이며 2% 는주로중국남동쪽에서소비되는우롱차 (oolong tea) 이다. 특히녹차는 flavonoid와 phenolic acid를포함한폴리페놀류를함유하고있는데강한항산화능을가진다. 녹차 polyphenol류는 catechin으로잘알려진 flavonoid류이며주요한녹차의 catechin으로는 (-)-epigallocatechin-3-o-gallate (EGCG), (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin-3-o-gallate (ECG), (-)- epicatechin (EC) 등이있는것으로알려져있다 (Graham 1992). 이에녹차를비롯한다류의다엽중에존재하는폴리페놀성화합물인카테킨성분은충치억제작용 (Cheng 1986), 혈압저하와혈소판응집감소 (Kazuko et al. 1991), 항암작용 (Kada et al. 1985), 중추신경계활성화 (Hayashi et al. 199), 항균작용 (Sakanaka et al. 1989), 항돌연변이작용 (Kada et al. 1985), 혈중콜레스테롤저하 (Muramatzu et al. 1986), 중금속류제거작용, 항알레르기작용 ( 임 1987) 등의여러약리작용이있는것으로보고되고있으며항산화작용이우수하여생체내외의산화적스트레스에의한자유라디칼제거에기여한다고알려져있다. 특히녹차중의카테킨은항혈전효과가비타민 E보다우수한것으로보고되고있으며 ( 최 2), 녹차가토끼의혈압과심박수에미치는영향을보고한연구에서 ( 장 1987) 녹차를공급함으로써미주신경을자극하여혈 압을저하시키는것으로보고하였다 ( 김 22). 한편막걸리의생리활성및기능성에대한연구로는실험동물의혈중지질감소효과에대한연구 (Kim et al. 21) 와막걸리가인체의혈액성분에미치는효과에대한몇몇연구만이보고되어왔으며최근에는막걸리분획물에의한암세포성장억제및 Quinone Reductase 활성증가효과에대한보고가있다 (Lee et al. 1985). 이러한결과로서녹차가건강식품, 식품보존료등으로다양하게산업적으로이용가능하기에본연구에서는녹차추출물이막걸리유래유산균의생리활성에미치는효과를감마선과의복합작용과비교 연구하여추후산업적잠재가치를가늠하는척도로활용하고자한다. 재료및방법 1. RRW 유래유산균의분리막걸리유래유산균을분리하기위해본실험에사용된막걸리 (RRW) 는전라북도정읍시정읍양조장에서구입하였으며, 멸균수를이용해단계적으로희석하고 MRS (Difco, U.S.A.) 한천배지 (1.5% agar, w/v) 에도말하여 3 C 에서평판배양하였다. 2. RRW 유래유산균의동정 MRS (Difco, U.S.A) 한천배지 (1.5% agar, w/v) 에도말하여 3 C 에서평판배양후얻은단일집락을 16S rrna sequencing을의뢰하였다 (SolGent service). 3. RRW 유래유산균의감마선조사단일집락을백금이로 MRS 액체배지에접종후 3 C 에서 24시간동안배양하였다. 한국원자력연구원방사선과학연구소내의 6 Co 선원 (7.4 PBq) 으로각,, 4, 8, 1,2, 1,8, 2, Gy를조사하였다. 이후 L. fermentum의최종조사선량을 LD 5 값인 8 Gy hr -1 이되도록조사한실험군을대상으로배양집락형성단위 CFU (Colony Forming Unit) 법을이용하여 3 반복된평균생존율을측정하였다. 4. RRW 유래유산균의천연추출물, 카테킨그리고천일염천연추출물은산수유추출물, 감잎추출물, 대나무수액추출물, 석류추출물, 녹차추출물, 가시오가피추출물등을주문하여사용하였으며 ( 천연올 : 등록번호 22-33-
천연식물추출물과감마선이유산균에미치는영향 321 61974) 더세밀한실험을위한녹차추출물은한국생명공학연구원에서분양받은시료를사용하였으며 ( 한국식물추출물은행 : 분양번호 2-86), 카테킨은 GREEN TEA EXTRACT CATECHIN 6 mg (Atlantic Essential Products, Inc., U.S.A.) 을사용하였다 ( 남과김 21). 결과및논의 1. RRW 유래유산균의분리및동정 SolGent service report에따르면 (no. 289-4), PCR 후 T-Blunt cloning 진행후 (SolGent사, Cat No. SOT1- K2), colony PCR (M13F, M13R) 하여 sequencing한결과분리된균주는 Lactobacillus fermentum (L. fermentum) 과 98% 의상동성을보였다. L. fermentum의생리적특성을살펴보고자단일집락을백금이로 MRS 액체배지에접종후 3 C 에서 16시간동안진탕배양후시료를채취하여 1-3 으로희석한시료를 spectrophotometer로 Optical Density (O.D.) 값을확인하고, 1 1-7 로희석한후 MRS 한천배지에도말하여 6시간후부터단일집락을계수하고이를 2시간마다반복하여 24시간까지측정하였다. 그결과RRW 유래 L. fermentum은생육8~12 시간사이에대수기중반을지나 18시간에생육정지기에이르렀다 (Fig. 1). 2. RRW 유래유산균의감마선조사 있었다 (Fig. 2). 3. RRW 유래유산균의천연식물추출물, 카테킨첨가조사여러천연식물추출물을대상으로선행실험한결과대조군에비해대나무, 석류, 녹차, 가시오가피, 감잎등은 L. fermentum을억제시켰으나오히려산수유는 L. fermentum을증식시켰다 (Fig. 3). 특히녹차추출물은 L. fermentum을현저하게억제시키는양상을보였으므로녹차추출물을농도별로실험하였다 (Fig. 4). 또한녹차에다량포함되어있는카테킨을단독으로첨가하여카테킨에따른유산균의균수와효모의균수를측정하였다 (Fig. 5). 그결과L. fermentum는 8 Gy에서 5% 생존하였는데이는녹차추출물을.15% 첨가한 L. fermentum 자체의 CFU값과 4.1 1 4 cells ml -1 로유사한결과이다. 더불어카테킨을단독으로첨가시효모의생존율은.15% 까지만제어되어.2% 이상부터는대조군보다효모의수가 12 Survival rate (%) 8 6 4 감마선과의복합작용이 RRW에미치는효과를보고자각선량별로조사를실시한결과, 감마선선량에따른 L. fermentum의균수는 8 Gy가반치사선량임을알수 2 Control 4 8 12 Dose of radiation (Gy) 3. Fig. 2. Survival rate of L. fermentum at different radiation doses. 2.5 Cell growth (OD 6 nm) 2. 1.5 1..5. Natural plant extract Phyllostachys bambusoides Punica granatum Thea sinensis Acanthopanax senticosus Diospyros kaki Cornus officinalis Control 2 4 6 8 1 12 14 16 18 2 22 24 Incubation time (hr) Fig. 1. The growth curve of L. fermentum in the MRS agar medium. 2 4 6 8 CFU of L. fermentum (1-4 ) Fig. 3. Effect of various plant extracts on L. fermentum.
322 남지영 김재훈 이주운 김진규 CFU of L. fermentum (1-4 ) 6 5 4 3 2.1.5.1.15.2.25.3 증식되었으며, 이에비해 L. fermentum 의균수는.2% 일 때대조군에비해제어되었고그이상부터는증식됨을알수있었다. 결 Thea sinensis (%) Fig. 4. Survival rate of L. fermentum at different concentrations of the Thea sinensis extract (%). CFU of Yeast (1-4 ) 18 16 14 12 8 6 4 2.1.5.1.15.2.25.3 Catechin (%) Fig. 5. Survival rate of Yeasts at different concentration of the catechin (%). 대표적인세계화한식인김치, 불고기에비해우리의주류인막걸리는좋은품질의영양과맛에도불구하고유통기한이짧기때문에국내유통뿐아니라해외수출에도어려움이많다. 상온에서시간이지남에따라유산균과기타미생물이기하급수적으로증가하고젖산이생성되면서술맛이시게되고음용감이나빠지게되어본래의맛을잃게되는것이다. 더불어최근사회적으로건강에대한관심이높아지면서우리가매일섭취하는 론 식품의중요성을인식하게되었는데우리나라의경우민간요법이나한방요법등을비롯한전래의학의관점에서, 생약이나자연식품으로부터추출된물질을이용하여여러가지건강음료들이개발되어왔고, 이들의생체기능조절및질병의회복이나예방등에관한가능성이제시되어왔다. 인삼, 생강, 계피, 녹차, 솔잎등이그예에해당되며이러한성분들의실제적인효과를분석하기위한시도도진행되고있다. 이에 Cornus officinalis, Diospyros kaki, Acanthopanax senticosus, Thea sinensis, Punica granatum, Phyllostachys bambusoides 등의천연추출물을대상으로선행실험한결과녹차추출물이 RRW 유래기타잡균등을억제하는양상을보였으므로이를확립하기위해여러조건으로접근해보았다. 그결과녹차추출물대신에감마선으로도그역할을대신할수있을것으로사료되지만녹차추출물의어떤세부적인성분이관여하는지는아직알수없으므로농도별에따른미생물의생육저해에관해서는집중적인연구가요구되는부분이다. 또한 RRW에농도별로카테킨을첨가한결과효모는.3%, 유산균은.5% 를첨가했을때카테킨이대조군에비해균수를제어함을확인할수있었다. 그러나막걸리는담금후누룩중의미생물에의한효소의작용으로인해원료성분이분해되어생성되는아미노산, 유기산, 당분등의맛성분과효모나젖산균등의미생물로인해알코올발효로휘발성풍미성분이생성되어색과함께품질의조화를이루게되므로 (Lee et al. 1996) 이들첨가물이막걸리의본래향과풍미에어떠한영향을끼칠지는미지수이다. 하지만천연첨가물은천연적인방부제이고인체에무해한동시에인위적으로균수를제어가능하므로앞으로막걸리를이용한기능성식품을개발할수있는가능성이있어이부분에대해서도추가적으로연구할필요성이보인다. 이상으로건강식품, 식품보존료등으로이미다양하게산업적으로이용되고있는녹차추출물이막걸리유래유산균의생리활성에있어서도감마선과의복합작용과같은효과를유발할가능성을제시하고카테킨의첨가에따라 RRW 유래효모, 유산균그리고기타잡균이영향을받으므로추후이를이용한산업적잠재가치가충분할것으로판단되며, 향후이를보편화하여활용하기위해서는세밀하고다양한접근방법으로보정해야할것으로사료된다. 사사본연구는교육과학기술부에서시행하는주요사업의
천연식물추출물과감마선이유산균에미치는영향 323 지원으로수행되었습니다. 이에감사드립니다. 참고문헌 김미지. 22. 녹차 Catechin 이전자파조사된흰쥐의항산화대사및심폐기능개선에미치는효과. 대구카톨릭대학교박사학위논문. pp. 15-16. 남지영, 김진규. 21. 방사선조사가막걸리유래유산균에미치는효과. 한국방사선산업학회. 학술발표대회. p. 284. 남지영, 김진규. 21. 녹차추출물과감마선이막걸리유래 Lactobacillus fermentum 에미치는효과연구. 대한방사선방어학회. 추계학술발표회. pp. 218-219. 신미옥, 강대연, 김미향, 배송자. 28. 막걸리분획물에의한암세포성장억제및 Quinine Reductase 활성증가효과. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 37(3): 288-293 양은주, 장해춘. 28. 김치로부터항진균활성 Lactobacillus plantarum 의분리및특성규명 Kor. J. Microbiol. Biotechnol. 36(4): 276-284 임영일. 1987. 녹차생약의약리효과에대해서. 포상재단연구보고서 1:25 장정옥. 1987. 녹차가가묘와자발성고혈압백서의혈압심박수및혈청지질농도에미치는영향. 한양대학교박사학위논문. pp. 15-28. 최정화. 2. 만성카드뮴중독흰쥐에서의골대사장애및혈전생성에대한녹차 catechin 의해독효과및작용기전. 대구카톨릭대학교박사학위논문. pp. 112-133. Cheng SJ. 1986. The preliminary study of inhibitory effects of green tea antioxidant mutation. Acta of Experimental Biology 9:328-334 Graham HN. 1992. Green tea composition, consumption and polyphenol chemistry. Pre. Med. 21:334-35 Gould GW. 21. New processing technologies: an overview. Proc. Nutr. Soc. 6:463-474 Hayashi E, Hayashi M and Yamazoe H. 199. Pharmalogical action of tea extracted on the central nervous system in mice. Oyo Takuri 4(3):351-356 Kada T, Kaneoko K, Matzuzaki S, Matsuzaki T and Hara Y. 1985. Detection and chemical identification of natural bioantimutagens. Mutation Research 15:127-131 Kazuko N, Midori Y, Chikusa T, Michiko I and Mitsuo N. 1991. Platelet aggregation inhibitory activity of tea extract. Nippon shoukhin Kogyo. 38:189-195. Kim MH, Kim WH and Bae SJ. 21. The effect of Makkoli on serum lipid concentration in male rats. J. Nat. Sci. Silla Univ. 9:73-84 Lee SH and Joo JS. 1985. Nutritional influence of Takju (Korean rice wine) on human body. J. Ko. Rae. Univ. 22:17-32 Lee JS, Lee TS, Park SO and Noh BS. 1996. Flavor components in mash of takju prepared by different raw materials. Korean J. Food Sci. Technol. 28:316-323 Muramatzu K, Fukuyo M and Hara Y. 1986. Effect of green tea catechins on plasma cholesterol level in cholesterol fed diet. J. Nutri. Sci. Vitaminol. 32(6):613-622 Sakanaka S, Kim M, Taniguchi M and Yamamoto T. 1989. Antibacterial substances in japanese green tea extract against streptococcus mutants a carcinogenic bacterium. Argic. Biol. Chem. 53(9):237-2311 Yoo TJ. 1981. Korean famous wine. Central New Book, Seoul, Korea. p. 96. Manuscript Received: October 22, 21 Revision Accepted: November 4, 21 323