DOI : 10.4093/kdj.2009.33.6.466 ORIGINAL ARTICLES 제 1 형당뇨병쥐모델에서유전공학적제조 K- 세포이식을통한당뇨병의치료 가톨릭대학교내과학교실 1, 가톨릭대학교의과학연구원면역생물학교실 2 심주연 1 김주희 1 안유배 1 송기호 1 한제호 1 차봉연 1 이숙경 2 문성대 1 Treatment of Type 1 Diabetes through Genetically Engineered K-cell Transplantation in a Mouse Model Ju-Yeon Sim 1, Ju-Hee Kim 1, Yu-Bae Ahn 1, Ki-Ho Song 1, Je-Ho Han 1, Bong-Yun Cha 1, Sook-Kyung Lee 2, Sung-Dae Moon 1 1 Department of Internal Medicine, Incheon St. Mary s Hospital, The Catholic University of Korea, Incheon, 2 Research Institute of Immunobiology, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea Abstract Background: K-cells function as targets for insulin gene therapy. In a previous study, we constructed EBV-based plasmids expressing rat preproinsulin controlled by glucose-dependent insulinotropic polypeptide promoters. In the present study, we attempted to correct hyperglycemia in vivo using genetically engineered K-cells in a mouse model of type 1 diabetes. Methods: K-cells expressing insulin were transplanted under the kidney capsules of STZ-induced diabetic mice. The blood glucose levels and body weights of the experimental animals were measured daily. After four weeks, the mice were injected intra-peritoneally with 2 g/kg glucose following a 6 hr fast. Blood glucose levels were measured immediately following glucose injections. All animals were sacrificed at the end of the glucose tolerance study, and pancreas and graft-bearing kidney tissue samples were stained with antibodies against insulin, glucagon, and C-peptide. Results: The body weights of K-cell-transplanted diabetic mice increased after transplantation, whereas those of untreated diabetic control mice continued to decline. The blood glucose levels of K-cell-transplanted diabetic mice decreased gradually during the two weeks following transplantation. After intra-peritoneal injection of glucose into K-cell-transplanted diabetic mice, blood glucose levels increased at 30 minutes, and were restored to the normal range between 60 and 90 minutes, while untreated control diabetic mice continued to experience hyperglycemia. Kidney capsules containing transplanted K-cells were removed, and sections were stained with anti-insulin antibodies. We detected insulin-positive cells in the kidney capsules of K-cell-transplanted diabetic mice, but not in untreated control mice. Conclusion: We detected glucose-dependent insulin secretion in genetically engineered K-cells in a mouse model of type 1 diabetes. Our results suggest that genetically modified insulin producing K-cells may act as surrogate β-cells to effectively treat type 1 diabetes. (Korean Diabetes J 33:466-474, 2009) Key words: Epstein-Barr virus, Gastric inhibitory polypeptide, Gene therapy, K-cell, Plasmid 접수일자 : 2009 년 9 월 28 일, 통과일자 : 2009 년 11 월 23 일교신저자 : 문성대, 가톨릭대학교내과학교실, E-mail: sungdaem@gmail.com 466
심주연외 7 인 : 제 1 형당뇨병쥐모델에서유전공학적제조 K- 세포이식을통한당뇨병의치료 서론제1형당뇨병은자가면역기전에의해췌도의베타세포가선택적으로파괴됨에따라인슐린결핍으로고혈당이되며적절한치료에도불구하고만성합병증으로진행하여삶의질이저하되는질환이다. 당뇨병의치료혹은합병증의발생을지연시키기위해서는정상수준의혈당조절을하도록권고하고있으나식이요법, 경구혈당강하제, 다회인슐린요법등에도불구하고정상수준의혈당을유지하는데는한계가있다. 최근에는당뇨병을근본적으로치료하기위한췌도이식, 줄기세포치료, 유전공학기술을이용한인슐린유전자치료법등이시도되고있지만아직미흡한실정이다. 인슐린유전자치료법은자가면역기전을피하기위해비베타세포인표적세포에인슐린유전자를전달하여인슐린분비를유도하는방법으로써췌도세포의인슐린분비기능을최대로모방하는기술이다 1,2). 비베타세포에전달된인슐린유전자로부터인슐린이분비되도록유도하되베타세포가혈당변화에민감하게인슐린을분비하는것처럼인위적인조작을가하여야한다 3). 왜냐하면, 인슐린치료에사용되는비베타세포는베타세포처럼엔도펩티다제를분비하여전구인슐린을인슐린으로전환하여야하며저장된인슐린을세포외로방출하는세포외유출능을가지고있어야하기때문이다 3-5). 지금까지인슐린유전자치료를위해사용된표적세포 6,7) 중가장베타세포와유사했던세포로는위, 십이지장, 공장등에널리분포하고있으면서커다란내분비기관을이루고있는 K-세포이다 8-10). K-세포는 glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) 를분비하며췌도의베타세포에서인슐린의분비를촉진한다. 최근인슐린유전자치료를위해사용되고있는 K-세포는생쥐의장종양에서분리한세포로서글루코키나제를분비하여포도당을감지하고엔도펩티다제의분비는물론인슐린의세포외유출능도있는것으로알려져있다 3,8,9). 저자들은인체에비교적안전하면서도큰유전자의도입이가능하며도입된유전자의지속적인발현이유지되는 Epstein-Barr virus (EBV)-유래에피솜벡터 11-13) 를사용하여 K-세포를유전공학적으로변환하여포도당농도의존적으로인슐린분비를유도한실험실연구결과를발표한바있다 14). 따라서, 본연구에서는유전공학적으로인슐린이분비되도록변환한 K-세포를스트렙토조토신으로유발한제1 형당뇨병쥐의신장피막에이식하여혈당농도의존적으로인슐린이분비되는지를확인함으로써당뇨병의치료를위한인슐린유전자치료의가능성을확인하고자하였다. 대상및방법 1. 세포배양및트랜스펙션 Dr. Hanahan (University of California, San Francisco) 으로부터기증받은 STC-1 세포주로부터순수한 K-세포만을분리하기위하여, 쥐의 GIP 프로모터와전전구인슐린융합유전자 (Fig. 1) 를포유동물세포주발현벡터에클로닝한후 STC-1 세포주에트랜스펙션하였으며, 이중 hygromycin 에내성을보이는 K-세포만을분리하여실험에사용하였다. 트랜스펙션은배양접시에 STC-1 세포가 90% 정도자랐을때세포를 PBS로씻어낸후혈청이포함되지않은 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) 배지에 DNA-Lipofectamin TM 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 을희석한후, GIP 프로모터와전전구인슐린융합유전자가클로닝된포유동물세포주발현벡터를첨가하였다 14). 대조군으로는 GIP 프로모터와 green fluorescent protein (GFP) 융합유전자가클로닝된발현벡터를트렌스펙션실험에사용하였다 (Fig. 1). 실험에사용된모든세포는 5% 의 CO 2, 37 의세포배양기에서 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA) 을첨가한 DMEM으로채워진배양접시에서계대배양한후사용하였다. A B Fig. 1. Schematic presentation of the construct which is EBV-based plasmid expressing PPI or GFP transcriptionally controlled by GIP promoter (GIPP). A. Plasmid expressing GFP as control. B. Plasmid expressing PPI. GFP, green fluorescent protein; GIP, glucose dependent insulinotropic peptide; PPI, preproinsulin. 467
2. 실험동물및당뇨병유도모든 BALB/c Nude 마우스는오리엔트바이오 (Seoul, Korea) 에서제공받았으며생후 5주된수컷을이용하였다. 가톨릭대학교동물실험윤리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee) 의승인과함께동물보호법 (Animal welfare act) 을준수하였으며모든실험마우스는가톨릭대학교성의교정동물실에서사육하였다. 마우스는정상군과당뇨병군그리고당뇨병군의일부는 K-세포를이식한치료군등으로분류한후실험을하였다. 당뇨병군은당뇨병을유발시키기위하여 16시간동안금식시킨뒤 Streptozotocin (STZ; Sigma, St. Louis, MO, USA) 150 mg/kg을 10 mm sodium citrate buffer (ph4.5) 용액에녹인뒤살균된여과기에서여과한후복강에주사하였다 15). 3일뒤혈당이 250 mg/dl 이상된마우스를당뇨병이유도된것으로간주하였다. 3. Nude 마우스에 K-세포이식과사육당뇨병이유발된마우스중에서이식군은무작위로선정하였으며인슐린을발현하는 K-세포를마우스의왼쪽신장피막에약 1 10 6 개이식하였다. 즉, 미리배양접시에서배양된 K-세포를트립신 EDTA로분리한후 DMEM으로풀어주고 1,000 rpm으로 90초간세포를가라앉힌뒤상층의 DMEM을제거하였다. 다시새로운 DMEM을 2 ml 첨가하여풀어주었으며, 트리판블루로염색한후세포의수를계산하였다. 약 1 10 6 개의 K-세포를얇은관에넣고 1,500 rpm으로 3분간가라앉혀서관의끝쪽에위치하도록하였다. 마우스의왼쪽후복부를절개하여신장을밖으로꺼낸후바늘로신장피막에상처를내고상처난부위에초정밀주사기 (Hamilton, Reno, NV, USA) 를이용하여 K-세포를이식하였다. 이식한상처부위로부터 K-세포가밖으로나오지않도록신장피막을봉하고, 신장을원래위치에넣은후피부를봉합하였다. 이식하지않은당뇨병군은당뇨병치료군에대한대조군으로삼았다. 모든마우스는매일꼬리정맥으로부터혈액을채취하여혈당기 (Accu-Chek Go; Roche Diagnotics, Mannheim, Germany) 로혈당변화를기록하였고동시에체중을측정하면서 30일동안키웠다. 4. 당부하검사 30일동안키운모든마우스를 12시간동안금식시킨뒤, 포도당 (2 g/kg) 을녹인생리식염수를마우스의복강안으로주사하였다. 포도당주사후 0, 15, 30, 60, 90, 120분마다꼬리정맥으로부터혈액을채취하여혈당기로혈당을측정하였다. 5. 면역조직화학염색 K-세포를이식한지 30일이경과한후모든마우스에서당부하검사를시행하였고안락사시킨후신장과췌장을적출하였다. 적출한신장과췌장은 10% 포르말린으로 24시간동안고정한후, 파라핀에포매하였다. 신장과췌장조직을 4 μm 두께로잘라서 100% 자일렌으로파라핀을제거한후수화시킨뒤, 실온에서 3% H 2O 2/MeOH에 30분동안반응시켜서조직내의과산화효소를제거하였다. PBS로세척후, 정상 goat 혈청으로실온에서 30분동안반응시킴으로써비특이적항원-항체결합을제거하였다. 1차항체처리는다클론기니픽인슐린항체 (1:200; Invitrogen) 와다클론글루카곤항체 (1:100, Invitrogen), 그리고다클론 C-peptide 항체 (1:200; Cell Signaling, Danvers, MA, USA) 로 4 에서 12시간동안반응시켰다. 2차항체는 horseradish peroxidase ( 인슐린, 글루카콘 & C-peptide; Vector Laboratory, Burlingame, CA, USA) 를 1시간동안실온에서반응시킨뒤, DAB (3,3'-diaminobenzidine) 용액에 1분동안처리한후증류수로씻은뒤표본을제작하였고광학현미경으로관찰하였다. 6. 면역조직형광염색 4 μm 두께의신장과췌장조직을면역조직화학염색법과동일한방법으로 100% 자일렌으로파라핀을제거한후수화시킨뒤, 조직내의과산화효소를제거하였다. 이어서 PBS로세척후, 정상당나귀혈청으로실온에서 15분동안반응시킴으로써비특이적항원 -항체결합을제거하였다. 각조직의염색은인슐린항체 (Invitrogen) 를 1차항체로하였고 2차항체로는 Rhodamine (Jackson Immuno Research, West Grove, PA, USA) 으로염색한뒤 DAPI (4', 6-diamidino -2-phenylindole) 로핵염색을하였다. 염색한각조직은공초점현미경 (Zeiss, Oberkochen, Germany) 으로관찰하였다. 7. 통계분석각각의실험은 3회반복하였으며결과는평균값 ± 표준편차로표시하였다. 통계적유의성검정은 Student's t-test 를이용하였으며통계적유의성은 P < 0.05로하였다. 결과 1. 혈당및몸무게변화 Citrate 완충액에 150 mg/kg의 STZ을녹여마우스의복 468
심주연외 7 인 : 제 1 형당뇨병쥐모델에서유전공학적제조 K- 세포이식을통한당뇨병의치료 Fig. 2. Average of body weight variation. Experiments on all nude mice were measured body weight every day. Body weight changes of normal control mice and K-cell transplanted diabetic mice were similarly increased, but only untreated STZ-induced diabetic mice maintain low body weight (16~19 g). Values are means. K-cells were transplanted at day 0. * P < 0.05 vs. normal control mice or K-cell transplanted diabetic mice group. Fig. 3. Blood glucose level after K-cell transplantation. Glucose levels of normal control mice show within normal limits (less then 180 mg/dl). Those of untreated STZ-induced diabetic mice were irregular and constant high level. Similarly, those of K-cell transplanted diabetes mice were high, but it was getting lower gradually during the experimental period. Values are means. K-cells were transplanted at day 0. * P < 0.05 vs. untreated STZ-induced diabetic mice group. 강에주사한후 3일만에모든마우스의혈당이 300 ± 50 mg/dl로상승하였다. 정상군과 K-세포를이식한당뇨병군에서는몸무게가점차증가하였으나, STZ을주사한당뇨병군은두군과비교하여시간이경과하여도체중이증가하지않았으며실험기간동안낮게유지되었다 (Fig. 2). 또한, K- 세포를이식한마우스는 K-세포가증식함에따라왼쪽하복부에지름 1~2 cm 정도의종괴를형성하였다 ( 자료생략 ). 그리고정상군에서는대체로정상범위의혈당분포를유지하고있었으나, STZ을주사한군에서는지속적으로혈당이높게측정되었다. K-세포를이식한군에서는 STZ만을주사한군에서보다혈당이서서히낮아지면서이식후 2주경부터는감소폭이더커지면서 200 mg/dl 이하로까지떨어졌다 (Fig. 3). 469
2. 당부하검사 K-세포를이식한날로부터 30일이지난뒤실험에사용된모든마우스를대상으로 12시간동안금식시킨뒤식염 수에 2 g/kg의포도당을녹여복강에주사하였다. 그리고각마우스에서몸무게를측정하였으며주사한시점으로부터 0, 10, 20, 30, 60, 90분마다혈당변화를관찰하였다. 정상군과 K-세포를이식한군에서는서로유사한내당력을보 Fig. 4. Glucose tolerance tests of normal control mice and K-cell treated diabetic mice or untreated STZ-induced diabetic mice. Values are means of each group (n = 3). * P < 0.05 vs. normal control mice or K-cell transplanted diabetic mice group. Renal parenchyma Graft of renal capsule Fig. 5. Immunohistochemistry of insulin expression in graft-bearing kidney and pancreas of the normal control mice, untreated STZ-induced diabetic mice or K-cell transplanted diabetic mice ( 400). 470
심주연외 7 인 : 제 1 형당뇨병쥐모델에서유전공학적제조 K- 세포이식을통한당뇨병의치료 Fig. 6. Immunofluorescence study for insulin expression in pancreas and graft-bearing kidney of normal control mice, untreated STZ-induced diabetic mice or K-cell transplanted diabetic mice ( 400). 였으나 STZ만을주사한군에서는지속적으로포도당불내성을보였다 (Fig. 4). 3. 면역조직염색결과 DAB 염색과면역형광염색을한결과, 두염색의결과는일치하였다. 췌장조직과신장조직에서염색을하였으며, 정상췌장에서는인슐린과글루카곤, C-peptide 모두에염색이되었지만 STZ를주사한마우스의췌장에서는췌도가파괴되어인슐린은물론글루카곤, C-peptide 모두에염색이되지않았다. 그러나, K-세포를이식한신장조직의종괴에서는면역조직화학염색에서인슐린과 C-peptide 모두에서염색이되었으며 (Fig. 5) 이를다시면역형광염색법으로재차확인할결과인슐린이발현되는것을알수있었다 (Fig. 6). 고찰이전연구에서본연구자들은쥐의 GIP 프로모터와전전구인슐린의융합유전자를 EBV-유래에피솜벡터에클로닝한후 STC-1 세포주에트렌스펙션하여인슐린을분비하는순수한 K-세포를분리한바있으며, 이 K-세포에서포도당농도의존적으로인슐린이분비되는것을시험관내에서확인한바있다 14). 본연구에서는생체내에서도 K-세포가혈당농도의존적으로인슐린의분비가원활하게이루어지면서당뇨병이치료될수있는지를확인하고자하였다. K-세포이식에따른면역거부반응을피하기위하여 BALB/c Nude 마우스를이용하였으며인슐린을분비하도록만든 K-세포가생체내에서착상하여혈당농도의존적인인슐린을분비하면서당뇨병이치료되는지를확인해본연구이다. 이전의인슐린유전자치료연구에서표적이된유전자는사람의인슐린유전자였지만 8,9,16) 본연구에서는쥐의전전구인슐린유전자를사용하였다. 그이유는정상베타세포에서인슐린이생성되는과정과유사한전전구인슐린에서전구인슐린을거쳐서최종적으로인슐린이생성되는과정을 K-세포에서구현해보고자하였으며, 또한사람대신쥐의인슐린을사용함으로써생체이식후분비되는인슐린이마우스의체내에서자가항체가생성되는것을차단혹은최소화하기위해서였다. Han 등도본연구의내용과유사한결과를발표한바있으나 17) 본연구와의차이점은이들은인슐린발현의전사조절을위해 GIP 프로모터만으로는인슐린의분비가충분하지않아서 GIP 유전자의인터론일부를 GIP 프로모터의 C-말단에융합하였으며벡터의 CMV 프로모터와 GIP 프로모터를치환하는과정에서 CMV 프로모터의일부를남겨두었다. 그러나본연구에서는 Han 등이사용한방법과달리 CMV 프로모터전부를 GIP 프로모터로치환하였으며그결과 GIP 프로모터만으로도인슐린의분비가충분히이루어지는것을볼수있어서후에이에대한규명이필요할것으로생각된다. 누드마우스의안정적인당뇨병유발을위해 150 mg/kg 의 STZ을복강내에주사하였으며고혈당 (300 ± 50 mg/dl) 이된것을확인한후실험을하였다. 당뇨병이유발된마우스의신장피막에인슐린을분비하는 K-세포를이식한결과정상군에서처럼몸무게가점차증가하였으며 (Fig. 2), 이 471
식 2주후에는지속적인혈당감소가관찰되었으나 (Fig. 3), STZ을주사한당뇨병군에서는뚜렷한체중감소와함께고혈당이지속되었다. 또한, 당부하검사에서도 K-세포를이식한당뇨병군에서는정상군과유사한내당력을보였으나 STZ만을주사한당뇨병군에서는지속적으로포도당불내성을보였다 (Fig. 4). 그리고실험대상이된모든마우스의췌장과신장을적출하여면역조직염색을통하여인슐린의분비를확인하였다. 그결과, K-세포를이식한당뇨병군과 K-세포를이식하지않은당뇨병군의췌장에서는베타세포가파괴됨으로써인슐린이분비되지않는것을알수있었지만, K-세포를이식한당뇨병군에서는 K-세포가이식된신장에서인슐린이분비되는것을확인할수있었다 (Fig. 5, 6). 이로써본연구자들이인슐린이분비되도록만든 K-세포를마우스의신장피막에이식한결과생체내에서도일정기간혈당농도의존적인인슐린이분비되어당뇨병이치료되는것을확인할수있었다. 하지만본연구는이식된 K-세포가종양을형성하여자라면서과도하게인슐린이분비되면서저혈당이유발된것과마우스의건강이좋지않아혈중인슐린농도를동시에측정하지못한제한점이있다. 그리고이식기간동안 K-세포를이식한당뇨병군은정상군과비교했을때체중은서로비슷하였으나외모상으로는매우마른상태였다. 즉, K-세포가이식된당뇨병쥐에서종괴무게와종양부하에따른과도한인슐린분비로저혈당이유발되었으며가중된이화상태로먹이섭취가증가한것등이실험결과에서로영향을주었을가능성이있다. 따라서, 보다체격이큰실험동물에서동일한실험을반복하되혈당과함께인슐린, C-peptide 농도를동시에측정하게되면좀더분명한결과를얻을수있을뿐만아니라엔도펩티다제에의한인슐린의처리과정도확인할수있을것으로생각된다. 본연구를통해 K-세포가혈당농도의존적으로인슐린이분비되는것을생체내에서도확인할수있었으나, 이식한 K-세포가이식부위에서종양을형성하면서종양부하의증가로저혈당을유발하기때문에결국인체에적용하기에는어려움이있을것으로생각된다. 그러나, 앞으로인체의줄기세포에서 K-세포의분리가가능해지면본연구에서시도된방법을보다유용한당뇨병의치료법으로발전시킬수있을것으로생각된다. STC-1 세포주는마우스의장종양세포에서분리한세포이기때문에동물에이식할경우종양이발생하였다 8,16,17). 이들연구자들도발생한종양에대해인슐린분비를확인한것외에는다른병리조직학적인검사는시행하지않았다. 그러나본연구자들은이전의 GFP를발현하도록제작한 K- 세포를신장피막에이식하여 K-세포의생착을확인하는과정에서종괴가생성되는것을확인할수있었으며떼어낸종괴를형광현미경으로관찰한결과종괴전체에서형광을발하는것을확인할수있었다 ( 자료생략 ). 따라서커다란종괴전부가 GFP를발현하는 K-세포로구성되어있음을알수있었으나후에종괴의성상에대한연구도필요할것으로생각된다. 결론적으로본연구는 EBV-유래에피솜벡터를이용한유전공학적제조 K-세포이식을통해안정적인인슐린분비가이루어지는것을생체실험을통해확인해보았으며또한, K-세포를이용한유전자치료는제1형당뇨병의치료를위한대체베타세포의가능성이있을것으로생각된다. 요약연구배경 : 인슐린유전자치료법의이상적인표적세포로 K-세포가알려져있다. 이전연구에서본연구자들은 EBV- 유래에피솜벡터를이용하여 K-세포에서포도당농도의존적인인슐린분비가이루어지는것을실험실환경에서확인한바있다. 본연구에서는스트렙토조토신 (STZ) 으로유발된제1형당뇨병쥐의신장피막에유전공학적으로제조된 K-세포를이식하여당뇨병이치료되는지를관찰해보았다. 방법 : 인슐린이분비되도록제조된 K-세포를 STZ으로유도된 BALB/c Nude 마우스의신장피막에이식한후혈당과몸무게를측정하였다. 마우스는정상군과 STZ으로유도된당뇨병군그리고당뇨병군의일부는 K-세포를이식한치료군등으로분류하여실험을하였다. 이식 4주후모든마우스에서 6시간동안금식한후 2 g/kg의포도당을복강내로주사하여당내성검사를하였다. 당내성검사가끝나자마자모든마우스의신장과췌장을적출하여인슐린, 글루카곤, C-peptide 등으로면역조직화학염색및면역형광염색을한후그결과를분석하였다. 결과 : STZ을복강에주사한마우스는주사 3일후혈당이 300 ± 50 mg/dl로상승하였다. 정상군과 K-세포를이식한당뇨병군에서는몸무게가점차증가하였으나, STZ만을주사한당뇨병군에서는실험기간동안낮게유지되었다. 그리고정상군에서는정상범위의혈당분포를유지하였으나, STZ만을주사한당뇨병군에서는지속적으로혈당이높게유지되었다. 그리고 K-세포를이식한당뇨병군에서는 STZ 만을주사한군에서보다혈당이서서히떨어졌으며이식 2 주후부터는급격히감소하였다. 당부하검사결과정상군과 472
심주연외 7 인 : 제 1 형당뇨병쥐모델에서유전공학적제조 K- 세포이식을통한당뇨병의치료 K-세포를이식한당뇨병군에서는서로유사한내당력을보였으나 STZ만을주사한군에서는지속적으로포도당불내성을보였다. 조직면역검사결과정상군의췌장에서는인슐린과글루카곤, C-peptide 모두에염색이되었지만 STZ만을주사한마우스의췌장에서는췌도파괴로인슐린은물론글루카곤, C-peptide 모두에염색이되지않았다. 그러나, K-세포를이식한당뇨병군의신장에서는면역조직화학염색에서인슐린과 C-peptide 모두에서염색이되었으며면역형광염색에서도인슐린이발현하는것을관찰할수있었다. 결론 : 유전공학적으로제조된 K-세포가마우스신장피막에착상되어혈당농도의존적으로인슐린을분비하여당뇨병이치료되는것을생체내에서도확인할수있었으며, EBV-유래에피솜벡터를이용한유전공학적조제 K-세포는제1형당뇨병의치료를위한대체베타세포로사용될수있을것으로생각된다. 감사의글본연구를위해 K-세포를기증해준 Dr. Hanahan (University of California, San Francisco) 교수께감사드린다. 참고문헌 1. Levine F, Leibowitz G: Towards gene therapy of diabetes mellitus. Mol Med Today 5:165-71, 1999 2. Morral N: Gene therapy for type 1 diabetes. New approaches. Minerva Med 95:93-104, 2004 3. Yoon JW, Jun HS: Recent advances in insulin gene therapy for type 1 diabetes. Trends Mol Med 8:62-8, 2002 4. Steiner DF, Rouille Y, Gong Q, Martin S, Carroll R, Chan SJ: The role of prohormone convertases in insulin biosynthesis: evidence for inherited defects in their action in man and experimental animals. Diabetes Metab 22:94-104, 1996 5. Tang SC, Sambanis A: Development of genetically engineered human intestinal cells for regulated insulin secretion using raav-mediated gene transfer. Biochem Biophys Res Commun 303:645-52, 2003 6. Nett PC, Sollinger HW, Alam T: Hepatic insulin gene therapy in insulin-dependent diabetes mellitus. Am J Transplant 3:1197-203, 2003 7. Stewart C, Taylor NA, Green IC, Docherty K, Bailey CJ: Insulin-releasing pituitary cells as a model for somatic cell gene therapy in diabetes mellitus. J Endocrinol 142:339-43, 1994 8. Cheung AT, Dayanandan B, Lewis JT, Korbutt GS, Rajotte RV, Bryer-Ash M, Boylan MO, Wolfe MM, Kieffer TJ: Glucose-dependent insulin release from genetically engineered K cells. Science 290:1959-62, 2000 9. Ramshur EB, Rull TR, Wice BM: Novel insulin/gip co-producing cell lines provide unexpected insights into Gut K-cell function in vivo. J Cell Physiol 192:339-50, 2002 10. Corbett JA: K cells: a novel target for insulin gene therapy for the prevention of diabetes. Trends Endocrinol Metab 12:140-2, 2001 11. Min KA, Oh ST, Yoon KH, Kim CK, Lee SK: Prolonged gene expression in primary porcine pancreatic cells using an Epstein-Barr virus-based episomal vector. Biochem Biophys Res Commun 305:108-15, 2003 12. Son JK, Oh ST, Cho SK, Yoon KH, Lee SK: Mechanism of prolonged gene expression by Epstein-Barr virus-based plasmid in porcine cells. Xenotransplantation 13:560-5, 2006 13. Mizuguchi H, Hosono T, Hayakawa T: Long-term replication of Epstein-Barr virus-derived episomal vectors in the rodent cells. FEBS Lett 472:173-8, 2000 14. Kim JH, Moon SD, Ko SH, Ahn YB, Song KH, Lim HS, Lee SK, Yoo SJ, Son HS, Yoon KH, Cha BY, Son HY, Kim SJ, Han JH: Glucose-dependent Insulin secretion from genetically engineered K-cells using EBV-based episomal vector. J Korean Diabetes Assoc 31:9-21, 2007 15. Takeshita F, Kodama M, Yamamoto H, Ikarashi Y, Ueda S, Teratani T, Yamamoto Y, Tamatani T, Kanegasaki S, Ochiya T, Quinn G: Streptozotocin-induced partial beta cell depletion in nude mice without hyperglycaemia induces pancreatic morphogenesis in transplanted embryonic stem cells. Diabetologia 49:2948-58, 2006 473
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