10_( )21-104_오승준_최종.hwp

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서우 진
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1 대한내분비학회지 : 제 21 권제 6 호 2006 원저 유전자조작근육모세포에서의포도당자극에의한인슐린분비 경희대학교의과대학내과학교실 오승준 우정택 김성운 김진우 김영설 Glucose Regulated Production of Human Insulin in Genetically Modified Myoblast Cell Line (C2C12) Seungjoon Oh, Jeong-Taek Woo, Sung Woon Kim, Jin-Woo Kim, Young Seol Kim Department of Internal Medicine, College of Medicine, Kyung Hee University ABSTRACT Background: To develop somatic gene therapy model for diabetes mellitus, it is the most important to control it by glucose concentration. In order to develop the myoblasts that produce insulin by glucose concentration, the transfection of genes of human insulin, rat glucokinase and rat GLUT2 was conducted using C2C12, the murine myoblast cell line. Methods: pmlc-hinsmut plasmid vector to which human insulin cdna was inserted in C2C12 cell line, pcb7/glut2 and pcb7/gk to which GLUT2 and glucokinase were inserted. Based on the inserted gene, C2C12/INS-GLUT2, C2C12/INS-GK and C2C12/INS-GK-GLUT2 were prepared. In each cell line, its mrna and protein expression were measured. Also, the capability of producing insulin in low glucose (2.7 mm) and high glucose (25 mm) were compared. Results: 1. It was observed that C2C12/INS-GLUT2, C2C12/INS-GK, C2C12/INS-GK-GLUT2 cell line expressed mrna and protein of transfected genes, respectively. 2. As for the insulin production depending on the glucose concentration in C2C12/INS, it slightly increased from ± μu/10 6 cells/hr to ± μu/10 6 cells/hr. However, in C2C12/GK-GLUT2-INS, it showed the most evident increase: from ± μu/10 6 cells/hr to ± μu/10 6 cells/hr. 3. The expression of insulin gene decreased in proportion to the insulin production capability, reaching the minimum point at the 8 th week. Conclusion: Genetically engineered murine myoblast secreted insulin depending on the glucose concentration in vitro and was able to cause its decrement when transplanted. However, it should be continued to study the method to maintain the consistent genetic expression in somatic cell therapy. (J Kor Endocrinol Soc 21:526~535, 2006) ꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏꠏ Key Words: Glucokinase, GLUT2, Insulin, Myocyte 1) 서 론 제 1 형당뇨병은자가면역기전에의해췌장의세포가파 접수일자 : 2006년 2월 1일통과일자 : 2006년 12월 21일책임저자 : 오승준, 경희대학교의과대학내과학교실 괴되는질환이며, 만성적인고혈당에의하여케톤산혈증과당뇨병의합병증을유발한다. 혈당조절을하기위해당뇨병

2 - 오승준외 4인 : 유전자조작근육모세포에서의포도당자극에의한인슐린분비 - 환자에서의인슐린보충요법은주사기를사용하는인슐린주사가가장전통적이며, 부족한인슐린을체내에공급해주기위한또다른시도로는췌장이식이나췌도세포의이식을고려할수있다. 췌장이식은공여자를구하기어렵다는점, 또한현재는이식성공률이 1년내 80% 정도로많이높아졌으나 [1], 췌장외분비효소의처리문제, 성공하더라도평생면역억제제를복용하여야하는등의제한점을갖는다 [2]. 췌도세포이식은사람이나돼지의췌장에서소도세포를분리하고이식수여자의면역시스템에감지되지않도록특수한레진에싸서이식하는방법이개발중에있으나 [3,4], 췌도세포의포도당감지, 생존기간, 이식된췌도세포의인슐린분비장애문제등해결해야할문제가산재하여있다 [5,6]. 이러한문제를해결하는방법의돌파구는결국어떻게인슐린을분비하는세포가주변의포도당농도에적절히반응하여적당량의인슐린을분비하느냐는것이다. 위에서이미기술한다양한방법들은공여자가존재하거나동물의췌도세포를얻고가공해야하는단점이있지만, 자신의근육세포를생검하여인슐린분비에관여된다양한유전자를모두주입시켜다시체내에주입하면주변의포도당농도에반응하여인슐린을분비할수있고이식에대한거부반응을회피할수있으며, 특별한공여자가필요없고, 간단한근육주사로이식을완료할수있는장점을갖는다. 현재까지근육세포에인슐린혹은전구인슐린 (proinsulin) 유전자를주입한시도는세계적으로 Yamasaki 등 [7] 과 Gros 등 [8] 에의하여시도되기시작하였으며, 그후다양한연구자들에의하여연구되었다 [9~13]. 그러나이들의연구들중일부는근육세포가인슐린을분비하여혈당을조절시킬수있는가능성을보여주긴하였다. 그러나인슐린분비조절을위한기구로서테트라사이클린반응단위 (tetracycline responsive element) 를도입하여테트라사이클린등의항생제의의해인슐린분비를증가시킬수는있지만주변의혈당을직접감지하여생리적인슐린을분비시키는단계까지는이루어지지는않은상태이다. 저자등은새로운당뇨병치료방법을개발하기전단계 Fig. 1. Schematic of expression plasmids. A. generalized map of plasmid used for expression of human insulin; B. generalized map of plasmids used for expression of rat glucokinase, or rat GLUT

3 대한내분비학회지 : 제 21 권제 6 호 2006 의실험으로써생쥐근육모세포에주변포도당농도를감지하여인슐린을분비할수있도록인슐린유전자를비롯한혈당감작기구로서 glucokinase 및 GLUT2 유전자를주입한한근육모세포를만들고자다음과같은실험을하였다. 방법 1. 플라스미드의구성돌연변이된사람전구인슐린 cdna가삽입된플라스미드 (pmlc-hinsmut) 는스페인의 Riu 박사 (Universitat Autonoma de Barcelona, Spain) 로부터 [8], 쥐의 GLUT2 (pcb7/glut2), glucokinase (pcb7/gk) 가삽입된플라스미드는미국의 Clark 박사 (BetaGene, Inc, TX, USA) 로부터기증받았다 [14]. pmlc-hinsmut는 furin 인지부위를갖고있는돌연변이된전구인슐린 cdna가삽입되어있다. 생체에존재하는 furin이라는효소를이용하여전구인슐린의 A쇄와 B쇄가절단될수있도록, furin이인지하는부위인 Arg-X-Lys-Arg를사람전구인슐린유전자에 A쇄와 B쇄에해당하는위치에삽입되어있다. 그리고돌연변이된사람인슐린유전자를조절하는 promoter로는근육세포에서세포특이적으로유전자를발현시키기위하여 myosin-light chain 1 (MLC1) promoter를사용하였고, 발현을증가시키기위하여사람인슐린유전자하위에 MLC1 3' enhancer가위치해있는구조로되어있다. 쥐 GLUT2와 glucokinase cdna가삽입된플라스미드상위에는안정적인유전자주입후지속적인유전자발현을위하여 cytomegalovirus (CMV) promoter가위치하고유전자주입된세포를선택하기위해 hygromycin resistance gene이삽입되어있다 (Fig. 1). 2. 세포배양및플라스미드 Trnasfection 생쥐에이식하기위한유전자조작근육세포를만들기위해생쥐근육모세포주인 C2C12세포를사용하였다. C2C12 세포는 4 mm L-glutamine, 1.5 g/l sodium bicarbonate, 4.5 g/l glucose, 1.0 mm sodium pyruvate가포함된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; GIBCO-BRL, USA) 에 10% (vol/vol) fetal bovine serum (GIBCO-BRL, USA) 을첨가한배지를사용하여, 37, 5% CO 2 가공급되는세포배양기에서배양하였다. 유전자주입후유전자가삽입된세포를선택하기위한항생제의적정농도를구하기위해 geneticin (G418, Invitrogen, UK) 과 hygromycin (100 mg/ml, Invitrogen, UK) 에대한사멸곡선을작성하였다. 6 well plate에 C2C12 세포가약 20% 정도의밀도가되도록배양한다음각각의항생제에대하여 0, 100, 300, 500, 800, 1,000 μg/ml의농도로배지에항생제를섞어세포가 7일만에완전히사멸되는농도를선택하였다. Geneticin은 500 μg/ml이었으며, hygromycin은 300 μg/ml이었다. 유전자주입은리포좀유전자주입키트인 FuGene 6 (Roche, Germany) 을사용하였다. 주입된유전자가들어간세포를선택하기위하여유전자주입 48시간후배지를 hygromycin 300 μg/ml이되도록교환하여일주일간배양하였다. Hygromycin이포함된배지에서자라난세포는각각 glucokinase, GLUT2, glucokinase와 GLUT2가삽입된세포로성장하여인슐린유전자를삽입할수있도록 60 mm 배양접시에 50~70% 가되도록배양한후, 다시동일한방법으로유전자를주입하였다. pmlc-hinsmut vector는유전자주입된세포를선택하기위한항생제내성유전자를갖고있지않기때문에, geneticin을이용하여유전자주입된세포를선택하기위하여 pmlc-hinsmut 5 μg과 pci-neo vector (Promega, Cat No. E-1841, USA) 1 μg을 cotransfection 시킨후 geneticin 500 μg/ml이섞인배지에서세포를배양하여 glucokinase-insulin, GLUT2-insulin, glucokinase-glut2-insulin이삽입된세포를제작하였다. 항생제에서선택된세포들에서인슐린을발현시키기위해서는근육모세포에서근육세포로분화시키는과정이필요하기때문에인슐린을측정하기 4일전에 2% 말혈청 (horse serum) 이첨가된 DMEM으로바꿔근육세포로분화되도록하였으며, 이들세포를이용하여실험을진행하였다. 3. RT-PCR을이용한유전자발현측정 60 mm 배양접시에가득차도록성장한각각의세포들을 RNAzol B (TEL-TEST Inc, TX, USA) 용액 500 μl를넣고세포를수거하여 1.5 ml 튜브에넣었다. RNA를추출 Table 1. Sequences of PCR primer sets used to amplify each cdna in this study cdna Site Primer (sense and antisense) Fragment size Pronsulin 5'-GGAATTCTGCCATGGCCCTG-3' 388 bp 5'-GAATTCCTCGAGGTCGACGG-3' Glucokinase '-TCTAGAGGCCACCGGTCTCT-3' 1775 bp 5'-GGATCCTCTAGAGGATCCCC-3' GLUT '-TCTAGAGGATCTGGTACCAC-3' 1996 bp 5'-TCCCAAGCTTATAACGTGCT-3'

4 - 오승준외 4인 : 유전자조작근육모세포에서의포도당자극에의한인슐린분비 - 한후, 역전사 (reverse transcription) 반응은 200 μl PCR tube에 1 μg total RNA, 25 mm MgCl 2 4 μl, 10 RNA PCR 완충액 2.0 μl, 10 mm dntp 2 μl, 20 U RNase inhibitor, 5 U AMV Reverse Transcriptase XL (TAKARA Inc, Japan), 2.5 pm Oligo dt-adaptor primer 1 μl, RNase free dh 2O를넣고반응총량이 20 μl가되게하였다. 역전사과정은 Gene Amp PCR System 9600 (Perkin-Elmer- Citus, USA) 를이용하여 60 에서 30분반응시키고, 99 에서 5분간반응시켜 reverse transcriptase를불활성화시켰다. 역전사시킨 DNA를이용한 PCR을위하여, 인슐린, glucokinase, GLUT2 유전자에대한각각의시발체 (primer) 를합성하였으며 (Table 1), 200 μl PCR tube에역전사반응물 4 μl, 25 mm MgCl 2 3 μl, 10 RNA PCR 완충액 5 μl, 10 mm dntp 1 μl, 2 U TaKaRa LA Taq (TAKARA, Japan) 30 pmol sense primer 1 μl, 30 pmol antisense primer 1 μl, dh 2O를넣어반응용량이 50 μl가되게하였다. PCR 증폭은 Gene Amp PCR system 9600 (Perkin-Elmer-Citus, USA) 을이용하여반응혼합용액을 94 5분간가열하여변성시키고, 이후 cycle부터는변성 (denaturing) 반응 94 1 분, 결합 (annealing) 반응 56 1 분, 연장 (extension) 반응 72 1분씩 25회반복하고마지막과정에서못다한연장반응을위하여 72 에서 5분간반응하였다. 반응종료후반응액중 5 μl를 1% 한천겔에전기영동하여반응산물을확인하였으며, Gel Doc 2000 (BioRad Inc, USA) 을이용하여영상을분석하였다. 4. Western blot Glucokinase와 GLUT2는세포외부로분비되는단백질이아니기때문에이들이단백질로발현되는지를알아보기위해 Western blot을시행하였다. 우선세포에서단백질을추출하기위하여 100 mm 배양접시에가득차도록성장한 C2C12/INS-GK, C2C12/INS- GLUT2, C2C12/INS-GK-GLUT2와쥐의췌장에서분리한췌도세포를 phosphate buffered saline로 3회세척한후 50 mm HEPES NaOH (ph 7.5), 150 mm NaCl, 10% glycerol, 1% triton X-100, 1.5 mm MgCl 2, 1 mm EGTA, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 mm sodium orthovanadate, 100 mm sodium fluoride로구성된세포용해완충액 (cell lysis buffer) 를 500 μl씩넣은후상온에서 10분간방치한후세포들을 scraper로긁어모아 1.5 ml 튜브에넣었다. 14,000 g로 4 에서 10분간원심분리한후상층액만분리하여 -20 에시료를보관하였다. 각각의단백질의양은 Lowry 법 (BioRad DC Protein assay kit, BioRad, USA) 을사용하여측정하였다. 각시료들을 50 μg씩덜어 5 sample buffer (60 mm 1 M Tris-HCl, ph 6.8, 25% glycerol, 2% SDS, 14.4 mm 2-mercaptoethanol, 0.1% bromophenol blue) 와섞은뒤 95 에서 3분간변성시킨뒤 10% SDS polyacrylamide gel eletrophoresis를 100V에서 3시간동안시행하였다. 전기영동된겔판을 nitrocellulose막에 4 에서 30 V로 16시간동안전기흡착시켰다. 전기흡착이제대로되었는지는 Ponceau S로염색하여단백질들의 band가 nitrocellulose막에있는것을확인한후 TBST buffer (10 mm Tris-Cl, ph 8.0, 150 mm NaCl, 0.05% Tween 20) 로세척하여다시탈색시켰다. Nitrocellulose막의비결합부위를차단시키기위하여차단용액 (blocking solution, 1% bovine serum albumin이포함된 TBST 용액 ) 30 ml을넣고 1시간동안안구형진탕기 (orbital shaker) 위에서 1시간동안천천히흔들어주었다. 용기에든차단용액을제거한후 TBST buffer로 10분간 3회세척한후일차항체인 rabbit anti-glut2 antibody (Santa Cruz, Cat No. sc-9117, USA) 와 rabbit anti-glucokinase antibody (Santa Cruz, Cat No. sc-7908, USA) 를각각 1:500으로희석한 TBST buffer에넣고 1시간동안안구형진탕기에서흔들며상온에서반응시켰다. 이후 1차항체용액을제거한뒤, TBST buffer로약 10분간 3회세척한후 2차항체혼합용액 (horse reddish peroxidase가붙은 goat anti-rabbit antibody 1:2000 희석액 ) 을넣고다시 1시간동안상온에서안구형진탕기에서반응시켰다. 다시 TBST 용액으로 10분씩 3회세척후발색을위해 ECL Western blotting kit (Amersham life science, USA) 를사용하여면역염색을시행하였다. 면역염색후발생하는형광에의해 X-ray 필름에 30초간노출시킨뒤현상하여띠를확인하였다. 5. 고농도및저농도포도당에서의인슐린분비측정 유전자주입이끝난 C2C12/INS, C2C12/INS-GK, C2C12/INS-GLUT2, 2C12/INS-GK-GLUT2 세포를 60 mm 배양접시각각두개에 10 6 개씩분주한후 2% 말혈청이함유된 DMEM 배지에 3일간배양하였다. 배양접시를 phosphate buffered salt 용액 (GIBCO-BRL, USA) 으로 2회세척한후 2.7 mm (50 mg/dl) 포도당이함유된 DMEM 배지와 25 mm (400 mg/dl) 포도당이함유된 DMEM 배지 3 ml로교환하였다. 1시간이지난후배지에서 100 μl를채취하였다. 인슐린은방사면역측정법 (Insulin RIABEAD II, DINABOT Co., Japan) 을사용하여측정하였다. 6. 통계처리 모든자료는평균 ± 표준오차로표시하였으며, 군간비교는비모수통계방법인 Mann-Whitney U test를실시하였으며, 동일군내의변동은 Wilcoxson sign rank test를통하여분석하였다. 통계적의미는 P값이 0.05 미만인경우로하

5 대한내분비학회지 : 제 21 권제 6 호 2006 Fig. 2. RT-PCR analysis of insulin, glucokinase, GLUT2 mrna in C2C12 derived cell lines at 8 th week after transfection. In the C2C12/GK-GLUT2- INS cell line in which glucokinase, GLUT2 and insulin gene were all transfected, all of three genes were expressed and other cells expressed mrna depending on inserted genes. 였다. 결과 1. 유전자조작된세포주의유전자발현음성대조군인 C2C12 세포주에서는인슐린과 glucokinase, GLUT2의 mrna의발현이없었지만, C2C12/INS-GK에서는인슐린과 glucokinase의 mrna가발현되었으며, C2C12/ INS-GLUT2에서는인슐린과 GLUT2가, C2C12/INS-GK- GLUT2에서는세가지유전자의 mrna가모두발현됨을확인하였다 (Fig. 2). 2. Glucokinase와 GLUT2의단백질발현 C2C12 세포주를대조군으로사용하고 glucokinase 유전자만 transfection시킨 C2C12/GK, glucokinase와인슐린유전자를 transfection시킨 C2C12/INS-GK, 인슐린과 glucokinase, GLUT2 유전자를모두이식시킨 C2C12/INS- GK-GLUT2와 C2C12/INS-GLUT2 세포주에대하여토끼의 anti-glucokinase antibody를사용하여 Western blot을한결과음성대조군으로사용한 C2C12 세포주와 C2C12/INS- GLUT2 세포주에서는 glucokinase가발현되지않았으며, 나머지 glucokinase가 transfection된세포주에서는 60 kda 위치에서 glucokinase가발현되는것을확인할수있었다 (Fig. 3A). 한편 GLUT2 유전자에대해서토끼의 anti-glut2 antibody를사용하여 Western blot을시행한결과음성대조 군으로사용한 C2C12 세포주와 C2C12/INS-GK 세포주는 60 kda 위치의 GLUT2에해당되는띠가보이지않았으나, GLUT2 유전자를 transfection시킨 C2C12/GLUT2, C2C12/ INS-GLUT2, C2C12/INS-GK-GLUT2 세포주에서는 GLUT2 가발현되었다 (Fig. 3B). 3. 고농도와저농도에서의인슐린분비능의비교 C2C12/INS, C2C12/GLUT2-INS, C2C12/GK-INS, C2C12/ GK-GLUT2-INS를각각 2.5 mm과 27 mm 포도당이포함된배지 (serum free) 에서각각한시간씩방치한후배지속에포함된인슐린의양을측정해본결과, C2C12/INS는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로거의증가하지않았다. 그러나 C2C12/GLUT2-INS 는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로증가하였으며, C2C12/GK-INS는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로증가하였다. 한편 C2C12/GK-GLUT2-INS는 ± μ U/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로가장뚜렷한증가를보였다 (P < 0.05)(Fig. 4). 4. 인슐린분비능의지속기간 pmlc-hinsmut vector가 transfection된후 2주뒤부터 2 주간격으로 24시간동안의인슐린생산량과 mrna 발현을관찰한결과시간에 2주째 μu/10 6 cells/day로가장높았으며, 시간이지남에따라점차적으로감소하여 4주째

- 오승준외 4인 : 유전자조작근육모세포에서의포도당자극에의한인슐린분비 - Fig. 3. Western blot analysis of glucokinase or GLUT2 protein in C2C12-derived cell line at the 8 th week after transfection.

6 - 오승준외 4인 : 유전자조작근육모세포에서의포도당자극에의한인슐린분비 - Fig. 3. Western blot analysis of glucokinase or GLUT2 protein in C2C12-derived cell line at the 8 th week after transfection. The arrow in the right side of the figure indicates glucokinase in Fig. 3A and GLUT2 in Fig. 3B, respectively. C, C2C12; 1 and 2, C2C12/GK; 3 and 4, C2C12/INS-GK; 5, C2C12/INS-GLUT2; 6, C2C12/INS-GK-GLUT2; 7 and 8, C2C12/GLUT2; 9 and 10, C2C12/INS- GLUT2; 11, C2C12/INS- GK-GLUT2; 12, C2C12/INS-GK. (μu/10 6 cells/hr) mm 25 mm INS INS-GLUT2 INS-GK INS-GK-GLUT2 Fig. 4. Effect of glucose concentration on insulin secretion in C2C12 cell lines overexpressing insulin gene and GLUT2 or glucokinase gene or both at 8 th week after transfection (n = 4). * P <

대한내분비학회지 : 제 21 권제 6 호 2006 2 wks 4 wks 6 wks 8 wks (μu/10 6 cells/day) 160 140 120 100 80 60 40 20 0 2 4 6 8 week Fig. 5.

7 대한내분비학회지 : 제 21 권제 6 호 wks 4 wks 6 wks 8 wks (μu/10 6 cells/day) week Fig. 5. RT-PCR analysis of insulin mrna and daily insulin production in C2C12 derived cell line μu/10 6 cells/day, 6주째 43.5 μu/10 6 cells/day, 8주째 34.5 μu/10 6 cells/day로현저히인슐린의생산및 mrna 발현이떨어지는소견을보였다 (Fig. 5). 고찰포도당농도에반응하여정상적인인슐린을분비하는이상적인유전공학적세포에요구되는조건들로는첫째, 포도당감지기구 (glucose-sensing apparatus) 인 GLUT2와 glucokinase 가존재하여야한다. 둘째, 포도당에고친화성 hexokinase의발현이약해야한다. 셋째로는전구인슐린에서효율적으로인슐린으로전환되는과정에필요한효소가필요하며 (prohormone convertase, PC2, PC3). 넷째, 포도당이나그밖에인슐린분비를자극하거나억제하는물질들에대해정상적인인슐린분비반응을보여야한다. 그러나이와같은조건을전부만족하는췌도베타세포를대신할세포는존재하지않기때문에가장적은조작을가하여베타세포와유사한기능을할수있는다양한시도들이시작되었다. 저자등은본연구에서 C2C12 근육모세포주를사용하였다. 이는생쥐근육세포주인 C2 세포주의한 subclone이다 [15]. 이세포주는매우빠르게증식하는특징이있기때문에유전자전달에용이하며, 클론을선택하기쉽고, 분화시킬경우더이상증식하지않는근육세포로분화가되는특징을갖는다. 전달된인슐린유전자 cdna는 A쇄와 B쇄에 해당하는부위에 furin이인식할수있도록유전자가돌연변이되어있어인슐린이전구인슐린이아닌성숙된사람인슐린을혈중으로분비할수있도록하였다. 또한인슐린을주변의포도당농도에반응하여분비시키기위한시도로포도당감작기구로서 glucokinase 유전자와 GLUT2 유전자를사용하였다. 각각의유전자들을단계별로차별화하여전달한세포를배양하여 2.5 mm과 27 mm 포도당이포함된배지에서각각 1시간씩자극한결과 C2C12/INS는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로거의증가하지않았다. 그러나 C2C12/GLUT2-INS는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr 로증가하였으며, C2C12/GK-INS는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로증가하였다. 한편 C2C12/GK-GLUT2-INS는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로가장뚜렷한증가를보였다. 예상대로포도당감작기구가모두전달된세포주인 C2C12/GK-GLUT2-INS에서는기저치의약 5.3배의인슐린분비가이루어졌다. 또한인슐린유전자와 GLUT2 유전자를전달한세포주보다인슐린과 glucokinase 유전자를전달한세포주가포도당농도가증가함에따라보다많은인슐린을분비하여인슐린분비시 GLUT2에비하여 glucokinase가보다큰역할을한다는사실을추측할수있었다. 그러나췌도세포가동일한포도당농도의자극을받아분비하는정도의인슐린분비능의증가가본실험에서는이루어지지않았다. 유전자조작에의한이와같은 ex-vivo 유

8 - 오승준외 4인 : 유전자조작근육모세포에서의포도당자극에의한인슐린분비 - 전자치료가생체에적용되기위해서는좀더많은개발이필요할것으로보인다. 그리고인슐린유전자만을전달한 C2C12/INS에비하여모든유전자가다주입된 C2C12/GK- GLUT2-INS의기저인슐린분비량이왜많은지는현재실험에서그이유를알기는어려웠다. 과거에유전자조작을한세포를이식시키기위한시도로신경내분비세포나간세포를가장많이이용하였다. 이중간 ( 肝 ) 세포를조작한연구의경우 [16], glucokinase와 GLUT2 가세포에서발현되므로포도당에대한인슐린분비를조절할수있으리라는가정하에실험이시도되었다. 그러나간세포는분비과립을갖고있지않으므로인슐린분비전저장이이루어질수없다는문제가있었다. 따라서포도당에대한조기인슐린분비의증가는기대할수없으며단지일정한양의인슐린만분비할수있다 [17]. 또한간세포는 prohormone convertase가없으므로전구인슐린에서인슐린으로만들수없어생체활성도가떨어지는전구인슐린만을분비하는결정적인단점을갖는것이해결되어야할문제로남게되었다 [17]. 그러나다음단계로유전적으로조작된세포들을이식시키는방법상의문제를간과할수는없다. 만일완전하게동작하는세포를개발하였다하더라도생착이잘되지않거나이식이용이하지않다면생체내에서의정상작동을기대하기어렵기때문이다. 그렇기때문에이식을간단하게할수있는점을먼저생각한다면근육세포가가장쉬울수있다. 근육세포는근육주사로간단하게이식할수있으며, 생착할경우그부위에서 myotube를형성하여주위의혈관등에연결되어있으므로인슐린을분비하여생체내로쉽게전달할수있는장점이있다. 그러나근육세포가인슐린을분비하기위해서는인슐린분비를위한여러가지유전자 ( 인슐린, glucokinase, GLUT2, PC2, PC3) 가모두부족하다는큰단점을갖고있다. 또한근육세포는호르몬을분비하는내분비기관내세포와다른구조를갖고있기때문에제대로호르몬을분비할수있을까하는의문도갖게한다. 그러나 1991년에사람성장호르몬을생쥐근육모세포인 C2C12 세포주에유전자주입시켜성장호르몬을분비시킬수있었다는두편의논문이발표되었다 [18,19]. 이것은근육세포도유전자조작을통하여내분비기관으로서의역할을수행할수있다는하나의가능성을보여주었으며, 성장호르몬은인슐린보다분자량이크기때문에인슐린역시유전자조작을가할경우충분히분비될수있다는것을시사하는실험이었다. 위에서기술한대로 C2C12 세포주는근육모세포인관계로세포자체적으로 glucokinase와 GLUT2 가발현되지않으므로조작된세포주들의삽입된유전자가제대로발현이되고있는지알아보기위해 RT-PCR과 Western blot을시행하였다. 그결과아무조작을가하지않은 C2C12 세포주에서는두가지유전자모두가발현되지 않는것이확인되었으며, 나머지유전자들을전달받은세포주들은전달받은유전자의종류에따라두가지유전자가각각발현됨을확인할수있었다. 그러나위에서도기술된바처럼조작된유전자가계속적으로영구히발현되지는않는 (transient expression) 관계로가장먼저전달된 glucokinase의발현이가장미약하였다. 이와유사한실험을시행한 Gros 등 [8] 은 myosin light chain promoter를이용하여동일한돌연변이인슐린유전자의발현을시킨결과 100 μu/10 6 cells/hr의인슐린분비능을갖는 C2C12 근육모세포주를만드는데성공하였다. 이는단일플라스미드를이용한유전자전달을하여본연구에서시도한세가지플라스미드를동시에한세포에전달하는방법에비해유전자전달의효율이높은것이그이유인것으로보인다. 그러나본연구에서만들어진유전자조작근육세포의이식은포도당농도에따라인슐린분비가증가되는점이다른연구에비해생리적이라는점은개선되었지만, 인슐린의생산효율이떨어진다는사실은개선해야할가장큰과제로남는다. 전달된인슐린유전자가발현된기간은유전자전달 2주째 μu/10 6 cells/day로최대인슐린분비가이루어졌다. 그러나시간이지남에따라점차감소하는경향을관찰할수있었으며, 유전자주입후 8주째 34.5 μu/10 6 cells/day 로현저히인슐린의생산이감소된것을확인할수있었다. 이는일반적으로일시적 transfection이수일내지 1주일정도발현이유지되는데반하여상대적으로긴기간동안유지되었다. 같은플라스미드를사용한 Gros 등 [8] 도 1.5개월동안인슐린분비가된것을확인하였고, CMV/insulin 유전자를근육세포에 transfection시켰던 Simonson 등 [12] 도 transfection 후 30일째인슐린의분비가측정되지않는수준까지떨어졌던것을비교한다면상대적으로장시간동안인슐린을안정적으로분비한것으로생각된다. 결론적으로본연구는유전자조작된근육모세포주가주변의포도당농도를감지하여인슐린을생산및분비할수있다는하나의가능성을보여주었다. 또한이러한세포주는췌도세포와똑같은양상의인슐린분비를보여주는것은비록실패하였지만, 현재의인슐린치료가갖고있는단점을극복할수있는하나의가능성을제시하였다고사료된다. 요약연구배경 : 당뇨병을치료하기위한세포이식을하는데있어가장중요한것은포도당에의해조절되는것이다. 포도당에반응하는유전자는현재여러종류가있지만, 췌도세포에서는 glucokinase와 GLUT2가그역할을하고있다. 저자는포도당에의해인슐린을생산하는근육모세포를개발하기위하여생쥐근육모세포세포주인 C2C12를이용하여사

9 대한내분비학회지 : 제 21 권제 6 호 2006 람인슐린, 쥐 glucokinase, 쥐 GLUT2 유전자를 transfection 시켰다. 방법 : C2C12 세포주에사람인슐린 cdna가삽입된 pmlc-hinsmut 플라스미드와쥐 GLUT2와 glucokinase가삽입된 pcb7/glut2와 pcb7/gk를 transfection시켜안정된세포주를얻었다. 각각의삽입된유전자에따라 C2C12/INS-GLUT2, C2C12/INS-GK, C2C12/INS-GK-GLUT2 세포주를만들었다. 이들세포주에대하여각유전자의 mrna 및단백질발현을관찰하였다. 그리고저농도포도당 (2.7 mm) 과고농도포도당 (25 mm) 에서의인슐린생산능을비교하였다. C3H 생쥐에 streptozotocin으로당뇨병을유발시킨뒤 C2C12/INS-GK-GLUT2 세포주를이식한후혈당의변화를관찰하였다. 결과 : 1. C2C12/INS-GLUT2, C2C12/INS-GK, C2C12/INS-GK- GLUT2 세포주는각각 transfection된유전자의 mrna와단백질을발현하여 transfection 후유전자가성공적으로작동함을확인할수있었다. 2. 포도당농도에따른인슐린생산은 C2C12/INS는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로거의증가하지않았다. C2C12/GLUT2-INS는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로증가하였으며, C2C12/GK-INS는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로증가하였다. 한편 C2C12/GK-GLUT2-INS는 ± μu/10 6 cells/hr에서 ± μu/10 6 cells/hr로가장뚜렷한증가를보였다 (P < 0.05). 3. 인슐린유전자의발현은시간이지남에따라인슐린생산능과함께비례하여감소하였으며, 8주째현저히감소되는양상을보였다. 결론 : 유전자조작된생쥐근육모세포는포도당농도에따라인슐린을분비하였으며, 이식시혈당저하를시킬수있었다. 그러나이러한체세포이식치료는유전자발현을지속적으로유지시킬수있는방법의개발이필요할것으로생각된다. 참고문헌 1. Sutherland DE, Gruessner AC, Gruessner RW: Pancreas transplantation: a review. Transplant Proc 30: , Pancreas transplantation for patients with type 1 diabetes: American Diabetes Association. Diabetes Care 23(suppl 1):S85, Panza JL, Wagner WR, Rilo HLR, Rao RH, Beckman EJ, Russell AJ: Treatment of rat pancreatic islets with reactive PEG. Biomaterials 21: , Aomatsu Y, Nakajima Y, Ohyama T, Kin T, Kanehiro H, Hisanaga M, Ko S, Nagao M, Tatekawa Y, Sho M, Ikeda N, Kanokogi H, Kobayashi T, Urizono Y, Yamada T, Shibaji T, Kanamura T, Ogawa S, Iwata H, Nakano H: Efficacy of agarose/polystyrene sulfonic acid microencapsulation for islet xenotransplantation. Transplant Proc 32: , Liu EH, Herold KC: Transplantation of the Islets of Langerhans. New Hope for Treatment of Type 1 Diabetes Mellitus. Trends Endocrinol Metab 11: , Zwillich T: Diabetes research. Islet transplants not yet ready for prime time. Science 289: , Yamasaki K, Sasaki T, Nemoto M, Eto Y, Tajima N: Differentiation-induced insulin secretion from nonendocrine cells with engineered human proinsulin cdna. Biochem Biophys Res Commun 265: , Gros L, Riu E, Montoliu L, Ontiveros M, Lebrigand L, Bosch F: Insulin production by engineered muscle cells. Hum Gene Ther 10: , Arcelloni C, Falqui L, Martinenghi S, Stabilini A, Pontiroli AE, Paroni R: Processing and release of human proinsulin-cleavage products into culture media by different engineered non-endocrine cells: a specific assessment by capillary electrophoresis. J Endocrinol 166: , Scougall KT, Shaw JA: Tetracycline-regulated secretion of human insulin in transfected primary myoblasts. Biochem Biophys Res Commun 304: , Shaw JA, Delday MI, Hart AW, Docherty HM, Maltin CA, Docherty K: Secretion of bioactive human insulin following plasmid-mediated gene transfer to nonneuroendocrine cell lines, primary cultures and rat skeletal muscle in vivo. J Endocrinol 172: , Simonson GD, Groskreutz DJ, Gorman CM, MacDonald MJ: Synthesis and processing of genetically modified human proinsulin by rat myoblast primary cultures. Hum Gene Ther 7:71-78, Wilson MO, Scougall KT, Ratanamart J, McIntyre EA, Shaw JA: Tetracycline-regulated secretion of human (pro) insulin following plasmid-mediated transfection of human muscle. J Mol Endocrinol 34:

10 - 오승준외 4인 : 유전자조작근육모세포에서의포도당자극에의한인슐린분비 , Clark SA, Quaade C, Constandy H, Hansen P, Halban P, Ferber S, Newgard CB, Normington K: Novel insulinoma cell lines produced by iterative engineering of GLUT2, glucokinase, and human insulin expression. Diabetes 46: , Yaffe D, Saxel O: Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature 270: , Mitanchez D, Doiron B, Chen R, Kahn A: Glucosestimulated genes and prospects of gene therapy for type I diabetes. Endocr Rev 18: , Vollenweider F, Irminger JC, Gross DJ, Villa- Komaroff L, Halban PA: Processing of proinsulin by transfected hepatoma (FAO) cells. J Biol Chem 267: , Barr E, Leiden JM: Systemic delivery of recombinant proteins by genetically modified myoblasts. Science 254: , Dhawan J, Pan LC, Pavlath GK, Travis MA, Lanctot AM, Blau HM: Systemic delivery of human growth hormone by injection of genetically engineered myoblasts. Science 254: ,

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를