대한임상검사학회지 : 39권제3호, 223-230, 2007 ISSN 1738-3544 위점막에서 H. pylori 검출을위한조직염색법의비교 전라북도군산의료원병리과 차민선 Comparative Analysis of Histochemical Stains about Detection of H. pylori in Gastric Mucosa Min-Seon Cha Department of Pathology, Gunsan Medical Center, Gunsan 573-713, Korea Several methods have been used in the detection of Helicobacter pylori (H. pylori) which was believed to be a pathogenic organism causing chronic gastritis, benign peptic ulcer, gastric carcinoma or malignant lymphoma. Even though several methods were introduced for detection of H. pylori in stomach, there were controversies in their sensitivities and specificities. This experiment were designed to study the comparative analysis of staining methods (hematoxylin and eosin (H&E), Giemsa, Warthin-Starry and immunohistochemical stain) to dectect H. pylori in the gastric mucosa. The results were as follows. Average density score of H. pylori classified by Genta were 2.29 in Warthin-Starry stain, 2.19 in Giemsa stain, 1.34 in immunohistochemical stain and 0.98 in H&E stain. By comparison between inflammatory degree by Sydney system and result of Warthin-Starry stain, the detection rate and densities of H. pylori were increased from mild (61.5% and 0.8), moderate (90.4 and 2.1), and severe (100% and 3.2). From the above findings, Warthin-Starry stain is useful method for detection of H. pylori in gastric mucosa. Key Words : Gastric mucosa, Helicobacter pylori, Hematoxylin and eosin stain, Giemsa stain, Warthin-Starry stain, Immnnohistochemical stain. I. 서론 H. pylori 는만성위염, 소화성궤양, 위선암또는 mucosa associated lymphoid tissue(malt) 림프종등의발생과관련있는병원체로알려져있으며특히만성위염의가장중요한원인으로위염환자의 90% 이상에서 H. pylori가관찰되는것으로보고되었으며 (Moss 등, 1992; 교신저자 : 차민선, ( 우 ) 573-713 전북군산시지곡동 29-1, 전라북도군산의료원병리과 Tel : 063-472-5373 E-mail : cms4277@kunmed.or.kr Kusters 등, 2006), 위장관질환자로부터 H. pylori를제거하면위장관질환이현저히감소되었다는보고도있다 (Graham, 1991). H. pylori는편모를가진 2.0 3.5 μm 길이의그람음성나선형간균이며위산의고산도와위내의산소및이산화탄소농도를최적환경으로삼아서식하는비호기성세균으로 urease를활성화시켜요소를암모니아와이산화탄소로분해하는데, 분해산물인암모니아에의해위산이중화되기때문에고산도의위에서살수있는것으로알려져있다 (Hazell 등, 1986; 안등, 2004; Ando 등, 2006). H. pylori는위점막표층에대부분분포하지만일부는점막고유층내에서도세균이존재하는것으로알려져있다 ( 김, 2001). 223
대한임상검사학회지 39(3):223-230, 2007 약 100년전에 Bizzozero에의하여동물의위점막에서세균이처음보고된후사람의위내에서나선균의존재가보고된예가있었으나, 그후 Palmer가사람의위에서흡입생검을통하여얻은위점막에서균을발견할수없다는보고를하였으며이로인하여위산분비가정상인위속에서세균은살수없다고생각하게되었다 (Palmer, 1954; 정, 2002). 그러나 1975년 Steer와 Colin-Jones 등이위궤양환자의위절제표본을검토한결과 81% 의환자에서나선균이있다고보고하였으나균주의배양에는성공하지못하였다 (Steer와 Eolin-Jones, 1975). 1982년 4월오스트레일리아의 Royal Perth 병원에서 Marshall과 Warren에의하여 37 의다습, 비호기조건에서균을배양하는데성공하였다 (Marshall와 Wamen, 1984). 처음분리배양된균은 Campylobacter와같은조건에서배양되었고위의유문부에서배양이이루어졌다고하여 Campylobacter pyloridis라고하였으나균을명명하는방법이잘못되어 1987년 Campylobacter pylori라고 Marshall이명명하였다. 그후세균의특성이 Campylobacter와는다른종으로알려져 1989년부터 Helicobacter pylori로불려지고있다 (Goodwin, 1994; 정, 2002). H. pylori 감염여부를알아보기위한진단법은내시경을이용해얻은조직으로검사하는침습적인방법과내시경을이용하지않고진단이가능한비침습적방법으로크게나눌수있다 ( 윤, 2001; 윤등, 2002; Ricci 등, 2007). 침습적인방법으로는신속요소분해효소검사법, 조직검사법, 균배양검사, 중합효소연쇄반응 (PCR) 법등이있고, 비침습적방법으로는혈청검사법, 요소호기검사법 ( 윤, 2001) 과, 최근사용되기시작한대변항원검사인 HpSA(Helicobacter pylori Stool Antigen) 검사법등이있다 ( 서, 2004). 이들검사법중 H. pylori의검출률이높은것은조직을이용한검사법으로알려져있다 ( 김, 2002). 내시경생검조직을이용한 H. pylori 검사법에는다양한염색방법이이용되고있으나각각의염색법에의한 H. pylori 검출결과는다양하다. 이에위내시경조직검체를대상으로 hematoxylin과 eosin(h&e) 염색과조직화학염색 (Giemsa 염색, Warthin- Starry 염색 ), 및면역조직화학염색을시행하여보다효과적이고활용가치가높은 H. pylori 염색법을알아보고자본연구를시행하였다. 1. 연구재료 II. 재료및방법 본연구는 2005년 10월부터 2006년 9월까지전라북도군산의료원에서위내시경검사를시행하여신속요소분해효소검사법에서양성을보이면서조직검사에서만성위염으로진단받은 58 예를대상으로하였다. 2. 연구방법 모든환자에서생검조직을 formaldehyde가 7.4% 함유된마스크폼 2A R (Danakorea, korea) 에 24시간고정한후자동침투기를이용하여탈수, 투명, 침투과정을거친후파라핀으로포매한다음 4 μm 두께의연속절편을제작하여유리슬라이드에부착시킨후각각의염색을시행하였다. 단, 면역조직화학염색에서는전처리과정에서의조직표본의탈락을방지하기위해 ProbeOn TM Plus Microscope slide R (Fisher Scientific, USA) 를사용하여조직절편을부착시켰다. 1) Hematoxylin and eosin(h&e) 염색조직절편을 xylene에서탈파라핀하여저농도의알코올과정을거쳐함수한후헤마톡실린용액 (5분), 분별및청색화과정을거쳐에오신염색 (1분) 을한다음탈수, Fig. 1. H. pylori stained with pink color by H&E stain in surface epithelium of gastric mucosa and they are difficult to detect with the H&E stain. 400. 224
Korean Soc. Clin. Lab. Sci. 39(3):223-230, 2007 Fig. 2. H. pylori stained with blue color by Giemsa stain in surface epithelium of gastric mucosa. 400. 투명과정을거쳐봉입하였으며, H&E 염색에서는위점막상피표면에분홍색으로염색된나선형간균의 H. pylori 균체를볼수있었다 (Fig. 1). 2) 조직화학염색 (1) Giemsa 염색탈파라핀과정을거쳐함수한후 Wright-Giemsa 염색액으로실온에서 20분간염색한후, xylene으로투명화한다음봉입하였으며, Giemsa 염색에서는위점막상피표면에청색으로염색된나선형간균의 H. pylori 균체를볼수있었다 (Fig. 2). (2) Warthin-Starry 염색 Warthin-Starry 염색은 ph 4.0의은용액에서 H. pylori 를도은한후 hydroquinone을사용하여은을금속성은 ( 흑색 ) 으로환원시켜호은성반응 (argyrophilic reaction) 을이용한염색방법으로서, 탈파라핀, 함수과정을거쳐 5 0 건열멸균기에 1% sliver nitrate 용액에넣고 50분간침투시킨후미리 50 건열멸균기에준비한혼합용액 (2% sliver nitrate, 0.15% hydroquinone, 5% gelatin) 에서발색시켰다. 이때절편이옅은황색이될때까지방치한후증류수에수세후탈수, 투명, 봉입하였으며, Warthin- Starry 염색에서는위점막상피표면에흑색으로염색된나선형간균의 H. pylori 균체를볼수있었다 (Fig. 3). Fig. 3. H. pylori stained with black color by Warthin-Starry stain in surface epithelium of gastric mucosa and they are easily detected in the Warthin-Starry stain sections. 100. 3) 면역조직화학염색 H. pylori에대한면역조직화학염색은효소표지중합체법을이용하여 UltraVision LP Detection System R (LAB VISION, USA) 에따라염색하였다. 조직절편을부착시킨슬라이드를 58 건열멸균기에서 2시간가열처리한후탈파라핀, 함수과정을실시한후항원성부활화를위해 ph 6.0 citrate 완충액에슬라이드를넣고 cooker를사용하여 microwave에 100 에서 15분간가열하였다. 내인성과산화효소억제방법으로 Hydrogen Peroxide Block R (LAB VISION, USA) 용액을사용하여 45 에서 5분간반응시킨후 Tris 완충액으로 4회세정하였다. 비특이반응을줄이기위하여 Ultra V Block R (LAB VISION, USA) 용액으로 45 에서 3분간반응시킨후 Tris 완충액에 4회세정하였다. 일차항체인 Helicobacter Ab-1(LAB VISION, USA; 1:100) 를 45 에서 40분반응시키고 Tris 완충액에 4 회세정한후 1 차항체의역가를증가시켜주고 Polymer-HRP R (LAB VISION, USA) 가 1차항체에잘침투할수있도록 Primary Antibody Enhancer R (LAB VISION, USA) 용액을 45 에서 15분반응시킨후 Tris 완충액에 4회세정하였다. 이차항체반응으로 F(AB)2 fragment 에 HRP가표지되어있는 mouse IgG와 rabbit IgG antibody를검출할수있는 Polymer-HRP R (LAB VISION, USA) 용액을이용하여 45 에서 17분반응시킨후 Tris 완충액으로 4회세정한다음 AEC 용액으로실온에서발색시킨후 Tris 완충액으로 4회세정하고 225
대한임상검사학회지 39(3):223-230, 2007 도 (mild), 중등도 (moderate), 고도 (severe) 의 3등급으로구분하였다. 4. 통계분석 위염정도에따른 Warthin-Starry 염색상에서의 H. pylori 검출률과균밀도와의관계를알아보기위한통계분석 (Ver. 12.0, SPSS INC., Chicago) 으로 Chi-Square Test를사용하였다. Fig. 4. H. pylori stained with brown color by Immunohistochemical stain in surface epithelium of gastric mucosa. but fungus body form of H. pylori was not accurately. 400. III. 결 과 1. H. pylori 검출률 Gill's hematoxylin으로 1분간대조염색하여봉입하였으며, 면역조직화학염색에서는위점막상피표면에갈색으로염색된나선형간균의 H. pylori 균체를볼수있었다 (Fig. 4). 3. 염색결과판독위점막에서의 H. pylori 검출은광학현미경고배율 ( 400) 시야에서 Genta 분류법에따라 H. pylori 검출률을 0에서 5까지등급화하였고 (Table 1), 위염의염증정도와 H. pylori 검출률과의관계를알아보기위하여위염의조직학적소견을 Sydney system에의거하여염증정도를경 1) H&E 염색 Genta 분류법에따라 H. pylori의균밀도를조사하여검출률을나타낸결과 58 예의염색표본상에서 H. pylori 가검출되지않은음성군은 23 예였으며, 검출된양성군은 35 예로 1등급은 17 예 (29.3%), 2등급은 14(24.1%), 3 등급은 4(6.9%) 였다. 그러나높은균밀도의 4, 5등급에서는균체가관찰되지않았다. 이에따른 H. pylori의평균균밀도는 0.98이었다 (Table 2). Table 1. Criteria used for the density of H. pylori in the gastric mucosa by Genta Score Description 0 No H. pylori bacteria are visible 1 2 3 Rare scattered H. pylori ; isolated bacteria or one or two small clusters in the mucosa or in a pit Few scattere H. pylori ; they are spaced widely apart from each other(most pits have few or none) Uniformly distributed on surface and pit ; H. pylori usually can be seen with no diffculty at 4, they are not crowded against each other and do not from large clumps 4 Very large number of H. pylori on most mucosal surface and pit ; they are large clumps 5 H. pylori on the entire mucosa Table 2. Density score of H. pylori analyzed by H&E, Giemsa, Warthin-Starry and immunohistochemical stains in the gastric mucosa H. pylori density score H&E No of specimen (%) Giemsa Warthin- Starry Immunohistochemical 0 23(39.7%) 5( 8.6%) 7(12.1%) 17(29.3%) 1 17(29.3%) 11(19.0%) 9(15.5%) 17(29.3%) 2 14(24.1%) 22(37.9%) 18(31.0%) 14(24.1%) 3 4( 6.9%) 12(20.7%) 12(20.7%) 7(12.1%) 4 0( 0.0%) 4( 6.9%) 8(13.8%) 3( 5.2%) 5 0( 0.0%) 4( 6.9%) 4( 6.9%) 0( 0.0%) Mean* 0.98 2.19 2.29 1.34 * Mean=(density score x No. of specimen) / total No. of specimen(58) 226
Korean Soc. Clin. Lab. Sci. 39(3):223-230, 2007 2) 조직화학염색 (1) Giemsa 염색 Genta 분류법에따라 H. pylori의균밀도를조사하여검출률을나타낸결과 58 예의염색표본상에서 H. pylori 가검출되지않은 0등급은 5 예 (8.6%) 였으며, 검출된 1등급은 11 예 (19.0%), 2등급은 22 예 (37.9%), 3등급은 12 예 (20.7%) 였다. 높은균밀도의 4, 5등급에서는각각 4 예 (6.9%) 를나타냈다. 이에따른 H. pylori의평균균밀도는 2.19이었다 (Table 2). (2) Warthin-Starry 염색 Genta 분류법에따라 H. pylori의균밀도를조사하여검출률을나타낸결과 58 예의염색표본상에서 H. pylori 가검출되지않은 0등급은 7 예 (12.1%) 였으며, 검출된 1 등급은 9 예 (15.5%), 2등급은 18 예 (31.0%), 3등급은 12 예 (20.7%) 였다. 높은균밀도의 4등급은 8 예 (13.8%), 5등급은 4 예 (6.9%) 를나타냈으며, 이에따른 H. pylori의평균균밀도는 2.29이었다 (Table 2). Table 3. Detection rate of H. pylori by Warthin-Starry stain the severity of chronic inflammation in gastric mucosa Degree of inflammation (n) No. of specimens positive for H. pylori (%) Mild (13) 8 ( 61.5) Moderate (21) 19 ( 90.4) Severe (24) 24 (100.0) Total 58 51 (100.0) Table 4. Relationship between degree of inflammation and density score of H. pylori stained by Warthin-Starry method Degree of Density score of H.pylori inflammation(n) 0 1 2 3 4 5 Mean* Mild (13) 5 5 3 0 0 0 0.8 Moderate (21) 2 3 9 4 3 0 2.1 Severe (24) 0 1 6 8 5 4 3.2 Total 58 7 9 18 12 8 4 2.3 * Mean=(density score No. of specimen ) / degree of inflammation(n) 3) 면역조직화학염색 Genta 분류법에따라 H. pylori의균밀도를조사하여검출률을나타낸결과 58 예의염색표본상에서 H. pylori 가검출되지않은음성군은 17 예였으며, 검출된양성군은 41 예로 1등급은 17 예 (29.3%), 2등급은 14 예 (24.1%), 3등급은 7 예 (12.1%) 였다. 높은균밀도의 4등급은 3 예 (5.2%) 였으나, 5등급에서는균체가관찰되지않았다. 이에따른 H. pylori의평균균밀도는 1.34이었다 (Table 2). 2. 위염정도에따른 Warthin-Starry 염색상에서의 H. pylori 검출률과평균균밀도와의관계위염의염증정도를 Sydney system에따라경도 (mild), 중등도 (moderate), 고도 (severe) 의 3등급으로분류하여 Warthin-Starry 염색에의한 H. pylori의검출률과비교한결과 Table 3에서보는바와같이경도염증군 (n=13) 에서 61.5%, 중등도염증군 (n=21) 에서 90.4%, 고도염증군 (n=24) 에서 100% 로염증의정도가높아질수록 H. pylori 의검출률이높은것으로나타났다 (p<0.05). 또한염증의정도와 H. pylori의균밀도와의관계를분석한결과 Table 4에서보는바와같이염증이심할수록 H. pylori의균밀도가높아지는경향을나타내었다 (p<0.05). IV. 고찰 H. pylori는다양한위질환의원인으로만성위염, 소화성궤양, 위선암또는 mucosa associated lymphoid tissue(malt) 림프종등의발생과관련있는병원체로알려져있으며 (Kusters 등, 2006), 특히한국인의경우유아시절부터감염되어성인및노인에이르기까지감염의상태가유지되므로국내에서발생하고있는위장관질환과관련하여 H. pylori의검출은매우중요하게다루어지고있다. 이러한 H. pylori의감염진단에있어서여러방법들이사용되고있으나위내시경생검조직을얻어시행하는검사법들이많이이용되고있다. 이는점막의조직학적정보 ( 염증의정도, 위축이나장상피화, 이형성, 악성화 ) 를동시에제공한다는장점를가지고있으며, 보고자에따라판독의결과가달라질수있다는단점이있음에도불구하고여러가지염색을통하여조직내의 H. 227
대한임상검사학회지 39(3):223-230, 2007 pylori를현미경으로관찰하는조직학적검사법이예민도나특이도를고려할때적절한검사법으로여겨지고있다 ( 김등, 1999; 윤, 2001). 그러나 H&E 염색에서의 H. pylori의검출률은대부분의경우예민도가매우낮은것으로보고되고있으며, 이에따라 Giemsa 염색이나 Warthin-Starry 염색등의조직화학염색법이병행되어야한다는보고도있다 ( 제갈등, 1999; 최, 2001). Kolts 등 (1993) 은 H&E, Warthin-Starry, Giemsa 염색의예민도를조사한결과 H&E 염색의경우 84% 인데비해 Warthin-Starry와 Giemsa 염색은 96% 로매우높게나타난것으로보고하였고, Molyneux와 Harris(1993) 은 Giemsa와 silver염색을표준검사법으로사용하여 H&E 염색과비교해본결과 66% 의매우낮은예민도를나타냈다고하였다. 또한제갈등 (1999) 은 H&E, Genta, EI-Zimaity, AgNOR 염색을비교한결과 H&E 염색이다른조직화학염색에비해 80% 로상당히낮게나타난것으로보고하였다. 본연구에서도위내시경을통하여얻은위점막조직에대하여 H. pylori가가지고있는다량의요소분해효소의성질을이용한신속요소분해효소검사법에서양성을보이면서조직검사에서만성위염으로진단받은 58 예를대상으로하였다. 단, 신속요소분해효소검사법에있어서항생제나비스무스제제와같은약물을복용한환자에서균이사멸할수있는경우와신속요소분해효소검사의조작과정에서검사자가조직을잘못다룰경우에나타날수있는위음성과위양성, 그리고동일내시경생검검체의연속절편을제작하는과정에서 H. pylori의균체가적을경우에는일부절편에서균체가발견되지않을수있다는점을감안하고연구에임하였다. 이러한 58 예를대상으로 H&E 염색과조직화학염색 (Giemsa 염색, Warthin- Starry염색 ), 그리고면역조직화학염색을시행하여 Genta 분류법에따라 H. pylori의균밀도를조사한결과 H&E 염색 0.98, Giemsa 염색 2.19, Warthin-Starry염색 2.29, 면역조직화학염색 1.34로 H&E 염색은다른조직화학염색과면역조직화학염색에비해상당히낮게나타났다. 이러한결과는이전의대부분의연구결과들과비슷하며 (EI-Zimaity 등 1998), H&E 염색의경우 H. pylori의검출률이다른조직화학염색법들에비해낮게검출된다는결과와일치한다 ( 제갈등, 1999). H&E 염색에서 H. pylori 균밀도가낮게나타나는이유로는 H&E 염색은조직절편을의도적으로과염시킨후과잉염색된부분을산 (acid) 을사용하여제거하기때문에이과정에서 H. pylori 가탈색되어광학현미경하에서 H. pylori의염색성이약하게나타나게되어검출이어려운것으로보여진다 ( 제갈등, 1999). 그러나조직화학염색과면역조직화학염색을이용한 H. pylori의검출에대한의견에는다소차이가있어, 유등 (2005) 은면역조직화학염색이 H. pylori를재확인하는방법으로조직화학염색인 Giemsa 염색보다 H. pylori의검출률이높아정확한검출법이될것이라고보고하였으며, Rotimi 등 (2000) 도 H. pylori의증명을위한염색법들과의비교연구한결과면역조직화학염색에서 98%, 조직화학염색 90% 로면역조직화학염색에서 H. pylori의검출률이높게나타났다고보고하였다. 그러나본연구에서는이전보고자들과다르게면역조직화학염색에비해조직화학염색인 Warthin-Starry와 Giemsa 염색에서 H. pylori의검출률이높게나타났다. 이러한결과는면역조직화학염색의경우표본상에서 H. pylori의균체모양이부정확하게관찰되어이부분의발색정도만을가지고 H. pylori라고판단할수없었기때문에나타난결과로보여진다. 조직화학염색인 Warthin-Starry와 Giemsa의염색에있어서 Warthin- Starry 염색의경우 H. pylori 병원체를저배율에서도관찰이용이하여정확하고쉽게확인할수있었지만, Giemsa 염색의경우저배율에서 H. pylori 병원체가적은경우는염색강도가다소약하여미세한단백성과립들과구별이쉽지않아관찰이다소어려워고배율에서재확인하는과정이필요했다. 위의염증정도와 Warthin-Starry 염색법에의한 H. pylori의검출률및출현균밀도를조사한결과염증의정도가심할수록 H. pylori의검출률및출현균밀도가증가하는것을알수있었고, 이는다른연구결과 (Tazawa 등, 1998; 제갈등, 1999) 들과일치하였다. 이상의내용을요약하면조직내 H. pylori 검출을위한염색법으로는도은법을이용한 Warthin-Starry 염색법이임상에서가장쉽게이용할수있을것으로생각되었다. 228
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