으로 H. pylori에 의한감염을조사한보고에의하 대상으로하였다. 면위염및위십이지장궤양환자의약 80-90% 가이세균에의해위질환이발생한다고하고있다 ( 정 2. 방법 1996; 김, 1997). 또한대부분의한국사람들은어린 시절부터 Helicobacter pylori 에 감

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한선 장
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1 일상병리검사과막외 XI: 저 134 뀐저 12 호, 88-94, '2002 Repetitive DNA Sequence-Based PCR(Rep-PCR) 을이용하여위궤양 조직으로부터분리된 Helicobacter pylori 의유전적다양성에관한연구 광양보건대학임상병리과 김양호 Genetic Diversity of Helicobacter pylori Isolated from Gastric Ulcer Tissue USing a Reperitive Sequence-Based Polymerase Chain Reaction Kim, Yang Ho Departηzent of Clinical Pathology, Gwang Yang Health College, Gwang Yang, Korea πle study was foαlsed on the estimation of genetic diversity of He /icobacter pylori. Thirty strains were isolated from 90. gastric ulcer tissues. The strains were indentified by typical Gram stain and conventional biochemical tests. Antral biopsies were taken for culture from 90 patients with chronic gastritis, gastric ulcer and du때enal ulcer at the time of endoscopy. H. pylori was identified by typical gram stain morphological and biochemical tests. UreA of the candidates were Amplified using PCR, and 30 strains were identified as H. pylori 담om 90 specimens. Repetitive sequence based polymerase chain reaction (Rep-PCR) fmgerprinting was perfonned by primers BOXA1R (5 -CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3 ). Isolates were divided into five molecular types (1 -V) at a similarity value of 0.5 using Repetitive Sequence-Based Polymerase Chain Reaction fmgerprinting. Distribution of the similarity value was 0.10 to 1.00, which shows a wide 때ge of similarity value. DNA fmgerprinting of the 30 isolates were anaηzed by Repetitive sequence based polymerase chain reaction (Rep-PCR). Isolates were divided into five molecular types (1 -V) at a similarity value of 0.5 using Rep-PCR fmgerprinting. Distribution of the similarity value was 0.10 to 1.00, which show a. wide range of similarity value. These results suggested that strains isolated in patients have much diversity. In conclusion, Rep-PCR fmgerprinting of H. pylori could be available for epidemoi이ogical infections and for clinical applicatlons. Key Words Helicobacter pylori, Repetitive DNA sequence-based PCR 1. 서로 - 활동성만성위, 위암등의중요인자로알려지고있 다 ( 김, 1994; 대한 H. pylori 연구회, 1998; Warren, 1. Helicobacter pylori ( 이하 H. pylori) 는소화성궤양 R., and B. 1. Marshall. 1983) 우리나라사람을대상 88

2 으로 H. pylori에 의한감염을조사한보고에의하 대상으로하였다. 면위염및위십이지장궤양환자의약 80-90% 가이세균에의해위질환이발생한다고하고있다 ( 정 2. 방법 1996; 김, 1997). 또한대부분의한국사람들은어린 시절부터 Helicobacter pylori 에 감염되어살아가는 1) H. pylori 분리및배양 것으로보고되고있다 ( 김 등, 1993; 노, 1997). 따라 서다양한변이종이나아형들이존재할것으로보 2000년 1 월부터 2000년 12월까지소화기증상을 인다. Helicobacter pylori 의다형성을파악하기위해 보여병원에내원하여내시경을받은환자의조직 Helicobacter pylori의 항원분석을통한혈정형을결 을 채취하여 H. pylori를 분리하기 위하여 즉시 정하기 위한많은노력이 시도되고있다 ( 이 등, vancomycin 1 Oug/ml, nalidixic acid 25ug/ml, amphothericin 1991; 홍등, 1997; Lior, 1991). 지금까지확인된혈청 B 1 ug/ml, 10% 의 우혈청이 첨가된 Mueller 형의수가적어다른세균에서같은 serotyping의의 Hinton 한천배지에접종하였다. 접종한배지를 10% 미가 없고 phage typing도 마찬가지다. 이는 H. CO 2 와 100% 습도가유지되는 37t 항온기에 1 주 pyroli가증식조건이까다로워배양이어렵고분리 일간배양하였다. 주간에생물학적혈청학적차이가적기 때문이다. 최근 Helicobacter pylori 의 유전자를분석한연구에 2) H. pylori의 확인 의하면분리균주에따른유전자다양성이다른세균에비해높은것으로알려지고있으며, 이를이용함으로써분리주의동질성을조사할수있을것으로생각된다. 본연구의목적은위궤양조직으로부터분리된 H. pyroli 균주를대상으로 Repetitive DNA sequence-based PCR (Rep-PCR) 을이용하여 Helicobacter pylori 분리주사이의 genomic diversity를분석, 유전자형 (genotype) 을설정하고이를토대로분자형과유전적다양성을알아보고자본연구를실시하였다. 이에저자들은만성위염, 위십이지장궤양의상부위장관질환을가진환자들의위생겸조직에서분리된 H pylori를대상으로 RAPD 볍에의해상사성지수 (similarity value) 를구하여유전적다양성을알아보고, 분자형을규명하여이들질병과의연관성을고찰하고자본연구를시행하였다. ll. 재료및밤법 1. 대상 2000년 1 월부터 2000년 12월까지소화기증상을보여병원에내원하여내시경을받은환자 90명을 배양하여, 형성된집락을 10% urea배지에넣어 urease시험을실시, 1-2분이내에양성반응을보이는집락을선택한후, Mueller-Hinton 한천배지에계대배양하였다. 순수한집락을취하여그람염색을실시하여그람음성만곡형의형태를확인하고, oxidase 양성, catalase 양성인지를확인하여, 모두양성으로판정되면 H. pylori로동정하였다. 동정된 H pylori 의분리주는 glycerol 이 20% 가첨가된 1% peptone broth에부유하여액체질소에냉동보관하였다. 3) Helicobacter pylori DNA 분리액체질소에냉동보관된 H. pylori 분리주를해동시켜 2m~ 의 brain heart infusion broth에접종, 35 0 C 에서배양, 균부유액 1 m~ microcentrifuge tube 5,000 rpm 4 0 C 5분간원섬분리, 상층액은버리고균침전물은 SE 완충액 (75mM NaCl, 25mM EDTA) 으로 1 회, 세척, 세척한침전물 200μ~ lysis 완충용액 (2mg of lysozyme per m~, 1M NaCl, 10mM tris[ph 8.0], l00mm EDTA, 0.5% sarkosyl) 으로 37 0 C 에서 30분간배양, 500μ 의 ESP 완충용액 (0.5M EDTA, 1 % sarkosyl, 1 mgf뼈 proteinase K) 으로 55t 에서 2시간 89

3 배양, 다시 RNase을 20μ예 mr 되게첨가 37 C 0 1 시간배양, 이용액에동량의 phenolfchlorofonnjisoamylalcohol (25:24: 1) 을넣고 12, 아 )() rpm 4 0 C 15분간원심분리, 상층액을취하고이과정 1 회반복, 다음 2 배량의 eth때 l과 1/10 양의 3M sodi뼈 acet따e 더하 여, -20 o C 에서하룻밤침전, 13, 아 )() rpm 4 oc 20분간원침, 침전된 DNA는 lmr 의 70% ethanol 세척, 즉시진공건조후 10α11 의 TE 완충액 (lot메1: tris[ph 8.0], lmm EDTA) 으로녹이고 uv 분광광도계로측정하 여 DNA농도를 5 Ong/μ로맞추었다. 4) UreA 유전자의중합효소연쇄반응 UreA 유전자의증폭을위해서는 Helicobacter pylori detection kit를이용하여증폭하고, 1.5% agarose gel을이용하여전기영동한후 325bp의 band 을확인하였다. PCR로부터얻어진자료로 RAPD 분석방법과동일한방법을사용하여각균주들간의 dendrogram을그려서균주들간의유사성및분자형을구하였다. 6) 유사도분석 RAPD profile은 band가있으면 1, 없으면 0 으로계수화하여 character matrix를작성하였다. 작성된정보를통계프로그램인 NTSYS-pc (numerical taxonomy system and mu1tivariate analysis system, version 1.51, Applied Biostatistics Inc, USA) Program을이용하여 Dice의 coefficient 법으로상사성지수 (similarity value) 를구하고 UPGMA (unweighted pairgroup arithmetic average analysis) 법으로군집분석을시행한다음 dendrogram을그려서균뜰간의유사성을표현했다. Ill. 결 과 5) Repetitive DNA sequence-based PCR (Rep-PCR) 시발체 BOXAIR (5 -CTACGGCAAGGCGACGCT- GACG-3 ) 사용, Taq Polymerase 2 unit, 10 X Reaction buffer 2.5μ, 만imer 50 pmol, dntps 2.5μ, 50mM MgCh 6.7μR, 10% DMSO 2.5μ, DH20 5.4따, Total 25μ9가되게하였으며, DNA를 1μM혼합후 microcentrifuge로약 5초동안 spin-down한후충분한 mineral oil을첨가, PCR반응 mixture의표면을덮었다 PCR의증폭은 Perkin-Elmer사 (USA) 의 GeneAmp PCR system 2400을사용, 이때 PCR의조건은초기변성 95 0 C 에 7 분, 90 0 C 1 분, 65 0 C 에 8분으로 30회변성, 최종 extension 65 oc 16 분. PCR반응은곧 -20 o C 로보관, DNA fmgerprint 형태의정확한비교분석을위하여순수분리된 DNA가필요, 1.5% agarose gel 에 loading 한다음 TAE 완충액 (4아빼 Tris-acetate, lmm EDT A, ph 8.0) 내에서 5v/cm로전기냥동을 8시간정도하였다. 이때전기영동후 gel 을 0.5μ예뼈 ethidium bromide로 20분염색하고증류수로 20분탈색하였다. 이 gel을 UV transilluminator 에옮겨증폭된 DNA 절편을확인하고 polaroid camera system을이용하여사진을촬영하였다. Rep- 1. H.!Jy/ori 으 분리및확인 소화가증상을가지고소화기내과에서내시경겸사를실시한환자 90명의위점막의조직으로부터 30 균주의 H. pylori을배양하여순수분리하였다. 분리된균주들은그람염색에서그람음성나선형의간균을보였으며, oxidase, catalase 양성을보였으며, 이들균주들은 PCR에서 325bp의 UreA 유전자를가지고있었다. 2. Rep-PCR 양상 250 bp 정도에서 5.0kb 사이에 ~ 의뚜렷한 띠를보였으며, 5.0kb에서대부분의균주가동일한띠를형성하였으며, 2 번과 3 번균주, 18-20번균주및 8 번과 17 번균주는매우유사한밴드양상을보였다 (Fig. 1). 90

~ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 ~ 1617 181920212223 2425 26 27282930~ 10αm 8.αm 6.αm 5.α)() 4.

$23 17 14 19 m 20 25 \3 9 22 w 15 10 V Fig. 2. Rep-PCR types and dendrogram of 30 H.$

4 ~ ~ ~ 10αm 8.αm 6.αm 5.α)() 4.αm 3.αm α)() l. 500 l.αm bp Fig. 1. Rep-PCR profiles of 30 H. pylori isolates using BOXAIR primer 빼빠- 때M l 2 nu 3 l-- L-l L-l H m \ w V Fig. 2. Rep-PCR types and dendrogram of 30 H. pylori isolates by REP-PCR. 91

5 3. Rep-PCR 아형의분류 5. 대상균주의유전적유사성 총 30 주 H. pylori 의 rep-pcr 분석결과 5 가지의형 (1- V) 으로분류할수있었다. 이를 dendrogram으로나타내면 Fig.2와같다. 대상균주들은유사성지수 0.4 에서한개의군집으로무리지어졌고, 유사성지수 0.5~0.6사이에서 5 개의형으로구분할수있었다. H 형이 10주 (33.3%) 로가장많았으며, 1 형, ill 형, V 형및 W 형이각각 7주 (23.3%), 7주 (23.3%), 3주 (10.0%) 및 3주 (10.0%) 였다 (Fig. 2). 대상균주사이의유사성지수의분포는 0.10에서 1.00로유전적으로다양하였다. 1 형에속한 7주의평균유사성지수는 0.59로다른형에비해유전적유사성이높았으며, 7주가속한 ill 형의평균유사성지수는 0.56 이고, II 형, N 형및 V 형의유사성지수는각각 0.55, 0.57 및 0.44로서대상균주전체의평균유사성지수는 0.54 이었고표준편차는 0.11 이었다 (Table 1) I I I I I I II I "Ü.5O α I I I I I I I I I I 찌 I I I I I I I I o I α) Table 1. Matrix of similarity values for 30 H. pylori isolates by Rep-PCR 없 lalysis N. 고화E 외 H. pylori 분리주의구분이나역학적조사를위 하여 특이한염기서열에대한 PCR 도시행되고있 분자생물학적인기술의발달로인하여이러한기 다. 특히일차시발체세트를사용하여일차 PCR 에 술이 H. pylori 검출진단에도도입되어획기적인 성과를거두고있다 ( 김, 1997). H. pylori 의경우, 16S rrna 유전자등이표적유전자로이용되며, 그 서생성된 DNA 절편에대한이차시발체세트를사 용하여이차 PCR 을시행하는 nested PCR 법을사용 하면예민도와특이도를더욱높일수있다고보고 92

6 되고있다 ( 신등, 1997). 또한 PCR 은검사에적은 균주들간의유사성및 분자형을구하였다. 대상균 시간이소요되어배양에서많은시간이요구되는데비해선속한진단법이라할수있다. PCR검사는여러가지제한점에도불구하고이검사만이갖는예민성, 정확성, 신속성으로인해현재사용하는 PCR 주사이의유사성지수의분포는 에서 으로 유전적으로다양하였다 (Table 1). 총 30주 H. pylori 의분석결과 5 가지의형 (1- V) 으로분류되었다 (Fig. 2). Rep-PCR도 H. pylori가유전적으로매우다 의 경우빠른진단보다는항생제치료후균의박 양함을알수있었다. 현재까지연구결과에의하면 멸여부를위한추적검사에유용할것으로생각된 다 ( 조등, 1998; 최등, 1997). H. pylori 의균주를구 분하기위하여 biotyping, serotyping 을많은연구가 H. pylori 는유전적다양성이다른세균에비하여높 다는것을확인되었으나이들을이용한체계적인 유전형을확립하는연구는널리이용되지않고있 있었으나분리주의균주를구분할수있을정도의 다. 따라서본연구에서수립한 RAPD 와 Rep-PCR 을 생물학적특징이나혈청형이다양하지않아역학적 이용한 H. pylori 의분자형은향후활발히전개된 연구에유용성이 없는것으로알려졌다. 따라서다 이균의유전적다양성연구및분자생물학적특성 양한분자생물학적인방법이최근에시도되고있으 구분에귀중한자료가될것으로사료된다. 며 H. pylori 의 genomic DNA 를분석하기위하여 Restriction endonuclease analysis (REA), PCR-based restriction fragment length polymorphism (RFLP), Pulse-field Gel Electrophoresis (PFGE) 등을이용한보고가있다 (Akopyanz et al., 1992; Foxall et al., 1992; Taylor et al., 1992; Yoshimura et al., 1993). 그러나이러한방법은결과에서판독까지많은시간이소요되고또한적절한 probe와염기서열에대한정보가마련되어야가능한방법들이다. 그에반하여 RAPD fmgerprinting은표적 DNA에대한정보가필요하지않고과정이단순하여많은시료를짧은시간에검사할수있는장점을가지고있다. 본실험에서도 H. pylori의분자형과유전적다양성규명을위하여 Rep-PCR 방법을이용하였다. 이방법은대부분의분자생물학적방법이그렇듯이설험전에충분한반복시험을통하여검사법의표준화를이루어재현성을확보하여야한다. Rep-PCR을위한 PCR 반응에서사용한시발체는 BOXA1R (5 -CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3 ) 를사용하였으며 agarose 전기영동후 ethidium bromide 염색으로한개이상의증폭된 DNA 절편이확인할수있었다. 각시발체들은 250 bp에서 5.0kb v. 결료를 본실험은위궤양조직으로부터분리된 H. pylori 의유전적다양성을규명하고자상부위장관질환의증상으로내원한 90명의환자로부터내시경을통하 여위점막으로부터 30균주를분리해냈다. 분리된 30균주는그람염색과생화학적검사등을통하여확인동정하였다. 위궤양조직으로부터분리된 H. pylori의유전적다양성을규명하고자 repetitive DNA sequence-based PCR (Rep-PCR) 을실시하였다. 소화기증상을보인 90 명의환자로부터내시경을통하여위점막으로부터 30균주를분리해냈다. 분리된 30균주는그람염색, 생화학적검사, PCR 등을통하여확인동정하였다. 순수분리배양된 30균주를대상으로 Rep-PCR을실시하였다. rep-pcr은시발체 BOXA1R (5 -CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3 ) 사용하였으며, rep-pcr의분석은상사성지수 0.5 부근에서 5 가지의분자형 ( 1 - V) 으로분리되었다. 대상균주의상사성지수의분포는 에서 1. 00까지분포하였으며, 유전적으로매우다양함을알수있었다. 사이에 2-107B 의 띠를보여대상균주들의유전적 결론적으로 rep-pcr 에지문분석은 H. pylori 의감 다양성을반영해주었다 (Fig. 1). Rep-PCR 로부터얻 염에 역학연구와임상적으로이용하면유용하라라 어진자료로각균주들간의 dendrogram 을그려서 생각된다. 93

7 VI. 잡고문흰 9. 김승준, 정인식, 오수혁. 국민학교학생과부모에 게서 Helicobacter pylori 의감염빈도. 대한소화기 1. Akopyanz A, Bukanov NO, Westblom TU, Kresovich S, Berg DE. DNA diversity among c1inical isolates of Helicobacter pylori detected by PCRbased RAPD fingerprinting. Nucleic Acids Res 20: , Foxall PA, Hu LT, Mobely JLT. Use of polyme~ rase chain reaction-amplified Helicobacter pylori urease structural genes for differentiation of isolates. J Clin Microbiol 30: , Lior H, Serologic characterization of Helicobacter pylori a provisional typing scheme. Ital J Gastroenterol 23(2):42, Taylor NS, Fox JG, Akopyants NS, Berg DE, Thompson N, Sham않 B, Yan L, Fontham E, Janney F, Hunter FM, Correa P. Long-term c이oni zation with single and multiple strains of Helicobacter pylori ass않sed by fmgerprinting. J Clin Microbiol 33: , Warren JR, Marshall BJ. Unidentified curved baci11i on gastric epithelium in active chronic gastritis. Lancet 1: , Yoshimura 班 -1, Evans DG, Graham DY. DNA DNA hybridization demonstrates apparent genetic differences between Helicobacter pylori from patients with duodenal ulcer and asymptomatic gastritis. Dig Dis Sci 38: , 김나영. 한국에서의 Helicobacter pylo까감염의진단과치료 예방. 대한의사협회지 40: , 김도영. 위생검조직에서중합효소연쇄반응을이 용한 Helicobacter pylori 감염의진단. 기학회지 29: , 1997 대한소화 병학회추계학술대회초록 8, 김학양. Helicobacter pylori와소화성궤양. 인간 과학. 18(8):17-25, 노임환. 한국에서의 Helicobacter pylori 감염, 대 한의사협회지 40(9): , 대한 Helicobacter pylori 연구회. 한국인에서의 Helicobacter pylori 감염의진단및치료. 대한소 화기학회지. 32: , 선연식, 임춘화, 정진홍, 최병권, 권계철, 구선 회, 박종우. 중합효소연쇄반응을이용한 Helicobacter pylori겸출. 대한임상병리학지 17(5): , 이광호, 이우곤, 백승철, 조명제, 최휴전. Helicobacter pylori의한무리항체생산및 Genomic Library 제작. 대한미생물학회지 26(4): , 조윤경, 정양숙, 임재영, 최명범, 박찬후, 우향옥, 오영균, 윤희상, 맹국영, 고경혁, 박철근, 백승철, 이우곤, 조명제, 이광호. 소아위생검조직절편을 이용한 H. pylori 감염진단에있어서 PCR 적용 한계. 대한소화기학회지 31: 16-22, 조윤정, 김대원, 박영태. 위생겸조직으로부터분 리된 Campylobacter pylori 세균학적성상. 상병리학회지 9: 145, 1989 대한임 17. 최태열, 강정옥, 박경남, 서일혜. 중합효소연쇄 반응을이용한 Helicobacter pylori 검출. 29: , 1997 감염 18. 홍수진, 박용순, 이영홍, 조영덕, 김진오, 봉형근, 조주영, 이준성, 이문성, 김연수, 황성규, 섬찬섭, 황승덕, 이희발. 소화성궤양환자에서 Helicobacter pylori 의 기학회지 29: DNA 지문분석. 대한소화 94

임상병리검사과학회지 : 제 31 권제 2 호 위궤양조직으로부터분리펀 Helicobacter pylori 의유전적다양성 광양대학임상병리과 서남대학교의과대학임상병리과 순천대학교생물학과 김양호 신명근백근식 성치남 Genetic Diversity of H

임상병리검사과학회지 : 제 31 권제 2 호 위궤양조직으로부터분리펀 Helicobacter pylori 의유전적다양성 광양대학임상병리과 서남대학교의과대학임상병리과 순천대학교생물학과 김양호 신명근백근식 ** 성치남 ** Genetic Diversity of H 임상병리검사과학회지 : 제 31 권제 2 호 1999. 위궤양조직으로부터분리펀 Helicobacter pylori 의유전적다양성 광양대학임상병리과 서남대학교의과대학임상병리과 순천대학교생물학과 김양호 신명근백근식 ** 성치남 ** Genetic Diversity of Helicobacter pylori Isolated from Ulcer Tissue Kim,