백색부후균의분자생물학적연구 유선화김명길이성숙노은운최형태최준원
발간사 최근화두가되고있는녹색성장을위해서는인간의삶에기본이되는환경과에너지문제를친환경적으로해결하는것이중요합니다. 서로상충되는문제를동시에해결하는것이쉬운일은아니지만우리는자연에서해결의실마리를찾을수있으며나무의리그닌성분을분해하는백색부후균의경우좋은예가될수있습니다. 비온후숲길을거닐다가나무그루터기에서발견할수있는버섯인백색부후균은나무성분의리그닌을분해하여오랜기간동안지구의탄소순환에중요한역할을하고있는소중한미생물자원입니다. 최근선진국들이주목하고있는 2세대원료인목질계바이오매스를활용한바이오에탄올생산에있어가장큰문제가되는것은나무의주성분인리그닌입니다. 이러한리그닌을효과적으로분해하기위해생명공학적기법을도입, 리그닌분해능이강화된형질전환백색부후균을만들어처리하면에탄올생산단가를획기적으로줄일수있습니다. 또한이들형질전환백색부후균은리그닌과구조가유사한환경호르몬도효과적으로분해하므로오염된폐수및토양의환경정화에도이용할수있습니다. 그러나백색부후균을식품인버섯으로써이용하고재배하는연구는오래전부터이루어졌지만분자수준에서의리그닌분해메커니즘이나형질전환과같은분자생물학적연구는상대적으로미진하여축적된정보와기술을얻기가쉽지않았습니다. 따라서국립산림과학원에서는식용버섯의재배기술이나품종개량과같은전통적인연구뿐만아니라 2005년부터분자생물학적접근을통해백색부후균의새로운가치를발굴하는연구를수행하였습니다. 백색부후균에서리그닌분해에관련된효소의유전자들을다량으로확보하고유용한유전자를삽입하여기능을강화시킬수있는형질전환기술을확립하였습니다. 본연구자료는국립산림과학원에서수행한백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절연구과제를통해확보된분자생물학적기술과관련자료를정리한것입니다. 백색부후균의분자생물학적연구의발전뿐만아니라친환경적목질계바이오에탄올생산과환경정화및복원산업의상용화를위한자료로활용되기를기대합니다. 2009년 9월 국립산림과학원장
목 차 제 1 장백색부후균의일반 3 1. 백색부후균이란? 3 2. 백색부후균의분류 3 3. 백색부후균의특성 10 가. 목재분해효소 11 나. 셀룰로오스분해효소 12 다. 헤미셀룰로오스분해효소 13 라. 리그닌분해효소 13 4. 백색부후균의이용 20 가. 리그닌분해효소에의한오염물질제거메커니즘 21 나. 페놀의분해메커니즘 22 다. 염료분해 23 라. Poly aromatic compounds(pahs) 분해 24 마. Chlorophenols 분해 25 바. Polychlorinated biphenyls 분해 25 사. TNT(2,4,6-trinitrotoluene) 분해 26 제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 31 1. 백색부후균의리그닌분해효소유전자분리및특성연구 31 가. Lignin 및 manganese peroxidase 유전자분리및특성구명 31 나. Laccase 유전자분리및특성연구 34
2. 백색부후균의리그닌분해효소재조합단백질생산 35 3. 백색부후균의형질전환발현벡터 36 4. 백색부후균을이용한내분비계장애물질분해연구 40 5. 백색부후균을이용한바이오매스전환 42 6. 형질전환을이용한백색부후균의분자육종 47 7. 형질전환을이용한백색부후균분자육종의전망 48 제3장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 53 1. 서론 53 2. 리그닌분해효소유전자의특성구명 54 가. 리그닌분해효소유전자의 full gene 확보 54 나. 리그닌분해효소유전자의 genomic DNA 분석 58 다. 리그닌분해효소의유전자발현특성조사 60 라. 리그닌분해효소특성조사 66 마. 겨울우산버섯의 cdna library 제작및전체적인발현유전자분석 67 바. Promoter 분리및특성구명 71 3. 백색부후균의형질전환체개발및분석 74 가. 형질전환방법확립 74 나. 형질전환용벡터개발 79 다. 형질전환체특성조사 84 라. 형질전환체의난분해성물질분해능분석 94 4. 결론 99 제 4 장참고문헌 105
제 1 장 백색부후균의일반 1. 백색부후균이란? 2. 백색부후균의분류 3. 백색부후균의특성 4. 백색부후균의이용
제 1 장백색부후균의일반 제 1 장백색부후균의일반 1. 백색부후균이란? 백색부후균 (White Rot Fungi, WRF) 은나무를구성하는물질을분해해서부후시키는목재부후균으로나무의구성성분중에서나무를단단하게유지시키는복잡한구조의리그닌 (lignin) 을분해하여나무가썩으면서하얗게변화되기때문에백색부후균이라칭한다. 주변에서쉽게볼수있는표고버섯이나느타리버섯등이백색부후균에속하며우리가식용으로먹는버섯모양은버섯의생활사중에서자실체라부르는열매와같은상태이며대부분은실모양의균사상태가나무나흙속에서자라면서나무의구성성분을분해하여영양분으로이용하며살아간다. 2. 백색부후균의분류 균류는종속영양성미생물로에너지원과세포합성을위해유기화합물을필요로하며, 수계및토양환경에서영양소의재순환에중요한역할을담당한다. 균류는주로균사를뻗어증식하는미생물로서세균에비하여나쁜환경에서도잘증식하는특징을가지고있다. 균류의주요분류군에해당하는담자균류 (basidiomycetes) - 3 -
는격벽 (septumm) 이있는균사를가지며종의증식과분산을위해담자기 (basidium) 라부르는구조의표면에담자포자 (basidiospore) 를형성하며다른균류가이용할수없는복잡한중합체를분해할수있는능력을갖고있다. 균류의계통분류학에대한방법은학문적인배경과발달과정에따라형태분류, 배양분류그리고계통분류로나눌수있다. 먼저형태분류는균류의형태및생활사를관찰하며, 배양분류는균류의배양특징과분화에따른유전현상및자실체의형성기작을연구한다. 그리고계통분류는구성물질의조성과유전정보의진화학적인의의를연구한다. 형태분류는거시적인자실체의외부형태와현미경적인미세구조의내부형태특징들을분류체계에이용하고있으며, 이와같은연구방법은발달된분류방법과축적된분류자료에의하여광범위하게응용되고있다. 자연상태의목재부후균류자실체는야외산림학자들이혹 (conk) 이라고부르며심재부후균류와변재부후균류에의한부후진행의지표로쓰이고있다. 옹이 (knot) 형성, 수지 (resin) 분비나손상조직탄화도목재부후의징후에해당하는데, 목재부후균류가항상표면에노출되는것은아니고침입초기에자실체를형성하는일은드물며, 낙엽진흙버섯 (Phellinus pini) 은바람에쓰러진나무나벌목통나무에자실체를형성하기도한다. 목재부후균류는근대까지포자를형성하는자실층의구조와자실체의전반적인형태를근거로하는 Fries의분류체계를사용하여왔으나최근에이르러는균사유형 (hyphal types) 에따른분류체계를비롯하여새로운분류기준의계속적인개발로현대에는분류체계가다양해졌다. 형태분류에비하면배양분류는원래 2차적인분류수단으로사용되어왔으며 20세기초반에시작된목재부후균류의순수분리와인공배양연구이래최근에이르기까지 Nobles 과 Boidin, Stalpers 등에의하여연구되어왔다. 균류의생장과정, 자실체형성, 생리현상, 그리고유전현상은실험실내의배양균류를관찰함으로써널리수행되고있으며, 균류의배양분류는균류분화연구에대한많은가능성을제시하고있다. 반면최근에주목을받고있는계통분류는형태분류나배양분류와같은관찰위주의연구방법에 - 4 -
제 1 장백색부후균의일반 서벗어나세포를구성하고있는아세포단위의분자특성과유전정보의진화학적인연구를주제로하는분석위주의분자생물학적인연구방법을이용하고있다. 이와같은아세포단위의분자에는세포벽, 단백질, 효소, 항체, 염색체, 핵산등이있으며특히그중에서도유전정보를지니고있는핵산의 G+C 염기조성분석, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 재결합조사, 제한효소분석법 (RFLP, restriction fragment length polymorphism), 핵산의염기서열및상동성비교, 그리고종간의유연관계분석등을통하여계통학적인의미를부여하는연구가널리진행되고있다. 유전정보물질은비교적안정하며일정한조성과기능을항상유지하고있으므로계통학적인연구에서는매우이상적인연구재료로사료되며, 최근에는급속히발달된정밀분석방법들이생명과학제반분야에적용되어원핵생물의경우종의분화와진화를규명하는데이미널리이용되고있다. 원핵생물뿐만아니라진핵생물에서도상당한분석자료들이발표되고있으나균류의경우는박테리아나동식물세포에비하여연구결과들이매우부족한편이며분류군에따라서는아직미개발분야로남아있는종류들도많다. 현대분류체계에서목재부후균류의분류학적위치는 Woese(1981) 의생물공통계통도에서진핵생물 (eukarya) 영역의균류계에속한다. 균류계에는 4개의문이있으며, 담자균문에속하는균류는일반인들에게잘알려진종류들이많고, 갓버섯류, 구멍장이버섯류, 꾀꼬리버섯류, 고약버섯류, 수염버섯류, 싸리버섯류, 말불버섯류, 방귀버섯류, 뱀버섯류또는찻잔버섯류와같은독특한종류들이주종을이루며, 세계적으로약 1만3천종이상의균류가보고되어있다. 대부분부생영양생활을하는부생균류로서섬유소, 리그닌, 및반섬유소를분해하여영양원으로이용하므로주로낙엽, 퇴비, 초원, 및산림이발달된곳에서식한다. 일부균류들은나무에질병을일으켜활엽수나침엽수에피해를주기도하지만적지않은수의균류가초본이나목본의뿌리와균근을형성하여공생하므로산림생태계유지에필수적인역할을담당하고있다. 또한일부균류는식용및약용자원으로널리애 - 5 -
용되고있으며, 최근들어균류의생리활성물질연구가각광을받고있다. 담자균문에는 4개의강이있는데, 전형적인목재부후균류는균심강 (hymenomycetes) 에속해있으며, 그중에서계통학적으로문제가많은민주름버섯목 (Aphyllophorales) 에집중되어있다. 계통학적으로담자균류는크게 8개의그룹으로나누어진다. 이들그룹중에서목재부후균류는구멍장이버섯계통분류군 (polyporoid clade) 과소나무비늘버섯계통분류군 (hymenochaetoid) 에주로분포되어있다. 갈색부후균류는백색부후균류보다더욱빠른속도로목재성분을분해하여이를이용하는데, 이는생장기간이짧고위도상으로높은한대지역과고도상으로높은고산지역의침엽수림에적응한결과로해석되고있다. 백색부후균류는담자균류에서계통분류군별로차이는있으나그물버섯계통분류군을제외한 8개계통분류군에두루나타난다. 갈색부후균류는구멍장이버섯계통분류군을중심으로 3개계통분류군에국한되어있어, 백색부후균류는계통학적으로원시유사성 (plesiomorphy) 을지닌반면갈색부후균류는백색부후균류가진화하는과정에서파생된형질의영양생활유형을지닌것으로보고있다. 그러나갈색부후균류는진화학적으로다계통 (polyphyly) 을이루는데이는영양생활전이과정에복잡한양상이개재되어있음을시사하며, 진화과정에서갈색부후영양생활은여러차례의변화과정을거쳐온것으로판단된다. 목재는자연계내에가장널리분포하는기질이지만매우복잡하고안정된구조를이루고있기때문에이를분해할수있는생물은주로목재부후균류에국한되어있다. 목재부후 (wood rot, wood decay) 는크게두분야즉살아있는나무의부후인심재부후 (heart rot) 와죽은나무나목재생산품의부후인변재부후 (sap rot) 로나누어생각해볼수있다. 목재부후는목질저하의원인이되는데이는목재부후균류들이효소를분비하고목재세포의세포벽을분해하여영양을섭취하므로목재무게와부피의감소, 목재열량의감소, 수분침투성의증가, 물리적경도 - 6 -
제 1 장백색부후균의일반 의약화, 펄프질의저하, 목재의변색등을일으키기때문이다. 목재부후균류는나무의상태에따라서살아있는나무의심재를부식시키면심재부후균류 (heart rot fungi), 죽어있는나무의변재와목재생산품을부식시키면변재부후균류 (sap rot fungi) 로불린다. 그러나예외적인종류도많으며잔나비불로초 ( 잔나비영지, 잔나비걸상, Ganoderma applanatum) 는느릅나무의그루터기에서변재부후균류로서식하지만기부나뿌리에서자라며심재부후균류로서식하기도한다. 목재부후균류는잘린상처, 불탄상처, 새가지및새뿌리를통하여건강한입목을감염시킬수있으므로심각한문제를야기한다. 또한, 부후특성에따라목재부후균류를세가지종류로나눌수있다. 연부후균 (soft-rot fungi) 은부드러운형태의부후를일으키며 Chaetomium globosum과 Daldinia concentrica와같은자낭균류들이이에속한다. 건조할때연부후균에의해서분해된목재는갈색의분해산물을생성하는갈색부후균 (brown-rot fungi) 에의해서분해된목재와흡사하다. 이균류는섬유소 ( 셀룰로오스 ; cellulose) 와반섬유소 ( 헤미셀룰로오스 ; hemicellulose) 를광범위하게이용하지만리그닌 (lignin) 은제한적으로이용한다. 세번째는대부분의목재부후균인백색부후균 (white-rot fungi) 으로부후재의외관의색이바랜다든지하얗게변화되기때문에백색부후균이라칭한다. 갈색부후균과는대조적으로자연계에서는활엽수재에서많이발생한다. 이균류는섬유소와헤미셀룰로오스뿐만아니라리그닌도분해하며이들세성분의분해비율은균의종류, 수종, 부후의진행상황등에의해차이가있지만부후가진전된목재에서는세성분이대략같은비율로분해되고있다. 목재부후균류는목재를분해하는효소의유형에따라나누기도한다. 목재부후균류는목재의주성분인섬유소 ( 세포무게의 50~70%) 를분해하는 cellulase를분비한다. 백색부후균류는목재의다음주성분인리그닌 ( 세포무게의 10~20%) 을분해하는 lignase 를분비한다. 단지섬유소만을분해하고갈색목재성분을남기는균류를갈색부후균류그리고섬유소와리그닌을모두분해하여백색목재잔여물을 - 7 -
남기는균류을백색부후균류라고부른다. 목재부후는진행되는유형에따라서다시세분할수있는데갈색부후는노끈모양의잔여물을남기는노끈갈색부후 (stringy brown rot), 구멍을내는구멍갈색부후 (pocket brown rot) 및목재를조각으로만드는조각갈색부후 (cubical brown rot) 로나누어지며, 백색부후도노끈모양의잔여물을남기는노끈백색부후 (stringy white rot) 와구멍을내는구멍백색부후 (pocket white rot) 로나누어진다. 흥미롭게도갈색부후균류는주로침엽수에서식하며, 백색부후균류는주로활엽수에서식하는숙주지향적경향이있다. 갈색부후균류는백색부후균류에비하여상대적으로숫자가적다. 현재목재부후담자균류의알려진숫자는 8,700종에이르며이중에서갈색부후균류는단지 200종에불과하다. 북미의경우목재부후균류의 6% 에해당하는 120종이갈색부후균류이며이들중 85% 가침엽수에서식하고약 65% 에이르는 79종이구멍장이버섯류 (polypore) 이다. 나머지목재부후균류는여러과 (family) 에분산되어있는데이러한현상은수평진화 (parallel evolution) 의결과로생각되며갈색부후균류의효소체계는진화계통별로독립적으로발전하여왔고이들종은형태학적으로가까운유연관계를지니고있으나계통학적으로항상가까운것은아니다. 백색부후균은목재세포벽의부후양태에따라동시분해형 (simultaneous rot) 과선택분해형 (preferential white rot) 으로구분하기도한다. 즉섬유소 ( 셀룰로오스 ; cellulose), 반섬유소 ( 헤미셀룰로오스 ; hemicellulose) 및리그닌 (lignin) 을동시에분해하는형과다당류의분해에앞서리그닌만을우선적으로분해하는선택분해형으로나누기도하며대부분의백색부후균은동시분해형에속한다. 백색부후균은주로목재의세포내강에서성장하며부후초기에균사가다수존재하고부후말기에는균사의수가줄어든다. 백색부후균은세포내강에서균사로부터분비된효소에의해세포벽을파괴시키는데부분적인차이는있지만전체적으로 S3층부터 S2, S1층으로차례로공격이진행되며세포벽은내강측으로부터점차얇아진다. 리그닌함유율이높은세포간층도공격을받기때문에부후재는섬 - 8 -
제 1 장백색부후균의일반 유상으로풀리기쉽게된다. 백색부후균에의한세포벽의분해는주로균사근처에서발생된다. 갈색부후균과는달리파괴되는부분은균사와근접되어있는데, 이와같은차이는양자의효소계의차이에의한것으로생각되어진다. 섬유소는만개의 glucose 단위분자가 β-1,4 결합으로이어진다당중합체사슬로서미세섬유구조로엮어져있으며, 다시수소결합에의하여교차결합되어있는조직화된결정체부분과비결정체무형부분으로되어있다. 반면리그닌은섬유소기질의비결정체무형부분에침투하여섬유소와결합된형태로채워져있으며 phenylpropane 기본구조에다수의결합구조를지닌복잡한중합체를이루고있다. 또한 glucose, galactose, mannose와같은육탄당과 arabinose, xylose와같은오탄당이결합하여이루어진반섬유소 (hemicellulose, 세포무게의 10~20%) 분자는무형기질내에리그닌과혼합되어있다. 섬유소, 리그닌, 반섬유소가목재구성의 95% 를차지하고나머지부분은녹말, 페놀, 펙틴및미네랄이차지하고있다. 이중페놀은다양한구조의방향족화합물로서목재로하여금향기, 색깔, 및부후내성을지니게한다. 이와같은목재성분을이용하려면섬유소-리그닌복합체를침투하고이를분해하기위하여체외분비효소들을생산하는균류만이가능하다. 섬유소만을분해하는균류는다수있으나섬유소와리그닌이결합된구조를분해하는균류는목재부후담자균류와소수의자낭균류에제한되어있다. Cellulase 에는두가지종류가있는데 endocellulase 는긴섬유소사슬을무작위적으로잘라다양한길이의섬유소사슬파편을만드는반면 exocellulase 는섬유소사슬말단에서 glucose 두개분자를체계적으로잘라나가며그결과이당류 cellobiose 를만든다. Lignase 는리그닌중합체를자르고 phenylpropane 분자를산화시키는데리그닌 peroxidase (LiPs), 망간 peroxidase(mnps) 및 laccase가메칠기제거, 고리구조분해및알코올기산화에관여하며또한 tyrosinase 의존재유무는배양분류학적의미를지닌것으로알려져있다. 반섬유소는섬유소미세섬유가효소작용을받기전에먼저 - 9 -
분해제거되며백색부후균류가활엽수기주그리고갈색부후균류가침엽수기주를 선호하는데연관되어있는것으로생각되고있다. 3. 백색부후균의특성 백색부후균은나무자체를영양원으로살아가기때문에나무의세포벽을구성하고있는고분자물질을저분자물질로만들어영양대사에사용한다. 이같이분해를위해부후균은균체외효소 (extracellular fungal enzymes) 를분비한다. 효소는생물이생성한생체촉매로서무기촉매와다른점은기질에대한특이성을나타낼뿐아니라상온, 상압그리고중성 ph에서도생화학반응을원활히촉진시킬수있다. 백색부후균의부후특성을살펴보면생태계에서식물세포벽의셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, carbohydrates, glycerol 등의탄소원을이용하기위하여리그닌분해라는 cometabolism 을수행하는것으로알려져있다. 셀룰로오스의분해는 fungi에 glucose 를제공하는역할을하는데당류계통이순환지않을경우 (nitrogen, carbon, sulfur limitation) 에는 starvation이일어나게되고이는 1차주요 (primary) 기작에서두번째 (secondary) 기작으로전이하게된다. 리그닌은단지 2차기작에서분해되며이때리그닌의분해에주요한역할을하는것은 ligninolytic enzyme 이다. 이러한기작을통해리그닌이분해되면나무내부에있는 cellulose 를분해하여실제기질공급에의해서영양순환이원활해짐에따라다시 primary 기작으로전환되어리그닌분해효소의공급이중단된다. 따라서 nitrogen, glucose, carbon limitation 등 ( 영양결핍상태형성 ) 과같은기질특성을적절히활용한다면리그닌분해기작효율을증대시킬수있을것이다. - 10 -
제 1 장백색부후균의일반 가. 목재분해효소 효소는단백질 (protein) 이주성분으로써 polypeptidechain 이입체적으로접혀져서구형상을이루고있다. 이러한부위를활성중심부 (active center) 라부른다. 대부분의효소단백질은아미노산으로만구성된단순단백질이나효소의종류에따라서는탄수화물, 인산, 지방질, 금속이온또는저분자유기물이결합되어있는것이있다. 이와같이효소가단백질부위와결합되어있는경우이효소를 holoenzyme 이라부른다. 이때효소의단백질부위를 apoenzyme 비단백질부위를보조인자 (cofactor) 라부른다. 보조인자는유기분자가될수도있고금속이온이될수도있다. 이효소의두부분은효소가활성화되기위해서는필수적인요소가된다. 효소의중요한특징은한정된기질에대하여한정된반응만을촉매하는특이성 (specificity) 이다. Cellulase 에비해 ligninase 는기질에대한특이성이다른효소에비해낮다는특징을가지고있다. 효소는또한대부분이상온, 상압그리고중성 ph에서최고의능력을발휘한다. 즉효소는생리적조건하에서만작용한다. ph의경우효소는한정된범위의 ph에서만그작용이가장강하며그범위를넘어설때는작용이약해진다. 또한일반화학반응에서는온도가높아질수록그반응이빨리진행되나, 효소는어느온도까지는반응속도가빨라지지만어느온도를넘어서면반응속도는감소하여결국반응이전혀진행되지않게된다. 이것은효소가단백질이기때문에고온에서는입체구조가파괴되어촉매작용을소실하기때문이다. 반응속도가최대일때의온도를최적온도라고하며대부분의효소의최적온도는 50 이하이다. 따라서효소를취급할때는변성 (denaturation) 이일어나지않도록가능한저온에서산이나알칼리와접촉하지않도록세심한주의를기울일필요가있다. 효소는또한여러물질에의해유도되고억제된다. 이와같이효소반응생성물을배지중에첨가할경우그효소의생성이억제되는대사조절기구를 feedback 억제라일컫는다. 또한대사경로의최초의반응을촉매하는효소의활성 - 11 -
이그경로말단의생성물에의해특이적으로저해를받는바이와같은현상을이화대사산물억제 (catabolite repression) 라부른다. Cellulase 는 glucose 가탄소원으로존재하면그효소의합성이억제되는것이그예이다. 이것은과잉의산물이축적되면그물질의합성을억제하여세포내의물질농도를적절히유지시키기위한대사조절기구이다. 효소는이상에서보는바와같이그생성량을조절할뿐아니라효소합성을조절하는기작이존재한다. 나. 셀룰로오스분해효소 Cellulase, 즉셀룰로오스분해효소는섬유소중의 β-1, 4 glucoside 결합을가수분해하는효소를총칭한다. 섬유소를분해하는미생물은많이있지만결정성섬유소를완전분해하는미생물은비교적제한되어있다. 섬유소를완전분해하는미생물로는 Trichoderma reesei 또는 Trichoderma viride, Humicola insolens, Aspergillus niger 등과같은자낭균과 Phanerochaete chrysosproium, Schnizophyllum commune, Irpex lacteus 같은백색부후균등이있다. 이들미생물들의공통점은결정성섬유소를분해하기위해여러가지의성질이다른섬유소분해효소를균체외로분비하여이들효소의작용에의해결정성섬유소가완전분해되는것으로알려지고있다. 섬유소는 glucose 만으로구성된 homopolysaccharide 이지만이것이효소적으로분해되어최종산물인 glucose 가되기위해서는최소한 3종의섬유소분해효소가작용해야한다. 즉 cellobiohydrolase, glucanohydrolase, 그리고 cellobiase가있다. 따라서섬유소분해효소는단일효소체계가아닌복합효소 (complex enzyme) 에속한다. 그럼에도불구하고이효소의존재형태, 구조및기능등은미생물의종류에따라크게다르다. - 12 -
제 1 장백색부후균의일반 다. 헤미셀룰로오스분해효소 헤미셀룰로오스는여러종류의당이다양하게결합하는양식을지니고있는 heteropolymer 라는점에서 cellulose 와차이가있다. 또한수종에따라주구성성분이다르다. 활엽변재는주로 glucuronoxylan 으로구성돼있는반면침엽변재는 glucunomannan 이헤미셀룰로오스의대부분을차지하고있다. 따라서 hemicellulose 를가수분해시키기위해서는다양한결합과성분에활성을갖는효소가필요하다. 즉 xylan을분해시키기위해서는 xylanase, mannase, β-xylosidase, α -galactosidase, α-glucuronidase, acetylesterase 가필요하다. 이중에서도중요한것은 endo형의 xylanase 와 mannase 이다. 이효소들에의한분해양식은 cellulase 에의한셀룰로오스의분해양식과유사하다. 라. 리그닌분해효소 리그닌은셀룰로오스헤미셀룰로오스와함께지구상에축적되는유기물중가장많은양을차지하고잘분해되지않는목재유기물의주성분을이룬다. 식물의중요한구성요소로서식물의 2차세포벽에존재하며식물의나이와목질조직이증가함에따라그함량도증가한다. 생물권에서 aromatic carbon 의대부분을차지하며이러한 aromatic 물질들은 polysaccharide filament 와 fibers 사이에서아교제역할을함으로서살아있는유관속식물에서조직의견고함과강도를유지하는역할을하며식물의물수송과미생물분해에대한저항성을부여하기때문에중요하다 (Monties and Fukushima, 2001). 식물의생존에리그닌이중요한역할을하는동시에리그닌의생분해가탄소원순환에있어중요하며 (Crawford, 1981) 또한종이, 동물의사료, 연료의생산과같은산업적가공과정에서 lignoncellulosic material 의효율적인이용에있어큰방해요인이되기때문에리그닌의생분해에대한관심이높아졌다 (Eriksson, 1990). - 13 -
( 그림 1-1) 리그닌 polymer의구조 (Glazer 1995, http://en.wikipedia.org/wiki/file:lignin_structure.svg#filehistory) 리그닌의화학구조는명확하지않으나 C 12 H 24 O 11 과 C 40 H 45 O 18 사이로추정되고있고 phenylpropanoid polymer로 pcoumaryl(p-hydroxyphenyl propanol), coniferyl(guaiacyl propanol), sinapyl alcohol(syringyl propanol) 과같은 phenolic precursor 로부터효소반응이아닌페놀과자유라디칼이관여하는화학반응에의 - 14 -
제 1 장백색부후균의일반 해무작위적으로합성된다 (Tuor, 1995). 이는탄소-탄소 (C-C), 에테르 (C-O-C) 결합과같은최소한 12가지의다른결합으로이루어진매우복잡한화합물로서 ( 그림 1-1), 세포외적인 (extracellular) 산화기작에의한탈중합화를필요로하기때문에일반적인효소로는분해되기어려우나 (Crawford, 1981; Eriksson, 1990; Kirk and Farrell, 1987) 일부의사상성진균류특히백색부후균은리그닌의분해능이높은것으로보고되었다. 백색부후균에의한리그닌과오염물질분해시생산되는리그닌분해효소로는 lignin peroxidase(lip), maganese-dependent peroxidase(mnp), laccase 등이있으며, 이들효소는균류의종류에따라다르게나타나며분비된효소에따라기능에있어차이를나타낸다. LiP은 class Ⅱ peroxidase 에속하고다양한백색부후균에서분비된다. 대부분 340개의아미노산으로구성되어있으며약 40 kda의분자량을갖는 heme protein으로서 hydrogen peroxide(h 2 O 2 ) 의존재하에서리그닌분자의비페놀부위 (non-phenol residues) 로부터하나의전자를방출시켜양이온라디칼 (radical) 을만들고, 이러한라디칼은산화반응으르통하여궁극적으로리그닌을산화시키고탈중합화시킨다. 이에비하여 MnP와 laccase 는단지리그닌의페놀부위 (phenolic residuse) 를산화시킨다. MnP는약 46 kda의분자량을가지며 H 2 O 2 의존재하에서 Mn(Ⅱ) 를 Mn(Ⅲ) 로산화시키고, 산화된 Mn(Ⅲ) 는리그닌의페놀부위를산화시킨다 (Wariishi, 1991). MnP는 LiP과같이 heme glycoprotein 이며매우높은상동성을갖는다. LiP은 1983년 Tien 과 Kirk에의해 Phanerochaete chrysosporium에서처음으로발견되었고 heme 구조를갖는당단백질 (glycoprotein) 효소이며 38,000~43,000 dalton 사이의분자량을갖는다. LiP의촉매반응은 hydrogen peroxide(h 2 O 2 ) 를필요로하며리그닌분자의비페놀부위 (non-phenol moiety) 로부터하나의전자를방출하여양이온의라디칼을만들고이러한라디칼은산화반응을통하여리그닌을 - 15 -
산화 (oxygenation) 시키고탈중합화 (depolymerization) 시킨다. LiP은리그닌뿐만아니라화합물과직접적으로산화반응하여화합물의탄소와탄소사이의분해, benzolic alcohol oxidation, demethylation, hydroxylation 그리고 dimerization시킨다고알려져있다. LiP은주로질소, 탄소그리고황과같은영양원이고갈되었을때생산되므로질소원이제한된조건에서의 peroxidase 생산과환경오염풍부할경우 phenanthrene 등의방향족화합물의분해가감소하게되며이외의연구에도유사한결과가보고되었다. MnP는 LiP와마찬가지로리그닌을분해하는공통된 peroxidase 로중요한역할을하며 heme을포함하는당단백질로 38,000~62,500 dalton 정도의분자량을갖고페놀성물질과같은유기성기질을산화할수있는효소로서리그닌및 lignin model compounds 의산화에관여한다. MnP의반응 mechanism 은유기성기질의산화에 Mn(Ⅱ) 를필요로하는것을제외하고는 LiP과유사하다. MnP에 Mn(Ⅱ) 는 one-electron donor 로작용하여 Mn(Ⅲ) 로산화되고, 산화된 Mn(Ⅲ) 는 phenolic substrate를 phenoxyl radical로, amines substrate를 amino radical로, certain non-phenolic aromatic substrate를 aryl cation radical로산화시키는반응을한다. 다른백색부후균은리그닌분해에관련된효소를생산하는데있어서 MnP와 LiP, MnP와 laccase 및 LiP과 laccase 등과같이생산하지만 Trametes versicolor는 MnP와 LiP을생산하는그룹에속하지만 laccase 또한생산한다. 이러한그룹에속하는균류는특히리그닌분해에탁월함이잘알려져있다 (Hatakka, 1994). 리그닌분해는복잡한과정에의해일어나며이러한효소들에의한시너지효과에의해분해되는것으로알려져있다. MnP 생산은몇몇담자균류에의해생산이보고되었으며 (Cairney, 1998), Coriolaceae, Polyporaceae 및 Tricholomataceae 같은 soil-litter colonizer들도생산하는것으로알려졌다. 게다가 sea grass(raghukumar, 1999) 와 brown coal(willmann and Fakoussa, 1997) 과같은 exotic 환경에서도 fungal MnP가생산된다. - 16 -
제 1 장백색부후균의일반 MnP와 LiP에대해가장많이연구된것은 P. chrysosporium으로써이균주에서 LiP와 MnP가보고된이래로 (Tien and Kirk, 1983) 몇가지 isozyme들이균주뿐만아니라다른백색부후균에서도보고되었다. T. versicolor가생산해내는 MnP 는 LiP과유사하며 multiple form으로생산된다. Johansson 과 Nyman(1993) 은이균주에서 5개의 MnP와 6개의 LiP을분리하였으며 chromosome 상에서매우가깝게연관되어있고, 동시에전사가이루어짐을보고하였다. Iron heme 단백질인 MnP는 guaiacol(2-methoxy phenol), vanilly alcohol (4-hydroxy-3-methoxybenzyl alcohol) 과같은다양한페놀기질과 o-dianisidine (3, 3'-dimethoxybenzidimethoxybenzidine) 과같은아민이나 dye의산화는 Mn 2+ 가존재시에만 H 2 O 2 에의존적으로촉매된다. MnP의 catalytic cycle은 horseradish peroxidase(hrp), cytochrome C peroxidase와같은 heme peroxidase나 LiP과비슷하고반응중간산물인 compound Ⅰ과 Ⅱ를만드는 native ferric 효소도포함된다 ( 그림 1-2). 하지만다른 peroxidase 와는다르게 MnP는전자전달체로써모든 lignocellulose 나토양에존재하는 Mn 2+ 를이용하여 autocatalytic cycle은 native ferric 효소의 organic peroxide나 H 2 O 2 의결합에의해시작되며 iron-peroxide complex 를만든다. Peroxide oxygen-oxygen 결합의분해는 heme으로부터 2개의전자가전달되어 Fe 4+ -oxo-porphyrin-radical complex인 MnP complex Ⅰ이형성된후 dioxygen band는가수분해되고 1개의물분자가방출되고 MnP compound Ⅱ(Fe 4+ -oxo-porphyrin complex) 를만든다. Monmchelated Mn 2+ 이온은이러한반응중간산물인 porphyrin 의전자전달체로서작용하여 Mn 3+ 로산화된다. Compound Ⅱ의환원도이와비슷하게일어나며 Mn 3+ 가 Mn 2+ 로부터생성되어 native 효소의생성과동시에물분자가방출된다. 반면에 MnP compound Ⅰ은 LiP과 HRP와비슷하며 Mn 2+ 이온은 ferrocyanide 나 phenolics 등에서제공되는전자전달체에의해환원된다. MnP compound Ⅱ는매우천천히환원이일어나며 - 17 -
이과정에서도 Mn 2+ 이온이필요하다. 형성된 Mn 3+ 이온은 oxalate 와같은 organic acids 에의해서안정화되어 redoxmediator 로써의역할을수행한다. ( 그림 1-2) MnP 의 catalytic cycle(hofricher 2002) Carboxylic acids(oxalate, malonate, malate, tartrate, lactate) 를갖는 Mn 3+ 의 chelates 는다양한기질의전자 1개를산화시킨다 ( 그림 1-2). 페놀과 amino-aromatic compounds 는 1개의수소가제거되어페놀기와아미노라디칼을생성한다. Tetramethoxybenzene 이나 anthracene 과같은낮은환원전위를갖는비페놀 aromatic substances 는 1개의전자가제거되어 aromatic ring을생성하며일부는 aryl cation radicals 을생성한다. 이러한라디칼은 autocatalytic reaction 을일으키는 peroxide 의 source 로이용되고, H 2 O 2 가없을시 MnP에의해사용된다 (Kuan and Urzuau, 1993). - 18 -
제 1 장백색부후균의일반 ( 그림 1-3) MnP 의기질과형성되는 radical(hofricher 2002) 리그닌분해효소군의세번째인 laccase 는약 55,000~90,000 dalton의분자량을가지며 carbohydrate 를포함하는당단백질이다. 또한구리를포함하고있는 phenoloxidase 로서분자 4개의구리이온을갖는데결합된구리는분광학적특성에따라 3가지 type으로구분될수있다. Type 1(blue) Cu 2+ 이온은가시광선의파장인 610 nm에서흡광도를나타내고 type 2(normal) Cu 2+ 이온은어떤분광학적흡광도도나타내지않으며 type 3(coupled pair) Cu 2+ 이온은자외선에가장가까운파장인 330 nm에서강한흡광도를보인다. Laccase 에의한기질산화는자유라디칼을형성하는 one-electron reaction으로 aromatic nucleus에서하나의전자를산 - 19 -
화한다고일반적으로알려져있다. 최근에는 Mn 2+ 가있을경우 laccase 의 chelator 로작용하여 laccase 와 MnP의반응이촉진된다고보고되었다. 이러한 laccase 의알려진생물학적기능으로는 lignin peroxidase, manganese dependent peroxidase 와함께 lignin을분해한다고알려져있다. 특히넓은기질범위를가지며 phenolic compounds의 polymerization, depolymerization 그리고 methylation 또는 demethylation 을촉진하는역할을한다. 4. 백색부후균의이용 오염된토양을정화하는데있어생물학적회복 (bioremediation) 기술을사용하는것은경제적으로도매우유용하다. 뿐만아니라오염물질및이들의분해과정에서생성되는독성이강한분해산물들이그들의분해에관여하는미생물의생물량 (biomass) 내로동화되어대사물질 (metabolite) 로전환되기때문에오염원을환경친화적인형태로전환할수있다는큰장점이있다. 이러한생물학적전환은결국그에관여하는효소가있어야함을의미하며이런효소는생물학적으로토양회복을하는데사용될수있다. LiP, MrP, MnP, laccase 및 niroreductase 등의난분해성물질의분해에관여한다고알려진효소들은난분해성물질의전환에있어생물학적인촉매로작용함을알수있고이것은이효소를생물학적회복에이용할수있는가능성을마련하는기초가될것이다. 그중 laccase 는 mediator 라불리는작은분자량을갖는화합물이존재할때더많은 aromatic lignin model compounds 를산화할수있다고알려져있다. 최근에는공통적으로 laccase-mediator system이라불리는이반응으로오염된토양이나지하수그리고 pulp deligninfication, 직물염색표백, 유기물의합성과같은산업적적용을처리하기위한방법으로고려되고있다. Bioremediation 은대중의인식과지지성이높고어떤방법은 - 20 -
제 1 장백색부후균의일반 성공률이높으며성공적인경우생물복원비용면에서매우관심을받고있는분야 이다. 하지만여러가지단점을가지고있어앞으로단점을보완하기위한추가적 은연구와이에대한지속적인관심이요구되어야한다. 가. 리그닌분해효소에의한오염물질제거메커니즘 백색부후균은 lignin과분자구조가유사한 aromatic compound 들을분해할수있는데그종류와분자구조에따라그리고백색부후균에서분비되는효소에따라분해효과와메커니즘이다양하다. 백색부후균에서오염물질분해에주도적인역할을하는대표적인 enzyme은 LiP(Lignin Peroxidase) 와 MnP(Manganese Peroxidase) 가있다. LiP는산화제로 H 2 O 2 를필요로하는 heme-containing glycoprotein 구조로되어있기때문에 LiP에반응하는양이온라디칼의형성과정을통해 nonphenolic 리그닌구조를산화한다. MnP와같은경우는 Mn이온을 redox 매개체로이용하여 phenolic compounds, polymetric dyes, lignin model compounds, amines등을산화시킨다 (Tour, 1995). 리그닌분해효소메커니즘은완벽하게규명된것은아니지만 LiP, MnP, laccase가주요효소임이관찰되었다. 이러한효소의작용은물질에대해매우비선택적이기때문에다양한물질에대해반응을하며효소에의한여러가지물질들의그분해메커니즘은매우유사하다. 대체로효소는 H 2 O 2 나 Mn(II) 와의전자교환을통해산화가이루어진후오염물질분해에활성을갖는경우와물질과의직접전자교환을이루는경우로나뉘어진다. 전체적으로효소에의한오염물질산화과정에있어서전자교환을통한산화과정의경우효소는하나의 cycle을갖는데일단전자에서반응성이없는휴지기의효소는다음반응식과같이 H 2 O 2 로부터전자 2개를얻어서 compound Ⅰ로산화된다. Compound Ⅰ은한개의전자를이용하여오염물질을산화시키고 compound Ⅱ로전환한다. Compound Ⅱ - 21 -
는남은한개의전자를이용하여또다른기질을산화시키고휴지기의상태로돌 아감으로써반응회로를형성하게된다. 이와같이효소에의한산화과정을촉진시 키기위하여별도의 H 2 O 2 를주입하는경우도있다 (Tonon and Odier, 1988). ferric peroxidase + H 2 O 2 compound Ⅰ + H 2 O (Resting Form) (2 개의전자가산화된상태 ) compound Ⅰ + A - compound Ⅱ + A compound Ⅱ + A - ferric peroxidase + A 이러한전자교환을통한산화과정과직접산화의두가지과정을통한오염물질 의제거메커니즘은다음의각각 phenol 과염료의분해과정을예로들어볼수 있다. 나. 페놀의분해메커니즘 페놀의산화과정은중개물질 (mediator) 로서 VA(veratryl alcohol) 를이용하는것을제외하고는앞서말한오염물질분해과정과유사하다. 그림 VA가 LiP에의해먼저 VA + 로산화되고그다음에 VA + 가 VA로다시환원되는과정에서페놀이 phenoxyl radical 로산화된다. 모든페놀이산화된후에 VA + 는 Compound Ⅲ를 Ferric enzyme으로되돌리는데사용될수있다 ( 그림 1-5). 이때 mediator로사용되는 VA는산화과정을통해 veratryl aldehyde 로산화하는경향을보이는데페놀합성물질이산화되는동안 VA의 veratryl aldehyde 산화과정은억제된다고한다. 이것은 VA의산화력보다페놀과 LiP효소간친화력이높은데기인한것이며따라서 VA가높은농도로존재하고있더라도페놀합성물질은우선적으로산화된다고할수있다. 그러므로오염물질분해촉진제로서 VA을사용하는방안들이제시되고있다 (Faison, 1986). - 22 -
제 1 장백색부후균의일반 ( 그림 1-5) Phenol 의대사과정 (Faison, 1986) 다. 염료분해 백색부후균에관한연구에서주로적용된염료는 azo dyes이다. Azo dyes는산업에서가장널리쓰이는염료로서일반적으로미생물에의한분해가어렵다. Azo dyes의색도제거에주요한반응이되는효소는 LiP, Laccase 등이며다양한균주에서색도제거에효과적인것으로나타났다 (Fu and Viraraghavan, 2001). 염료의효소에의한분해는효소의직접적인작용에의한것이다. LiP에의해바로산화될수있는물질에는 PCBs, PAHs, cyanaid, benzo(a)pyrene, dibenzodioxin 그리고다양한염료들이있다. 이중 LiP에의한염료 (azo dye) 의분해과정은다음과같이이루어진다. Azo dye중대표적인한가지로 1-(4`-acetamidophenylazo)-2-naphthol 의분해과정을보면그림 1-6과같이나타낼수있다. 먼저 LiP는 dye의 phenolic 고리로부터두개의전자를얻는다. 그로인해 phenolic 고리에는불안정한 carbonium 이온이발생한다. 이것은물과반응하여 naphthoquinone 과불안정한 phenyldiazene 로나뉘어진다. 이중불안정한 phenyldiazene 은산소분자와반응하여 OOH를발생하고 N은 N 2 가스로분해되고, 결과 - 23 -
적으로주위의수소에의해안정화되는과정을거치게된다. 이것처럼어느정도 그중간과정이밝혀진경우도있지만아직까지는모든염료의반응과정이완전히 알려지지는않은상태이다. ( 그림 1-6) 1-(4`-acetamidophenylazo)-2-naphthol( 염료 ) 의대사과정 (Stolz, 2001) 라. Poly aromatic compounds(pahs) 분해 Poly aromatic compounds 는백색부후곰팡이에서분비되는 LiP 효소에의해 주로분해되는물질이다. 리그닌의분자구조가유사한 poly aromatic compounds 의효소에의한산화물은 quinone type product 형태를띠게되는데이러한오염 - 24 -
제 1 장백색부후균의일반 물질제거성능을개선하기위해반응의중간재로서 veratryl alcohol을주입하는경우가있는데 veratryl alcohol 이 LiP의효소반응촉매역할을하는것으로알려져있다. PAHs 계열오염물을잘분해하는균주로는이미잘알려진 Phanerocheate chrysosporium이있으며 Trametes versicolor, Chrysosporium lignorum, Pleurotus ostreatus 와 Coriolopsis polyzona의균주들또한 PAHs 분해효과가탁월한것으로나타났다. 마. Chlorophenols 분해 Paper mill effluent에주로분포하는오염물질로서 chlorophenol 은 LiP, MnP 효소에대한주요기질로도적용된다. PCP와같은오염물질은독성을띄기때문에내성이있는균주의선택이필요한데 T. versicolor가높은 PCP 의농도에서도성장에제한을받지않는것으로나타났다 (Allenman, 1992). PCP 오염물질제거에적용가능한균주들로는 P. chrysosporium, T. versicolor, Inonatus dryophilus 등이있다. Bleach plant effluents 해당오염물은주로펄프나제지산업폐수가많이존재하고여기서는 MnP 효소가중요한역할을하며 LiP는보조역할만하는것으로나타났다. 바. Polychlorinated biphenyls 분해 산업에서다양하게이용되는유기물로써분자량이작은 PCB 계통오염물의경우호기성미생물에의한분해가가능하지만분자량이큰경우는분해가어려울뿐만아니라 chlorinated solvent 와같이혐기상탈염소반응에의한것도어려운물질이다. 이러한오염물질에관한최근연구에의하면 P. chrysosporium이높은농도 (10 ppm) 에서도잘제거되는결과를보여주었다. 또다른연구에서는다양한 - 25 -
종류의백색부후균에대해 PCP의민감성에대해연구하였는데이들을한천배지에서배양하였을때그중 18종에서 10 mg/l 농도의 PCP에대해생장이저해되는것으로나타났다. 18종중에서 17종이 2주이내에억제영역에서자랐으며액상에서의독성실험에서는 18종모두 5 mg/l의 PCP 용액에서사멸하였다. 사. TNT(2,4,6-trinitrotoluene) 분해 백색부후균에의한 TNT 분해가순수배양을사용한실험실규모에서보고된바있으나몇몇인자에의해현장규모의정화에서는어려움이발생하여아직은성공적인현장적용은이루어지지않았다. 이러한제한요소로는토착박테리아와의경쟁, 독성에의한제한, 화학흡착등이있다. 백색부후균은질소제한환경에서가장성공적으로활동한다. 균류와박테리아의혼합된 bench scale 규모실험에서대부분의 TNT 분해는토착박테리아에의해이루어지는것으로보고되었다. TNT와 PCP의농도가높을경우백색부후균의생장이저해될수있다. 한연구에서는특정종류의백색부후균은 TNT의농도가 20 ppm 이상인토양에서는생장할수없다고주장하였다. 또한, 백색부후균에대한다른몇몇연구에서도 TNT가실제적인분해보다는균이나토양에흡착되어손실이발생하는것이보고되었다. 인용자료 박희문, 신현동, 오덕철, 윤권상, 이종규. 2000. 기초균류학. 월드사이언스. 오재일, 김학윤, 최영화. 백색부후곰팡이를이용한난분해성오염물질제거. http://www.alric.org/trend/. 2009.7. - 26 -
제 1 장백색부후균의일반 정학성. 2005. 백색부후균의계통분류학적연구백색부후균에의한난분해성물질분해. 심포지엄초록집. Hofrichter, M. 2002. Review:lignin conversion by manganese peroxidase(mnp). Enzyme Microbiol. Technol. 30:425-444. Tuor U., K. Winterhalter, A. Fiechter, 1995. Enzymes of White-rot fungi involved in lignin degradation and ecological determinants for wood decay. J. Biotechnol. 41:1-17. - 27 -
제 2 장 백색부후균의분자생물학적연구현황 1. 백색부후균의리그닌분해효소유전자분리및특성연구 2. 백색부후균의리그닌분해효소재조합단백질생산 3. 백색부후균의형질전환발현벡터 4. 백색부후균을이용한내분비계장애물질분해연구 5. 백색부후균을이용한바이오매스전환 6. 형질전환을이용한백색부후균의분자육종 7. 형질전환을이용한백색부후균분자육종의전망
제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 1. 백색부후균의리그닌분해효소유전자분리및특성연구 리그닌을분해하는미생물의대부분은담자균에속하는백색부후균이며이들은세포외리그닌분해체계를보유한유일한집단이다. 이러한백색부후균이분비하는리그닌분해효소로는 lignin peroxidase(lip), Mn-dependent peroxidase(mnp) 및 laccase가있다. Tien과 Kirk(1983) 에의한 LiP의존재가최초로보고된이래다양한백색부후균에서리그닌분해효소와그기능들이보고되고있다. 리그닌분해효소의분자생물학적연구는이들효소에의한리그닌분해기작을이해하는데필수적인조건이라하겠다. 따라서백색부후균의리그닌분해효소유전자의분리및특성연구는미생물에의한목질분해메커니즘을구명하여지구상의탄소사이클을이해하는데큰의의가있을뿐아니라선발유전자에의한유용효소생산및기능성이강화된미생물의개발을통해난분해성물질오염의생물학적복원이나친환경적바이오에너지산업등에활용될수있다. 가. Lignin 및 manganese peroxidase 유전자분리및특성구명 가장많은연구가진행되고있는백색부후균은 Phanerochaete chrysosporium 으 - 31 -
로이균은 lignin biodegradation 에관한주요모델이되었다. 이러한이유는급속한성장과리그닌의기작에있어서상대적으로높은온도에서도잘자라고무성포자와담자균류포자 ( 유성포자 ) 형성능력이있는데이러한것이유전학적, 분자생물학적연구에대한장점을지니고있으며화학적으로조성된 media에서도자랄수있는능력이있기때문이다. Ligninolytic peroxidase genes와 cdna는 P. chrysosprium(tien and Tu, 1987; Pribnow, 1987) 를포함해서 T. versicolor(jonsson and Nyman, 1992; Collins, 1999), Pleurotus ostreatus(asada, 1995; Irie, 2000), Pleurotus eryngii(ruiz-duenas, 1999) 등다양한 lininolytic fungi에서 cloning되고염기서열이보고되었으며이러한유전자들은아미노산서열을포함하여분자적수준에서연구되었다. MnP와 LiP은 multiple gene에서부터유래되어 multiple isozyme 으로분비되며 posttranslational modification 과정을통하여 mature form으로전환된다. 최초의 LiP분리는 1983년 Tien과 Kirk에의해 P. chrysosprium으로부터시작되었다 (Tien and Kirk, 1983). 또한이 LiP를코드하는유전자로서 lipa, lipb, lipc, lipd, lipe, lipf, lipg, liph, lipi, lipj가분리되었다. 이들중 lipa, lipb, lipc, lipe, lipg, liph, lipi, lipj가링크되어있으며 lipd, lipf가 8개의유전자와는떨어진곳에존재한다는것이밝혀졌다 (D'Souza, 1993; Gaskell, 1991; Stewart, 1992; Gaskell, 1994). 또한이들유전자중 lipi, lipc 및 lipj의전사레벨은탄소원과질소원의제한배지에서차이가있는것으로나타나이들 lip cluster 전사제어는서로다르게제어되는것으로추정되었다 (Stewart and Cullen, 1999). Manganese peroxidase를코드하는유전자로써 mnp1, mnp2 및 mnp3의세개의유전자가 P. chrysosprium에서분리되었으며이들유전자는서로링크되어있지않으며어떠한 LiP 유전자와도링크되어있지않다고보고되었다 (Orth, 1994). 또한, 질소원을제한하고망간을공급한배지에서배양하여배양후 2일부터 7일까지 RT-PCR 을이용하여조사한결과 mnp1의전사레벨은배양후 3일에서 7일까지비교적낮 - 32 -
제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 은것으로나타난반면 mnp2는배양 5일후에, mnp3는배양 3일후에가장높게나타났다 (Gettemy, 1998). 그리고정치및진탕배양을한후 total RNA를조사한결과정치배양시에는 mnp2가, 진탕배양시에는 mnp1의발현양이큰것으로나타나는 (Gettemy, 1998) 등 P. chrysosporium의리그닌분해효소유전자에대한많은연구가있다. 운지또는구름버섯으로불리는 Trametes versicolor도복수의 LiP와 MnP isozyme을생산하며이들 isozyme 은상동성이높은유전자에의해코드되는것으로밝혀졌다. Johansson과 Nyman(1993) 은 T. versicolor에서분리된 5개의 MnP와 6 개의 LiP 유전자들이 chromosome 상에서매우가깝게연관되어있고동시에전사가이루어짐을보고하였다. 그리고 LiP를코드하는 LPGⅠ, LPGⅡ, LPGⅢ, LPGⅣ 의네개의유전자가분리되어 LPGⅠ은 LPGⅣ와 LPGⅡ는 LPGⅢ와각각 96% 와 99% 의상동성이있는것으로나타났다 (Johansson and Nyman, 1994; 1996). Cullen(1997) 도 T. versicolor에서 2개의 LiP와 1개의 MnP 유전자들을분리하여이러한 MnP와 LiP 유전자사이에서 54% 의높은상동성이있음을보고하였다. 또한, MnP 유전자로써 mnp1을분리하여코드하는 polypeptide 의 identity 를조사한결과 LPGⅣ가코드하는 polypeptide 와 70% 의 identity 를갖는것으로나타났다 (Johansson and Nyman, 1996). Isozyme으로 mnp2는상류에금속반응인자 (metal response elements; MREs) 는없으나 MnSO 4 첨가배지에서전사레벨이 250배증가하는것으로나타난반면, 같은조건에서 MREs를가지고있는 mnp1는겨우 8배증가하는것으로나타났다 (Johansson, 2002). 따라서, T. versicolor의 MnP 유전자는 isozyme 에따라다르게제어되며상류의 MREs는필수불가결한것은아닌것으로나타났다. Coprinus cinerius의 peroxidase(cip) 는다른 ligninolytic 효소와 cluster 를이루지않고있다 (Kjalke, 1992). 생화학적으로이러한단백질은중성이나산성조건에서 Mn 2+ 나 veratryl alcohol을산화시킬수없는특성도있다. - 33 -
MnP와 LiP은기본적으로 4가지 group으로나눌수있으며첫번째 cluster group은서로 75% 이상의높은상동성을보이며 N-말단에 50개의 cystein 이존재하며 Mn 2+ binding site가존재한다. 두번째 cluster group은 N-말단이매우짧고 8개의 cystein 이존재하며 Mn 2+ binding site 또한잘보존되어있고 P. ostreatus 의 MnP와 T. versicolor의 PGV를제외하고는 Trp residus(lip에서는 W171) 가 veratryl alcohol 을산화시키는데관여한다. 세번째 group에서는 substrate binding site가잘보존되어있다. 네번째 group에 T. versicolor에서 Mn에의해발현이억제되는 manganese repressed peroxidase(mrp) 가보고되었다 (Collins, 1999). 이러한 ligninolytic 유전자들의발현은탄소, 질소와황등의영양원이고갈되었을때유도되지만, Bjerkandera adusta와 P. ostreatus에서는놓은질소원이존재하는조건에서발현됨이보고되었다 (Kaal, 1995). 또한 T. versicolor에서보고된 MRP와 MnP는 heat shock, oxidative 및 chemical stress에 insensitive함이보고되었고그발현패턴은 strain이나배양조건, 기질, 배양시간등에따라다르다 (Collins, 1999). 나. Laccase 유전자분리및특성연구 리그닌을분해하는기작에서중요한역할을하는 laccase 는 1883년요시다 (Yoshida) 에의해바니시 (varnish tree, Rhus vernisifera) 나무에서처음밝혀진이후백색부후균에서더많은기능이연구되어져왔다 (Yoshida, 1883). Laccase 는구리를포함하는산화제로서리그닌외에리그닌과구조가비슷한각종화합물에대하여비특이적으로작용할수있는기작을보유하여그활용이다양하다. 특히, 염료나내분비계장애물질과같은난분해성유해화합물 (Xenobiotics) 을분해하는데관련된연구가보고되고있다 (Xu, 1999; Mayer and Staples 2002; Han, 2004). 백색부후균에서세포외로분비되는 laccase 효소에의해분해가이루어지기때문에 - 34 -
제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 적절한매질에고정화된백색부후균을이용하면분해과정에의한 2차적인오염없이고농도의독성화합물과불용성화합물의처리가가능하고생장조건의특이성으로선택적인성장을보이므로현장적용에서기타미생물의영향을배제할수있다. Laccase 유전자에대한연구는다양한백색부후균에서연구되고있는데 T. versicolor에서 1999년 Cassland과 Jőnsson 에의해 RT-PCR 방법으로처음 laccase cdna가분리되었고 2003년 Kim 및 2005년 Cheong 등은 T. versicolor의단핵균사로부터상동성이높은새로운 cdna를분리하였다. 2,4,6-trinitrotoluene(TNT) 가분해되는동안 TNT와이것의대사중간물질에의해 laccase 유전자들의발현이크게증가되는것을보여주며 TNT 분해과정에서 laccase 가중요한역할을하는것으로보고하였다 (Cheong, 2006; Gibson 2006). 아시아에서식용버섯으로가장많이재배되는 Lentinula edodes에서분리된 laccase 유전자로 lac1과 lac2는성숙된자실체의갓에서가장높은효소활성을나타내었으나유전자의발현양상은배지의영양원과자실체를포함한발생단계에따라다른결과를보여주며버섯의 morphogenesis 에중요한역할을하는것으로추정하였다 (Zhao and Kwan, 1999; Ohga and Royes, 2001). 2. 백색부후균의리그닌분해효소재조합단백질생산 리그닌분해효소는펄프제지산업에서크라프트펄프의효소적전표백과정이나섬유산업에서염색폐수의정화등에이용될수있어이들효소들의효율적인생산에관한연구가활발하다. Novozyem 사등은 laccase 를대량생산하여상업적으로판매가되고있다. 생물공학적기술의발달로유전자를이용하여재조합단백질을제작하여합성하면저비용으로동일한효소의대량생산이가능하다. Escherichia coli는벡터의제작과형질전환을쉽게할수있고재조합단백질의 - 35 -
발현효율도매우높기때문에가장많이활용되는균주이다. P. chrysosporium 의 lignin peroxidase 유전자 (rliph2) 를 E. coli에서발현시켜배양액에서 3.4 mg/l의양으로효소가생산되었다. 재조합단백질의효소활성은 veratryl alcohol oxdase activity가 39 s -1 로원래 lignin peroxidase(liph2) 가갖는효소활성 30 s -1 와거의유사한활성을나타내어 E. coli에서재조합단백질의대량생산가능성을보여주었다. 그러나단백질정제후적당한시약 (urea, Ca 2+, hemin) 이포함된용액에서 glutathione 을매개로한산화반응을통해 refolding하는과정을거쳐야만활성을갖는단백질이되었다 (Nie, 1998). Aspergillus는담자균과가장유사한균사형태를갖는진균으로재조합단백질발현에관한연구가많이이루어졌다. Aspergillus niger를이용해서 Pycnoporus cinnabarinus의 laccase유전자를 6.3 mg/l 효율의재조합단백질로발현시켰으며 (Eric, 2002) Trametes versicolor의 laccase 유전자 (laccase gene Ⅳ) 를재조합하여 50 g/l의재조합단백질이발현되는것을보고하였다 (Téllez-Jurado, 2006). Pichia pastoris는생산되는단백질을세포외로분비하는데효율적이기때문에발현된재조합단백질의회수가편리하고담자균과같은진핵생물이므로재조합단백질의 refolding 과정이필요없다. Wang과 Wen은최근 Pichia X-33 균주에서 P. chrysosporium의 lignin peroxidase 유전자를이용하여발현후 12시간만에 refolding 과정없이 15 U/L의효소활성을갖는재조합단백질을생산하는데성공하였다 (Wang and Wen, 2009). 3. 백색부후균의형질전환발현벡터 Shishido 등은표고버섯의 promoter 를이용하여외래유전자발현벡터 plc1, plc2 를개발하였다 (Ogawa, 1998). 이벡터에사용된 promoter 는표고버섯 - 36 -
제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 (Lentinus edodes) 유래의 ras(hoti, 1991; Kajiwara and Shishido, 1992) 와 pria(kajiwara, 1992; Ishizaki, 1999) 유전자의것을, 그리고터미네이터는 pria 유전자의것을사용하였다. ras는 Lentinus edodes의영양증식기및자실체형성과정을통해상시높게발현하고있는유전자이고 promoter 영역에통상의 CAAT, CACCC 및 2개의연속되는 TATA box 이외에 CT 모티브 ( 또는 stretch ; 62염기중 55염기가피리미딘염기인배열 ) 를가지고있다. pria는자실체원기 (primordium) 시에, 특히높게발현하는유전자로서최초로분리된것으로 promoter 영역에 GC, CaTT 및 TATA box 이외에역시 CT 모티브 (26 염기중 25염기가피리미딘염기인배열 ) 을가지고있으며, 터미네이터영역에는효모유래의유전자에서가끔관찰되는전사종결 Poly(A) 시그널 (TAG...TAGTG...TTC)(Zaret and Sherman, 1982) 을가지고있다. plc1(6.4kb) 은대장균 plasmid puc19에 ras의 promoter(2.5kb) 와 pria의터니네이터 (1.2kb) 을그사이에 BamHI 크로링부위를삽입한형태이다. plc2(5.6kb) 는대장균 plasmid pbr322 에 pria의시간특이적인발현에관련되고있다고생각되는 cis-element 영역을제외한기본 promoter(0.37kb) 와 pria의터미네이터 (1.2kb) 을삽입한것으로역시 BamHI 클로닝부위를가지고있다. plc1과 plc2 는담자균버섯의외래유전자의발현에효과적으로예를들면대장균염색체유래의 β-글루크로시다아제유전자 (GUS) 와하이그로마이신 B 내성유전자, 대장균트랜스포젼 Tn903유래의네오마이신내성유전자또는방선균유래의비아라호스내성유전자등을 Lentinus edodes, Pleurotus ostreatus, Coprinus cinereus의염색체에상동치환만아니라다수의 copy를삽입하여발현시키는것이가능하였다 (Yamazaki, 2000). 또한, 담자균의경우에는상동치환비율은 5% 이하로추정된다. 담자균유전자의 promoter 영역에는진핵생물 promoter 공통의보존배열이외에대부분긴 CT 모티브가존재한다. CT 모티브는 promoter 영역내에가장하류에존재하고때때로그중간에전사개시점이발견되기도한다. 또한, CT 모티브 - 37 -
내에는분자내삼중쇄구조 (intramolecular triplex structure)(wells, 1998) 형성과관련된미러리피트 (mirror repeat) 배열이발견되었다. 이와같은제조건을만족하는 CT 모티브는자낭균유전자 promoter 영역에서발견된적이있지만효모와동 식물유전자의 promoter 에는거의존재하지않는다. Shishido 등은표고버섯 ras와 pria 양 promoter 의 CT 모티브에대해서다음과같은결과를얻었다. Ras 및 pria의 CT/AG 배열을포함하는 DNA 절단을 pbr322 의 EcoRI 부위에삽입하여얻은 recombinant plasmid 에관하여일본쇄 ( 一本鎖 ) 에특이적인뉴크레아제 S1에의한절단부위를해석하였다. 그결과, 두개의 DNA 단편은마이너스 (-) 의초나선힘의아래에서, ras의경우는 CT/AG 배열내에 pria의경우는 CT/AG 배열내또는 CT/AG 3'-인접배열내에이본쇄 ( 二本鎖 ) 개열부위를형성하는것이밝혀졌다 (Yamazaki, 2000). CT/AG 배열내의 mirror repeat 배열전체혹은한쪽만을결손시키거나 mirror repeat 배열의한쪽그리고 CT쇄의 2개의프린염기를피리미딘염기로 (AG쇄의 2개의프린염기를피리미딘염기로 ) 치환한경우에는일본쇄부위가형성되지않았다 (Yamazaki, 2000). 이것은 mirror repeat 배열이 S1 감수성의일본쇄부위의형성에관여하고있다는사실, 즉 mirror repeat 배열을매개로하여삼중쇄구조가형성되어그것에의해필연적으로일본쇄부위가형성되는것을시사하고있다. pbr322의테트라사이클린내성유전자 (tet) 의 promoter 의상류에일본쇄부위가형성되는것처럼 CT/AG 배열을포함하는 DNA 단편을삽입한경우에는 tet의전사가활발하게되어대장균의테트라사이클린내성이현저히상승하는것으로나타났다 (Yamazaki, 2000). 또한, 방선균유래의비아라호스내성유전자 (bar) 를리포터로서 pria promoter의 CT 모티브의역할 기능을, 형질전환이용이한 Coprinus cinereus를이용하여조사하였다. 그결과, 야생형의 CT 모티브에비해 2개의염기에변이를가지는 CT 모티브의경우에는 bar의전사발현양이현저히감소한다는것을, 그리고야생형의경우에는 3개의개시점으로부터효율적으로전사가일어나는것에비해변이형의경우에는전사가 3개가운 - 38 -
제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 데한개에서만일어난다는사실이밝혀졌다. 이상 CT 모티브가담자균유전자의담자균내의효율적인전사발현에직접적으로관련이있다는사실이판명되었다. 담자균세포의핵내에분자내삼중쇄구조의형성여부에대해서는확실하지않지만크로마틴 ( 염색질 ) 의뉴크레오솜으로부터히스톤팔량체가해리하면마이너스의초나선 ( 超螺線 ) 힘이그곳에발생하므로 plasmid 분자내의경우와유사한 DNA 환경이만들어져분자내삼중쇄구조가형성될가능성이충분히있다. Schizophyllum commune, Phanerochaete chrysosporium 등으로부터분리된글리세롤알데히드-3-인산탈수효소유전자 (gpd) 의 promoter 를 puc에삽입한벡터를개발하였다 (Mayfield, 1994). gpd는구성적으로발현하는대표적인유전자의하나로 S. commune, 및 P. chrysosporium의 gpd promoter 영역에는 TATA box의하류에 mirror repeat 를포함하는 CT 모티브가발견되었다. 이들 gpd promoter와터미네이터 ( 동 식물유전자공통의 poly(a) 부가시그널모양의배열이있음 ) 가 S. commune의방선균유래의프레오마이신결합단백질유전자의발현에유효하다는것이 Schuren과 Wessels(1994) 에의해증명되었다. 그러나, 대장균유래의 GUS 유전자, 하이그로마이신 B 내성유전자와 β-갈락토시다아제유전자의경우에는발현되지않았다. 이들유전자를프레오마이신결합단백질유전자의하류에연결하여 S. commune의융합유전자의전사발현을조사하였다. 그결과, 전사가하류유전자내에서정지한것같은작은사이즈의전사산물이검출되었다. 담자균유전자의전사종결과 poly(a) 부가시그널에대해서는 pria 유전자와같은시그널배열을가지고있지않으면서동 식물유전자공통의 poly(a) 부가시그널 AATAAA 혹은이것과유사한배열을가지는것도있어복잡하지만, 위의 3개의유전자의염기배열내에 AATAAAA 모양의배열이있어그곳에서전사산물이절단될가능성이있다고하였다. 그러나, Shishido등은유전자와하이그로마이신 B 내성유전자를느타리버섯과표고버섯내에서발현시키는데성공하였으며다른가능 - 39 -
성도생각할필요가있다. 또한지금까지개발된벡터중에대표적인것은 puc에선택마커로써 S. commune의 ade5( 아미노이미다졸리보뉴클레오티드신세다아제 ) 와 P. chrysosporium의 gpd promoter 를삽입한벡터 (pog118-1) 이다 (Mayfield, 1994). 4. 백색부후균을이용한내분비계장애물질분해연구 내분비계장애물질은생체외부에서들어와내분비기관안에서호르몬의생리작용을교란시키는화합물을말하며일반적으로환경호르몬이라고불려진다. 다이옥신, PCB, PAH, 푸란, 페놀, 그리고 DDT와같은살충제와플라스틱가소제로쓰이는프탈레이트등이잘알려진내분비계장애물질이다. 대표적인예로젖병과같은음식용기나 CD의재료로쓰이는비스페놀A가에스트로겐과유사한작용을함으로써남성에게서무정자증을유발하게하고여성에게서는이상성징후가나타나게하는등의작용을하는것을들수있다. 현재비스페놀A는프탈레이트계가소제와함께한국정부가규정한위험환경호르몬으로분류되어있다. 내분비계장애물질은생체호르몬과는달리쉽게분해되지않고안정하다. 그래서환경과생체내에잔존하며심지어는수년간지속되기도한다. 따라서자연속에서쉽게분해되지않는난분해성물질로물이나토양등에저농도로남아있다가먹이사슬을통해생물체의체내로흡수되어문제를야기하게된다. 미생물을이용한내분비계장애물질의분해연구는 1990년대초부터시작되었고 (Corti, 1995), 특히백색부후균을이용한난분해성내분비계장애물질의분해에관련하여리그닌분해효소인 laccase와 maganese peroxidase(mnp) 에대해주목하였으며 (Tsutsumi, 2001), laccase 활성의안정성을향상시키기위한방법에대한연구들이수행되었다 (Modaressi, 2005). 최근백색부후균의리그닌분해효소및그유전자에 - 40 -
제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 대한연구는상당한수준으로발전되었다. 미국을비롯한많은나라에서백색부후균의 laccase, LiP 및 MnP들의유전자를클로닝하고이들이다양한조건에서발현되는양상을연구하고있다. 또한난분해성물질분해관련효소들의유전자발현양상을분석하고선발된유용유전자를이용하여분해능향상균주개발과분해효소의대량생산및효소의효율적인이용을위한연구가진행되고있다. 다양한미생물을대상으로유전자를클로닝하고이를증폭하여발현을대량유도하는실험은 1990년대에많은실험실에서수행되고있다. 이러한연구는주로세균을대상으로활발하게진행되었으며, 진균류를대상으로분자생물학적연구기법은효모균에집중되었으며, 비교적최근산업적으로중요한누룩곰팡이와농작물에피해를주는도열병균등에대한분자생물학적연구가진행되고있다. 이에비하여가장고등한진균류인담자균류에대한분자생물학적연구는상대적으로매우뒤떨어진상태이다. Bumpus 등은수종의백색부후균을이용하여 14 C-DDT의분해를시도하여 30일동안에 5~14% 의무기화 ( 14 CO 2 ) 을관찰하였다 (Bumpus and Aust, 1987). 또한, Kennedy등은 P. chrysosporium을이용하여 14 C-chlordane, lundane, dieldrin, heptachlor, alddin의분해를시도하여 30일동안에 9~23% 의무기화를관찰하였다 (Kennedy, 1990). 잔류성이높은 pentachlorophenol에대해서도 P. chrysosporium과 P. sordida를이용하여검토한결과단시간에분해가관찰되었다 (Mileski, 1998; Lamar, 1990). 또한, 잔류기간이짧은 atrazine(masaphy, 1993), 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid(ryan, 1989), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid(yadav and Reddy, 1993) 및유기인제농약도백색부후균으로분해가가능하였다. 이와같이백색부후균에의한수많은농약의생분해가보고되고있다. 환경호르몬가운데수지의원료인비스페놀A와계면활성제의원료인노닐페놀은비교적높은빈도로환경중에검출되고있어이들의제거는가장큰문제가되고있다. 환경호르몬의 bioremediation 은그물질자체가감소해도대사생성물이에스 - 41 -
트로겐활성을갖게되면의미가없다. 그러나 Tsutsumi 등은리그닌분해효소인 MnP와 laccase 를이용하여비스페놀A 및노닐페놀을처리하여반응계전체에서에스트로겐과같은활성을완전히제거하였다고보고하고있다 (Tsutsumi, 2001). 군사용폐기물중폭약으로사용되고있는 2,4,6-trinitrotoluene의백색부후균에의한생분해가보고되고있으며그중에는본화합물의분해에 MnP가기여하고있다는보고도있다. 독가스인 Yperite 의백색부후균에의한분해에대해서도보고되고있지만 (Itoh, 1997), 분해에관여하는효소계에대해서는언급되고있지않다. 또한, 다환식 ( 多環式 ) 방향족화합물의백색부후균에의한분해에대해서도다수보고되고있다 (Kotterman, 1998). Antrasene 과 phenanthrene 에대해서는그분해경로까지제안되고있다 (Bezalel, 1996). 균을처리한경우에는초기에 P450등세포내수산화효소에의한산화를일으키는분해경로가제안되고있고, 리그닌분해효소는관여하지않는다는보고도있다 (Bezalel, 1997). 그러나이와는대조적으로균체외 LiP(Hammel, 1986) 와 MnP-불포화지방산계 (Bogan, 1996) 에의한산화를시발로하는분해경로도존재하고있다는보고도있다. 최근에백색부후균의 P450 유전자가단리되어복수로존재한다는사실이밝혀졌다 (Ichinose, 2002). 또한, LiP 와 MnP-불포화지방산계에의한다환식방향족화합물의산화도가능하므로어느분해경로도존재하는것으로보여진다. 5. 백색부후균을이용한바이오매스전환 현재인류가직면하고있는자원 에너지의고갈, 환경의악화등의문제에대해서식물계바이오매스는재생산이가능하므로환경친화적인자원으로서주목을받고있으며그이용에관한기술개발의필요성이크게부각되고있다. 식물바이오매스를처리하여유용물질을공업적규모로생산하기위해서는에너지를줄이면 - 42 -
제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 서도환경순응형의생물적처리방법이적합하다. 식물조직은셀룰로오스섬유간극을헤미셀룰로오스 ( 주성분 xylan) 가채워결합하고있고그들주위를감싸듯이난분해성리그닌 ( 페놀프로판구조를기본으로하고여러종류의결합을매개로중합하고있는복잡한구조를가짐 ) 이막을형성하고있다. 이들식물체의주요구성성분가운데자원면에서특히유용한것은그대로도널리이용되어당 알콜로의변환도가능한셀룰로오스와감미료혹은알콜변환도가능한 xylose( 木糖 ) 이다. 따라서, 식물계바이오매스로부터셀룰로오스와 xylose 을얻으려고하는경우에는리그닌과헤미셀룰로오스를분해 제거혹은단당화하는기술이중요하므로, 여기에서주목을받는것이두물질을분리하고난분해성의리그닌을분해할수있는목질분해균이다. 지금까지의연구는주로자연계로부터분리한목질분해균을이용한것으로분해활성에는한계가있고또한리그닌과헤미셀룰로오스분해효소의생산이적기때문에백색부후균을이용한유용물질의획득은성공하지못하였다. 그러므로이러한경우필요한것은유전공학적인방법을이용하여리그닌과헤미셀룰로오스를고효율로분해할수있는생육이빠른목질분해균의개발이다. Shishido 등은표고버섯 (Lentinus edodes) 의생명현상을분자레벨에서해명하기위해다양한유전자를단리하여구조해석을하는과정에서유전자의 promoter 및터미네이터를얻었다 (Hori, 1991; Kajiwara, 1992; Yamazaki, 1997; 2000). 그리고이들을이용하여여러가지버섯균의염색체상에서유용유전자를효율적으로발현시키는벡터를개발하였다 (Yanai, 1996; Ogawa, 1998; Sato, 1998). 이러한버섯균에관한연구에서는유종의대상으로서증식이빠른 Coprinus cinereus을이용하였다. 개발한벡터중에서 Coprinus cinereus에가장효과적인것이 plc2라고이름붙여진벡터였다. 이벡터는표고버섯 pria 유전자의 promoter 와터미네이터를가지며그사이에 BamHI 크로닝부위를갖고있다. 느타리버섯유래의리그닌분해효소, 망간 (Ⅱ) peroxidase(mnp) 의 cdna 유전자 (mnpc) 를 plc2의 BamHI 부위에 - 43 -
넣어변환시킨 plasmid plc2-mnp를구축하여 Coprinus cinereus 유래의 TRP1 유전자를가지는 plasmid pcc 1001의동시형질전환과함께 Coprinus cinereus의단상균사 Trp 에 - 도입하였다. 그결과 Trp + colony 로부터리그닌분해력이아주높은형질전환주가분리되어 CcTF 2-7(Po.MnP) 로명명하였다 (Ogawa, 1998). 본형질전환주는염색체상에서약 10 copy의느타리버섯유래의 mnpc 배열을가지고있다. CcTF 2-7(Po.MnP) 주는 MYG( 맥아 효모엑키스, 글루코오스 ) 혹은 MY 배지에서 Trp + 대조균주 (pcc1001 만을도입하여얻은균주 ) 와비교하여현저히리그닌을탈색및분해하는것으로나타났다 (Ogawa, 1998). 색소 Remazol Brilliant Blue R(RBBR) 을기질로하여배양여액중의옥시다제활성을측정한결과 CcTF 2-7(Po.MnP) 주가 Trp + 대조균주의 30배의활성을갖는것으로나타났다. 느타리버섯유래의 MnP 분비시그날에해당하는염기배열을붙인 Bacillus subtilis 유래 endo형 xylanase(endo-1,4-d-xylanase; Xyn') 유전자를벡터 plc1( 표고버섯 ras 유전자의 promoter 와 pria 터미네이터를보유 ) 및앞에서언급한 plc2의 BamHI 부위에삽입했다. 그래서얻어진형질전환 plasmid plc1-bs.xyn' 와 plc2-bs.xyn' 을 pcc1001과함께 Coprinus cinereus 단상균사에동시에형질전환하여높은 xylan 분해활성을보유하는형질전환균주 CcTF 2-11(Bs.Xyn') (plc2-bs.xyn' 유래 ) 과 CcTF 1-16(Bs.Xyn')(pLC1-Bs.xyn' 유래 ) 을만들어냈다 (Kikuchi, 1999). CcTF 2-11(Bs.Xyn') 과 CcTF 1-16(Bs.Xyn') 은염색체상에각각 10 혹은 6 copy 정도의 Bacillus subtilis 유래의 xyn' 배열을가지고있으며, 형질전환균주는배양액중에 Trp + 대조균주의각각 9배, 7배의 xylanase 을분비생산하는것으로나타났다 (Kikuchi, 1999). 또한, Aspergillus oryzae 유래의 endo형 xylanase XynF1의 cdna을 Coprinus cinereus 단상균사에도입한결과염색체상에이 cdna가다수의 copy로삽입되어그전사발현이확인되었음에도불구하고배양여액중의 xylanase 활성의상승은거의보이지않았다. 따라서 XynF1 의시그널배열을느타리버섯 MnP의시그널 - 44 -
제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 배열과교환하여도입한결과얻어진형질전환주 CcTF2-1(Ao.Xyn') 이염색체상에서약 5 copy의 Aspergillus orazae 유래의 Xyn'( 치환형 Xyn) 배열을가지고있고 Trp + 대조균주의약 10배의 xylanase 를분비생산하는것이확인되었다. 또한 XynF1 의분비시그널의배열에점변이, 즉분비시그널배열의절단점바로앞이본래 Ser-Arg 이었으나이것을 Lys-Arg 가되도록변이를도입한것을이용하여얻어진형질전환주 CcTF2-14(Ao.Xyn") 은염색체상에서 5 copy의 Xyn"( 점변이형 Xyn) 배열을갖고있고, 약 10배의 xylanase 생산성을나타내었다. 리그닌혹은 xylan 고분해성분자육종주 CcTF 2-7(Po.MnP) 와 CcTF 2-11(Bs.Xyn') 을이용하여각종식물계의바이오매스로부터실제로셀룰로오스를얻을수있는지검토하였다. 알카리로가볍게 (0.1N MaOH, 1시간 ) 처리한바이오매스파쇄물을 0.5%(w/v) 포함하는 0.025% MnCl 2 용액중에서 2개의분자육종주를 27 에서 3주간혼합배양하여배양물에대해서셀룰라아제분해법을이용하여조사하였다. 그결과볏짚의경우수량이가장높고전셀룰로오스의약 25% 을가용성 ( 원심분리하여침전하지않음 ) 셀룰로오스로서얻을수가있었다. Coprinus cinereus의대조구만을이용한경우에는가용성셀룰로오스의수량이 9% 정도이었다. 지구상의다양한생물중에서가장분해하기어려운화합물인리그닌을단독으로무기화 ( 이산화탄소와물로분해 ) 가가능한것은오직버섯균 ( 백색부후균 ) 뿐이다. 버섯균은광합성을할수있는능력을가지고있지않는대신에진화과정에서이와같은특수한능력을가지게되었다고사료된다. 리그닌은메톡시기를가지는방향환에탄소 3개의측쇄가결합한구조를기본단위로하여다양한결합에의한중합으로인해아주복잡한구조를가지고있다. 이러한복잡한구조를가지고있는리그닌을분해할수있는백색부후균은펄프폐액등에포함되어있는펜타크로로페롤, 쓰레기소각로주변의토양및쓰레기집하장의침출수등에포함되어있는다이옥신등의방향족유해염소화합물을 1 LiP와 MnP 등의세포외분비효소로방향족화합물을비특이적으로공격하거나 2 생성되는다양한분해물 - 45 -
을세포내로흡수하여분해하는것으로환경호르몬을분해 무독화하는것으로알려져있다. Shishido등은 Coriolus hirsutus 단상의균사염색체상에 Coriolus hirsutus의 ras promoter와표고버섯의 pria 터미네이터의사이에느타리버섯유래의 mnpc을삽입한발현카세트를여러 copy 도입하여대조균주와비교하여몇배높은 MnP 활성을나타내는형질전환주 ChTF 3-3(Po.MnP) 을얻었다. 이렇게만든분자육종주로맥주를만들고남은찌꺼기를배지로하여배양하여얻어진배양여액에대해서펜타크로르페놀의분해성을 HPLC로분석한결과원래의 Coriolus hirsutus 에비해분해능이높은것으로나타났다. 또한, 다이옥신류와부분적으로구조가닮은 RBBR을아주효율적으로분해하는것으로나타났다. 이상의실험결과에따라 Shishido 등은 Coriolus hirsutus 의리그닌및헤미셀룰로오스분해능향상균주를이용하여볏짚으로부터어느정도의셀룰로오스를얻을수있었다. 새롭게만든버섯균을공업적규모로이용하는경우특히버섯균자신에의한환경오염이문제가된다. 이런점을감안하여 Shishido 등은육종의대상으로단상균사즉, 비산감염의원인이되는포자를만들지않는균사를이용하여생태계에악영향을미치지않도록배려하고있다. 식물바이오매스자원의리사이클을실현하기위해서는새롭게만든버섯균의효소생산성을높일수있는저비용의배양조건설정과셀룰로오스로부터글루코오스로의저비용변환기술의확립이필요하다. 또한이번에만들어진 Coprinus cinereu의분자육종주는볏짚과함께대표적인미이용식물바이오매스인목분에대해서는효과적이지못하였다. 앞으로목분으로부터셀룰로오스를얻는데적합한리그닌고분해성버섯균의분자육종이필요할것으로사료된다. 또한, 다이옥신의분해에관해서는 LiP와 MnP의두종류의리그닌분해효소가관련되므로이들효소를많이생산하는 Coriolus hirsutus의제작이요구될것으로기대된다. - 46 -
제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 6. 형질전환을이용한백색부후균의분자육종 UV 조사, 화학처리등과같은일반변이처리의경우확보된변이주의유전적해석이어려울뿐만아니라목적효소의분비빛활성이뛰어나더라도유전적인안정성을기대할수없기때문에유전적으로아주안정한형질전환체들이구성되어야한다. 특정유전자만을증폭한형질전환체는기본성격이변하지않으므로현장적용이용이한장점이있다. 또한야생형보다특정물질을생분해수있는효소의발현이우수한형질전환체의경우고정화효소를이용한내분비계장애물질분해등에유용하게이용될수있다. 특히백색부후균들의종류, 내분비계장애물질은용해도, 분해효소의분비량및종류등에따라생분해능은다르기때문에우수균주로선별된백색부후균이라도특정내분비계장애물질에대하여그생분해효소를제대로분지하지못하거나유전자를지니고있지않은경우가있을수있다. 그러므로이경우에해당되는효소의유전자를기존우수균주에도입할경우처리비용면이나처리조건의조정에대하여부담이될수있는균주의수를감소시킬뿐만아니라특수한경우고농도로유입되는내분비계장애물질을처리할수있는능력을지닌시스템의개발에기반균주로활용될수있다. 또한과발현형질전환체의분해효소생산능력은야생형보다우수하기때문이효소의분리정제및고정화효율을증가시키고이와더불어고정화매질에고정된효소량을증가시킬수있기때문에고정화효소를이용한내분비계장애물질처리시스템의처리효율이증대되고처리시설의규모또한축소시킬수있다. 백색부후균의하나인버섯류는지구환경에도움이되는대표적인생물의생물이라고할수있다. 즉, 목질분해균은동물 ( 소비자 ), 식물 ( 생산자 ), 균류 ( 분해자 ) 의발란스를이루고있는생태계의바이오매스의 90% 는식물이고이식물체의주요구성성분인리그닌, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스등을분해하고생태계의물질 ( 탄소 ) 순환을담당하는중심적인생물인동시에식물의뿌리에공생하여그생육을 - 47 -
조장하는중요한역할을담당하고있다. 담자균인버섯의경우많은생물과달리접합형이다른일핵 (n) 균사를융합하여도곧 2n화는이루어지지않고, 균사의응집과극적인분화에의하여형성되는자실체의담자기에서 2n화가이루어지기까지의오랜기간을중상핵 (n+n) 의상태로생활하는등특유의생명현상을나타낸다. 담자균버섯류의분자생물학적연구는효모, 다른자낭균등에비해늦었지만교배형의결정과화합성의확립및자실체의형성에관여하는유전자와이들산물의기능에대해서흥미있는결과가있었다 (Kondoh, 1995; Yasuda, 1997a; 1997b; Cooper, 1997; Miyazaki, 1997; Zhou, 1998). 여러가지유전자의구조해석의결과 promoter 또는터미네이터영역이밝혀져이들을이용하여염색체삽입형의유용한벡터가개발되었다. 이러한벡터를이용하여식물체의주요구성성분을효율적으로분해할수있는형질전환백색부후균버섯이제작되었다. 7. 형질전환을이용한백색부후균분자육종의전망 식물계바이오매스로부터셀룰로오스를얻을때꼭필요한리그닌분해와관련되는 MnP와 LiP의유전자를균류중에서도생육이늦은담자균에도입하여발현시키기보다는효모나자낭균등에발현시키는것이좋을것이라고사료되지만담자균이외의균들은충분한활성이있는효소의생산이쉽지않다. 담자균목질분해균의 LiP와 MnP에는 isozyme 이다수존재하고효모나자낭균에비해생산성이높을것으로사료된다. 또한리그닌이산화탄소의분해에는 LiP와 MnP이외의 peroxidase, laccase 등을비롯한동정되지않은각종의효소군이관련될것이므로이들효소류를전부가지고있는것이담자균인백색부후균이다. 이들효소적기반이없는생물에 1개나 2개의유전자를도입해도효율적인리그닌분해는기대할수없다. - 48 -
제 2 장백색부후균의분자생물학적연구현황 담자균의 LiP와다른 peroxidase, laccase 등의 cdna 유전자를 Coriolus hirsutus, Coprinus cinereus를비롯한생육이빠른여러가지의담자균에도입한후발현시켜다수의유용균주를제작하는것이바람직할것으로사료된다. Shishido 등이제작한담자균분자육종주가알카리를처리한볏짚으로부터셀룰로오스를얻을수있는것으로판명되었지만알카리미처리의볏짚의경우에는셀룰로오스의수량이 5~10% 로상당히낮다. 최근 Shishido 등은알카리처리가아닌미생물처리에의해볏짚을효소가공격하기쉬운형태로변환시킬수있을것으로생각하고여러가지미생물을검토한결과, 한방약의소재인잔나비걸상버섯에의해볏짚의팽윤, 조직의파괴가관찰되었다. 이전처리법을이용하여셀룰로오스의수량을 20% 이상높이는것이가능하였다. 또한, xylose 의수량을높이는방법이지만 xylosidase 고생산주를만들어이것을 endo형 xylanase 고생산주와함께사용하면효과적일것으로사료된다. 한편, 목분과낙엽으로부터셀룰로오스와 xylose을효율적으로얻을수있는담자균의육종이바람직할것으로생각된다. 담자균인백색부후균의분자육종법으로는목적유전자를숙주염색체상에복수의 copy를삽입하여발현시키는방법이육종주의안전성을생각할때당연한것이지만이경우문제가되는것이있다. 그것은발생할것으로생각되는숙주균의유전자파괴를어느정도억제할수있는가하는것으로 Shishido 등은표고버섯게놈상에는 1000 copy 이상산재하면서도수 copy를제외하고는전사되지않는특정의염기배열의분리에성공하였다. 이와같은배열이다른버섯에도존재할것으로생각하여이들배열을 plasmid 에삽입하여상동치환에의한형질전환주를만들수있다면문제가해결될것이다. 이러한관점에서는 Aspergillus nidulans의형질전환효율을 50~100 배상승시킬수있는 A. nidulans 유래의 DNA 단편 ans1 가보고되고있다 (Ballance and Turner, 1985; Cullen, 1987). ans1은 S. cerevisiae내에서자율복제능을가지는 DNA 단편 (ARS) 으로부터분리된것이다. 표고버섯과느타리버섯의미토콘드리아내재성선모양 plasmide 로부터 S. cerevisiae내 - 49 -
ARS를다수분리하고있으나 (Yui, 1988; Katayose, 1990; Nakajima, 1993) 이들이담자균인목재부후균에서도 A. nidulans 와같은 ans1과같은활성을나타낼지는앞으로의연구과제이다. 백색부후균이생산하는 LiP, MnP와다른 peroxidase, laccase 를비롯한효소류는리그닌분해이외에내분비계장애물질 ( 환경호르몬 ) 의다이옥신, 펜타크로로페놀등의유기염소화합물의분해를촉매할수있다. 유해유기염소화합물의효율적인분해가가능한담자균목질분해균이제작되면자원, 에너지획득, 자원의리사이클시스템확립뿐만아니라파괴된환경의회복에크게공헌할수있을것으로생각된다. 인용자료 송홍규, 최형태. 2008. 백색부후균과그분해효소를이용한내분비계장애물질의 제거. 환경부. 이성숙. 2003. 목질분해균의분자유전학적연구. 산림청임업연구원. - 50 -
제 3 장 백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 1. 서론 2. 리그닌분해효소유전자의특성구명 3. 백색부후균의형질전환체개발및분석 4. 결론
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 제 3 장 백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 1. 서론 백색부후균 (White rot fungi) 은척박한환경에서도잘자라며견고한구조의나무를부후시켜분해함으로써산림생태에서영양소의재순환에중요한역할을담당한다. 특히목질에포함된리그닌을분해할수있는대표적인리그닌분해효소군 (ligninolytic enzymes) 인 lignin peroxidase(lip), manganese dependent peroxidase(mnp), laccase 등을이용하여목질을생분해한다. 리그닌분해효소군은낮은기질특이성을가지고있어서백색부후균들은다른균류와달리복잡한중합체를분해하여생장하는능력을지니고있다. 그래서이들은목질뿐만아니라다양한난분해성방향족물질, 염료및내분비계장애물질등을생분해할수있다 (Reddy, 1995; Song, 1999; Cripps and Hirano, 2000; Yu, 2004; Hwang, 2005; Soares, 2005; Yu, 2006; Shin, 2007). 또한백색부후균은분해대상물질의완전무기화가가능하고리그닌분해효소군들은세포외로분비되는효소로물에대한용해도가극히낮은물질이라도산화시키는능력을지녔기때문에백색부후균에의한난분해성물질생분해연구가큰주목을받고있다. 국립산림과학원에서는백색부후균을이용한환경호르몬의분해기술을연구하기위해목질내리그닌과구조적으로유사한환경오염물질에대해우수한분해력을가지는백색부후균으로 - 53 -
겨울우산버섯 (Polyporus brumalis), 아교버섯 (Phlebia tremellosa), 꽃구름버섯 (Stereum hirsutum), 큰이빨버섯 (Basidioradulum molare) 등을우리나라산림에서선발하였다. 리그닌분해력과환경정화기능이강화된백색부후균의우량품종개발을위해서는리그닌분해효소유전자의기능구명과이를이용한형질전환을통해유전자발현조절이필요하다. 따라서백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절연구의목적은목질분해기능이극대화된백색부후균의품종개발을위한리그닌분해효소유전자의 promoter 조작및형질전환기술확립에있다. 2. 리그닌분해효소유전자의특성구명 가. 리그닌분해효소유전자의 full gene 확보 1) 겨울우산버섯의 manganese peroxidase 유전자의 full gene SSC 배지에서배양한겨울우산버섯 (Polyporus brumalis) 으로부터 6개의새로운 MnP 유전자를분리하여 Pbmnp1, Pbmnp2, Pbmnp3, Pbmnp4, Pbmnp5, 및 Pbmnp6로명명하고각각 full gene의염기서열을결정하였다 ( 그림 3-1). 각각의 MnP 유전자는각각 51~89% 유사성을가졌는데전체길이는 1,250~1,500 bp로 ORF(Open Reading Frame) 부분의아미노산서열이 360 aa 정도이고분자량은보통의 MnP가가지는특성인 38-39 KDa에포함되었다 ( 표 3-1). 그러나 UTR(Untranslated Region) 부분의크기가매우달라발현과활성에서다른특성을가질것으로예상되었다. - 54 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 그림 3-1) 겨울우산버섯의 MnP 유전자의 alignment ( 표 3-1) 겨울우산버섯 MnP 유전자의특성 Full length(nt) ORF(aa) 5'UTR(nt) 3'UTR(nt) Mw. pl pbmnp1 1,269 bp 365 aa 17 bp 154 bp 38.92 kda 4.26 pbmnp2 1,274 bp 360 aa 90 bp 101 bp 38.48 kda 4.84 pbmnp3 1,410 bp 363 aa 85 bp 167 bp 38.02 kda 4.25 pbmnp4 1,394 bp 364 aa 545 bp 152 bp 38.10 kda 4.25 pbmnp5 1,471 bp 365 aa 211 bp 193 bp 39.02 kda 4.54 pbmnp6 1,300 bp 364 aa 77 bp 128 bp 37.99 kda 4.07-55 -
2) 겨울우산버섯과아교버섯의 laccase 유전자 full gene 겨울우산버섯에서는 2개의새로운 laccase 유전자로 Pblac1, Pblac2로분리하였고아교버섯에서는새로운 laccase 유전자로 Ptlac1를분리하였다. 세개의유전자의길이는약 1,830 bp 였고 ORF 부분의아미노산염기서열크기는 520 aa 이고분자량은약 56 KDa이며균류의 laccase 가공통적으로가지는 4개의 copper binding region 도잘보존되어있었으며 ( 그림 3-2, 표 3-2) 각유전자간의상동성도 70% 를보였다. 그리고 EMBL Nucleotide sequence database 에 ptlac1(accession # AM282562), pblac1(accession # EF362634) 및 pblac2(accession # EF362635) 를등록하였다. ( 그림 3-2) 겨울우산버섯과아교버섯 laccase 유전자의 alignment - 56 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 표 3-2) 겨울우산버섯과아교버섯의 laccase 유전자특성 Full length(nt) ORF(aa) 5'UTR(nt) 3'UTR(nt) Mw. pl pblac1 1,836 bp 520 aa 48 bp 225 bp 55.92 kda 4.67 pblac2 1,811 bp 524 aa 84 bp 152 bp 56.02 kda 4.17 ptlac 1,832 bp 520 aa 66 bp 203 bp 55.75 kda 4.26 3) 아교버섯의 lignin peroxidase 유전자 full gene 아교버섯이가지는 3개의 LiP cdna(ptlip1, ptlip2, ptlip3) 를 RACE-PCR 방법으로클로닝하였다. 아교버섯 lip 유전자 3개 (1,702-2,088 bp) 를아미노산으로전환하고이를상호비교한결과그림 3-3와같이 ptlip1과 ptlip2는 79%, ptlip1와 ptlip3 은 72%, ptlip2와 ptlip3은 62% 의상동성을보여아교버섯은 3개의 LiP isogene 을가지는것으로판단되었다. 또한, Ptlip1, Ptlip2, Ptlip3를 EMBL Nucleotide sequence database에등록하였다 (Accession # AM397950-397952). ( 그림 3-3) 아교버섯 lignin peroxidase 유전자의 alignment - 57 -
나. 리그닌분해효소유전자의 genomic DNA 분석 1) 겨울우산버섯의 laccase 유전자 genomic DNA 분리겨울우산버섯의 laccase 유전자 (Pblac1, Pblac2) 의 genomic DNA를분리하여 GPBLAC1, GPBLAC2로명명하고두유전자간의비교를해보았는데, cdna의크기는비슷하나 genomic DNA의구조는매우다르게나타났다. 두유전자의 cdna 크기는각각 1563 bp와 1575 bp로비슷하였으나 pblac1의 genomic DNA 크기는 2280 bp이고 pblac2의 genomic DNA 크기는 2141 bp였으며 exon과 intron의크기와배열에서매우다른양상을보여서로다른특성과발현을보일것으로예상되었다 ( 그림 3-4). ( 그림 3-4) 겨울우산버섯의 laccase genomic DNA 구조 2) Southern blot에의한유전자확인겨울우산버섯과아교버섯의 chromosomal DNA로부터유래된유전자임을확인하기위하여 4가지제한효소에의해각각의 copy 수가보이는지확인하였고각각의유전자들이다른밴드의양상을띠는것을보아 genomic DNA 결과와종합하여보면각각의유전자들이구조적으로확실히다른특성을가지고있다고결론지을수있었다 ( 그림 3-5, 3-6 및 3-7). - 58 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 그림 3-5) Southern blot 분석에의한겨울우산버섯의 Laccase 확인 ( 그림 3-6) Southern blot 분석에의한겨울우산버섯의 MnP 확인 - 59 -
1 2 3 4 5 lane 1:positive control(pcr product) lane 2:negative control(prs 316) lane 3:Mt dikaryon(hind III) lane 4:Mt-2 monokaryon(bamh I) lane 5:Mt-2 monokaryon(hind III) ( 그림 3-7) Southern blot 분석에의한아교버섯의 laccase 확인 다. 리그닌분해효소의유전자발현특성조사 1) 겨울우산버섯의리그닌분해효소역가및유전자발현조사겨울우산버섯의리그닌분해효소역가및발현량은예상한바와같이 PDB 배지보다효소분비용배지인 SSC 배지에서높게나타났다. 이를바탕으로리그닌분해효소의유전자의발현조절을위해서는 SSC 배지에서배양한균사체를이용하고후에형질전환체도 SSC 배지에서배양하여그발현량을비교분석한다면좋은결과를얻을수있을것이라고판단되었다 ( 그림 3-8). - 60 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 그림 3-8) 배지조성에따른리그닌분해효소역가 ( 상 ) 및유전자의발현양상 ( 하 ) DBP(Dibutylphthalate) 처리농도와시간에따른발현특성을조사하였는데유전자마다발현의정도는차이나지만 DBP 처리에의해리그닌분해효소유전자발현이유도되며특히 pbmnp2, pbmnp4 그리고 pblac1 유전자가강하게유도되어환경호르몬분해에매우강하게발현되는유전자로특징지을수있었다 ( 그림 3-9, 3-10). - 61 -
MnP specific activity 250 200 control 100uM 300uM 150 100 50 0 5 일 5 일 (0) 10 일 (5) 14 일 (9) 20 일 (15) ( 그림 3-9) 겨울우산버섯의 MnP 활성및발현특성 250 200 Laccase specific activity control 100uM 300uM 150 100 50 0 5 일 5 일 (0) 10 일 (5) 14 일 (9) 20 일 (15) ( 그림 3-10) 겨울우산버섯의 laccase 활성및발현특성 2) 아교버섯의리그닌분해효소역가및유전자발현조사아교버섯의최소배지배양시 BPA(50 ppm), BBP(300 ppm), DEP(400 ppm) 을각각더하고 laccase 의활성변화및발현을분석한결과배양 7일째상등액의 laccase 활성과균체에발현정도는모두 DEP에서약 35배의활발한활성및발현증가를보였고, BBP에서도약 26배의증가를보였다. 그러나 BPA에의한활성및발현증가는나타나지않았다 ( 그림 3-11). - 62 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 A) B) Enzyme activity (U/ml) 2,000 1,600 1,200 800 400 0 No addition DEP 1.8 mm BBP 1.0 mm BPA 0.2 mm 1 2 3 4 ( 그림 3-11) 환경호르몬첨가에따른아교버섯의 laccase 활성. A, laccase 활성. B, Northern 분석에의한 laccase 발현 ; lane 1, 무첨가 ; lane 2, DEP(400 ppm); lane 3, BBP(300 ppm); lane 4, BPA(50 ppm) Lignin peroxidase의발현분석은클로닝된 lignin peroxidase들이 BPA, BBP 및 DEP에의한활성증가는 BBP에서약 20~60% 증가를나타냈고, DEP에의한증가는없었으며 BPA의경우오히려활성이감소하는것으로나타났다 ( 그림 3-12). 한편 Slot blot을사용한 Northern hybridization 분석에서는 BBP에의한발현증가가일정치않았다 ( 결과미제시 ). ( 그림 3-12) 아교버섯 lignin peroxidase(lip1) 발현 - 63 -
LiP 의경우 Mn 2+ 가높은농도로존재할때발현이증가하기때문에 MnSO 4 의 농도를각각 2 μm, 100 μm, 200 μm 을더하고배양한결과 200 μm 농도에서뚜 렷한활성증가를보였으며이때유전자의발현도동시에증가하였다 ( 그림 3-13). A) B) influence of Mn2+ on Lip 1 O.D (310nm) 0.8 0.6 0.4 0.2 0 4 8 12 day Mn- Mn+ ( 그림 3-13) MnSO 4 첨가에따른아교버섯의 lignin peroxidase 활성. A, Lip 활성 B, Lip 유전자발현특성 내분비계장애물질 (EDC:Endocrine disrupters) 분해에대한아교버섯의활성은 phthalate group에는상당한효과가있는것으로확인되었으나 bisphenol A에는거의작용하지못하는것으로나타났다. 그러므로 bisphenol A 계열의물질을분해하기위하여몇가지방법을개발해야할것이다. 즉타균류를이용하거나아교버섯이가지지않는 manganese peroxidase(mnp) 를도입하여작용범위를확대하는방법등이다. EDC 첨가에의한 laccase 의활성증가를확인하기위해배양액의상등액을취하여 o-tolidin 이효소에의해산화되어발색되는정도를흡광도로측정하였을때유전자의발현이유도되는결과와같이 DEP 400 ppm과 BBP 300 ppm 처리에의해활성이크게증가되었다 ( 그림 3-14). - 64 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 그림 3-14) EDC 첨가조건에서아교버섯상등액의 laccase activity 변화 EDC 첨가조건에서 laccase 발현이유도되는것을확인하기위해배양액에 DEP, BBP, BPA를넣고아교버섯균사로부터 total RNA를분리하여 northern blot과 RT-PCR 을실시하였다. DEP 400 ppm과 BBP 300 ppm 처리군에서유전자의발현이증가되는것을확인하였고특히 DEP 에의해발현이크게증가하였다 ( 그림 3-15). (A) (B) ( 그림 3-15) EDC 첨가조건에서아교버섯의 laccase 발현분석. A, Northern blot(lane 1:RNA marker 0.2~10 kb(sigma), Lane 2:positive control(laccase full length cdna), Lane 3:control(Non adding), Lane 4:DEP 400 ppm, Lane 5:BBP 300 ppm, Lane 6:BPA 100 ppm, Lane 7:Negative control(pbargem7-1)), B, RT-PCR(Lane 1, 5:DNA(+) ladder, Lane 2: control(non adding), Lane 3:DEP 400 ppm, Lane 4:BBP 300 ppm) - 65 -
라. 리그닌분해효소특성조사 1) 리그닌분해효소분리아교버섯을 PDB 액체배지에서배양한후상등액을회수하여 ethanol precipitation하고 DEAE-Sepharose CL-6B ion exchange column으로분획하여농축시킨후 10% native polyacrylamide slab gel로 Native-PAGE 와 10% SDS polyacrylamide slab gel 로 SDS-PAGE 실시한결과약 70 KDa의분자량을갖는 laccase 단백질을분리하였다. 염기서열에의해결정되는단백질의예상분자량은대략 56 KD 정도로본다면이는실제아교버섯의 laccase 가보통 glycosylation 되어분자량이예상사이즈보다크게된것으로보여진다 ( 그림 3-16). (A) (B) ( 그림 3-16) Native-PAGE 후 o-tolidine으로 activity staining하여아교버섯의 laccase 단백질확인 (A), SDS-PAGE 후 coomassie blue staining 을통해약 70 KDa 의분자량을확인 (glycosylation form으로예상됨 ), Lane 1:molecular weight marker, Lane 2:purified Mt2 Laccase(560 ng loading), Lane 3: purified Mt2 Laccase(840 ng loading) - 66 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 2) 리그닌분해효소생산을위한효모형질전환용벡터제작효모의대량생산에이용되는 ppiczb와 ppiczαc( 또는A) 벡터에겨울우산버섯에서분리한 laccase 유전자를삽입하여 6종의재조합벡터를제작하고 ( 표 3-3) 전기충격장치를이용하여 Pichia pastoris 효모에형질전환하여확인하였다 ( 그림 3-17). ( 표 3-3) 효모형질전환용벡터 번호 재조합벡터 삽입된유전자 벡터 1 ppiαlac1 pblac1 ppiczαc 2 ppiαlac2 pblac2 ppiczαa 3 ppilac1 pblac1 ppiczb 4 ppilac2 pblac2 ppiczb 5 ppilac1 pblac1-a ppiczαc 6 ppilac1-a pblac1-a ppiczb ( 그림 3-17) 재조합벡터가삽입된 Pichia pastoris 확인 M:1 kb(+)ladder, 1:pPIα lac1, 2:pPIαlac2, 3:pPIlac1, 4:pPIlac2, 5:pPIαlac1-A, 6:pPIlac1-A 마. 겨울우산버섯의 cdna library 제작및전체적인발현유전자분석 1) 겨울우산버섯의 cdna library 제작 cdna librery 합성 kit 를사용하여형성된 1 차 library 의크기는 5.25 10 5-67 -
clones 이였고이중증폭된 library titer는 1 10 7 pfu/ml이었다. 분석된 libraries 는 500bp이상의 cdna가삽입되었고 ( 그림 3-18), library titer는 1 10 7 pfu/ml이었다. Sequencing된 cdna는 1,582개였고, ESTs 분석된것은 1,479개로 103개는 quality가낮아제거하였다 ( 표 3-4). ( 표 3-4) 겨울우산버섯의 cdna lilbrary 요약 Mean insert size 500 bp Library titer 1 10 7 pfu/ml Number of cdnas sequenced 1582 Mean reading length 569.7 Mean ESTs length(exclude vector & polya) 544 Number of high quality ESTs 1479 Number of unusable read 103 - low quality(<200bp) 103 ( 그림 3-18) cdna library 에서벡터내로삽입된 cdna 확인 2) cdna library 유전자분석 위에서제작한 cdna library 로부터 1,479 개의 EST(Expressed Sequence Tags) 를 생성시켜그결과를분석한결과는표 3-5 및그림 3-19 와같다. 분석된 1479 개의 - 68 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ESTs 중 702 개의 ESTs 가 181 개의 cluster 를형성하였고단일의 EST 수는 777 개였 다. 따라서 unique EST 는총 958 개였으며분석된 ESTs 는약 47% 의 redundancy 를보였다. ( 표 3-5) 겨울우산버섯의 EST 요약 Description N0. of ESTs Number of ESTs assembled 1479 Number of clusters 181 Clustered ESTs 702 Number of singlets 777 Number of unique ESTs 958 Redundancy (clustered ESTs/Total ESTs) 47% ( 그림 3-19) 겨울우산버섯 EST 의 redundancy level Redundancy 를보이는것들중 cluster size 가 121, 44, 12, 10 인것은각각 1 개 씩이었고 2 개의 cluster 는 105 개로가장많이차지하였다 ( 그림 3-19). 각각의 EST - 69 -
를 BlastX 프로그램을통해 GeneBank의데이터베이스에서 homology를조사한결과기능이알려진유전자와유사성을갖는것이 28%(Known), 기능이알려지지않은유전자와유사성을갖는것이 29%(Unknown), GeneBank의데이터베이스에서유사한유전자를찾을수없는것이 43%(No hit) 로분류되었다 ( 그림 3-20). 그리고유사성이있는 EST들을 yeast 유전자의기능분류데이터를참고하여기능별로분류해본결과 protein synthesis가 16% 로가장높았고, 그다음으로 metabolism, localization, unclassfied protein이각각 15% 를차지하였다 ( 그림 3-21). ( 그림 3-20) BLASTX 데이터베이스검색결과 3.3% 0.5% 5.8% 4.9% 1.6% Metabolism 15.4% Energy Cell cycle and DNA processing Transcription 3.8% 7.5% 2.5% 9.0% 6.8% 6.0% 3.9% 8.0% Protein synthesis Protein fate (folding, modification, destination) Protein with biniding function/ cofactor requirement Protein activity regulation Cellular transport Cellular communication/ signal transtuction Cell rescue and defense Interaction with the cellular environment Cell fate 0.8% Development 10.4% 9.9% Biogenesis of cellular components Cell type differentiation Unclassfied protein ( 그림 3-21) EST 의기능별분류 - 70 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 Redundancy 가높은 EST는표 3-6에서나타나는바와같이 small heat shock protein, membrane protein 등이있었으며이중 heat shock protein은 121개의 clusters로 redundancy 가매우높았다. Heat shock protein은 cell이 damage를받았을때발현되어그 damage 를줄여주어 cell이살아남을수있게하는단백질이다. 따라서높은농도의 DBP와 DEHP 처리에서도균사가생장할수있는겨울우산버섯의특성은이단백질의발현이높은것과관련성이있을것으로추정되며앞으로더자세한연구가필요하다고사료된다. ( 표 3-6) EST 에서고발현유전자 Description Percent No. of contigs Small heat shock Unnamed protein product Membrane protein Heat shock protein HSS1 Translation elongation factor 1α 8.2% 3.0% 0.8% 0.5% 0.5% 121 44 12 8 7 바. Promoter 분리및특성구명 1) 겨울우산버섯의 laccase promoter 분리 laccase 유전자의발현조절메커니즘을구명하고 homologous expression 형질전환방법에의한우수한균주의개량에서유전자발현을조절하는 promoeter 확보하기위해겨울우산버섯의 PBLAC1 genomic DNA로부터 promoter 를분리하고자하였다. 그기초단계로우선 PBLAC1 genomic DNA의 TATA box 앞에몇가지 functional group에해당하는 site를확인하였다 ( 그림 3-22). - 71 -
( 그림 3-22) 겨울우산버섯 genomic DNA(PBLAC1) 에서 functional group 의위치 2) 아교버섯의 laccase promoter 분리아교버섯으로부터 3,153 bp 길이를갖는 laccase의 genomic DNA를분리하여전사개시점앞부분으로 810 bp 크기의 promoter 를확보하였다. 염기서열을분석한결과 MREs(Metal-responsive elements), CreA(CreA-binding sites), HSEs(Heat-shock elements), NFBs(Nitrogen factor binding sites), XREs(xenobiotic-responsive elements) 등의다양한 cis-element가존재하였다 ( 그림 3-23). ( 그림 3-23) Laccase promoter 서열및예상되는다양한 consensus 들확인 - 72 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 Laccase promoter를이용하여유도발현형질전환벡터 (pbarmtprolacc) 를제작하고 ( 그림 3-24) 상용되는 gpd promoter(pbarlac) 와유전자발현활성을비교하기위하여기계충버섯에각각의벡터를형질전환하여발현이조절되는 laccase효소활성을조사하였다. 무처리상태에서아교버섯의 laccase promoter가사용된형질전환체 (pbarmtprolacc) 와 gpd promoter 가사용된형질전환체 (pbarlac) 간의효소활성이비슷하였으나 EDC를첨가하였을때 pbarmtprolacc 형질전환체에서활성이 BBP에서는 3배, DEP는약 4배, BPA는 1.5배더증가되었다. 따라서 EDC를효과적으로분해하기위해서는유전자발현이크게증가되는 pbarmtprolacc 벡터가효과적임을알수있었다 ( 그림 3-25). (A) (B) ( 그림 3-24) Laccase promoter와 laccase genomic DNA를포함하는 laccase 유전자를 pbargem 7-1과재조합한모식도. A, 재조합모식도, B, Left lane, 1 kb (+) ladder; right lane, pbarmtprolacc(7.6 Kb) - 73 -
( 그림 3-25) gpd promoter 와 EDC에의해발현이유도되는 laccase promoter의활성비교 3. 백색부후균의형질전환체개발및분석 가. 형질전환방법확립 1) Transformation 의선택표지로서선택제재에대한민감성분석백색부후균의리그닌분해효소의특성을알고형질전환을하기위한기초자료로사용하기위해몇가지형질전환에주로사용하는선택제재에대한민감성여부를조사하였다. 겨울우산버섯과아교버섯의항생물질에대한민감성조사는표 3-7 및표 3-8과같다. 아교버섯 monokaryon(pt-2) 의경우 glutamine synthetase inhibitor 인 phosphinothricin 에대한민감성이가장두드러졌고, 균류의형질전환실험에서흔히사용하는 hygromycin B에대해서는저항성이있는것으로확인되어이선택제재는형질전환시사용하지않는것이바람직하다고판단되었다. 이에비해겨울우산버섯의경우 hygromycin B에대해서민감성이확인되어형질전환시 50 ug/ml 농도이상에서선택제재로사용가능함을확인하였다. - 74 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 표 3-7) 아교버섯의항생물질에대한민감성 dikaryon ( 원균주 ) monokaryon (Pt-2) monokaryon (Pt-87) dikaryon (mating) hygromycine B 75 μg/ml + + + + 100 μg/ml + - + + geneticin 150 μg/ml +++ + +++ +++ 200 μg/ml + - +++ + 250 μg/ml + - + + phosphinothricin 20 μg/ml - - - + 30 μg/ml - - - + +++: 정상, +: 성장저해, -: 성장못함 ( 표 3-8) 겨울우산버섯의항생물질에대한민감성 Hygromycin B 농도 100 μg/ml 75 μg/ml 50 μg/ml 25 μg/ml 0 μg/ml 균사성장정도 - - - + +++ +++: 정상, +: 성장저해, -: 성장못함 2) 백색부후균의균사체로부터원형질체 (protoplast) 분리 10일간 PDA 배지에서배양한공시균주의균사를수술용칼로잘라 PDB 배지 100 ml에넣고 5 일간 1차배양하였다. 배양 5 일째자란균사체를 blending 하여 (Waring Commercial) PDB 배지 100 ml에 20%(V/V) 농도로하여 2차배양하였다. 5일후같은방법으로 blending 한균사체를 20%(V/V) 농도로하여 CKMM 최소배지 (1% maltose, 0.2% KNO 3, 40 ml trace element(cacl 2, MgCl 2 6H 2 O, FeCl 3 6H 2 O, citric acid, MnSO 4, ZnSO 4 ), 25 ml salt solution(ammonium tartrate, - 75 -
KH 2 PO 4, Na 2 PO 4, Na 2 HPO 4, Na 2 SO 4 ), 1 ml thiamine solution(0.1 mg / ml )) 100 ml에넣고 1일배양하였다. 배양하여얻은균사체를원심분리 (Hettich Rotina 38R, 3,000 rpm, 10 min, 25 ) 하여회수하였고, 회수한균사체는삼투압안정제 (0.6 M sucrose) 를이용하여 2번 washing하고원심분리 (Hettich Universal 320R, 3,000 rpm, 10 min, 25 ) 했다. 원형질체생성을위해원형질체생성효소로서기계충버섯과아교버섯은 1% Novozyme 234를겨울우산버섯은 0.5% Usukizyme 을회수한균사체양에대해 2배양의삼투압안정제에녹여서균체에첨가하고이것을 30, 70 rpm로 shacking incubator(vision) 에서 1~4시간동안흔들어주면서원형질체가형성되는것을확인하였다. 형성된원형질체는 filtration Assembly(Aldrich chemical) 를이용하여회수하였고, 회수된원형질체는 STC buffer(0.55 M Sorbitol, 10 mm Tris HCl, ph 7.5, 10 mm CaCl 2 ) 로 2번 washing 단계를거쳐 (Hettich Universal 320R, 9,000 rpm, 20 min, 4 ) 반응에관련된효소를제거하였다. Pellet을 STC buffer 700 μl에현탁하고 hemocytometer 를이용하여원형질체수를계산하여ml당 1 10 7 의농도가되도록 STC buffer 양을계산하여최종적으로원형질체가약 1.0 10 7 / ml가되도록 STC buffer에현탁하였다. ( 그림 3-26) Blender( 좌 ) 및분리된원형질사진 ( 우 ) - 76 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 3) 원형질체 (protoplast) 수계산법원형질체액을그림 3-27과같은구조를갖는 hemocytometer 의 counting chamber 안에충분히들어가도록올려놓고 cover glass를덮은다음현미경으로그림 3-28 에서보이는네곳의모퉁이와가운데를포함하는 5곳의 1/25 sq. mm. 안에들어있는 protoplast 수를합산한다음아래와같이계산한다. 가 ) 1 ml당 protoplast 수 = 5개 1/25 sq. mm. 안의 protoplast 수 5 10 4 나 ) protoplast를녹인 STC buffer 최종 volume( ml )=1 ml당 protoplast 수 /1 10 7 ( 그림 3-27) Hemocytometer 의구조 ( 그림 3-28) Hemocytometer 의눈금 - 77 -
4) REMI(Restriction enzyme mediated integration) 방법에의한형질전환 5 μg의벡터 DNA를제한효소로절단하여 STC buffer에현탁되어있는 300 μl의원형질체 (1 10 7 개 / ml ) 에넣은후 40% PEG 용액 (40% polyethlene glycol 4000, 25 mm CaCl 2, 25 mm Tris-HCl, ph 7.5) 을섞어서상온에서 30분반응하고삼투압안정제로써 0.55 M sorbitol 이첨가된 CKMM 액체배지에서 25 에서 16 시간정도배양하였다. 액체배지에서배양된혼합물 100 μl를 0.55 M sorbitol 과 0.8% agar를포함한 10 ml CKMM 선별배지에섞고이를 bottom 배지 (agar 1.6%) 인 CKMM 선별배지 (0.55 M sorbitol 포함 ) 에부어 25 에서배양하였다. CKMM 선별배지에는사용하는균과벡터에맞는항생제로겨울우산버섯에는 50 μg / ml hygromycin 과 ampicillin, 기계충버섯과아교버섯에는 50 μg / ml phosphinothricin 과 ampicillin 을각각첨가하였다. 배양다음날부터관찰하여균사가형성되는것이보이기시작하면균사부분만칼로잘라서항생제의농도를두배로증가시킨 2차선별배지로옮겨배양하였다 ( 그림 3-29). ( 그림 3-29) 아교버섯원형질분리 ( 좌 ) 및항생제배지에서자라는형질전환체 ( 우 ) - 78 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 나. 형질전환용벡터개발 1) 겨울우산버섯형질전환용기본벡터제작겨울우산버섯의형질전환용기본벡터를확보하기위해 pan 7-1에서 PCR을이용하여 685 bp 크기의 Pgpd promoter(pgpd-1) 를포함한 hygromycin 저항유전자 (hph) 를증폭하고이를 pbargem 벡터에서 bar 유전자와 promoter가제거된곳에삽입하여 HPH가선별마커로도입된 phytrp 벡터를제작하였다. phytrp 에원하는유전자가항상발현되도록조절하는 promoter 를삽입하기위해 PgpdA promoter를 pbargpe1 벡터에서 BamH1과 BglII로잘라내어 BamH1으로절단한 phytrp 와 ligation 하여 phygpt 벡터를만들었다 ( 그림 3-30). ( 그림 3-30) phytrp 에 PgpdA 를추가하여 phygpt 벡터개발 또한, Ttrpc terminater 를가지면서선별마커로 phosphinothricin 저항성유전자 (bar) 와 hygromycin 저항성유전자 (hph) 를각각가지고있는 pbartrp, phytrp - 79 -
벡터를제작하고여기에 2 종류의 promoter 를각각추가하여 phygpt, phycry 를 제작하여새로운백색부후균형질전환용기본벡터 4 종을제작하였다 ( 그림 3-31). 2) 형광표지유전자발현용벡터 새로제작된 phygpt 벡터와 pan 벡터에형광표지유전자 (GFP, CFP) 를삽입하여 유전자의발현을형광으로확인할수있는형질전환벡터를제작하였다. 3) 겨울우산버섯리그닌분해효소유전자발현용벡터기본벡터에겨울우산버섯에서분리한리그닌분해효소유전자를재조합하여백색부후균형질전환용벡터 phylac1, phclac1, pbarlac1, pbarmnp4, pbarmnp4atg, pbarlac1를제작하였다 ( 그림 3-32). ( 그림 3-31) 새로제작된형질전환용기본벡터, promoter와유전자발현벡터 : pbartrp(bar 선별마커 ), phttrp(hph 선별마커 ); 유전자과발현벡터 : phygpt(gpd promoter), phycry(crypromoter) - 80 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 그림 3-32) 리그닌분해효소유전자발현용벡터 (laccase 유전자발현벡터 :phylac1, phclac1, pbarlac1; MnP 유전자발현벡터 :phymnp4atg, pbarmnp4, pbarmnp4atg) 4) 아교버섯리그닌분해효소유전자발현용벡터 trpc terminater와 gpd promoter를포함하는벡터 pbargpe1 에아교버섯의 laccase 유전자를발현벡터로재조합하여 pbarptlac 벡터를제작하고 XhoI 제한효소로확인하였다 ( 그림 3-33, 3-34, 3-35). - 81 -
( 그림 3-33) 아교버섯의형질전환용벡터모식도 ( 그림 3-34) 형광표지유전자발현용벡터 - 82 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 그림 3-35) 아교버섯형질전환용벡터 (pbarptlac) 확인. Lane 1, molecular weight marker(1 kb ladder); lane A2, cloned laccase cdna(1.8 kb; red arrow); lane B2, pbargpe1(5.5kb); lane B3, pbarptlac(7.3 kb). 유전자의발현을조절하기위해상용되는 gpd promoter 를제거하고아교버섯에서분리된 laccase 유전자의발현에관여하는 810 bp 부분의 laccase promoter 를동일한제한효소로잘라서삽입하여유도발현형질전환벡터 (pbarmtprolacc) 를제작하였다 ( 그림 3-36). ( 그림 3-36) 아교버섯의 laccase promoter 가삽입된형질전환벡터 - 83 -
5) 구름버섯리그닌분해효소유전자발현용벡터 pbargpe1 에구름버섯의 MnP 유전자를발현벡터로재조합하여 pbartvmnp 벡터를제작하고 XhoI 제한효소로확인하였다 ( 그림 3-37). ( 그림 3-37) 구름버섯 MnP 가삽입된형질전환벡터 다. 형질전환체특성조사 1) 겨울우산버섯의형질전환체겨울우산버섯에사용한벡터는 phygpt, phylac1, phyegfp, PAN 벡터를아교버섯은 pbarlac1과 pbartvmnp2 벡터를이용하여 REMI 방법으로형질전환을실시하여겨울우산버섯에서 68개, 아교버섯에서 26개의균사체를항생제배지에서 1차선발하였다 ( 그림 3-38). 항생제배지에서선발된형질전환체에서외래유전자도입유무를확인하기위해선별된균사체로부터 genomic DNA를분리하고이를도입 - 84 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 된벡터 primer 로 PCR 수행하여전기영동으로확인하였다 ( 그림 3-39). PCR 확인 결과아교 pbarlac1 벡터에서 5 개, 겨울우산에서 phygpt 는 9 개, phylac1 는 23 개, phyegfp 는 15 개, PAN 는 0 개의형질전환체가확보되었다 ( 표 3-9). ( 그림 3-38) 겨울우산버섯원형질체및항생제배지에서형질전환체선발 A: 분리된겨울우산버섯원형질체, B: 항생제배지 (hygromycin B 50 μg / ml ) 에서자란균사 C, D: 항생제배지 (hygromycin B 100 μg / ml ) 에서겨울우산버섯균사와형질전환시킨균사의성장비교 (WT: 겨울우산버섯야생형균주, 1~8: 형질전환시킨균사 ) ( 표 3-9) 아교버섯과겨울우산버섯형질전환체의개수 공시균주 도입된벡터 항생제선발된균사체 PCR 확인된형질전환체 아교버섯 pbarlac1 26 5 겨울우산버섯 phygpt 13 9 phylac1 28 17(6) phyegfp 22 15 PAN 5 - - 85 -
( 그림 3-39) PCR을이용한형질전환체확인, 아교버섯 :pbarlac1, 겨울우산버섯 : phygpt, phylac1, phyegfp, PAN Laccase 를과발현시킬수있는 phylac1 벡터를도입한형질전환체에서 laccase 의활성이증가되었는지확인하기위해겨울우산버섯야생형균주와항생제배지에서선발된형질전환균사체를염료 (Poly R, RBBR) 가첨가된고체배지에배양하여탈색능을비교하였다. RBBR이첨가된배지에서는 1, 12, 13, 17, 19, 21, 24, 27번형질전환체에서야생형균주에비해비교적높은탈색능을보였고 Poly R이첨가된배지에서는 1, 13, 16, 20, 23, 24, 27번형질전환체에서야생형균주에비해비교적높은탈색능을보였다 ( 그림 3-40). - 86 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 그림 3-40) RBBR이첨가된고체배지에서탈색능조사, WT: 겨울우산버섯야생형균주, 1~27:pHYlac1 이도입된겨울우산버섯형질전환체 (A: 배양 7일, B: 배양 17 일 ) ( 그림 3-41) Poly R이첨가된고체배지에서탈색능조사, WT: 겨울우산버섯야생형균주, 1~28:pHYlac1 이도입된겨울우산버섯형질전환체 (A: 균사생장비교, B: 탈색비교 ) - 87 -
액체배지에서 laccase 활성은 o-tolidine의산화에의한발색으로조사하였다. 배양일수에따라활성의변화가많아서활성의차이를일정한값으로나타낼수없었으나대체적으로형질전환체에서높은 laccase 활성을보였다. 야생형균주에서는배양후 7일이전까지는 laccase 활성은거의없었으나배양기간이지속되면서형질전환체에서는 laccase 활성이증가되어야생형균주가가장높은효소활성을나타내는 10~11일배양기간에서 23, 25, 26번형질전환체는야생형균주보다 3-4 배높은활성을나타내었으며 ( 그림 3-40) 배양후 20일전후에서는야생균주에비해형질전환체에서 10배에서최고 50배이상높은활성을나타냈다 ( 그림 3-42). ( 그림 3-42) 액체배지 (SSC) 배양에서 laccase 활성비교. 배양액에존재하는 laccase에의해 o-tolidine이산화되는정도를 590 nm에서흡광도를측정하여효소활성을조사. 야생형균주 (WT) 의효소활성이나타나는배양 7일에서 laccase 활성을대조구에대한상대값으로비교 ( 좌 ), 효소활성이가장높은배양 10과 11에서 laccase 활성을산화된 o-tolidine의흡광도로비교 ( 우 ). - 88 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 그림 3-43) 겨울우산버섯형질전환체 laccase 활성조사 (W.T : 야생균주, V19, 22 : laccase가없는벡터, 8-26 : laccase가과발현하는벡터형질전환체 ) 2) 아교버섯의형질전환체구름버섯에서 (Trametes versicolor) 에서분리한 MnP 유전자를형질전환벡터 (pbartvmnp2) 로제작하여아교버섯 (Phlebia tremellosa) 에도입한형질전환체들의 MnP 활성이야생균주보다증가되었고 ( 그림 3-44), 아교버섯형질전환체에서 genomic DNA를 Bar와 MnP 유전자의 specific primer로 PCR하여 MnP가삽입됨을확인하였다 ( 그림 3-45). ( 그림 3-44) 아교버섯형질전환체의 MnP 활성비교 - 89 -
( 그림 3-45) 아교버섯형질전환체의 pbartvmnp2 벡터도입확인 (A : bar gene specific primers, B : MnP specific primers) 아교버섯에 laccase 유전자를삽입한형질전환체를항생제배지에서항생제저항성을재차확인한결과 10개의균주가야생형균주에비해뛰어난생장을나타내었고선발된아교버섯형질전환균사체가배양된고체배지에서 EDC 첨가에의해 laccase 활성이증가되는것을확인하였다. ( 그림 3-46) 아교버섯형질전환체의 pbarptlac 벡터도입확인, Lane M:1Kb(+)ladder, Lane 1:Positive control(bar gene of pbargpe1), Lane 2:Negative control( 야생형균주 ), Lane 3~8: 형질전환체 - 90 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 그림 3-47) 아교버섯형질전환체의 laccase 과발현 ( 그림 3-48) EDC 첨가조건에서형질전환체의증가된 laccase 활성측정 구름버섯의 MnP 유전자를아교버섯에삽입하여형질전환체를생성하고 RT-PCR ( 그림 3-49) 과 Southern blot( 그림 3-50) 으로확인하였으며, 항생제배지에서선발된아교버섯의형질전환체중 5, 6, 8, 9번이높은 MnP의활성을나타내었으며특히 MnP 유도배지에서더높은활성을보였다 ( 그림 3-50). (A) (B) ( 그림 3-49) Complete medium에서의 MnP activity 측정 (A), MnP 유도배지에서 MnP activity 측정 (B) - 91 -
(A) (B) ( 그림 3-50) Southern blot으로 pbartnmnp 벡터삽입확인, Lane 1:Recipient, Lane 2: Transformant #5, Lane 3:Transformant #17, lane 4:Transformant #2-1(A), 형질전환체 #9은적어도 MnP 2 copy 이상, #5와 #6은 2 copy가삽입되었을것으로판단 (B) 3) 기계충버섯의형질전환체 Laccase 를갖고있지않거나갖더라도매우약하게발현되는기계충버섯에아교버섯의 laccase 를형질전환하여고체배지와액체배지에서배양하여 o-tolidine으로 laccase 활성을조사한결과형질전환체들이야생균주보다 5배까지활성이증가되었다 ( 그림 3-51). ( 그림 3-51) 고체배지 (A) 와액체배지 (B) 에서 laccase 활성비교 (1 : 야생균주, 2-4 : 형질전환체 ) Genomic DNA 를추출하여 bar-gene specific primer 와 laccase specific primer 를이용하여 PCR 을수행하여 chromosomal DNA 로 bar 와 laccase 유전자가삽입 - 92 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 된것이확인되었고 Southern blot analysis 에서도유전자삽입확인하였다 ( 그림 3-52). 발현이유도되는 laccase promoter 를사용한형질전환체 (pbarmtprolacc) 의유전자발현은 EDC에의해증가되었으며특히 DEP에의해서 4배이상발현이증가하는것을알수있었다 ( 그림 3-53). ( 그림 3-52) 기계충버섯의형질전환체에서 pbarptlac 및 pbarmtprolacc 벡터의도입확인 ( 좌 :PCR 및우 :Southern blot analysis) ( 그림 3-53) 형질전환체 pbarmtprolacc 기계충버섯에서 EDC 처리에의한유전자발현분석 - 93 -
라. 형질전환체의난분해성물질분해능분석 1) 형질전환체에의한 EDC 분해리그닌분해효소활성이증가된형질전환체에의한 EDC 분해력을조사하기위해배양액에다양한 EDC를넣고야생균주와형질전환체의균사체를배양한후효소활성을측정하고 HPLC로분해된 EDC 잔존량을조사하였다. Laccase 발현이증가된기계충버섯형질전환체모두야생균주보다효소활성이증가되었고분해후 EDC 잔존량도감소되어분해율이 20~50% 증가되었다. 특히 pbarmtprolacc 에서는효소활성이 EDC에의해크게증가되고 NP의감소량은 4배증가하였다 ( 그림 3-54, 3-55). ( 그림 3-54) 기계충버섯 pbarptlac 형질전환체에의한 EDC 분해에서 laccase 활성 ( 좌 ) 및 HPLC에의한 EDC 잔존량분석 ( 우 ) 또한, MnP 발현이증가된아교버섯에서는 BPA 에의해효소활성이증가되고 EDC 감소량도크게증가되었다 ( 그림 3-55). - 94 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 ( 그림 3-55) 기계충버섯 pbarmtprolacc 형질전환체에의한 EDC 분해에서 laccase 활성 (A) 및 HPLC에의한 EDC 잔존량분석 (B) ( 그림 3-56) 아교버섯형질전환체에의한 EDC 분해에서 laccase 활성 (A) 및 HPLC 에의한 EDC 잔존량분석 (B) - 95 -
EDC의에스트로겐성을보여줄수있는 Yeast two hybrid system으로 EDC 분해산물의에스트로겐활성을확인하였다. 기계충버섯의형질전환체는야생균주에비해에스트로겐성이현저히줄어들어 70~90% 감소율을보였고 ( 그림 3-57), 아교버섯의형질전환체는야생균주에비해에스트로겐성이약간줄어드는경향을보였다 ( 그림 3-58). ( 그림 3-57) 기계충버섯 pbarptlac(a), pbarmtprolacc(b) 형질전환체에의한 EDC 분해산물의에스트로겐성분석 ( 그림 3-58) 아교버섯형질전환체에의한 EDC 분해산물의에스트로겐성분석 2) 형질전환체에의한염료분해 리그닌과구조가유사한방향족환을갖는염료에대해형질전환체의분해력을 조사하였다. 배지에다양한염료를첨가후기계충버섯의야생균주와형질전환체 - 96 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 의균사를배양한후흡광도를측정하여염료의탈색정도를확인한결과 0.01% 의 Poly-R 과 0.04% 의 RBBR 은야생균주보다약간높았으며 0.01% 의 metyl green 에 서는 2~3 배높은탈색능을보였다 ( 그림 3-59). ( 그림 3-59) 기계충버섯에의한염료탈색능조사 (Poly-R 0.01%, RBBR(Remazol Brilliant Blue R) 0.04%, Methyl Green 0.01%) 3) 리그닌분해분석리그닌분해효소의활성이증가된겨울우산버섯형질전환체의리그닌분해력을조사하기위해모래배지에서상수리나무와소나무와시편블록 (8cm 3 ) 의중량감소율및리그닌함량을분석하였다 ( 그림 3-60). 중량감소율은상수리나무의경우야생균주에비해 1.5배정도증가되어 60일째는 25% 정도의비슷한감소율을보이나소나무의경우 2% 에서 20% 까지형질전환균주마다차이가컸으며야생균주와비교하면 4~40배까지감소율증가되었다 ( 그림 3-61상 ). 그리고리그닌함량은형질전환체에서상수리나무의경우 2~27% 까지감소율을보였으며소나무의경우약 10% 정도의감소율을보여야생균주에비해 12~20배리그닌분해력이증가되었다 ( 그림 3-61하 ). - 97 -
( 그림 3-60) 모래배지에서겨울우산버섯의소나무 ( 좌 ) 와상수리나무 ( 우 ) 분해실험모습 ( 그림 3-61) 모래배지에서겨울우산버섯형질전환체에의한소나무와상수리나무의분해력분석 - 98 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 4. 결론 가. 겨울우산버섯으로부터는 2개의 laccase 유전자와 6개의 MnP 유전자를클로닝하여 full sequence 를확보하였다. 아교버섯의 laccase cdna 유전자 1개와 lignin peroxidase cdna 유전자 3개를클로닝하여모두 EMBL Nucleotide sequence data base에등록하였다. 겨울우산버섯은 laccase와 MnP는확보하였으나 LiP은발견하지못하였으며반면아교버섯은 laccase 와 LiP을가지고있으나 MnP를찾을수없었다. 이를보완하기위하여분리한유전자를각기다른버섯에도입하여 laccase 와 LiP은물론 MnP의활성까지가지는새로운형질전환체를확보하여도입된유전자의발현을분석함으로써새로운균주의활용성을분석함은물론이러한 heterologous expression 방법에의한우수한균주의개량에대한전략을확립해야할것이다. 겨울우산버섯의리그닌분해효소는균사배양시 SSC 배지와 PDB 배지에서의유전자발현량에차이를보이므로리그닌분해효소발현을향상시키기위해서는 SSC 배지가적당함을알수있었고, 아교버섯의경우에는오히려 PDB에서리그닌분해효소발현율이좋았다. 그리고배양기간에따라서도유전자발현패턴이변화하였는데배양후 5일에서 10일정도가가장높은발현을보였고 DBP와 DEP 같은내분비계장애물질첨가에의해발현량이높아졌다. 분석된발현특성은리그닌분해효소유전자의발현량이높은배지와배양조건을확립하는데이용될수있을것이며백색부후균의리그닌분해력을향상시키기위한기초자료로활용될수있다. 나. 겨울우산버섯의 cdna library 를구축하고 EST 분석을통하여유전자의집단적발현패턴을분석하였다. 1 10 7 pfu/ml의 titer를갖는 library에서 1,479개의 EST를생성시켜그결과를분석한결과 protein synthesis, me- - 99 -
tabolism, localization, unclassfied protein 에관련된유전자들이각각 16~15% 를차지하였다. 그중에서도발현이높은유전자는스트레스에대응하는 heat shock protein 이주된단백질임을알수있었다. 그러나 70% 이상의유전자들은데이터베이스에서기능을확인할수있는정보가없는것으로나타났는데이것은담자균에대한분자생물학적연구가세계적으로도미흡하기때문으로판단되며이를극복하기위해서는지속적인연구를통해데이터축적이필요하다. 다. 제한효소를매개로한형질전환은백색부후균의종류에따라원형질체분리방법이나선별마커등을달리하여형질전환실험방법을확립하였다. 겨울우산버섯의경우 0.5% Uskizyme 을이용하여세포벽을분해하였고아교버섯과기계충버섯은 1% Novozyme 234을사용하여균사로부터세포벽을제거하여원형질체를형성하는조건을완성하였다. 또한다양한항생제에대한민감성을조사하여겨울우산버섯은 hygromycin B를아교버섯과기계충버섯은 phosphinothricin 가선택되었고이에맞추어형질전환벡터를다르게제작하였다. 아교버섯과기계충버섯은 phosphinothricin 에대한저항성유전자 Bar 를가지고있는기본벡터 pbargpe 를이용하여형질전환용벡터를제작하였다. 겨울우산버섯형질전환용벡터를제작하기위해하이그로마이신에대한내성을갖는유전자 (HPH) 를이용하여형질전환체를선별할수있는새로운기본벡터 (phygpt) 를제작하였다. 여기에분리된리그닌분해효소유전자를이용하여 laccase 가과발현되는형질전환벡터로 pbarptlac 과 phylac1 를제작하고 MnP가과발현되는 pbartvmnp 과 phymnp4atg 를제작하였다. 또한아교버섯으로부터새롭게분리한 laccase promoter 를이용하여환경호르몬 (EDC) 에의해유전자발현이유도될수있는형질전환벡터인 pbarmtprolacc 를제작하였다. - 100 -
제 3 장백색부후균의리그닌분해효소유전자발현조절 라. 겨울우산버섯과기계충버섯그리고아교버섯에서원형질체를분리하여제한효소를매개로한형질전환 (REMI) 법을실시한결과각각에서형질전환체를확보하였고유전자가도입된것을 PCR과 Southern blot analysis를통해확인되어안정적인형질전환시스템을확립하였다. 각각의형질전환체는리그닌분해효소 (laccase, MnP) 유전자의발현이증가됨에따라효소활성이야생형균주에비해대체로 3배에서 10배이상증가된우량균주를확보하였다. 특히야생형균주에서는 laccase 활성이거의없는기계충버섯의형질전환체에서는아교버섯의 laccase 유전자를삽입하여 laccase 활성이 5배이상나타났으며특히 laccase promoter 를이용한 pbarmtprolacc 벡터를삽입한형질전환체는환경호르몬 (EDC) 에의해유전자발현이크게유도되어활성이증가되었는데 EDC의종류에따라유전자발현양과활성에차이가보였다. 따라서 EDC가포함된오염물질을분해하고자한다면 EDC 존재에의해리그닌분해효소유전자발현과활성을증가시킬수있는 pbarmtprolacc 와같은발현이유도되는형질전환용벡터가매우유용할것으로기대된다. 리그닌분해효소활성이증가된형질전환체는 EDC을분해하여흔히 EDC의독성을나타내는에스트로겐성이현저히줄어들어 70~90% 감소율을보였다. 염색염료의탈색능비교에서는염료의종류에따라차이를보였는데 Poly-R 과 RBBR은형질전환체가야생형균주보다약간높은탈색능을보였으며 metyl green에서는 2~3배높은탈색능을보였다. 균에의한나무의중량감소율과리그닌분해력에있어서는나무종류와균주에따라차이를보였으나리그닌분해력이증가된형질전환체가야생형균주보다나무의중량감소율이 1.5 배에서크게는 40배까지증가되었고리그닌함량도 12배에서 20배까지감소율이증가되었다. 따라서백색부후균의형질전환체는리그닌분해효소유전자의발현과효소활성이증가되어 EDC 분해력과염료의탈색능이증가되고실제나무의리그닌을분해할수있는능력이강화되었다. - 101 -
마. 앞으로본연구를통해확보된유전자와형질전환체는재조합단백질합성과리그닌분해산물조사등의실험을통해백색부후균의리그닌분해효소의분자생물학적특성과기능을이해하고리그닌분해기작을구명하기위해연구가계속진행될것이다. 또한목질계바이오매스를이용한바이오에너지화연구에서목질내리그닌을제거하는전처리와생산성향상을위한목질분해효소의대량생산을기대할수있고이와더불어환경호르몬분해력이강화된환경정화용미생물로개발할수있을것으로본다. 개발된기술을기반으로표고등식용버섯의우량종균개발시전통적으로해오던육종방식외에분자생물학적방법을접목시켜효과적인우량종균개발을위해다양한기초자료와기술로활용할수있을것으로기대된다. - 102 -
제 4 장 참고문헌
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국립산림과학원연구보고목록 서 명 일련번호 발행연도 2002 태풍루사에의한산지재해원인과복구대책 03-01 2003 2002년도산림병해충발생예찰조사연보 03-02 2003 임목축적생장율적용방법개발 03-03 2003 지속가능한산림경영을위한현지적용기준및지표보고서 (2002) 03-04 2003 21세기국유림의역할및관리강화방안 03-05 2003 도시숲이직장인에게미치는영향및학교숲의편익 03-06 2003 주 5일제근무제도입에따른산림, 임업분야영향및대응방안 03-07 2003 지속가능발전시대의산림관리방향 03-08 2003 밤 표고소득분석 03-09 2003 우리나라산림휴양실태및수요전망 03-10 2003 전국산촌기초조사보고서 ( 전국 ) 03-11 2003 전국산촌기초조사보고서 ( 광역시 ) 03-12 2003 산림사업의공적관리시스템강화및임산바이오매스를활용한대체에너지보급 03-13 2003 주요수종의임목자원평가및예측시스템 04-01 2004 2003년도산림병해충발생예찰조사연보 04-02 2004 산림기능구분도작성 04-03 2004 A feasibility study on rehabilitation of degraded forests and establishment of agroforestry based on community participation in JAVA the republic of INDONESIA 04-04 2004 2003년도밤 표고소득분석 04-05 2004 한국의산림입지 ( 산림토양 ) 04-06 2004 주요산불피해지임목및임분복 04-07 2004 산림지속성지수개발에관한기초연구 04-08 2004 주요단기소득임산물의수급및유통실태 04-09 2004 제주시험림의사회 경제 경영조사분석 04-10 2004 지속가능한산림경영이행을위한 IPF/IFF 실행권고안의국내이행평가 04-11 2004 일제강점기조선의산림이용 ( 산업용재와연료재의수급추이및영향 ) 05-01 2005 제주시험림조사보고서 (Ⅱ) - 산림생태계분야 - 05-02 2005 2004년도산림병해충발생예찰조사연보 05-03 2005 지구온난화, 기후변화협약, 산림 ( 기후변화협약에대응한산림의역할 ) 05-04 2005 열대림조성 관리에관한연구보고서 - 인도네시아 KTH사조림지를중심으로 - 05-05 2005
서 명 일련번호 발행연도 소나무재선충병항공방제가소나무림생태계에미치는영향 05-06 2005 산림의공익기능계량화연구보고서 05-07 2005 오염지역식생복원을위한환경정화수종육성 05-08 2005 도시숲의생태적가치 05-09 2005 산림유전자원종자목록 ( 난대산림연구소보유편 2005) 05-10 2005 2004년도밤 표고소득분석 05-11 2005 특용수종재배기술 05-12 2005 침엽수구조부재의장기하중특성 05-13 2005 주요목재문화재의수종구성 05-14 2005 생명의물수액 05-15 2005 목탄 목초액이용 05-16 2005 목질칩을이용한분뇨처리 05-17 2005 도시림형산림공원조성방안 05-18 2005 국민의숲 제도운영활성화방안 05-19 2005 건조목재품질인증제타당성조사 05-20 2005 환경친화성생물농약개발 05-21 2005 속성수신품종육성현황 05-22 2005 DNA marker 분석과 QTL mapping 05-23 2005 2005년도산림병해충발생예찰조사연보 06-01 2006 GIS에의한수치산지이용구분도구축방법 06-02 2006 제주유망수종신품종육성 06-03 2006 국유림영림계획단위산림기능구분도작성 06-04 2006 환경호르몬의분해기술 06-05 2006 포플러배양세포발현유전자대량염기서열분석 06-06 2006 제주지역외래식물편람 06-07 2006 한라산정상일대의산지안정화연구 06-08 2006 국유림장기경영계획기법및임분단위시업의사결정지원시스템개발 06-09 2006 조림 CDM사업길잡이 06-10 2006 지역개발촉진을위한산촌진흥계획방향정립 06-11 2006 자연재배형표고톱밥재배시스템 06-12 2006 지속가능한산림경영현지이행및모니터링체계구축 06-13 2006 지구온난화와산림그리고탄소나무계산기 06-14 2006 2005 밤 표고소득분석 06-15 2006 아까시나무황화피해및임분관리 06-16 2006 우리나라의산림녹화성공요인 06-17 2006
서 명 일련번호 발행연도 채종원의수형조절을통한종자생산관리방안 06-18 2006 제4차전국산림자원조사서 ( 제주도기본계획구 ) 06-19 2006 기후변화협약대응산림부문온실가스통계체계구축 06-20 2006 저항성품종육성 06-21 2006 진주시험림산림조사보고서 06-22 2006 임업기계, 장비의활용 06-23 2006 임도구조개량방법개선 06-24 2006 활엽수혼효림시업법체계화 06-25 2006 천연소나무림임분유형구분 06-26 2006 백두대간보호지역내벌기령이상산림의표준입목가액산정기준 06-27 2006 2006년도산림병해충발생예찰조사연보 07-01 2007 제주특산수종의조경및절화용품종특성과재배기술 07-02 2007 평균경사도산출및능선구분프로그램 07-03 2007 숲가꾸기에의한녹색댐조성효과 07-04 2007 산림의공익기능계량화연구 07-05 2007 산불피해지생태계변화조사 07-06 2007 리기다소나무의구조용집성재이용기술개발및성능향상 07-07 2007 극다중분광영상자료의산림정보해석및활용기법개발 07-08 2007 친환경임산물의소비자의향과마케팅전략 07-09 2007 산림자원의기내대량증식 07-10 2007 1970년대산림녹화정책 07-11 2007 오갈피나무류의대량배양 07-12 2007 국내외환경변화에따른임업보조금체계개편방안 07-13 2007 제주시험림의생태관광계획수립 07-14 2007 고성능목질세라믹복합재개발 07-15 2007 제주시험림의지속가능한산림경영의현지이행체계수립 07-16 2007 가시오갈피우량품종육성및재배법개발 07-17 2007 2006 밤 표고소득분석 07-18 2007 산림부문의추세및장기전망 07-19 2007 2007년도산림병해충발생예찰조사연보 07-20 2007 품질인증제품검사의방부제용탈시험추가타당성시험 07-21 2007 우리나라산림바이오매스자원평가 07-22 2007 밤생산조절직접직불제도입방안관한연구 07-23 2007 산림부문온실가스흡수원배출원인벤토리평가 07-24 2007 국유림의산림휴양기능확대방안 07-25 2007
서 명 일련번호 발행연도 산불피해지복구및산림의내화성증진기술 07-26 2007 산림환경서비스지불제도입기초연구 07-27 2007 우리나라임가경제조사를위한입목자산가치평가시스템의구축 08-01 2008 국산재의건축부재이용을위한연구 - 대단면재및접합부개발평가 - 08-02 2008 산촌체험관광발전방안 08-03 2008 제주지역의희귀식물 08-04 2008 산림병해충방제를위한천연물제제개발 08-05 2008 외래및돌발병해충의방제대책연구 08-06 2008 버섯균사체의액체배양및유용물질생산 08-07 2008 Trends and Projections for the Forest Sector in the Republic of Korea 08-08 2008 족제비싸리 (Amorpha fruticosa) 의생리활성물질탐색연구 08-09 2008 두릅나무병해방제연구 08-10 2008 산림부문온실가스흡수 배출계수관리방안 08-11 2008 북한사회주의체제의중앙 지방산림조직특징및운용체계분석 08-12 2008 백합나무조림적지및타당성조사 08-13 2008 1:5,000 임상도제작방안수립 08-14 2008 산림부문 IPCC 2006 가이드라인적용성평가 08-15 2008 주요산림기능별숲가꾸기 08-16 2008 천연소나무림시업법 08-17 2008 효율적산림작업을위한임내도로망배치기술 08-18 2008 2008년도산림병해충발생예찰조사연보 08-19 2008 목질제품의 VOC 평가및개선 08-20 2008 도시숲이용형태별시업모델 08-21 2008 산림작업의표준화에관한연구 08-22 2008 산음 ' 치유의숲 ' 조성기본계획 08-23 2008 적지적수 ( 適地適樹 ) 역사와그활용연구 09-01 2009 산지전용허가기준의개선방안 09-02 2009 무역자유화협상에따른임업및임산업영향및대응방안 09-03 2009 친환경임산물생산기반및유통체계확립방안 09-04 2009 산림바이오에너지이용기술 09-05 2009 대형산불피해지의지표지질변화 09-06 2009 한국의산림인증현황과표준체계시안개발 09-07 2009 능이접종묘생산및꽃송이버섯재배실용화기술 09-08 2009 임산염료자원및기능성신소재개발 09-09 2009 백색부후균의분자생물학적연구 09-10 2009