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CANCER PREVENTION RESEARCH ORIGINAL ARTICLE 인간의전립선암세포주인 DU145 세포와단핵구인 THP-1 세포의상호작용이종양증식에미치는영향 1 한림대학교식품영양학과, 2 강원대학교 BT 특성화학부식품생명공학전공 임도영 1 ㆍ조한진 1 ㆍ김종대 2 ㆍ윤정한 1 In vivo Tumor Growth Is Enhanced by Interactions of DU145 Human Prostate Cancer Cells and THP-1 Human Monocytes Do Young Lim 1, Han Jin Cho 1, Jong Dai Kim 2 and Jung Han Yoon Park 1 1 Department of Food Science and Nutrition, Hallym University, Chuncheon 200-702, 2 Department of Food Science and Biotechnology, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Korea Tumor and tumor-microenvironment are most important aspects in recent years. Tumor associated macrophages (TAM) play key roles in tumor-microenvironment. Macrophages are originated from blood monocytes. In this study, we examined whether DU145 androgen-independent prostate cancer cells and THP-1 human monocytes interact each other in vivo and in vitro. In vivo xenograft model, DU145 cells and/or THP-1 cells were inoculated subcutaneously in Balb/c nude mice. Tumor growth was accelerated in a group of co-inoculation of DU145 cells with THP-1 cells compared to only DU145 or THP-1 cell-injected group. Immunohistochemistry assay in tumors revealed that Ki67, CD31, and vascular endothelial growth factor (VEGF) expressions were increased by the co-inoculation group. Secretion of IL-6, IL-8 or VEGF were induced when DU145 cells incubated with THP-1 cells. In the present study, we demonstrated that increase of IL-6, IL-8 and VEGF secretion in co-culture of DU145 and THP-1 cells may one of the key inducers of promotion in tumor growth of co-inoculation with DU145 human prostate cancer cells and THP-1 human monocytes. (Cancer Prev Res 16, 194-199, 2011) Key Words: Androgen-independent DU145 human prostate cancer cells, THP-1 human monocytes, Tumor growth, IL-6, IL-8 서 고형암은암세포, 섬유아세포, 내피세포, 면역적격세포등으로구성되어있으며, 이들은서로지속적인상호작용을통하여증식한다. 이렇게고형암을구성하고있는주변환경을일컬어종양미세서식환경 (tumor microenvironment) 이라하며, 50% 이상을차지하고있는것은 책임저자 : 윤정한, 200-702, 춘천시한림대학길 39 한림대학교식품영양학과 Tel: 033-248-2134, Fax: 033-256-0199 E-mail: jyoon@hallym.ac.kr 접수일 :2011 년 7 월 1 일, 1 차수정일 :2011 년 7 월 7 일, 2 차수정일 :2011 년 7 월 11 일, 게재승인일 :2011 년 7 월 14 일 론 대식세포이다. 이러한대식세포들은혈액의단핵구로부터유래하며, 암세포의주변에서는대식세포본래의기능이변질되어종양의진전및증식촉진을돕는대식세포 (tumor associated macrophage, TAM) 가된다. 1) 고형암내, 외부의 TAM들은염증과암에중요한역할을하며암세포의증식을촉진하거나신생혈관형성을유도하는등종양형성및증식에도중요한역할을담당하며암이성장하는데좋은환경을제공한다. 2,3) 따라서이러한암과 Correspondence to:jung Han Yoon Park Department of Food Science and Nutrition, Hallym University, 39 Hallymdaehak-gil, Chuncheon 200-702, Korea Tel: +82-33-248-2134, Fax: +82-33-256-0199 E-mail: jyoon@hallym.ac.kr 194

임도영외 3 인 : 전립선암세포와단핵구의상호작용 195 종양미세서식환경을조절하는연구가최근에항암연구의주요테마가되고있다. 전립선암은서구형암으로최근우리나라에서도전립선암의발병률이계속적으로증가하고있다고보고되었다. 4) 초기전립선암의근치적치료방법으로는병소의외과적제거및방사선치료가있고보조적으로 androgen을억제하는호르몬요법이있다. 그러나후에전립선암이재발하거나발견이늦은경우에전립선암은 androgen 비의존적으로성장하고또한타기관으로전이가되어있어호르몬요법등으로만은치료가어렵게된다. 종양과종양미세서식환경의세포들간의커뮤니케이션은다양한요소들에의하여영향을주고받는다. 그중 cytokine이라는대식세포를포함한면역세포계에서분비하는단백질은종양과그인접세포들간의상호작용소통에있어중요한역할을담당한다. 분비된 cytokine 은 autocrine 또는 paracrine으로자기자신또는주변인접세포에영향을미치게된다. 그중 interleukin (IL)-6는주요 inflammation mediator로, 특히 androgen 비의존성전립선암의진행과전이를촉진한다고보고되었다. 5) Angiogenesis를촉진한다고알려진 IL-8도신생혈관형성촉진이라는주요한기능이종양에서는암의증식과림프구의침투를증가시키는등의역할을한다고보고되었다. 6) Androgen 비의존성전립선암과종양미세서식환경에대한연구는현재미비한실정이다. 따라서전립선암과종양미세서식환경에대하여보다자세히연구하여전립선암을치료및억제할수있는 target을규명하는연구가필요하며, 본실험에서는 androgen 비의존성의인간의전립선암세포인 DU145세포를단핵구인 THP-1과함께이식하였을때 tumor growth에미치는영향과그상호작용에대하여연구하였다. 1. 실험재료 재료및방법 실험에사용한인간의전립선암세포인 DU145 세포와 THP-1 세포는 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) 에서구입하였다. 세포배양에사용한 Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture Ham's F12 (DMEM/F12) 은 Gibco/BRL (Gaitherburg, MD, USA) 에서, RPMI-1640은 Thermo Scientific (Waltham, MA, USA) 에서구입하였고, fetal bovine serum (FBS), trypsin-edta, penicillin-streptomycin은 Cambrex (Walkersville, MD, USA) 에서구입하였다. 세포배양에사용한멸균된플라스틱용기는 Corning (Corning, NY, USA) 에서구입하였고, 면역염색 에사용한 LSAB + kit은 Dako (Carpinteria, CA, USA) 에서구입하였다. IL-6와 VEGF ELISA kit는 R&D system (Minneagpolis, MN, USA) 에서구입하였고, IL-8 ELISA kit는 ebioscience (San Diego, CA, USA) 에서구입하였다. 2. 세포배양 DU145 세포와 THP-1 세포는 37 o C 습윤한 CO 2 incubator (5% CO 2 /95% air) 에서각각 DMEM/F12와 RPMI- 1640 배지를사용하여배양하였다. 실험에사용할세포를유지하기위해각각의배지에는 FBS (10%) 와 penicillin (100 units/ml), 그리고 streptomycin (100μg/ml) 을첨가하여사용하였다. 세포가약 80% confluent 해지면 DU145 세포는 phosphate-buffered saline (PBS, ph 7.4) 으로세포의단층을씻어낸후, 0.25% trypsin-2.65 mmol/l EDTA로처리하여계대배양하였다. THP-1 세포는 1000 rpm에 3분동안 centrifuge한후, 새배지로 suspension하여계대배양하였다. 3. In vivo xenograft model 동물실험에사용한 Balb/c nude mouse는 Orient Inc. ( 경기도, 대한민국 ) 에서구입하였으며, 구입후일주일간적응기간을두고실험에사용하였다 (n=5/group). DU145 세포는 3.0 10 6 cells/mouse, THP-1 세포는 3.0 10 5 cells/ mouse로 PBS에분주하고 Matrigel과 1:1로섞어마우스의피하에이식하였다. Tumor volume은매주 caliper로측정하였으며 (3.14/6) long axis short axis short axis 7) 으로계산하여도식화하였다. 각세포를마우스에이식한지 4주가되었을때마우스를희생하여 tumor weight을측정하였으며, 채취한 tumor는면역염색을위하여 4% paraformaldehyde에고정하였다. 모든동물구입및동물실험방법은한림대학교동물윤리위원회로부터승인되었다 (Hallym2009-126-1). 4. Immunohistochemistrical analysis 파라핀에포매시킨 tumor tissue는 5μm로 section하여조직절편을준비하였다. Histo-clear로파라핀을제거한후, 100% alcohol에서시작하여 0% alcohol (H 2O) 까지순차적으로 alcohol의 % 를낮춤으로써조직을수화하였다. 수화된조직은 10 mmol/l citrate buffer (ph 6) 로 antigen retrieval 단계를거친후, 3% 의 hydrogen peroxide (H 2O 2) 로 5분간처리하여내인성과산화효소를불활성화하였다. 5% BSA/TBST로 blocking한후, 다양한 antibody로 overnight incubation하였다. 이후의염색은 LSAB+ kit를사용하여제조회사에서제시한방법으로실험을진행하였

196 Cancer Prevention Research Vol. 16, No. 3, 2011 다. 3,3 -Diaminobenzidine으로발색한후에 hematoxylin으로대조염색 ( 핵염색 ) 을수행한후, 광학현미경으로표적단백질의발현을조사하였다. 면역염색에사용한 antibody들은다음에제시한구입처에서구입하였다 ; Ki67 (1:500), Keratin8/18 (1:300) 은 abcam (Cambridge, MA, USA) 에서, CD31 (1:300), VEGF (1:250), human specific CD45 (1:250) 는 Santa Cruz Biotechonolgy, Inc. (Santa Cruz, CA, USA) 에서, mouse specific CD45 (1:300) 는 R&D system (Minneagpolis, MN, USA) 에서구입하여사용하였다. 5. ELISA DU145 세포와 THP-1 세포를각각또는동시에배양하여얻은배지로 ELISA를수행하여분비된 cytokine (IL- 6, IL-8, VEGF) 의농도를조사하였다. 먼저 DU145 세포를 50,000 cells/well의밀도로 24-well plate에분주하고 24시간후에 1% serum이포함된배지로 serum deprivation하였다. 24시간후에 DU145 세포가들어있는 well에 THP-1 세포 (5,000 cells/well) 가포함되거나포함되지않은배지로교체하여배양하였다. 2시간후에배지를모아원심분리한후, 얻어진상층액을사용하여각각의제조사에서제시한방법으로 ELISA를수행하였다. 6. Statistics 모든분석수치는 mean±sem으로나타나있다. 수집된결과는 SAS (Statistical Analysis System) Windows ver. 8.12 (SAS, Inc., Cary, NC, USA) 을이용하여통계분석하였다. 각실험군들의평균치간의유의성은 p<0.05 수준에서 Duncan's multiple range test에의해분석하였다. 결과및고찰 1. 인간의전립선암세포인 DU145 세포와단핵구인 THP-1의 co-inoculation이 tumor growth에미치는영향단핵구로부터분화된대식세포는식작용을통하여외부의물질을처리하고반응하여체내면역계가인지할수있도록하는기능을가진다. 그러나암조직의미세서식환경에서는이러한대식세포들의본래의기능이외부의다양한요소들에의하여변형되어암의성장을돕거나촉진하는역할을한다고보고되어왔다. 8) 본실험에서 Balb/c nude mouse의피하에 DU145 세포와 THP-1 세포를각각또는동시에이식하는 xenograft model을확립하였다. DU145 세포를 injection한지 2주부터 tumor가형성되고, 마우스를희생 ( 암세포를 injection 후 4주 ) 할때까지 tumor growth를관찰하였다. THP-1의경우, DU145 세포보다낮은 growth를보였다. 반면 DU145 세포와 THP-1 세포를함께이식한군에서 tumor growth는세포이식 3주째부터현저히증가하는것이관찰되었다 (Fig. 1A). 세포를이식하고 4주후동물을희생하여얻은종양무게 (tumor weight) 도단일세포이식군에비하여두세포를함께이식한군에서 3배이상으로증가하였다 (Fig. 1B). 위의결과는암세포와단핵구를함께이식하였을때두세포의상호작용에의해 tumor의증식이더욱빠르게진행되었음을나타낸다. Fig. 1. Co-inoculation of DU145 cells with THP-1 cells in Balb/c nude mice. DU145 cells or THP-1 cells were inoculated alone, or co-inoculated with DU145 and THP-1 cells. (A) Tumor volumes were monitored weekly by caliper measurement. (B) At the termination of the experiment, all the mice were sacrificed and tumors were removed and then weighed. a,b Means without the same letter differ, p<0.05.

임도영외 3 인 : 전립선암세포와단핵구의상호작용 197 2. 종양조직내의다양한지표들의변화 In vivo model로부터얻은종양조직에서면역염색법을이용하여다양한지표들을조사하였다 (Fig. 2). Epithelial cell marker인 Keratin8/18은 DU145 세포를이식한군에서관찰되고 THP-1 세포를이식한군에서는관찰되지않았 다. CD45는림프구, 호중구, 호염기구, 단핵구등에서발현이관찰된다고알려져있다. 9) Human CD45 (hcd45) 는 DU145 세포를이식한군에서는관찰되지않고 THP-1 세포를이식한군에서관찰되었다. DU145 세포와 THP- 1 세포를같이이식한군에서는 Keratin8/18 (DU145 cells) 과 hcd45 (THP-1 cells) 가관찰되었으며, 면역염색을통 Fig. 2. Keratin8/18, CD45, Ki67, CD31, and VEGF expression are increased in tumor tissues from co-inoculation group of DU145 and THP-1 cells. Immunohistrochemical staining was based on 3,3'-diaminobenzidine staining as described in Materials and Methods section. Tumor tissues were counterstained with hematoxylin. Photographs of immunohistochemical staining, which were representative of four different animals, are shown ( 200).

198 Cancer Prevention Research Vol. 16, No. 3, 2011 하여두세포가 tumor 전반에걸쳐분포되어있음을알수있다. Mouse CD45 (mcd45) 는 mouse specific한 CD45를검출하기위하여사용하였다. 특히본실험에사용되어진단핵구인 THP-1은 human 유래의세포이기때문에 mcd45 marker를이용하면암세포를이식한동물의혈액에존재하는대식세포등이종양조직내로 infiltration된정도를관찰할수있으며, 이는외부에서종양의주변미세서식환경을형성하기위한다양한요소들을 recruitment한다는것으로나타낸다. 10) mcd45의발현은세군에서모두발현되었으며두세포를같이이식한군에서다소증가함이관찰되었다 (Fig. 2). 이는암세포와단핵구의상호작용을통해 CD45-positive cells이 host의혈액으로부터새로운조직으로의침투가이루어졌음을나타내며, 이들의유입증가가종양증식촉진에기여하는지에대하여자세한연구가필요할것으로사료된다. Cell proliferation marker인 Ki67은세포주기를활발히진행하고있을때발현되고휴지기 (G0 phase) 에서발현되지않는다고알려져있다. 11) Ki67은세가지군에서모두발현이되었고암세포와단핵구를동시에이식한군에 서발현이다소증가하였다. 이는세포를이식한동물을종양조직증식이활발히일어나고있는시기에희생하였기때문에세군의세포들이계속적으로증식하고있었고, 따라서비슷한발현정도를나타낸다고사료된다. 어떠한조직이든지증식하기위해서는새로운혈관이생성되어영양분을공급받아야한다. 특히종양조직의증식속도가급속도로진행되는이유중에는새로운혈관을형성하는요소들과그발현을촉진하는요소들의분비가활발하기때문이다. 대표적으로내피세포부착물질이라고도불리는 CD31과신생혈관형성인자인 VEGF 가있다. 혈관내피세포의생성정도를나타내는 CD31과 VEGF의발현은두세포를동시에이식한군에서현저히증가하였다. 따라서 DU145 세포와 THP-1 세포를같이이식한군에서증식지표와내피세포인자등의두드러진발현증가는두세포가공존하면서상호작용에의한종양증식촉진을나타내는것이라사료된다. Fig. 3. Interleukin (IL)-6, IL-8, and VEGF secretion are increased in DU145 cells cultured with THP-1 cells. DU145 cells were plated at 50,000 cells/well in 24-well plate and after 24 h, cells were serum-deprivated with 1% FBS containing media. Serum-deprivated DU145 cells were co-cultured with THP-1 cells (5,000 cells/well). 2 h conditioned media were collected for IL-6 (A), IL-8 (B), or VEGF (C) ELISA. Each bar represents the mean±s.e.m (n=3). a~c Means without a common letter differ, p<0.05.

임도영외 3 인 : 전립선암세포와단핵구의상호작용 199 3. DU145 전립선암세포와 THP-1 세포의 co-culture시분비되는 cytokine의변화면역세포는염증, 치료및감염에관여하며, 이를매개하기위하여 cytokine이라는단백질들을분비한다. 이들은면역세포계내에서직ㆍ간접적으로상호작용을일으키는데중요한단백질이다. In vivo model에서단핵구인 THP-1과전립선암세포인 DU145의 co-inoculation군에서 tumor의증식이현저히증가하였으므로 in vitro model에서 cytokine의변화를중심으로두세포의상호작용을조사하였다. 이를위하여각각의세포를배양하거나두세포를동시에배양 (co-culture) 하여얻은배양액에서 ELISA 를이용하여다양한 cytokine의변화를조사하였다. 그결과 IL-6와 IL-8 그리고신생혈관형성인자인 VEGF의분비가전립선암세포인 DU145 세포만을배양하였을때보다 THP-1을함께배양하였을때현저히증가하였다 (Fig. 3). IL-6는 autocrine 또는 paracrine으로 androgen 비의존성전립선암의진행에기여한다고보고되었다. 12) 또한 IL-8 의신생혈관형성조절이라는주요한기능이암의증식과전이및림프구의침투를증가시고면역반응의변형을초래한다고보고되었다. 6) 본연구는전립선암과종양미세서식환경을조절하는 factor를밝힌기본연구라사료된다. 나아가이러한요소들을중심으로자세한기전연구가필요하며, 전립선암및종양미세서식환경을조절하는주요 target을규명하고규명된 target을제어할수있는물질을개발한다면, 전립선암의치료뿐만아니라예방에도효과적일것이라사료된다. 결론식생활의서구화등으로인해서구형암이었던전립선암발병률이국내에서지속적인증가추세에있다. 발병초기상태에서는 androgen 억제나화학요법등을병행하면치료가가능하나, 완치되지않아재발하거나발견이늦어진전립선암의상태는 androgen 비의존성으로진행되어위의방법만으로는치료가어렵게된다. 본연구에서는 androgen 비의존성의전립선암세포인 DU145 세포와단핵구인 THP-1 세포를함께동물에이식하여각각의단일세포이식군들과의 tumor 증식을비교하였다. 두세포를같이이식한군에서 tumor 증식이현저히증가하였다. 이는두세포간의상호작용을통해신생혈관형성인자 (VEGF) 와암의진행과증식을촉진하는 IL-6와 IL-8의분비가증가되기때문이라고결론지을수있다. 따라서본연구는 in vivo에서전립선암과종양의미세서 식환경과의상호작용을연구함으로써실질적인전립선암의예방또는치료의주요 target을규명하기위한기본연구를수행하였다는점에서의의가있다고사료된다. 감사의글 이논문은 2010년도정부 ( 교육과학기술부 ) 의재원으로한국연구재단의중견연구자지원사업 (2010-0006926) 과지역거점연구단육성사업 / 의료바이오신소재융복합연구사업단에의하여수행되었으며, 이에감사드립니다. 참고문헌 1) Solinas G, Germano G, Mantovani A, Allavena P. Tumorassociated macrophages (TAM) as major players of the cancer-related inflammation. J Leukoc Biol 86, 1065-1073, 2009. 2)Mantovani A, Sozzani S, Locati M, Allavena P, Sica A. Macrophage polarization: tumor-associated macrophages as a paradigm for polarized M2 mononuclear phagocytes. Trends Immunol 23, 549-555, 2002. 3) Martinez FO, Helming L, Gordon S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annu Rev Immunol 27, 451-483, 2009. 4) 연도별연령표준화발생률추이, 보건복지부, 2008. 5) Corcoran NM, Costello AJ. Interleukin-6: minor player or starring role in the development of hormone-refractory prostate cancer? BJU Int 91, 545-553, 2003. 6) Yuan A, Chen JJ, Yao PL, Yang PC. The role of interleukin-8 in cancer cells and microenvironment interaction. Front Biosci 10, 853-865, 2005. 7) Tanaka T, Delong PA, Amin K, Henry A, Kruklitis R, Kapoor VK, Kaiser LR, Albelda SM. Treatment of lung cancer using clinically relevant oral doses of the cyclooxygenase-2 inhibitor Rofecoxib. Ann Surg 241, 168-178, 2005. 8) Pollard JW. Tumor-educated macrophages promote tumor progression and metastasis. Nat Rev Cancer 4, 71-78, 2004. 9) Hermiston ML, Xu Z, Weiss A. CD45: A critical regulator of signaling thresholds in immune cells. Ann Rev Immun 21, 107-137, 2003. 10)Talmadge JE, Donkor M, Scholar E. Inflammatory cell infiltration of tumors: Jekyll or Hyde. Cancer Metastasis Rev 26, 373-400, 2007. 11) Scholzen T, Gerdes J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. J Cell Physiol 182, 311-322, 2000. 12) Smith PC, Hobisch A, Lin DL, Culig Z, Keller ET. Interleukin-6 and prostate cancer progression. Cytokine Growth Factor Rev 12, 33-40, 2001.