Korean J Lab Med 2010;30:111-6 DOI 10.3343/kjlm.2010.30.2.111 Case Report Diagnostic Hematology Molecular Analysis of Two Cases of Severe Congenital Neutropenia Joonhong Park, M.D. 1, Myungshin Kim, M.D. 1, Jihyang Lim, M.D. 1, Yonggoo Kim, M.D. 1, Bin Cho, M.D. 2, Yeon-Joon Park, M.D. 1, and Kyungja Han, M.D. 1 Departments of Laboratory Medicine 1 and Pediatrics 2, College of Medicine, The Catholic University of Korea, Seoul, Korea Severe congenital neutropenia is a rare hematological disease characterized by a selective decrease in circulating neutrophils, maturation arrest of granulocytic precursors at the promyelocyte stage, and recurrence of infections. A 2-month-old male infant (patient A) and a 14-month-old female child (patient B) were referred to our hospital due to severe neutropenia. Sequencing analysis of ELA2 and HAX1 genes was performed. Two single nucleotide polymorphisms of HAX1 gene were found. They were 5,104T G point mutation of exon 1 and 5,474A G point mutation of intron 1 in HAX1 gene. The mutation of ELA2 gene was not found. The patient A showed a good response to granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) treatment and the absolute neutrophil count recovered to 1,195/mL. But the patient B showed a partial response to G-CSF treatment and experienced several episodes of herpetic gingivostomatitis, oral ulcer, acute pharyngotonsillitis and otitis media during follow-up. (Korean J Lab Med 2010;30:111-6) Key Words : Severe congenital neutropenia, ELA2, HAX1 서 론 검사를시행하고문헌고찰과함께보고하고자한다. 선천성호중구감소증 (severe congenital neutropenia, SCN) 은순환호중구의선택적감소, 전골수구단계에서골수과립구계세포의성숙정지그리고반복적인감염을특징으로하는드문혈액질환이다 [1]. SCN 환자는대부분소아이고절대호중구수 (absolute neutrophil count, ANC) 가보통 200/mL 이하이며골수구성장촉진인자 (granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF) 를이용한치료가도입되기이전에는심한세균감염으로인해조기에사망하였다 [2]. SCN의병태생리에흔히관여하는유전자변이로는상염색체우성 SCN의 ELA2 (elastase 2, neutrophil) 유전자변이와상염색체열성 SCN의 HAX1 (HCLS1 associated protein X-1) 유전자변이가보고되어있다 [3-6]. 저자들은항생제치료에도불구하고심한호중구감소증을보인 2명의 SCN 환아를대상으로분자유전학적 Received : April 29, 2009 Manuscript No : KJLM09-057 Revision received : January 11, 2010 Accepted : February 4, 2010 Corresponding author : Kyungja Han, M.D. Department of Laboratory Medicine, College of Medicine, The Catholic University of Korea, 505 Banpo-dong, Seocho-gu, Seoul 137-701, Korea Tel : +82-2-2258-1644, Fax : +82-2-2258-1719 E-mail : hankja@catholic.ac.kr 증례 1. 증례 A 환자 : 2개월, 남아주증상 : 심한호중구감소증현병력 : 환아는생후 2일째부터지속되는열로타병원에입원하여요로감염으로진단받고항생제치료를받았으나심한호중구감소가지속되어본원소아과외래를경유하여입원하였다. 과거력및가족력 : 형제는없으며기타특이사항은없었다. 이학적소견 : 호흡수는분당 60회, 맥박은분당 138회, 체온은 36.4 였고기타특이소견은없었다. 검사소견 : 총백혈구는 7.8 10 9 /L였고이중분절호중구가 2% 로 ANC가 156/mL 였다. 기타백혈구백분율은림프구 94%, 단핵구 1%, 호산구 3% 였다. 혈색소는 8.8 g/dl, 적혈구용적은 25.7%, 혈소판은 569 10 9 /L, ESR은 44 mm/hr, CRP는 39.59 mg/l였다. 말초혈액도말상심한호중구감소가관찰되었다. 골수도말및생검소견 : 골수의세포충실도는 100% 였고 M:E ratio는 1:2였다. 과립구계세포가현저히감소하였고소 111
112 Joonhong Park, Myungshin Kim, Jihyang Lim, et al. 수의전골수구가관찰되었으며성숙호중구는거의관찰되지않았다 (Fig. 1). 세포감별계산은적혈모세포 27%, 골수모세포 1%, 전골수구 7%, 골수구 1%, 후골수구 0%, 대상호중구및분엽핵호중구 0%, 호산구 4%, 호염기구 1%, 림프구 59% 였다. 말초혈액을이용한림프구면역표현형검사에서림프구는 CD3 (72%), CD19 (17%), CD3+CD4+ (61%), CD3+CD8+ (11%), CD3-(CD16+56)+ (7%), CD19+CD5+ (0%) 로정상이었다. 골수염색체검사 : 염색체분석결과 46,XY[20] 로정상소견을보였다. 분자생물학적검사 : ELA2와 HAX1 유전자에대한시발체는참고문헌에따라 Table 1과같이제작하였다 [7, 8]. BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 와 ABI 3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems) 를이용한염기서열분석결과, HAX1 유전자의 exon 1에서 5,104T G 점돌연변이와 intron 1에서 5,474A G 점돌연변이가관찰되었다 (Fig. 2). ELA2 유전자분석결 과에서는돌연변이가관찰되지않았다. 미생물검사 : 소변배양검사, 인후배양검사, 혈액배양검사상균이분리되지않았다. 치료및경과 : 환아는 3일동안항생제 (piperacillin, tazobactam) 와 G-CSF 4 mg으로치료받은후증상이호전되어 1주일후퇴원하였다. 퇴원시검사소견은백혈구는 7.64 10 9 /L ( 분절호중구 3.3%, 림프구 80.1%, 단핵구 5.6%, 호산구 9.6%, 호염구 1.4%) 로써 ANC가 252/mL, 혈색소는 8.7 g/dl, 적혈구용적은 26.3%, 혈소판은 478 10 9 /L였다. 퇴원 4개월후검사소견은총백혈구수가 8.36 10 9 /L였고이중분절호중구가 14.3% 로 ANC가 1,195/mL 였다. 2. 증례 B 환자 : 14개월, 여아주증상 : 심한호중구감소증 A B C D Fig. 1. Bone marrow smears show markedly decreased granulocytic precursors (A and C, Wright stain, 400) and a few promyelocytes (B and D, Wright stain, 1,000) in patient A and B, respectively.
Molecular Analysis of SCN 113 Table 1. Primers for PCR amplification and sequencing of ELA2 and HAX1 genes Primers for PCR amplification Sequence Nucleotides ELA2 Forward primer CTCGCGTGTCTTTTCCTC 57-74 Reverse primer AGCCCTTCTCAGTGGGTC 833-850 HAX1 Forward primer CGTTTACGACAGTGTCAGGATCG 5,017-5,039 Reverse primer TGACAAACTGACATGGCCCCAG 8,253-8,274 Primers for sequencing Sequence Nucleotides ELA2 1 Forward primer CTCGCGTGTCTTTTCCTC 57-74 Reverse primer GACGTTTACATTCGCCAC 252-269 2 Forward primer CCCAACTTCGTCAT GTCG 222-239 Reverse primer AGGCACTGCACCCCGTTG 476-493 3 Forward primer ATCAACGCCAACGTGCAG 423-440 Reverse primer GATTAGCCCGTTGCAGAC 657-674 4 Forward primer AACGTCTGCACTCTCGTG 591-608 Reverse primer AGCCCTTCTCAGTGGGTC 833-850 HAX1 1 Forward primer CGTTTACGACAGTGTCAGGATCG 5,017-5,039 Reverse primer GAAAGGTGGCAGGTGTTTGC 6,187-6,206 2 Forward primer TTTTGATG TGGCAGCCAGTC 5,634-5,653 Reverse primer GGCTGGTCTC CAACTCCTG 6,535-6,553 3 Forward primer CCCTAAGGGGCAACCTGTG 6,049-6,067 Reverse primer CTACAA AGAGAAGTCCCCAC 7,811-7,830 4 Forward primer GAAGGAGTGTGTAAATAAGGC 7,242-7,262 Reverse primer TGACAAACTGACATGGCCCCAG 8,253-8,274 Nucleotide position corresponds to GenBank entry NM_001972 (ELA2) and NG_007369.1 (HAX1). 현병력 : 환아는타병원에서내원 2일전부터지속되는미열과식욕부진으로치료중심한호중구감소증이관찰되어본원소아과외래를경유하여입원하였다. 과거력및가족력 : 환아는출생후 3일동안지속되는열과요로감염으로 2주간입원한병력이있었고이후에도구강궤양과급성위장관염으로진료받은과거력이있었다. 형제는없으며기타특이사항은없었다. 이학적소견 : 호흡수는분당 30회, 맥박은분당 130회, 체온은 36.0 였고기타특이소견은없었다. 검사소견 : 총백혈구는 8.3 10 9 /L였고이중분절호중구가 0.4% 로 ANC가 33/mL 였다. 기타백혈구백분율은림프구 81.9%, 단핵구 14.7%, 호산구 2.5% 였다. 혈색소는 10.6 g/dl, 적혈구용적은 30.7%, 혈소판은 669 10 9 /L, ESR은 32 mm/h, CRP 는 17.50 mg/l였다. 말초혈액도말상심한호중구감소가관찰되었다. 골수도말및생검소견 : 골수의세포충실도는 60% 였고 M:E ratio는 1:1이었다. 과립구계세포가현저히감소하였고소수의전골수구가관찰되었으며성숙호중구는거의관찰되지않았다 (Fig. 1). 세포감별계산은적혈모세포 22%, 골수모세포 1%, 전골수구 10%, 골수구 3%, 후골수구 0%, 대상호중구및분엽핵호중구 0%, 호산구 5%, 호염기구 1%, 림프구 53% 였다. 분자생물학적검사 : ABI 3130XL DNA analyzer (Applied Biosystems) 를이용한염기서열분석결과, HAX1 유전자의 exon 1에서 5,104T G 점돌연변이와 intron 1에서 5,474A G 점돌연변이가관찰되었다 (Fig. 2). ELA2 유전자분석결과에서는돌연변이가관찰되지않았다. 미생물검사 : 소변배양검사, 인후배양검사, 혈액배양검사상균이분리되지않았다. 치료및경과 : 환아는 6일동안항생제 (augmentin) 와 G-CSF 50 mg 으로치료받은후호전되어 2주일후퇴원하였다. 퇴원시검사소견은백혈구는 22.4 10 9 /L ( 분절호중구 31.4%, 림프구 51.1%, 단핵구 10.0%, 호산구 2.4%, 호염구 5.1%) 로써 ANC 가 7,033/mL, 혈색소는 10.2 g/dl, 적혈구용적은 29.4%, 혈소판은 481 10 9 /L였다. 그러나퇴원 2개월후검사소견은총백혈구수가 7.3 10 9 /L였고이중분절호중구가 1.5% 로 ANC가 109/mL 였다. 이후환아는 G-CSF 치료에일시적인반응을보이며수차례반복적인발열과헤르페스잇몸입안염 (herpetic gingivostomatitis), 구강궤양, 인후염과중이염등으로입원또는외래진료를받으며추적관찰중이다. 고찰 Kostmann [9] 은 1956년에 ANC가 500/mL 이하인심한호중구감소증과조기에발병하는심한세균감염을특징으로하는상염색체열성혈액질환을보고하였고이후 Kostmann 증후군으로명명되었다. SCN에서는구강점막을보호하는호중구의감소로잇몸입안염과구강궤양이가장흔한증상이고피부감염, 중이염, 폐렴, 요로감염등도흔하다. 세균감염과관련된균주로는황색포도상구균및대장균이가장흔한감염균주이고환자는패혈증, 복막염등으로사망한다 [10]. SCN 환자들의약 9% 가 G-CSF 치료중골수이형성증후군 (MDS) 이나급성골수성백혈병 (AML) 으로이행하는것으로보고되었다. G-CSF가 SCN에서 MDS/AML을유발하는직접적인기여인자임을배제할수없으나 G-CSF 치료로 SCN 환자들의생존율이향상되면서잠재적인 MDS/AML 유발소인이발현하는것으로생각되고있다 [11]. SCN에서 MDS/AML로이행은 mo-
114 Joonhong Park, Myungshin Kim, Jihyang Lim, et al. 5,104 (T G) 5,474 (A G) C A G G T T K C C C C C A G G A A T A R G A C A G B C A G G T T G C C C C C G G A A T A G G A C A G C A G G T T G C C C C C G G A A T A G G A C A G C D Fig. 2. Sequencing analysis of HAX1. 5,104T G point mutation of exon 1 (A, C) and 5,474A G point mutation of intron 1 (B, D) in patient A and B, respectively. The point mutations of patient A are heterozygous and those of patient B are homozygous mutations. nosomy 7, trisomy 21, ras 돌연변이를획득하는일부 SCN 환자에서다단계경로를통해일어난다 [12]. 본증례의환아들은모두생후 2-3일째부터발열이관찰되었고요로감염으로진단받아항생제치료를하였다. 특히증례 B 환아에서는추적관찰중에잇몸입안염, 구강궤양, 인후염, 중이염등이관찰되었다. 염색체검사를시행한증례 A 환아는정상염색체핵형이었다. 국내에서는 SCN에대한 5예의증례보고가있고 [13-17] 보고된환아들은반복적인세균감염으로피부감염, 인두염, 부비동염, 폐렴, 중이염, 잇몸입안염등의병력이있었다. G-CSF 투여로 SCN 환자에서호중구수가증가하고발열과감염의빈도가감소함이보고되었다 [16]. 1994년에 Severe Chronic Neutropenia International Registry (SCNIR) 가설립되어 700명이상의 SCN 환자를추적관찰한결과, 90% 이상의환자가 G-CSF 치료에반응하였고 ANC가 1,000/mL 이상으로호전되었으며치료에반응한모든환자에서항생제의사용과입원기간이현저히감소하였다 [18-22]. 현재 G-CSF는대부분의 SCN 환자에서추천되는 1차치료제이고, G-CSF 치료에불응하는환자와 MDS/AML로이행된환자에서는조혈모세포이식이유일한치료방법으로알려져있다 [23]. 본증례 에서증례 A 환아는 G-CSF 투여로임상증상이호전되었고 ANC도 1,195/mL 로회복되었다. 그러나증례 B 환아는 G-CSF 치료에일시적인반응은보였으나 ANC가 500/mL 이상지속되지않았으며추적관찰중에반복적인세균감염이관찰되었다. 국내에서 Seo 등 [24] 이선천성무과립증환자를대상으로유전자재조합인 G-CSF를투여하여 G-CSF가 SCN의일차적선택치료제제가될수있음을확인한이후 Yoon 등 [16] 과 Lee 등 [17] 은 SCN 환아들을대상으로한 G-CSF 치료경험을보고하였다. G-CSF는현재국내에서도 SCN 환자들에게추천되는 1 차치료제이다. SCN은 ELA2 [25], HAX1 [5,6], G-CSF receptor (G-CSFR) [26], Wiskott-Aldrich syndrome protein (WAS) [27], growth factor independent-1 transcription repressor (GFI-1) [28] 등다양한유전자가관여하는이형 ( ) 질환임이밝혀졌다. ELA2 유전자변이는대략 50-60% 의 SCN 환자에서관찰되는가장흔한유전자이상이며특히상염색체우성 SCN 환자에서흔하게보고되고있다 [3, 4]. HAX1 유전자변이는 SCN 환자의 3분의 1에서보고되고있다 [5, 6]. WASP, GFI-1 등과같은다른유전자변이는극히드물고소수의환자에서만보고되었다.
Molecular Analysis of SCN 115 최근상염색체열성 SCN 환자에서 anti-apoptotic gene인 HAX1 유전자변이가보고되었다 [5]. Klein 등 [5] 은중동의 20 명의 SCN 환자와전형적인 Kostmann 증후군을보이는세가족을대상으로상염색체열성 SCN의원인인동형 ( ) HAX1 유전자변이를연구하여 HAX1 유전자는골수세포에서 inner mitochondrial membrane potential을유지하고 apoptosis 에대해방어역할을하는데중요하다고제안하였다. ELA2 유전자변이와 HAX1 유전자변이는유사한형태학적이상과임상적으로공통적인표현형을보이는데이것은두유전자변이에의한분자생물학적결함이유전자발현의공통적인경로에존재할가능성을의미한다. Skokowa 등 [29] 은 ELA2 유전자변이와 HAX1 유전자변이를보이는각각의환자군에서 transcription factor인 Lymphoid enhancer-binding factor-1 (LEF-1) 의발현소실과순차적인 CCAAT/enhancer binding protein a (C/EBPa) 와 survivin의 down-regulation으로인하여과립구계전구세포들의생존율이감소하고분화가지연되며골수에서과립구생성의성숙정지와말초혈액에서호중구감소가관찰된다고보고하였다. 본증례에서는두예모두 ELA2 유전자변이는관찰되지않았으나 HAX1 유전자의 exon 1에서 5,104T G 점돌연변이와 intron 1에서 5,474A G 점돌연변이가관찰되었다. 관찰된두개의변이중, exon1의 5,104T G 점돌연변이는 protein-coding sequence를이용한염기서열분석결과 ATG (start codon) 이전의부분이어서 protein 합성과는관련이없을것으로생각되었다. Intron 1의 5,474A G 점돌연변이는염기서열분석결과만본다면종결코돈으로사용될수도있으나변이의위치가 intron이기때문에코돈이형성되지않을것으로판단되었다. 분석결과, 관찰된두개의점돌연변이는 open reading frame (ORF) 내에위치하지는않았고모두외국 SNP database에보고된단일염기변이 (single nucleotide polymorphism, SNP) 였다. RefSNP 번호는 exon1 의 5,104T G 점돌연변이는 rs11265425였고, intron 1의 5,474A G 점돌연변이는 rs1194593이었다. 증례 A 환아의 SNP는 heterozygote였고증례 B 환아의 SNP는 homozygote였다. 환아들의가계도분석결과, SCN의가족력은없었으나환아들은모두형제가없었기때문에질환의표현형을분석하기에어려움이있었다. 최근에국내 SCN 환자에대한 ELA2와연관된새로운돌연변이가보고되었으나 [30] 아직한국 SCN 환자들을대상으로한분자유전학적연구가보고된바가거의없어서앞으로국내 SCN 환자들을대상으로추가적인분자유전학적연구가필요하다. 증례 A 환아는 G-CSF 치료에좋은반응을보였지만증례 B 환아는 G-CSF 치료에일시적인반응을보였고 추적관찰중에반복적인세균감염이관찰되었다. 환아들은세균감염과 MDS/AML로의이행에대한조기진단을위해추적관찰중이다. 요약선천성호중구감소증 (severe congenital neutropenia, SCN) 은순환호중구의선택적감소, 전골수구단계에서골수과립구계세포의성숙정지, 빈번한감염을특징으로하는드문혈액질환이다. 저자들은항생제치료에도불구하고심한호중구감소증을보인 2명의 SCN 환아를대상으로분자유전학적분석을시행한결과, 두예모두에서 ELA2 유전자변이는관찰되지않았으나, HAX1 유전자의 exon 1에서 5,104T G 점돌연변이와 intron 1에서 5,474A G 점돌연변이가관찰되었다. 증례 A 환아는 granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) 치료에좋은반응을보였지만증례 B 환아는 G-CSF 치료에일시적인반응을보였고추적관찰중에반복적인세균감염이관찰되었다. 환아들은세균감염과급성백혈병이나골수이형성증후군으로의이행에대한조기진단을위해추적관찰중이다. 참고문헌 1. Boxer LA. Severe congenital neutropenia: genetics and pathogenesis. Trans Am Clin Climatol Assoc 2006;117:13-31. 2. Kostmann R. Infantile genetic agranulocytosis. A review with presentation of ten new cases. Acta Paediatr Scand 1975;64:362-8. 3. Dale DC, Person RE, Bolyard AA, Aprikyan AG, Bos C, Bonilla MA, et al. Mutations in the gene encoding neutrophil elastase in congenital and cyclic neutropenia. Blood 2000;96:2317-22. 4. Horwitz MS, Duan Z, Korkmaz B, Lee HH, Mealiffe ME, Salipante SJ. Neutrophil elastase in cyclic and severe congenital neutropenia. Blood 2007;109:1817-24. 5. Klein C, Grudzien M, Appaswamy G, Germeshausen M, Sandrock I, Schaffer AA, et al. HAX1 deficiency causes autosomal recessive severe congenital neutropenia (Kostmann disease). Nat Genet 2007; 39:86-92. 6. Germeshausen M, Grudzien M, Zeidler C, Abdollahpour H, Yetgin S, Rezaei N, et al. Novel HAX1 mutations in patients with severe congenital neutropenia reveal isoform-dependent genotype-phenotype associations. Blood 2008;111:4954-7. 7. Kawaguchi H, Kobayashi M, Nakamura K, Konishi N, Miyagawa
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